CN108026548A - 生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法 - Google Patents

生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108026548A
CN108026548A CN201680039064.XA CN201680039064A CN108026548A CN 108026548 A CN108026548 A CN 108026548A CN 201680039064 A CN201680039064 A CN 201680039064A CN 108026548 A CN108026548 A CN 108026548A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coa
methacrylic acid
microorganism
acid
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680039064.XA
Other languages
English (en)
Inventor
格雷厄姆·罗纳德·伊斯特汉
吉尔·斯蒂芬斯
安德鲁·亚克梅提
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Luset British International Co Ltd
Mitsubishi Chemical UK Ltd
Original Assignee
Luset British International Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1508582.2A external-priority patent/GB201508582D0/en
Priority claimed from GBGB1517545.8A external-priority patent/GB201517545D0/en
Application filed by Luset British International Co Ltd filed Critical Luset British International Co Ltd
Publication of CN108026548A publication Critical patent/CN108026548A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F120/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F120/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F120/04—Acids; Metal salts or ammonium salts thereof
    • C08F120/06—Acrylic acid; Methacrylic acid; Metal salts or ammonium salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F120/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F120/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F120/10—Esters
    • C08F120/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F120/14—Methyl esters, e.g. methyl (meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03006—Acyl-CoA oxidase (1.3.3.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01084—Alcohol O-acetyltransferase (2.3.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02023—4-Hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (3.1.2.23)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种甲基丙烯酸和/或其衍生物的生产方法，包括以下步骤：(a)在氧化酶的作用下，将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及(b)将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸和/或其衍生物。本发明还延伸到适于实施该方法的步骤的微生物。

Description

生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法
技术领域
本发明涉及生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法。特别地，该方法涉及使用特殊的酶转化，从异丁酰辅酶A通过甲基丙烯酰辅酶A来形成甲基丙烯酸，及自其产生的聚合物或共聚物。
背景技术
丙烯酸和其烷基酯，特别是甲基丙烯酸(MAA)和其甲酯，甲基丙烯酸甲酯(MMA)在化学领域是非常重要的单体。他们主要应用在生产各种用途的塑料上。其非常重要的聚合应用是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的浇注、模制或挤塑来生产高光学透明度塑料。此外，许多共聚物被使用，重要的共聚物有：甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸乙酯与α-甲基苯乙烯、丙烯酸乙酯及丙烯酸丁酯的共聚物。此外，通过简单的酯交换反应，MMA可以转化为其他酯，例如：甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯等。
目前，通过许多化学方法来制备MAA(以及MAA)，其中一个是成功的“Alpha法”，通过该“Alpha法”，通过与甲醛的无水反应从酯(丙酸甲酯)获得MMA。在Alpha法中，丙酸甲酯是由乙烯羰基化制备而成的。该乙烯原料来自化石燃料。最近，对于化工领域而言，寻找可持续的生物质原料的来源也成为所求。因此，代替使用Alpha法的可选的合成MMA的生物路线将是有益的。
因此，本发明的一个目的是解决上述问题，并提供制备甲基丙烯酸的生物或半生物方法。
令人意外的是，本发明人还发现了一种应用目前在工业应用水平未曾考虑的用于形成甲基丙烯酸的新颖的酶底物组合的方法，因此提供了一种合成关键单体例如MMA的新的可行的基于生物的路线。
众所周知，异丁酰辅酶A氧化成甲基丙烯酰辅酶A自然发生在缬氨酸降解I通路，并且已经在一些细胞中，观察到实施此转化的酶。在这些***中，该转化通常使用酰基辅酶A脱氢酶，该酰基辅酶A脱氢酶需要一个相应的电子传递***来将底物的氧化和泛醌的还原偶联起来，然后再生。
WO201438216中描述了使用微生物来制备甲基丙烯酸的方法，和使用醇酰基转移酶将甲基丙烯酰辅酶A转化成酯的方法。该文献展示了2-氧代异戊酸到异丁酰辅酶A和异丁酰辅酶A到甲基丙烯酰辅酶A的少量转化。上述还讨论了在体内从甲基丙烯酰辅酶A到甲基丙烯酸的理论上的生产，但没有成功生产。
然而，在WO201438216中，唯一的在体内产生甲基丙烯酸的实施例是，使用衍生自在同属的宿主内重组表达的酰基辅酶A脱氢酶的红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)；一种红球菌属(Rhodococcus)细菌。其他实施例试图在不同的宿主中异源地表达在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中发现的相似的酰基辅酶A脱氢酶，但没有产生甲基丙烯酸。异源酰基辅酶A脱氢酶在宿主中的上调或表达很难实现，且尚未报道。
因此，本发明更进一步的目的是提供一种甲基丙烯酸的改善生产。
目前无已知产生甲基丙烯酸的代谢途径(或者作为一种产品或作为一种中间体)。酰基辅酶A硫酯酶被认为催化结构相关的底物水解，然而这些酶倾向于具有很窄的底物特异性，且尚未被测试，或者不催化甲基丙烯酰辅酶A的水解。此外，在生物***中(如表达宿主细胞)，由于必要的细胞硫酯的脱靶水解，那些具有广泛的底物特异性的更罕见的品种似乎成为一个问题。另外，没有任何已知的催化甲基丙烯酰辅酶A的水解作用的酶。因此，至今并未证明这些酶对于涉及甲基丙烯酸的生物生产的工业应用是可行的。
因此，本发明的进一步的目的是解决上述提到的问题，并且提供一种可用于工业过程的将甲基丙烯酰辅酶A转化成甲基丙烯酸的酶转化，其可以独立地用于任何将异丁酰辅酶A转化成甲基丙烯酰辅酶A的酶中。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种生产甲基丙烯酸和/或其衍生物的方法，包括以下步骤：
(a)在氧化酶的作用下，将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸和/或其衍生物。
根据本发明的第二方面，提供了一种制备甲基丙烯酸的方法，包括以下步骤：
(a)将异丁酰辅酶A转化成甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)在硫酯酶(合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(4HBT))、转移酶、合成酶、和/或磷酸转酰酶和短链脂肪酸激酶的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化成甲基丙烯酸。
优选地，在本发明的第二方面中，在硫酯酶的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A转化成甲基丙烯酸，所述硫酯酶优选为4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(4HBT)，合适地为属于EC群组3.1.2.23的。更优选地，在来自节杆菌属(Arthrobacter)物种的菌株SU的酰基辅酶A-硫酯酶4HBT的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A转化成甲基丙烯酸。
有益地，本发明的方法提供了另一种生产关键化学品甲基丙烯酸及其已知衍生物的生物途径，降低了对化石燃料的工业依赖性并增加了可持续性。
该方法可以将可再生原料通过微生物发酵容易地转化为异丁酰辅酶A，且催化步骤(a)和步骤(b)的酶的共表达将会提供一种制备MAA的直接微生物发酵途径。
更进一步地，该方法中所使用的酶，无论是步骤(a)或者步骤(b)的酶，在以前都未曾考虑用于甲基丙烯酸的生产，并且在天然存在的缬氨酸途径中也未曾发现。特别是，用于步骤(a)的酶，不需要相关联的电子传递***，就可将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A；且用于步骤(b)的酶，对甲基丙烯酰辅酶A具有很高的底物特异性，以避免该中间体在宿主生物体中积聚的问题。因此，无论是步骤(a)还是步骤(b)中的酶，都可以单独用来部分改善形成甲基丙烯酸的化学过程，或者改善形成甲基丙烯酸的生物过程。可选择地，步骤(a)和步骤(b)中的酶，可以一起使用，以形成用于生产工业应用水平的甲基丙烯酸的独立的生物方法，并且，该方法能在异源宿主生物体中起作用。
酶
在本发明的上下文中，“生物地”是指使用了生物催化剂。优选地，该生物催化剂为酶，但可以包括源自生物源的任何催化结构。
在本发明的上下文中，“化学地”是指使用了除生物催化剂(例如：酶)以外的化学手段。
关于所述第一方面，步骤(b)可以生物地或化学地实施，优选生物地实施。
关于第二方面，步骤(a)可以生物地或化学地实施，优选生物地实施。
优选地，步骤(a)和步骤(b)使用一种或多种酶进行酶法实施，其中所述酶作为生物催化剂起作用。
优选，氧化酶是作用在CH-CH键上的氧化酶(属于EC编号1.3.X.X)，更优选地，氧化酶是使用氧气作为电子受体作用在CH-CH键上的氧化酶(属于EC编号1.3.3.X)。进一步优选地，该氧化酶是酰基辅酶A氧化酶(合适地属于EC编号1.3.3.6)。更优选地，该酰基辅酶A氧化酶选自以下任何酶：来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ACX4、来自节杆菌(Arthrobacter nicotianae)的短链酰基辅酶A氧化酶、来自绿豆(Vigna radiata)的过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶、来自念珠菌属(Candida)物种的酰基辅酶A氧化酶以及来自热带念珠菌(Candida tropicalis)的酰基辅酶A氧化酶4。最优选地，该酰基辅酶A氧化酶为来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ACX4。
可选择地，在氧化还原酶(合适地属于EC群组编号1.X.X.X)的作用下，异丁酰辅酶A可以转化为甲基丙烯酰辅酶A。优选地，该氧化还原酶是一种作用在电子供体的CH-CH基团上的氧化还原酶(合适地属于EC群组编号1.3.X.X)。更优选地，该作用在供体的CH-CH基团上的氧化还原酶是FAD依赖的氧化还原酶，又更优选地，该氧化还原酶是属于EC群组编号1.3.8.X的辅酶A脱氢酶。更进一步优选地，该氧化还原酶是一种短链酰基辅酶A脱氢酶(合适地属于EC群组编号1.3.8.1)、一种异戊酰辅酶A脱氢酶(合适地属于EC群组编号1.3.8.4)、一种2-甲基-支链酰基辅酶A脱氢酶(合适地属于EC群组编号1.3.8.5)或者一种酰基辅酶A脱氢酶(合适地属于EC群组编号1.3.8.-，例如：异丁酰辅酶A脱氢酶)。最优选地，该氧化还原酶为选自以下酶中的任一种：来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的短链/支链酰基辅酶A脱氢酶、来自智人(Homo sapiens)的异丁酰基辅酶A脱氢酶、来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的异戊酰辅酶A脱氢酶。
辅酶A脱氢酶通常需要一个相关联的电子传递***以将底物的氧化和泛醌(其接着再生)的还原偶联在一起。这样的电子传递***由电子传递黄素蛋白(ETF)和电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶(ETFQO)组成。该ETF必须与酰基辅酶A脱氢酶以及ETFQO二者相容。因此，在一些使用酰基辅酶A脱氢酶的实施例中，优选采用以下再生***的其中之一：
在一个实施例中，使用宿主微生物将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A，该宿主微生物包括内源辅酶A脱氢酶(其对异丁烯酰辅酶A具有活性)和与其相关联的电子传递***，如在(例如)恶臭假单胞菌的例子中。
在第二实施例中，在宿主生物体内，在异源的辅酶A脱氢酶的作用下，将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A，伴随着来自相同的生物体的电子传递***的蛋白质作为异源的辅酶A脱氢酶。例如：来自智人、恶臭假单胞菌、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)或来自拟南芥的辅酶A脱氢酶和电子传递***组分均表达在大肠杆菌(或者其他宿主生物体)内。
在第三实施例中，在宿主生物体内，在异源的辅酶A脱氢酶的作用下，将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A，伴随着同样来自不同微生物的电子传递***组分，这些组份彼此相容，且和辅酶A脱氢酶相容。例如：来自智人的辅酶A脱氢酶与野猪(Sus scrofa)的电子传递黄素蛋白相容，而该野猪的电子传递黄素蛋白反过来与来自类球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶相容。可选择地，由于拟南芥的ETF-泛醌氧化还原酶与类球形红细菌的ETF-泛醌氧化还原酶具有很高的序列同源性，因此异戊酰辅酶A脱氢酶和拟南芥的ETF可以和来自类球形红细菌的ETF-泛醌氧化还原酶形成功能***，来氧化异丁烯酰辅酶A。最后，由于恶臭假单胞菌ETF和人、猪的ETF的相似性，预计来自脱氮副球菌的ETF和ETF-泛醌氧化还原酶可以与来自其他来源(例如：智人或不同生物体的同源物)的异丁酰辅酶A脱氢酶相容。
优选地，在硫酯水解酶(也称为硫酯酶)(合适地属于EC群组编号3.1.2.X)的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸。更优选地，该酶为酰基辅酶A硫酯酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.20)、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.4)、ADP依赖性酰基辅酶A硫酯酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.18)、4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.23)或者属于EC群组编号3.1.2.-的硫酯酶(如：水杨酰辅酶A硫酯酶)。更优选地，该硫酯酶选自以下任一种酶：来自节杆菌属(Arthrobacter)物种菌株SU的4HBT、来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的4HBT、来自假单胞杆菌(Pseudomonas)物种菌株CBS-3的4HBT、来自大肠杆菌的EntH、来自大肠杆菌的YciA、来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的YciA、来自大肠杆菌的TesA或来自大肠杆菌的TesB、来自结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的FcoT。又更优选地，该硫酯酶是一种酰基辅酶A硫酯酶。又更优选地，该硫酯酶是一种4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.23)。最优选地，该酰基辅酶A硫酯酶是来自节杆菌属物种菌株SU的4HBT。
因此，在一个实施例中，异丁酰辅酶A可以在氧化酶的作用下转化为甲基丙烯酰辅酶A，且甲基丙烯酰辅酶A可以在4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.23、更优选来自节杆菌属物种菌株SU的酰基辅酶A硫酯酶4HBT)的作用下转化为甲基丙烯酸。
在一个实施例中，异丁酰辅酶A可以在酰基辅酶A氧化酶(合适地属于EC群组编号1.3.3.6，更优选为来自拟南芥的ACX4)的作用下，转化为甲基丙烯酰辅酶A，且甲基丙烯酰辅酶A可在4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(合适地属于EC群组编号3.1.2.23，更优选来自拟南芥属物种菌株SU的4HBT)的作用下转化为甲基丙烯酸。
可选择地，甲基丙烯酰辅酶A可以在以下酶促路线中的一种的作用下转化为甲基丙烯酸：
在一个实施例中，甲基丙烯酰辅酶A在转移酶(合适地属于EC群组编号2.X.X.X)的作用下转为为甲基丙烯酸。优选地，该转移酶是一种转移含硫基团的转移酶(合适地属于EC群组编号2.8.X.X)，更优选地，该转移酶是一种酰基辅酶A转移酶(合适地属于EC群组编号2.8.3.X)，又更优选地，该转移酶是乙酸酯依赖性酰基辅酶A转移酶或乙酸乙酯依赖性丁酰基辅酶A转移酶(合适地分别属于EC群组编号2.8.3.8和2.8.3.9)。最优选地，该转移酶选自以下任一种酶：来自芽孢梭菌属(Clostridium)物种SB4的丁酰辅酶A：乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)的丁酰辅酶A：乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824的丁酸酯：乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自大肠杆菌的乙酸酯辅酶A转移酶ydiF。
在本文中，所使用的术语“连接酶”、“合成酶”、“合酶”如本领域所公知，可以互换使用。
在第二实施例中，甲基丙烯酰辅酶A在反向作用的合成酶(合适地属于EC群组编号6.X.X.X)的作用下转化为甲基丙烯酸。优选地，该合成酶是一种碳-硫键形成性的合成酶(合适地属于EC群组编号6.2.X.X)。更优选地，该合成酶是一种酸-硫醇连接酶(合适地属于EC群组编号6.2.1.X)。更优选地，该合成酶是一种可逆ADP或GDP形成性酰基辅酶A连接酶，例如：GDP形成性琥珀酸辅酶A合成酶(合适地属于EC群组编号6.2.1.4)，ADP形成性琥玻酸辅酶A合成酶(属于EC群组编号6.2.1.5)，ADP形成性戊二酸辅酶A合成酶(属于EC群组编号6.2.1.6)，ADP形成性苹果酸辅酶A合成酶(属于EC群组编号6.2.1.9)，GDP形成性羧酸辅酶A合成酶(合适地属于EC群组编号6.2.1.10)，ADP形成性乙酸酯辅酶A合成酶(属于EC群组编号6.2.1.13)或ADP形成性柠檬酸辅酶A合成酶(属于EC群组编号6.2.1.18)。
在第三实施例中，甲基丙烯酰辅酶A在以下酶的共同作用下转化为甲基丙烯酸：与磷酸转乙酰酶、磷酸转丁酰酶同类的磷酸转酰酶(属于EC群组编号2.X.X.X，优选地属于EC群组编号2.3.X.X，更优选地属于EC群组编号2.3.1.X，最优选地属于EC群组编号2.3.1.8或者2.3.1.19)和短链脂肪酸激酶(属于EC群组编号2.X.X.X，优选地属于EC群组编号2.7.X.X，更优选地属于EC群组编号2.7.2.X，最优选属于EC群组编号2.7.2.1的乙酸酯激酶、属于EC群组编号2.7.2.6的甲酸酯激酶、属于EC群组编号2.7.2.7的丁酸酯激酶、属于EC群组编号2.7.2.14的支链脂肪酸激酶或者属于EC群组编号2.7.2.15的丙酸酯激酶)。优选地，该磷酸转酰酶是甲基丙烯酰辅酶A磷酸转酰酶。优选地，该短链脂肪酸激酶是可逆的甲基丙烯酸激酶。最优选地，该磷酸转酰酶选自以下任一种酶：来自丙酮丁醇芽孢梭菌ATCC824的磷酸转丁酰酶。最优选地，该短链脂肪酸激酶选自以下任一种酶：来自螺旋体(Spirochete)MA-2的支链脂肪酸激酶、来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的丁酸酯激酶、来自酪酸芽孢梭菌(Clostridium butyricum)的丁酸酯激酶。
在本发明的上下文中，术语“其衍生物”是指直接相关的或者包括甲基丙烯酰辅酶A或者甲基丙烯酸的任何化学品，例如：其酯、其酰卤、其酸酐、其胺、其氰化物、其内脂、其盐、其络合物、其异构体、其低聚物或共聚物，以及他们的任何进一步的取代形式，更优选，“其衍生物”是指其酯或盐。
优选地，甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯。优选地，甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸烷基酯，更优选的是甲基丙烯酸低级烷基(C1-C20)酯，又更优选的是甲基丙烯酸(C1-C12)烷基酯，特别是C1-C4烷基酯(例如：甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸丁酯)，或者C4-C12烷基酯。最优选地，所述甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸丁酯，例如：甲基丙烯酸正丁酯。
优选在属于EC群组编号2.X.X.X的转移酶的作用下，更优选在属于EC群组编号2.3.X.X的酰基转移酶的作用下，更优选在属于EC群组编号2.3.1.84的醇酰基转移酶的作用下，可以从甲基丙烯酰辅酶A生物地形成甲基丙烯酸酯。
优选地，当从甲基丙烯酰辅酶A生物地形成甲基丙烯酸酯时，该甲基丙烯酰辅酶A是在氧化酶的作用下从异丁酰辅酶A生物地形成的。
因此，根据本发明的第三方面，提供了一种生产甲基丙烯酸酯的方法，包括以下步骤：
(a)在氧化酶的作用下，将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)在醇酰基转移酶的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸酯。
优选地，第三方面的氧化酶是作用在CH-CH键上的氧化酶(属于EC群组编号1.3.X.X)，更优选的是使用氧气作为电子受体、作用在CH-CH键上的氧化酶(属于EC群组编号1.3.3.X)。又更优选的是，该氧化酶是酰基辅酶A氧化酶(合适地属于EC群组编号1.3.3.6)。又更优选地，该酰基辅酶A氧化酶是选自以下任一种酶：来自拟南芥的ACX4、来自节杆菌属的短链酰基辅酶A氧化酶、来自绿豆(Vigna radiata)的过氧化酰基辅酶A氧化酶，来自假丝酵母属(Candida)物种的酰基辅酶A氧化酶，以及来自热带假丝酵母属物种的酰基辅酶A氧化酶4。最优选地，所述酰基辅酶A氧化酶是来自拟南芥的ACX4。
优选地，第三方面的甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸烷基酯，更优选的是甲基丙烯酸低级烷基(C1-C20)酯，又更优选的是甲基丙烯酸(C1-C12)烷基酯，特别是C1-C4烷基酯(例如：甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸丁酯)，或者C4-C12烷基酯。最优选地，所述甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸丁酯，例如：甲基丙烯酸正丁酯。
合适地，醇酰基转移酶在醇或苯酚存在下作用，优选为直链或支链的C1-20无取代醇、芳烷基醇或苯酚，以及特别优选C1-8烷基醇或C1-4烷基醇，例如：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、叔戊醇、正己醇、异己醇、2-己醇、2-甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇、苯甲醇或苯酚。优选地，醇酰基转移酶在醇的存在下起作用，该醇更优选地是：C1-C12烷基醇，更更优选C1-C4或者C4-C12烷基醇；又更优选在丁醇(例如：正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇)的存在下起作用。最优选地，该醇酰基转移酶在正丁醇的存在下起作用。
本文所述的醇是指一类具有羟基(-OH)且可以和甲基丙烯酸形成酯基的物质。优选地，该醇可以是C1-C20烷基醇，更优选地，是C1-C12烷基醇，仍更优选地，是C1-C4烷基醇或者C4-C12烷基醇，最优选为C4烷基醇。
优选地，该醇酰基转移酶衍生自植物来源，更优选地，该植物属于选自以下各目的任一目：姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)以及木兰目(Laurales)，又更优选地，该植物属于选自以下各科的任一科：芭蕉科(Musaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、番木瓜科(Caricaceae)以及彰科(Lauraceae)；仍然更优选地，该植物属于选自以下各属的任一属：芭蕉属(Musa)、草莓属(Fragaria)、苹果属(Malus)、李属(Prunus)、梨属(Pyrus)、越橘属(Vaccinium)、猕猴桃属(Actinidia)、香瓜属(Cucumis)、番木瓜属(Carica)以及鳄梨属(Persea)；还更优选地，该植物是以下任一种：香蕉、草莓、苹果、梅、梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜果以及鳄梨。最优选地，该醇酰基转移酶衍生自水果来源，例如：苹果、甜瓜或番茄来源，合适地为苹果来源。
可以使用其中存在着醇酰基转移酶的生物组织或其加工产品，例如：水果、叶子、花瓣、茎、种子、水果皮、果肉等。可选择地，可以使用提取自这些生物组织的粗酶液，也可以使用纯化酶或者类似物。可选择地，可将用于醇酰基转移酶的基因分离出来，导入宿主微生物中，以在其中表达。
醇酰基转移酶用于将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸酯的用途在专利文献WO2014/038214中有完整描述，在此将该文件的公开内容通过引用并入本文，特别是其中有关醇酰基转移酶基因及其序列、以及包括所述序列的质粒载体的内容。
进一步方法步骤
非必要性地，本发明第一方面或第二方面的方法可进一步包括步骤(c)，该步骤(c)为将步骤(b)中所得到的任何甲基丙烯酸转化为甲基丙烯酸酯。
优选地，所述甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸烷基酯，更优选的是甲基丙烯酸低级烷基(C1-C20)酯，又更优选的是甲基丙烯酸(C1-C12)烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。最优选地，该甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸丁酯。
步骤(c)中形成的甲基丙烯酸酯可以生物地或者化学地形成，优选它们是生物地形成。
非必要性地，步骤(c)可以通过与合适的醇进行酯化反应而化学地实施。酯化反应的反应条件可以有很大不同。在室温下反应进行得很慢，但在升高的温度下反应会进行得相当迅速。一般使其中一种反应物按化学计量比过量，以驱动反应。另一种反应物称为限量试剂。大约99％的限量试剂(例如：酸、醇、多元醇)可以在几小时内转化为酯。限量试剂通常是非过量存在的试剂，例如，在制备多元醇酯中使用的限量试剂是多元醇。
因为，醇和有机酸的的酯化反应是可逆反应，该酯化反应通常反应不完全。然而，通过移除至少一种酯化反应产物(通常为水)，可以实现超过99％的转化。如果其中一种产物比另一种产物以及反应物的沸点更低，该移除通常通过蒸馏来实现。现有技术中已知有多种蒸馏技术可以从反应区移除产生的水。一种移除水的方法包括：在液体介质中进行反应，该液体介质可以形成共沸物，该共沸物的沸点低于该反应的任一种成分或每一种成分的沸点。如果该反应物和所得到的酯在大气压下具有大于100℃的沸点，则可以简单地调节反应温度以移除水，而不需要能够与水形成共沸物的液体介质。另外，可以使用共沸剂来帮助从反应混合物中蒸馏出水。在酯的制备过程中可以使用惰性材料(例如：环己烷、己烷、苯、甲苯或二甲苯)作为共沸剂。另外，可以采用具有较低沸点的反应物作为共沸剂。在后一种情形中，作为共沸剂的这种反应物作为共沸剂通常以超过化学计量比的量加入反应混合物中。酯化过程(包括那些移除水的过程)可以以分批或连续操作的模式进行。在Kirk-Othmer化学技术百科全书第四版(1994)第9卷pp.762-768中揭示了各种酯化过程，其全部内容特以此引用的方式并入本文。
传统的分批酯化反应方法包括在反应循环开始时将所有的反应物加入反应器中。在催化酯化反应方法中，该催化剂通常是在该批次达到目标温度后加入反应混合物中。该反应混合物可以再进一步加热。反应混合物的温度上升直到达到反应混合物的沸点，在该沸点加入共沸剂(如果有使用的话)，将副产物水从反应混合物中蒸出。通常，塔顶蒸汽凝结，水从共沸剂中分离，且该共沸剂再循环回反应容器。该反应温度(从而其反应速率)受反应混合物的沸点的限制。当将具有较低沸点的反应物作为共沸剂使用时，随着反应的进行，其浓度逐渐降低。而且反应物的浓度在反应过程中降低，也会对反应速率造成负面影响。因此，无论是否加入共沸剂，反应温度(从而反应速率常数)均会随着反应的进行而上升，特别是若在反应过程中持续进行热输入的话。
优选地，步骤(c)在属于EC群组编号3.1.X.X的、作用于相关酯键的酯酶或水解酶的作用下生物地实施。更优选地，该酶是属于EC群组编号3.1.1.X、且涉及酯键切除和形成的催化作用的水解酶类中的酶。最近有一篇有关微生物酯酶的综述文章：Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci(2013)2(7):135-146.。
优选地，该方法进一步包括生产异丁酰辅酶A的一个或多个步骤，更优选地，包括从2-酮异戊酸和/或异丁酸生产异丁酰辅酶A的步骤。
在一个实施例中，该方法进一步包括从2-酮异戊酸生产异丁酰辅酶A的一个或多个步骤，该一个或多个步骤为如下任一步骤：
优选地，该方法进一步包括将2-酮异戊酸转化为异丁酰辅酶A的步骤。更优选地，2-酮异戊酸通过支链酮酸脱氢酶复合物(包括α亚基单元、硫辛酰胺酰基转移酶组分、硫辛酰胺脱氢酶组分)转化为异丁酰辅酶A。更优选地，该脱氢酶选自以下任一种酶：来自恶臭假单胞菌的支链酮酸脱氢酶(BCKD)、来自枯草芽胞杆菌的BCKD、来自铜绿假单胞菌的BCKD、来自拟南芥的BCKD、来自天蓝色链霉菌的BCKD以及来自嗜热栖热菌的BCKD。
可选择地，可以通过氧化还原酶(合适地属于EC群组编号1.X.X.X)将2-酮异戊酸催化转化为异丁酰辅酶A，优选地，该氧化还原酶是作用在供体的醛基或氧代基团上的氧化还原酶(合适地属于EC群组编号1.2.X.X)，更优选地，该氧化还原酶是使用铁-硫蛋白作为电子受体的、作用在供体的醛基或氧代基团上的氧化还原酶(属于EC群组编号1.2.7.X)，最优选地，该氧化还原酶为2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶(也称为酮缬氨酸铁氧还蛋白氧化还原酶)(合适地属于EC群组编号1.2.7.7)，它是由α、β、γ、δ亚基组成的四聚体。这种酶的例子有：来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosis)的2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶，来自火球菌属(Pyrococcus sp)物种的2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶；来自热球菌属(Thermococcus sp)物种的2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶，来自Thermococcus litoralis的2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶，来自Thermococcus profundus的2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶，以及来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的2-酮异戊酸铁氧还蛋白还原酶。
在第二实施例中，该方法进一步包括生产异丁酰辅酶A的一个或多个另外的步骤。该一个或多个另外的步骤选自以下任一步骤：
优选地，该方法进一步包括将异丁酸转化为异丁酰辅酶A的步骤。
非必要性地，异丁酸在连接酶(合适地属于EC群组编号6.X.X.X)的作用下转化为异丁酰辅酶A，优选地，该连接酶是属于EC群组编号6.2.X.X的碳-硫键形成性连接酶；更优选地，该连接酶是属于EC群组编号6.2.1.X的酸-硫醇形成性连接酶；更优选地，该连接酶是GDP形成性、ADP形成性或者AMP形成性连接酶，例如：合适地属于EC群组编号6.2.1.1的AMP形成性乙酸乙酯辅酶A连接酶、合适地属于EC群组编号6.2.1.2的丁酸辅酶A连接酶、合适地属于EC群组编号6.2.1.10的羧酸辅酶A连接酶、合适地属于EC群组编号6.2.1.13的ADP形成性乙酸酯辅酶A连接酶、合适地属于EC群组编号6.2.1.17的丙酸辅酶A连接酶或合适地属于EC群组编号6.2.1.-的酸-醇连接酶。最优选地，该连接酶选自以下任一种酶：来自铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas chlororaphis)的AcsA、来自拟青酶(Paecilomyces variot)的丁酰辅酶A合成酶、来自牛心脏线粒体的丁酰辅酶A合成酶。
在第三实施例中，该方法进一步包括从异丁酸酯生产异丁酰辅酶A的一个或多个另外的步骤。该一个或多个另外的步骤选自以下任一步骤：
优选地，该方法进一步包括将异丁酸酯转化为异丁酰基磷酸酯的步骤，以及将异丁酰基磷酸酯转化为异丁酰辅酶A的步骤。
优选地，通过激酶将异丁酸酯转化为异丁酰基磷酸酯，该激酶合适地属于EC群组编号2.X.X.X，优选属于EC群组编号2.7.X.X，更优选地属于EC群组编号2.7.2.X；最优选地，该激酶为合适地属于EC群组编号2.7.2.1的乙酸酯激酶、属于群组编号2.7.2.6的甲酰激酶、属于群组编号2.7.2.7的丁酸酯激酶、属于群组编号2.7.2.14的支链脂肪酸激酶或属于群组编号2.7.2.15的丙酸酯激酶。最优选地，该激酶选自以下任一种酶：来自螺旋体(Spirochete)MA-2的支链脂肪酸激酶，来自丁酸梭菌(C.butyricum)的丁酸激酶。
优选为在属于EC群组编号2.X.X.X的转移酶的作用下，更优选为在属于EC群组编号2.3.X.X的酰基转移酶的作用下，再更优选为在属于EC群组编号2.3.1.X的、转移除胺基-酰基以外的基团的酰基转移酶的作用下，将异丁酰基磷酸酯转化为异丁酰辅酶A。又更优选地，该转移酶为分别属于EC群组编号2.3.1.8以及群组编号2.3.1.19的磷酸酯乙酰基转移酶或磷酸酯丁酰基转移酶。更优选地，该转移酶是来自丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824的磷酸酯丁酰基转移酶，或来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、海栖热胞杆菌(Thermotoga maritima)以及梭菌属的磷酸酯乙酰基转移酶。这些酶的另外的来源包括：其他厌氧菌，特别是梭菌属物种，例如巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)。
最优选地，该方法进一步包括在合成酶的作用下从异丁酸生产异丁酰辅酶A，该合成酶优选异丁酰辅酶A合成酶，最优选为来自铜绿假单胞菌(P.chloraphis)B23的异丁酰辅酶A合成酶(AcsA)。
可选择地，上述关于第一和/或第二和/或第三实施例的描述中提及的所述另外的步骤中的任何步骤均可以组合。
微生物
上述方法中的酶可以包含在一种或多种微生物中，或者在没有微生物的条件下存在，例如：以无细胞提取物或纯化酶的形式存在于反应容器中或被保持在色谱柱上。
优选地，该方法的生物转化在一个或多个宿主微生物中实施。更优选的是执行生物转化的一种或多种酶包含在一种或多种微生物内。
优选地，一种或多种微生物表达一种或多种催化相关步骤所必须的酶。更优选地，该相关步骤以及任何进一步的酶催化步骤在一种或多种微生物活体内实施。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于根据第一、第二或第三方面的任一方法生产甲基丙烯酸和/或其衍生物的微生物。
一种或多种微生物可以天然地表达一种或多种酶，或者被基因工程化以表达该一种或多种酶，或可以表达野生型或经基因工程的酶二者的组合。该基因工程生物体可以描述为重组微生物。
一个或多个生物体可以内源地或异源地表达一种或多种酶，或内源的和异源的酶的组合。
在本发明的上下文中，术语“重组生物体”(Recombinant Organism)是指经基因修饰或工程化的生物体，其包含被人工构建并***至生物内的遗传物质。该遗传物质可以包括内源性或异源性的核苷酸，可以对该内源性或异源性的核苷酸进行进一步的基因修饰，也可以不对该内源性或异源性的核苷酸进行进一步的基因修饰。
在本发明的上下文中，术语“内源性”是指源自相同物种的生物体。
在本发明的上下文中，术语“异源性”是指源自不同物种的生物体。
在本发明的上下文中，术语“适于”(adapted)当针对微生物使用时，是指：如以上所定义的经过基因修饰或基因工程化的生物体，或者生物体的突变株，已基于其能够自然地表达所述一种或多种酶而被选中。
如上所述的经过基因工程化或基因修饰的、在上述任一种方法中使用的微生物可以选自天然产生的野生型或非天然产生的重组微生物，例如：细菌、古细菌、酵母、真菌、藻类或能够应用于发酵过程的各种其他微生物中的任一种。
因此，根据本发明的第五方面，提供一种重组微生物，其应用于生产甲基丙烯酸的方法中，该微生物适于进行以下步骤：
(a)通过表达氧化酶将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；
(b)将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸，其中，该重组微生物为大肠杆菌。
根据本发明的第六个方面，提供一种微生物，其应用于生产甲基丙烯酸的方法中，该微生物被一种或多种异源核苷酸修饰来执行以下步骤：
(a)通过表达氧化酶将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；
(b)将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸。
根据本发明的第七方面，提供一种适于执行以下步骤的微生物：
(a)通过表达氧化酶将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；
(b)将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸和/或其衍生物。
根据本发明的第八方面，提供一种适于执行以下步骤的微生物：
(a)将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；
(b)通过表达硫酯酶(合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(4HBT))、转移酶、合成酶和/或磷酸转酰酶以及短链脂肪酸激酶，将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸。
根据本发明进一步的方面，提供一种微生物，该微生物适于通过表达硫酯酶(合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(4HBT))、转移酶、合成酶和/或磷酸转酰酶以及短链脂肪酸激酶，将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸。
根据本发明又进一步的方面，提供一种微生物，该微生物被一种或多种重组核苷酸修饰，该一种或多种重组核苷酸编码能够将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸的一种或多种酶。
根据本发明又进一步的方面，提供一种微生物，该微生物被一种或多种重组核苷酸修饰，该一种或多种重组核苷酸编码能够将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸酯的一种或多种酶。
根据本发明又进一步的方面，提供了一种生产甲基丙烯酸的方法，该方法使用根据该进一步
的方面的一种或多种酶。
根据本发明又进一步的方面，提供了一种生产甲基丙烯酸酯的方法，该方法使用根据该进一步的方面的一种或多种酶。
所述第一、第二或第三方面的方法的进一步优选特征可以与上述定义的第四、第五、第六、第七、第八或进一步的方面的微生物任意组合。
在一个实施例中，该微生物至少表达以下酶：
(a)(i)酰基辅酶A氧化酶；和/或
(ii)辅酶A脱氢酶，以及非必要性地，以下各项中的一种或多种：
(b)(i)酰基辅酶A硫酯酶，合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(4HBT)；和/或
(ii)酰基辅酶A转移酶；和/或
(iii)酰基辅酶A合成酶；和/或
(iv)磷酸转酰酶和短链脂肪酸激酶；和非必要性地
(v)醇酰基转移酶。
在一个实施例中，该微生物至少表达以下酶：
(a)(i)酰基辅酶A氧化酶；以及非必要性地，以下各项中的一种或多种：
(b)(i)酰基辅酶A硫酯酶；和/或
(ii)酰基辅酶A转移酶；和/或
(iii)酰基辅酶A合成酶；和/或
(iv)磷酸转酰酶和短链脂肪酸激酶；和非必要性地
(v)醇酰基转移酶。
在本发明的第四、第五或第八方面的一个实施例中，该微生物至少表达以下酶：
(a)(i)酰基辅酶A硫酯酶，合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A硫酯酶(4HBT)；和/或
(ii)酰基辅酶A转移酶；和/或
(iii)酰基辅酶A合成酶；和/或
(iv)磷酸转酰酶和短链脂肪酸激酶；以及非必要性地，以下各项中的一种或多种：
(b)(i)酰基辅酶A氧化酶；和/或
(ii)酰基辅酶A脱氢酶；以及进一步非必要性地
(c)(i)醇酰基转移酶。
优选地，当存在时，所述辅酶A脱氢酶伴随着互补的电子传递***。
在一个优选地实施例中，该微生物表达以下酶中的至少一种：
(a)酰基辅酶A氧化酶，例如ACX4，和
(b)酰基辅酶A硫酯酶，例如：4HBT。
在一个更优选的实施例中，该微生物至少表达以下酶中的一种：
(a)ACX4，合适地为源自拟南芥的ACX4；以及
(b)4HBT，合适地为源自节杆菌属物种的4HBT。
在一个些实施例中，所述微生物适于执行以下步骤：
(a)通过表达酰基辅酶A氧化酶，将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；和
(b)通过表达醇酰基转移酶，将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为的甲基丙烯酸C1-C20烷基酯，合适地为甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，例如：甲基丙烯酸C1-C4烷基酯或甲基丙烯酸C4-C12烷基酯。
优选地，所述甲基丙烯酸酯是甲基丙烯酸C1-C20烷基酯，更优选地，是甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，又更优选地，是甲基丙烯酸C1-C4烷基酯或者甲基丙烯酸C4-C12烷基酯，最优选地是甲基丙烯酸丁酯。
在一些实施例中，该微生物是大肠杆菌，和/或酰基辅酶A氧化酶是来自拟南芥的ACX4，和/或醇酰基转移酶是来自本文所列的植物来源(如：诸如苹果的水果)，和/或该微生物是重组微生物。优选地，该微生物可以是大肠杆菌，酰基辅酶A氧化酶可以是来自拟南芥的ACX4，醇酰基转移酶可以来自苹果、甜瓜或番茄来源，以及该微生物可以是重组微生物。
优选地，该微生物表达所述优选的实施例或一些实施例中的酶(a)和酶(b)二者。
优选地，该微生物进一步表达以下一种或多种酶：支链酮酸脱氢酶或ADP形成性、GDP形成性或AMP形成性酰基辅酶A合成酶/合酶/连接酶，或者短链脂肪酸激酶以及磷酸转酰酶。
更优选地，该微生物更进一步表达以下一种或多种酶：2-酮异戊酸酯脱氢酶，异丁酸酯辅酶A连接酶，ADP形成性、GDP形成性或AMP形成性酰基辅酶A合成酶/合酶/连接酶，或者短链脂肪酸激酶与磷酸转酰酶。
最优选地，该微生物进一步表达异丁酰辅酶A合成酶，特别是来自假单胞菌(尤其是假单胞菌B23)的AcsA。
关于本发明的第四、第六、第七、第八方面以及进一步的方面，优选微生物宿主为细菌，合适的细菌实施例包括：属于艾希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等的变形菌门的肠杆菌，属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)的所谓的棒状杆菌，以及属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、甲烷球菌属(Methanococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮根瘤菌属(Axorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、边虫属(Anaplasma)、类杆菌属(Bacteroides)、巴尔通体属(Bartonella)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、芽孢梭菌属(Clostridium)、柯克斯菌属(Coxiella)、艾里希氏体菌属(Ehrlichia)、肠球菌属(Enterococcus)、弗朗西斯杆菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Kelbsiella)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、细球菌属(Micrococcus)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、蛋白胨链球菌属(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、立克次氏体菌属(Rickettsia)、罗克利马氏体菌属(Rochalimaea)、罗思氏菌属(Rothia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、耶尔森菌属(Yersinia)等的细菌。
细菌实施例包括选自以下的物种：大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、产琥玻酸厌氧螺杆菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥玻酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥玻酸曼氏菌(Mannheimiasucciniciproducens)、根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)以及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
关于本发明的第四、第六、第七、第八方面以及更进一步的方面，优选该细菌为大肠杆菌。
酵母菌或真菌的实施例包括那些属于酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、隐球菌属(Crytpococcus)等。示例性酵母菌或真菌物种包含选自以下所述：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces marxianus,)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)等的酵母菌或真菌。
本发明的第四、第六、第七、第八方面或者进一步的方面中的任一方面的一种或多种微生物可以被基因修饰，以提高或降低上述天然存在的或基因工程化的酶的活性。
优选地，该微生物被基因工程化以增进甲基丙烯酸及其衍生物的产生。
增加甲基丙烯酸和/或其衍生物的产量可以包括通过采用本领域已知的各种基因工程技术，来对现存的细胞内代谢过程、核酸和/或蛋白质进行修饰。增加甲基丙烯酸和/或其衍生物的产量可以包括修饰微生物，以在微生物中表达一种或多种异源基因。这些可以包括编码从碳基原料(例如本文列举的)到甲基丙烯酸的酶的基因，或可以包括直接或间接地促进该途径中的酶的功能或表达的其他辅助基因，以下详细描述。
因此，可以修改微生物，以表达一种或多种用于产生甲基丙烯酸和/或其衍生物的基因，以及优选地，进一步修饰该微生物，以增加甲基丙烯酸和/或其衍生物的产量。
一种或多种基因可以在微生物内表达的基因被修饰来产生甲基丙烯酸和/或其衍生物，所述基因包括编码以下任一酶的基因：来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ACX4、来自烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)的短链酰基辅酶A氧化酶，来自绿豆(Vignaradiata)的过氧化酰基辅酶A氧化酶、来自热带假丝酵母(Candida tropicalis)的酰基辅酶A氧化酶4、来自假丝酵母物种(Candida sp)的酰基辅酶A氧化酶以及具有广泛底物范围的相关氧化酶、来自节杆菌物种(Arthrobacter sp)的4-羟基苯酰基辅酶A硫酯酶、来自大肠杆菌的(Escherichia coli)YciA、来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的YciA、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的TesA、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的TesB、来自节杆菌(Arthrobacter globiformis)的4HBT、来自假单胞菌物种(Pseudomonassp.)株系CBS-3的4HBT、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的EntH、来自梭菌属(Clostridium)物种SB4的丁酰辅酶A乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自斯氏梭菌(Clostridiumsticklandii)的丁酰辅酶A乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824的丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶、来自大肠杆菌的乙酸辅酶A转移酶ydiF、来自丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824的磷酸转丁酰酶、来自螺旋体(Spirochete)MA-2的支链脂肪酸激酶、来自海栖热胞菌(Thermotoga maritima)的丁酸酯激酶、来自丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的丁酸激酶、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的支链酰基辅酶A脱氢酶、来自智人(Homo sapiens)的异丁酰辅酶A脱氢酶、来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的异戊酰辅酶A脱氢酶、来自智人(H.sapiens)的电子传递黄素蛋白、来自猪(Sus scrofa)的电子传递黄素蛋白、来自拟南芥的电子传递黄素蛋白、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的电子传递黄素蛋白、来自脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的电子传递黄素蛋白、来自智人的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶、来自猪的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶、来自恶臭假单胞菌的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶、来自拟南芥的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶、来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶。
一种或多种基因可以在微生物内表达，从而被修饰来增加甲基丙烯酸和/或其衍生物的产量，所述基因包括编码以下任一酶的基因：来自绿菌素单胞杆菌(Pseudomonaschlororaphis)的AcsA、来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的bkdA1,bkdA2,bkdB和lpdV、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的bkdA1,bkdA2,bkdB和lpdV、来自枯草芽孢杆菌的alsS、来自大肠杆菌的ilvD、来自大肠杆菌的ilvC、来自大肠杆菌的ilvB、来自大肠杆菌的ilvN、来自大肠杆菌的ilvI、来自大肠杆菌的ilvG、来自大肠杆菌的ilvM、来自大肠杆菌的ilvH、来自具有G14D和S17F突变的大肠杆菌的ilvH、携有S34G、L48E以及R49F突变的来自谷氨酸棒状杆菌R的ilvC、来自棒状杆菌(Corynebacterium)R的ilvB和ilvN、来自携有G156E突变的来自棒杆菌R的ilvN、以及来自其他生物体的同源物，其带有如上所述类似的突变，来缓解酶的反馈抑制并在适当时改变辅因子的依赖性。
本发明可以进一步包括降低或消除酶活性的修饰，该酶通过在上述提到的生物合成途径中，竞争相同的底物和/或中间体，来催化除甲基丙烯酸及其衍生物以外的化合物的合成。该酶的例子包括：来自大肠杆菌的YciA,TesA,TesB，以及那些在大肠杆菌中由fadB,ilvA,panB,leuA,ygaZ,ygaH,aceF,aceE,lpdA,tpiA,pfkA,pfkB,mdh,poxB,ilvE,ldhA以及lldD编码的酶，以及如本文所述的在其他宿主菌株中的同源物。
本发明可以进一步包括降低或消除酶的活性的修饰，该酶在上述所述的生物途径中，代谢甲基丙烯酸及其衍生物或代谢中间体。与该代谢有关的酶的例子有：在大肠杆菌中天然缬氨酸降解途径的酶、或其他可以消耗工程化途径中的硫酯中间体的硫酯酶。
本发明可以进一步包括降低或消除参与其他细胞功能(移除上述所述的生物合成途径中的中间体)的蛋白质的活性的修饰。这种细胞功能的例子可以包括：诸如液泡存储(例如：酵母)、或能够存储代谢产物(例如：细菌微室)的其他胞内体、细菌周质的存储机制，或诸如能够输出代谢产物的跨膜泵或跨膜孔的运输机制。
编码蛋白质(特别是在根据本发明的微生物内表达的酶)的基因的核酸来源，可以包括如其中编码的基因产物能够催化相关反应的任何物种。该物种包括真核生物和原核生物，包括但不限于：细菌(包括古细菌和真细菌)以及真核生物(包括：酵母、植物、昆虫、动物和包括人类的哺乳动物)。该来源的物种的实施例包括：如大肠杆菌、智人、费氏丙酸杆菌属(Propionibacterium fredenreichii)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、副痢疾杆菌(Shigella flexneri)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、费氏耶氏菌(Yersinia frederiksenii)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、挪威大鼠(Rattus norvegicus)、隐形秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、醋酸钙不动杆菌型(Acinetobacter calcoaceticus)、贝利不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、不动杆菌物种(Acinetobacter sp)、克鲁维氏胞芽梭菌(Clostridium kluyveri)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、巴氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、Anaerotruncuscolihominis、Natranaerobius thermophilus、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、猪(Susscrofa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、Methylibium petroleiphilum、肉桂链霉菌(Streptomycescinnamonensis)、除虫链酶菌(Streptomyces avermitilis)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)、温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Clostridiumcochlearium、破伤风形梭状芽孢杆菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、富氧罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、小鼠(Mus musculus)、欧洲牛(Bos taurus)、核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、自氧黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、土曲酶(Aspergillus terreus)、念珠菌属(Candida)、Sulfolobus tokodaii、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)以及本文公开的或可以得到的作为相应基因的来源的其他物种的例子。应该强调的是，编码可以在本发明的微生物内表达的酶的一种或多种基因还包括编码所述酶的变体的基因，例如：突变酶(variant enzymes)，其包括在多肽序列中取代、删除、***或添加一种或多种胺基酸，并且所述多肽保留未经修饰的酶的活性。该突变酶还包括相比于未经修饰的酶和具有变构调节修饰的酶的酶活性降低的突变酶，例如来自具有G14D和S17F突变的大肠杆菌的ilvH、来自携有S34G、L48E和R49F突变的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的ilvC、来自棒杆菌R(Corynebacterium R)的ilvB和ilvN、和来自携有G156E突变的棒杆菌R的ilvN。
用于构建以及测试蛋白质在非天然存在的甲基丙烯酸产生的微生物中的表达的方法，可以采用本领域已知的重组技术和测试方法来进行。该方法被描述在例如：Sambrooket al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001)；和Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1999)中。
利用本领域公知的技术，将参与产生甲基丙烯酸及其衍生物或其形成中的中间体的途经的外源核苷酸序列，稳定地、瞬时地导入微生物细胞中，该本领域公知的技术包括但不限于：接合、电穿孔、化学转化、转导、转染以及超声转化。
转化方法的例子可以包括：用氯化钙处理受体微生物细胞，以增加DNA的渗透性，以及从处于生长阶段的细胞制备感受态细胞、然后进行DNA转化。可选择地，使DNA-受体细胞导入原生质体或原生质球(可以轻松地摄取重组DNA)，然后将重组DNA导入细胞中，该方法公知可以应用于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、放线菌、酵母菌。此外，微生物的转化也可以采用电穿孔。该方法在本领域是公知的。
对于在大肠杆菌或其他原核微生物细胞中的外源表达，在真核生物的核酸的基因或cDNAs的核苷酸序列可以编码导向信号，例如：N-终端线粒体或其他导向信号，如果需要，该信号可以在转化为原核微生物细胞之前除去。例如：线粒体的前导序列的移除，导致大肠杆菌中的表达增加(Hoffmeister et al.,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母菌或其他真核微生物细胞中的外源表达，基因可以在胞液中表达，无需添加前导序列，或者通过添加合适的导向序列(例如：对靶向细胞器合适的线粒体导向或分泌信号)导向线粒体或其他细胞器、或者靶向分泌物。因此，应当理解的是，可将对核苷酸序列合适的修饰(以移除或加入导向序列)，引入外源核苷酸序列，来赋予所需的性质。更进一步，可以使用本领域公知的技术对基因进行密码子优化，以实现微生物中的蛋白质的优化表达。
可以构建表达载体，以包含一种或多种编码本文例举的生物合成途径酶的核苷酸，其与微生物中表达调控序列可操作地连接。本发明中在微生物中可以使用的表达载体包括：质粒、粘粒、嗜菌体载体、病毒载体、附加体、人工染色体，人工染色体包括可选择地稳定***宿主染色体中的载体以及选择序列或标记物。
另外，该表达载体可以包括一种或多种可选择的标记基因，以及合适的表达调控序列。还可以包括可选择的标记基因：例如提供对抗生素或毒素抗性的抗性、补足营养缺失、或供应不在培养基中的关键营养物。表达调控序列可以包括：本领域公知的组成型、诱导型或抑制型启动子、转录增强子、转录终止子、翻译信号等。当共表达两种或多种外源核苷酸序列时，可将两种核苷酸序列都***诸如单独表达的载体中或分开表达的载体中。对于单个载体的表达，该编码核苷酸可选择地连接至一个相同表达调控序列，或连接至不同表达调控序列，例如：诱导型启动子以及组成型启动子。在一些实施例中，该载体可以具有用于共表达多种基因或操纵子的两个或更多启动子。在一些实施例中，该基因/操纵子可以表达在一个或多个具有一个或多个相应启动子的不同载体上。
用于转化的载体可以是一个在微生物细胞中自主复制的载体。可在肠科杆菌(诸如大肠杆菌)细菌内自主复制载体的例子包括：质粒载体pUC19,pUC18,pBR322,RSF1010,pHSG299,pHSG298,pHSG 399,pHSG398,pSTV28,pSTV29,pET20b(+),pET28b(+)(pETz载体可从Novagen获得)、pLysS,(pHSG和pSTV载体可从Takara Bio Inc.获得),pMW119,pMW118,pMW219,pMW218(pMW载体可从Nippon Gene Co.,Ltd.获得)等，以及他们的衍生物。另外，用于棒状杆菌细菌的载体可以包括pAM330(日本专利公开号58-67699),pHM1519(日本专利公开号58-77895),pSFK6(日本专利公开号2000-262288),pVK7(USP2003-0175912A),pAJ655,pAJ611,pAJ1844(日本专利公开号58-192900),pCG1(日本专利公开号57-134500),pCG2(日本专利公开号58-35197),pCG4,pCG11(日本专利公开号57-183799),pHK4(日本专利公开号5-7491)等。另外，用于酵母菌的载体可以包括酵母质粒，例如：用于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)pD902或pD905f，或者用于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的pD1201,pD1204,pD1205,pD1207,pD1211,pD1214pD1215,pD1217,pD1218,pD1221,pD1224,pD1225,pD1227,pD1231,pD1234,pD1235,pD1237。通过已知的方法(例如：Datensko andWanner(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L.2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645))可以将基因导入宿主染色体中。
增强酶的活性可以包括增加靶基因的表达，其通过用具有合适强度的启动子来取代靶基因的表达调控序列，例如基因组DNA或质粒上的启动子。例如：thr启动子,lac启动子,trp启动子,trc启动子,pL启动子,tac启动子等是公知的常用启动子。在微生物(如细菌)中，具有高表达活性的启动子的例子，可以包括延长因子Tu(EF-Tu)基因的启动子、tuf、编码辅助伴侣蛋白(co-chaperonin)GroES/EL、硫氧还原蛋白还原酶、磷酸甘油酸变位酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等的基因的启动子(WO2006/028063,EP1697525)。强启动子的例子以及评价该启动子的强度的方法在本领域是公知的。
此外，也可以取代基因的启动子区域的几个核苷酸，使得启动子具有合适的强度(如WO 2000/18935所公开)。表达调控序列的取代可以与诸如使用温度敏感性质粒的基因取代相同的方式来进行。可以用于大肠杆菌(Escherichia coli)或菠萝泛菌(Pantoeaananatis)的具有温度敏感复制起点的载体的例子可包括例如：WO 1999/03988国际公开中描述的质粒pMAN997及其衍生物等。另外，表达调控序列的取代还可以以线性DNA的方法来进行，该方法诸如使用λ-噬菌体的Red重组酶的称为“Red驱动性整合”的方法(Datsenko,K.A.and Wanner,B.L.2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645)，Red-驱动性整合方法和λ-噬菌体切除***结合的方法(Cho,E.H.et al.2002.J.Bacteriol.184:5200-5203)(WO2005/010175))等。该表达调控序列的修饰可以与增加基因拷贝数结合。
另外，众所周知，核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔物中的数个核苷酸的取代(特别是，紧贴起始密码子的上游的序列)，会深刻地影响mRNA的可翻译性。通过对这些序列的修饰可增强翻译。
当将靶基因引入上述的质粒或染色体中时，可以使用任何启动子来表达该基因，只要启动子在所挑选的该微生物中起作用。该启动子可以是该基因中的天然启动子，或者被修饰的启动子。基因的表达还可以通过适当地选择在所选微生物中具有强效功能的启动子，或者接近共有序列的启动子的大约-35和-10区域来控制。
涉及的代谢或合成途径的外源核苷酸序列的转化、转导、接合或染色体***可以使用本领域公知的方法来确认。这些方法包括诸如提取质粒或染色体DNA，然后特定靶序列的聚合酶链的扩增，或者限制酶切作图，进一步的核苷酸的分析方法，例如：Northern印记、或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增、或聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶活性测量、或对基因产物表达的免疫印迹法、或用于测试引入的核苷酸序列或其相关基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应该理解的是，外源核苷酸以足以产生产生所需的基因产物的量表达，且还需要理解的是，可以使用本领域众所周知的方法来优化表达水平，以得到足够的表达。
可选择地，可进一步修改本发明的任何上述方法所使用的第四、第五、第六、第七、第八方面或进一步的方面的一种或多种微生物，以降低或消除参与细胞功能的酶或蛋白质的活性：
(i)从甲基丙烯酸的生产途径转移原料；和/或
(ii)代谢甲基丙烯酸和/或其衍生物。
为了降低或消除上述酶或蛋白的活性，可以通过常规随机或定点突变或基因工程技术，将用于降低或消除酶或蛋白质的细胞内活性的突变引入上述酶或蛋白质的基因中。突变的例子可以包括：例如X射线或紫外线辐射、用突变剂(诸如N-甲基-N'-硝基-N-硝基亚硝基胍)处理、分别通过高保真度或易出错聚合酶链反应的体外定点或随机突变等。引入突变的基因的位点可以在编码酶或蛋白质的编码区，或者在表达控制区(例如启动子)。基因工程技术的例子可以包括：基因重组、转导、细胞融合、基因敲除等。
可以通过测试来自候选菌株的细胞提取物或经纯化的馏分中的酶或蛋白质的活性，并和野生型菌株进行比较，或者通过测量全细胞所形成的目标产物来确定目标酶或蛋白质的细胞内活性的降低或消除，以及其降低程度。
赋予或增强甲基丙烯酸和/或其衍生物的生产能力和/或其中间体的其他方法的例子可以包括：赋予对甲基丙烯酸或有机酸类似物、呼吸抑制剂等的抗性，以及赋予对细胞壁合成抑制因子以敏感性。这些方法可以包括：诸如通过与渐增浓度的毒性物质一起生长来挑选抗性细胞、赋予单氟代乙酸抗性、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性、减弱尿素酶、赋予丙二酸抗性、赋予对苯并吡喃酮或萘醌的抗性、赋予HOQNO抗性、赋予α-酮基丙二酸抗性、赋予胍抗性、赋予青霉素敏感性等所属领域已知的方法。
该抗性细菌的例子可以包括以下物种：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ3949 FERM BP-2632、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJ11628 FERM P-5736、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ11355 FERM P-5007、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJ11368 FERM P-5020、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)AJ11217 FERM P-4318、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJ11218FERM P-4319、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ11564 FERM P-5472、黄色短杆菌AJ11439 FERM P-5136、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)H7684FERM BP-3004、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11426 FERM P-5123；谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJ11440 FERM P-5137以及乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ11796 FERM P-6402。
赋予或增强甲基丙烯酸和/或其衍生物生产能力和/或其中间体的更进一步的方法可包括：赋予下调剂/抑制剂的抗性、给予对上调剂/激动剂以敏感性或降低通过其他化合物来对酶的变构激活的需要。例如：降低通过缬氨酸来对来自恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)的支链酮酸脱氢酶的变构激活的需要，或者降低来自大肠杆菌的乙酸乳酸合成酶的变构抑制。
发酵
因此，本发明上述所述的方法可以通过培养本发明的第四、第五、第六、第七、第八方面或更多方面的微生物来实施，该微生物在适当的培养基中，能够产生甲基丙烯酰辅酶A中间体和/或甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)。
因此，适当地，本发明的第一、第二或第三方面的方法可以进一步包括培养一种或多种微生物，以产生甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的步骤。
优选地，所述培养在发酵培养基中进行。
因此，根据本发明的第九方面，提供了一种发酵方法，该方法包括在发酵培养基中，培养第四、第五、第六、第七、第八或更多方面的微生物，以产生甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)。
该甲基丙烯酸和/或其衍生物可以存在于发酵培养基或在微生物的细胞内。
合适地，因此，本发明的第一、第二或第三方面的方法可以进一步包括以下步骤：从发酵培养基或从微生物细胞中收集甲基丙烯酸和/或在其形成中的中间体和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)。
该甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)可以通过如上所述的分泌甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的微生物存在于发酵培养基中。
该甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)可以通过如上所述的积累甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的微生物存在于微生物的细胞中。
因此，适当地，可以利用本领域任何公知的方法(例如：过滤、离心等)从发酵培养基中移除该细胞，且可以采用本领域任何公知的方法(例如：蒸馏、液-液萃取等)从发酵培养基收集甲基丙烯酸或其盐和/或甲基丙烯酸酯，。因此，适当地，本发明的方法可以进一步包括从周围培养基中收集甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的步骤，该步骤可以首先通过过滤或离心从培养基中移除细胞，然后通过蒸馏或液-液萃取，从澄清化的培养基中提取甲基丙烯酸和/或其衍生物来实施。可选择地，收集甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)可以进一步包括一步从细胞中释放甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的步骤，该步骤可以通过本领域所公知的任何方法来实施。优选地，该细胞被裂解(例如通过超声、均质化、酶处理、珠磨、渗透性冲击、冻-融、酸/碱处理、噬菌体溶解等)，以释放所需产物，然后通过与上述相同的收集方法，从发酵培养基中收集。因此，合适地，本发明的方法可以包括从细胞收集甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的进一步的步骤，该步骤可以通过裂解细胞，并接着过滤细胞碎片，然后提取甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)来实施。
合适地，微生物的培养或养殖需要碳基原料，微生物依赖该碳基原料得到能量并生长。优选地，该微生物在碳基原料中培养，且本发明的第一或第二方面的方法可以进一步包括从碳基原料中培养一种或多种可以产生甲基丙烯酸和/或其衍生物的微生物的步骤。
优选地，该培养或养殖在发酵培养基中进行，该培养基适当地为围绕该微生物的周围培养基，优选碳基原料存在于培养基中，可选择地，溶解或悬浮在培养基中，鼓泡通入培养基和/或与培养基混合。因此，优选地，该培养基包括：该微生物和碳基原料以及任何缓冲物和盐。
因此，根据本发明的第十方面，提供了一种发酵培养基，该发酵培养基包含第四、第五、第六、第七、第八方面或更多方面的一种或多种微生物。
优选地，该发酵培养基进一步包含甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)。
优选地，该微生物以高于基本速率的增加的速率产生甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)，因此，优选地，无论是来自直接分泌还是来自细胞裂解，培养基中存在的甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的浓度为高滴度。
优选地，在发酵培养基中，甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的滴度至少为5mg/L。例如：5,15,25,35,45,55,65,75,85,95,105,115,125,135,145,155mg/L。优选至少大于130mg/L。
优选地，在一个实施例中，甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)在微生物中积累，存在于细胞中的甲基丙烯酸和/或其中间体和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的浓度至少为0.05mM,更优选地，至少为0.1mM，更优选地，至少为1mM,更优选地，至少为2mM,更优选地，至少为5mM，更优选地，至少为10mM。优选地，甲基丙烯酸或其中间体和/或其衍生物(例如甲基丙烯酸酯)在细胞中的浓度为100mM到约300mM，更优选为约20mM到约200mM，又更优选地，为约30mM到约100mM，最优选地为约40mM到约70mM。
本发明的该微生物可以作为分批式、重复批式、分批补料式、重复分批补料式或连续培养的方法养殖或培养。
适当地，该培养方法在培养基(或者在本文中称为周围培养基或发酵培养基)中进行。优选地，采用分批补料式或重复分批补料式方法，其中碳源和/或氮源和/或其他化合物被补料入培养方法中。更优选地，碳基原料和/或氮源补料入培养方法中。
培养本发明的微生物的发酵培养基可以为能满足所讨论的生物体的需求的任何商业可获得的培养基，只需限定所述生物体所需要的营养物质。该培养基可以是需氧的或厌氧的，然而在采用氧化酶的本发明上下文中，该培养基优选需氧的。
该发酵培养基合适地含有如上所述的碳基原料和氮源，以及微生物的生长和/或甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的形成所需要的其他化合物。
本领域公知的合适的碳基原料的例子包括：葡糖糖、麦芽糖、麦芽糊精、蔗糖、水解淀粉、淀粉、木质素、芳香族物、合成气或者其组分、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、糖蜜及油。优选地，该碳基原料源自生物质。可以使用混合物，以及废弃物，例如：都市废弃物、食物废弃物、以及来自食品加工、林业或农业的木质纤维素废弃物。
本领域公知的合适的氮源的例子包括：大豆粉、玉米浸液、酵母萃取物、氨、铵盐、硝酸盐、尿素、氮气或其他含氮源。
微生物生长所需要的其他化合物的实施例包括：抗生素、抗真菌剂、抗氧化剂、缓冲剂、磷酸盐、硫酸盐、镁盐、微量元素及/或维生素。
加入培养基的碳基原料和氮源的总量可以根据微生物和/或培养方法的长度来变化。
在培养基中碳基原料和氮源的比例可以变化很大。
微生物的生长和/或甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的产生所需要的其他化合物，如磷酸酯、硫酸酯或微量元素，可以在不同微生物种类(例如：真菌、酵母以及细菌间)时，以变化的量添加。此外，可以根据甲基丙烯酸和/或其衍生物(诸如甲基丙烯酸酯)的形成与否，以及使用哪种途径来形成它们决定加入的其他化合物的量。
典型地，对微生物的生长所必要的发酵培养基的每种组分的量通过测量营养物质的生长率，并进一步评估培养方法中所使用的相关碳基原料的量来确定，因为形成的生物质的量将主要由所使用的碳基原料，以及在任何喂食方案期间所加上的营养物质的限制来确定。
根据本发明的培养或养殖方法优选以工业规模实施。工业规模方法应该理解包含在体积规模为0.01m3,优选地≥0.1m3,优选地≥0.5m3,优选地≥5m3,优选地≥10m3,更优选地≥25m3,更优选地≥50m3,更优选地≥100m3,最优选地≥200m3的一个或多个发酵罐中的培养或养殖方法。
优选地，本发明的微生物的培养或养殖通常在生物反应器中进行。“生物反应器”通常被理解为指工业上培养微生物的容器。生物反应器可以为任何尺寸、数目以及形式，且可以包括入口，该入口用于提供营养物、用于生长的其他物质、新鲜培养基、碳基原料、气体添加剂(例如但不限制于：空气、氮气、氧气或二氧化碳)。生物反应器可以包括出口，该出口用于移除大量培养基的出口，以从该发酵培养基本身或从该微生物中收集甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯。该生物反应器优选还具有一个用于培养基取样的出口。该生物反应器通常可以配置为例如通过通过搅拌、滚动、摇动、转动、对培养基鼓气等混合发酵培养基。可选择地，一些连续的培养不需要混合，例如使用柱塞流***的微反应***。生物反应器本领域中常见且众所周知的，可以在标准教科书中找到它的例子，诸如：生物技术：工业微生物教科书，第二版(1989)作者Wulf Cruegar和Annelise Crueger,翻译Thomas D.BrockSinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA。
因此，根据本发明的第十一个方面，提供了一种生物反应器，该生物反应器包含第四、第五、第六、第七、第八方面或更多方面的一种或多种微生物和/或第十方面的发酵培养基。
可选择地，该生物反应器可以包括本发明的多种不同的微生物。
优选地，该生物反应器仅包含能够实施本发明方法的微生物。
更优选地，该生物反应器仅包含相同物种的微生物，从而可以自始至终使用相同的培养条件。
生物质原料
优选地，所使用的该生物质包含高含量的碳水化合物，特别是C5或C6糖、碳基气体、或芳香族物质来源的碳水化合物，优选地为C5或C6糖，更优选的为葡萄糖，例如但不限于淀粉、木质素、纤维素、糖原、***木糖醇、壳多糖或果胶。
可选择地，所使用的该生物质包含高含量的脂肪，特别优选甘油和脂肪酸来源的脂肪或油，具体为甘油三酯。合适的甘油三酯包含可以从植物或动物来源得到的任意油或脂肪。该油或脂肪的例子包括：棕榈油、亚麻仁油、菜籽油、猪油、牛油、鲱鱼油、椰子油、蔬菜油、葵花油、蓖麻油、大豆油、橄榄油、可可脂、水牛酪油、鲸脂等。
该生物质可以由一种或多种不同的生物质来源组成。合适的生物质来源的例子如下：新鲜木料、能源作物、农业残余物、食物废弃物、都市废弃物以及工业废弃物或幅产物。
新鲜木料生物质来源可以包括，但不限于：木片、树皮、残枝、圆木、锯木屑、木丸或压块。
能源作物生物质来源可以包括，但不限于：短期轮作矮林或林业、非木质草、(诸如芒草、麻、柳枝枝稷、芦苇或黑麦)、农作物(诸如糖、淀粉或油料作物)、或水生植物(诸如微型或大型藻类与杂草)。
农业残留物可以包括，但不限于：果壳、稻草、玉米杆、面粉、谷物、家禽垃圾、粪肥、泥浆、合成气或青贮。
食物残留物可以包括，但不限于：蔬果皮、贝壳、果壳、果心、果核、动物或鱼的不可食用部分、来自果汁与油提取的果肉浆、来自酿酒的谷物渣或啤酒花、家庭厨房废弃物、猪油或油或脂肪。
工业废弃物可以包括(但不限于)：未经处理的木头，包括：木丸、处理后的木头、页岩气；组合木材，包含：MDF/OSD、木板、纸浆/碎纸/废纸；纺织品，包含纤维/纱/流出物；或下水污泥。
更进一步的产物
另外，可以设想其他有机化合物的产生，例如甲基丙烯酸的衍生物，诸如其各种酯。因此，甲基丙烯酸产物可以被酯化以产生其酯。潜在的酯可以选自：C1-C20烷基酯或C2-C12羟基烷基酯、缩水甘油酯、异冰片酯、二甲基氨基乙酯、三丙二醇酯。最优选地，用于形成酯的醇或烯烃可以衍生自生物原料，例如：生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇。优选的酯为甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸羟基甲基酯、甲基丙烯酸羟基丙基酯或甲基丙烯酸甲酯。最优选地为甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸丁酯。
优选地，甲基丙烯酸通过酯化反应转化为甲基丙烯酸烷基酯或甲基丙烯酸羟基烷基酯。对于该转化合适的反应条件是本领域所公知的，且与甲基丙烯酸的生产结合被描述于WO/2012/069813。
根据本发明的第十二方面提供了一种制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物的方法，包括以下步骤：
(i)根据本发明的第一、第二、第三方面或进一步的方面制备甲基丙烯酸和/或其衍生物；
(ii)可选择地对(i)中制备的甲基丙烯酸进行酯化，以生产甲基丙烯酸酯；
(iii)将(i)中制备的甲基丙烯酸和/或其衍生物和/或(若存在)(ii)中制备的酯可选择地与一种或多种共聚单体聚合，以产生其聚合物或共聚物。
步骤(i)可以包括根据上述第一、第二以及第三方面中所提到的任意进一步特征与该等第十二方面组合。
优选地，上述(ii)中的甲基丙烯酸酯选自：C1-C20烷基酯或C2-C12羟基烷基酯、缩水甘油酯、异冰片酯、二甲基氨基乙酯、三丙二醇酯。更优选地，为甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸羟基甲基酯、甲基丙烯酸羟基丙基酯或甲基丙烯酸甲酯。最优选地为甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸丁酯。
因此，根据本发明的进一步的方面，提供了一种制备甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物的方法，包括以下步骤：
(i)根据本发明的第三方面或更进一步发方面制备甲基丙烯酸酯；
(ii)将(i)中制备的甲基丙烯酸和/或其衍生物可选择地与一种或多种共聚单体聚合，以产生其聚合物或共聚物。
步骤(i)可以包括根据上述第三方面中所提到的任意进一步特征与该等第十二方面组合。
有利地，如果并非所有的单体残留物衍生自除化石燃料以外的来源，那么该聚合物具有相当可观的部分。
在任何情况下，优选的共聚单体包括：单乙烯属不饱和羧酸以及二羧酸及其衍生物，例如：酯、酰胺以及酸酐。
具体地，优选的共聚单体为：丙烯酸、丙烯酸甲基、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羟基乙基酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟基丙酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯、二丙烯酸三丙醇酯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、异氰酸酯(包含甲苯二异氰酸酯和p-p'-亚甲基二苯基二异氰酸酯)、丙烯腈、丁二烯、丁二烯与苯乙烯(MBS)和ABS，根据上述任何共聚单体(并非是选自上述(i)或(ii)中的甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯)，在所述(i)中所述酸单体或酯或者(ii)中所述酯单体和一种或多种该共聚单体的任何给定共聚化中。
当然可以使用不同共聚单体的混合物。该共聚单体自身可根据也可以不根据来自上述(i)或(ii)中的单体相同的方法制备。
根据本发明的第十二方面，提供了一种从本发明的第十一方面的方法形成的聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚甲基丙烯酸丁酯的均聚物或共聚物。
附图说明
现在参考以下非限制性的例子和附图，说明本发明，其中：
图1展示了以甲基丙烯酰辅酶A作为底物，来自节杆菌属物种(Arthrobacter sp)SU的羧基端六组氨酸标记的4-羟基苯甲酰辅酶A硫酯酶(75μg.ml-1)的动力学特征的Lineweaver-Burke图。
图2展示了以异丁酰辅酶A作为底物，来自节杆菌属物种SU的羧基端六组氨酸标记的4-羟基苯甲酰辅酶A硫酯酶(1mg.ml-1)的动力学特征的Lineweaver-Burke图。
图3展示了利用HPLC法得到的标准品异丁酰辅酶A(主尖峰位于32.2min，且次要尖峰位于32.9min)、甲基丙烯酰辅酶A(主尖峰位于30.8min，且次要尖峰位于31.6min)、甲基丙烯酸(主尖峰位于13.5min)及辅酶A(主尖峰位于11min，且次要尖峰位于12min)的重叠HPLC曲线，以确定来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的短链酰基辅酶A氧化酶(ACX4)将异丁酰辅酶A氧化为甲基丙烯酰辅酶A的体外活性。黄素腺嘌呤二核苷酸在27.8min洗脱，其用作异丁酰辅酶A和甲基丙烯酰辅酶A的内标。
图4展示了测试混合物的HPLC曲线，该混合物包含ACX4无细胞提取物，置于HEPES测试缓冲液中的经纯化的羧基端六组氨酸标记的4HBT和黄素腺嘌呤二核苷酸，未加底物，作为阴性对照。
图5展示了将ACX4的无细胞提取物和异丁烯酰辅酶A在含有黄素腺嘌呤二核苷酸的HEPES试验缓冲液中孵育30分钟后，测试混合物的HPLC分析图。
图6展示了将ACX4的无细胞提取物和异丁烯酰辅酶A在含有黄素腺嘌呤二核苷酸的HEPES试验缓冲液中孵育30分钟后，测试混合物的HPLC分析图，其中在反应混合物酸化停止反应后向该缓冲溶液中添加另外的异丁酰辅酶A。
图7展示了通过ACX4无细胞提取物和经纯化的羧基端His标记的4HBT，将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酸和甲基丙烯酸辅酶A的酶偶联反应的HPLC分析图。
图8展示了pET20b(+)::4HBT-ACX-AcsA质粒，pET20b(+)质粒包含受单一的T7启动子的控制的4HBT基因、ACX4基因和AcsA基因。
图9展示了通过大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA共表达4HBT,ACX4和AcsA的SDS-PAGE分析。
图10展示了用于分析在诱导后20.5小时，异丁酸向甲基丙烯酸的生物转化的HPLC曲线和所有相关对照，其中图10A展示了未加入异丁酸的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA的培养物的曲线；图10B展示了未加入异丁酸的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)培养物的曲线；图10C展示了5mM异丁酸标准品的HPLC曲线；图10D展示了大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)的培养物的HPLC曲线，该培养物在诱导重组蛋白表达1h后补入异丁酸(5mM)；图10E展示了异丁酸(5mM)和甲基丙烯酸(200μM)标准品的混合物的HPLC曲线；图10F展示了大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA培养物的HPLC曲线，其中诱导重组蛋白表达1h后加入异丁酸(5mM)。
图11展示了补充有异丁酸的大肠杆菌中BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA培养物中甲基丙烯酸的浓度随时间的变化(底部的线)，以及由于异丁酸加入该培养物，该培养物的ln(OD600)曲线随时间的变化(顶部的线)。
图12展示了pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD质粒，其中pET20b(+)质粒具有编码来自节杆菌属物种菌株SU的HBT、来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ACX4以及来自恶臭假单胞菌KT2440的bkdA1,bkdA2,bkdB和lpdV基因(所有皆在单一的T7启动子的控制下)的经密码子优化的基因的。
图13展示了2-酮异戊酸(5mM)、异丁酸(5mM)及甲基丙烯酸(200μM)标准品的混合物的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mM KH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速。
图14展示了大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)阴性对照菌株的培养物的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离组分，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mM KH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速。
图15展示了大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD的培养物的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离组分，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mMKH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速，证明了自葡萄糖的甲基丙烯酸的产生。
图16展示了加入另外的0.24mM纯甲基丙烯酸的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD的培养物的样本的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离组分，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mM KH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速。
图17展示了补充有2-酮异戊酸的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)阴性对照菌株的培养物的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离组分，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mM KH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速。
图18展示了补充有2-酮异戊酸(5mM)的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD的培养物的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离组分，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mM KH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速，证明了以2-酮异戊酸补充培养物会显著提高藉由此菌株的甲基丙烯酸的产量。
图19展示了掺入另外的0.24mM纯甲基丙烯酸的补充有2-酮异戊酸(5mM)的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD的培养物的HPLC分析，其中通过等度洗脱分离组分，该洗脱是使用在以HCl酸化至pH2.5的50mM KH2PO4中的14％乙腈，以1ml.min-1的流速。
图20展示了质粒pMMA121的结构，其用于在大肠杆菌中的拟南芥ACX4蛋白质的表达。
图21展示了使用实施例5的重组大肠杆菌产生拟南芥ACX4蛋白质的自异丁酰辅酶A的甲基丙烯酰辅酶A的生产。
图22展示了含有拟南芥ACX4蛋白质的实施例5的重组大肠杆菌的馏分的SDS-PAGE分析。
图23展示了质粒pWA008、pMMA133和pMMA134的结构，其用于在重组大肠杆菌中的苹果AAT(MpAAT1)、来自拟南芥属的ACX4、来自铜绿假单胞菌PA01菌株的bkdA1,bkdA2,bkdB和lpdV:BCKAD复合基因的表达。
图24展示了通过重组大肠杆菌产生的表达质粒pMMA134的培养物的样本的HPLC分析的来自2-酮异戊酸与丁醇的甲基丙烯酸丁酯的生产。
具体实施方式
参照下述实施例(非限制性)和图对本发明进行阐述。
实施例1：甲基丙烯酸辅酶A的选择性水解；
实施例2：在酶偶联反应中，异丁酰辅酶A向甲基丙烯酰辅酶A的氧化，以及异丁酰辅酶A向甲基丙烯酸和辅酶A的体外转化。
实施例3：异丁酸向甲基丙烯酸的全部细胞生物转化。
实施例4：通过2-酮异戊酸中间体，从葡萄糖到甲基丙烯酸的全细胞生产。
实施例5：通过重组大肠杆菌从2-酮戊酸到甲基丙烯酸丁酯的全细胞生产。
1.1实施例1-4的材料
列举了实施例1-4所使用的细菌菌株，以及整个实验所使用的生长培养基、琼脂平板。引物的表格列出了本研究中所使用的所有引物，以及质粒表格列出了本研究所使用和构建的所有质粒。
1.1.1细菌菌株
使用大肠杆菌JM107作为质粒克隆宿主，同时大肠杆菌BL21(DE3)pLysS作为基因表达宿主。
1.1.2细菌生长培养基和营养琼脂平板
1.1.2.1 Luria Bertani肉汤(LB培养基)
凡是提到LB培养基都指的是Luria Bertani高盐培养基(Melfold)(25g.L-1)，其中在1L中25g高盐培养基由来自酪蛋白消化的蛋白胨(10g.L-1)、酵母提取物(5g.L-1)、氯化钠(10g.L-1)组成。LB培养基通常补充有羧苄青霉素(50μg.ml-1)、氯霉素(34μg.ml-1)、和/或葡萄糖(1％w/v)。LB培养基通过高压灭菌器(autoclave)灭菌，同时将溶于水的葡萄糖(20％w/v)、溶于水的羧苄青霉素(100mg.ml-1)以及溶于乙醇的氯霉素(34mg.ml-1)储备溶液过滤灭菌，并分别加入。
1.1.2.2 MSX基本培养基
通过在室温下混合MSA培养基(760ml.L-1)、MSB培养基(200ml.L-1)以及12.5％(w/v)葡萄糖储备溶液(40ml.L-1)制备MSX培养基。MSB培养基由NH4Cl(15g.L-1)以及MgSO4.7H2O(2.0g.L-1)组成，并通过高压灭菌器灭菌。MSA培养基由KH2PO4(7.89g.L-1)、vishniac微量元素(2.63ml.L-1)组成，并经高压灭菌器灭菌前，加入氢氧化钾溶液直到pH达到7.0。Vishniac微量元素如先前描述(Vishniac W,Santer M.THE THIOBACILLI,.BacteriologicalReviews1957；21(3):195-213.)来制备，但只使用3.9g.L-1的ZnSO4.7H2O。葡萄糖用0.22μm过滤无菌器过滤灭菌。MSX培养基有时补充有核黄素(1mg.L-1)，且其首先通过将核黄素溶解在MSB培养基(5mg.L-1)中来达成。然后将该溶液过滤灭菌，再将该MSB+核黄素溶液与MSA和葡萄糖以相同的体积混合(同仅MSX培养基)，以形成补充有核黄素的MSX。MSX和用核黄素补充的MSX常都会补加羧苄青霉素(50μg.ml-1)和氯霉素(34μg.ml-1)，其制备同上述LB培养基所描述。
1.1.2.3 Luria Bertani琼脂平板
使用Luria Bertani高盐培养基(Melford)(25g.L-1)和琼脂(20g.L-1)来制备Luria Bertani琼脂平板。该LB和琼脂混合物经高压灭菌器灭菌，且在倾倒前使其在50℃的水浴中冷却。该LB琼脂平板通常会补充羧苄青霉素(50μg.ml-1)、氯霉素(34μg.ml-1)和葡萄糖(1％w/v)。该羧苄青霉素、氯霉素以及葡萄糖储存液可以按上描述的Luria Bertani液体培养基来制备，且在在倾倒前加入至LB琼脂溶液中。该葡糖糖储备液在加入到LB琼脂中前，在50℃的水浴中预热。
1.1.3引物表格和序列的列表
SEQ ID NO.1-在大肠杆菌中表达的来自节细菌属物种菌株(Arthobacter sp.)SU的4-羟基苯酰辅酶A硫酯酶(4HBT)的经密码子优化的基因序列。
SEQ ID NO.4-聚合酶链反应的产物，该聚合酶链反应对4HBT基因进行修饰，将PCR产物亚克隆入pET20b(+)质粒中，以形成pET20b(+)::CtHis-4HBT质粒。
SEQ ID NO.5-在pET20b(+)::CtHis-4HBT质粒中，编码羧基端组氨酸标记的4HBT的酶的基因。
SEQ ID NO.6-编码在大肠杆菌中所表达的、来自拟南芥的短链酰基辅酶A氧化酶(ACX4)的经密码子优化的基因。
SEQ ID NO.11-将4HBT和ACX4连接成一个聚核苷酸的重叠延伸聚合酶链式反应的产物。
SEQ ID NO.12-编码在大肠杆菌中所表达的、来自针假单胞菌B23的酰基辅酶A合成酶(AcsA)的经密码子优化的基因。
SEQ ID NO.13-在pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA中的Ndel和Xhol限制酶切位点之间(包含该位点)的序列。
SEQ ID NO 14-由Biomass合成的“ppBCKD”聚核苷酸，其包含四个基因，该基因编码恶臭假单胞菌KT2440支链酮酸脱氢酶的亚基，传输到pBSK::ppBCKD质粒中。
SEQ ID NO.15-在pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD质粒中，Ndel和Xhol限制酶切位点之间(包含该位点)的序列。
SEQ ID NO.22-包含经修饰的Sse8387I限制酶切位点的pET16b(Sse)的表达载体的序列。
SEQ ID NO.23-编码在pET16b(Sse)表达载体中所表达的、来自拟南芥的短链酰基辅酶A氧化酶(ACX4)的经密码子优化的基因。
SEQ ID NO.24-编码在pET16b(Sse)表达载体中所表达的、来自苹果的醇酰基转移酶(AAT)的经密码子优化的基因。
1.1.4质粒表格
1.2实施例1-4的一般方法
1.2.1质粒至大肠杆菌JM107克隆宿主中的转化
使用Fermentas TransformAidTM细菌转化试剂盒将质粒(1ng)转化到感受态大肠杆菌JM107(50μl)中。将新鲜转化的细胞在冰上孵育5min，然后涂布在补充了羧苄青霉素(50ng.μl-1)的经预热的LB琼脂平板上。该平板在37℃下孵育16h。
1.2.2质粒的限制性消化
为了从质粒中分离基因或聚核苷酸***物，根据提供的说明，使用Fermentas系列的限制性内切酶来进行质粒的限制性消化。所有的限制性消化反应在37℃的水浴下进行3h。
1.2.3线性表达载体的制备
质粒在限制性消化反应液(100μl)中被线性化，该反应包含质粒DNA(100ng.μl-1)、FermentasGreen缓冲液(1X)、如上所述的Fermentas限制性内切酶。线性化载体通过琼脂糖凝胶电泳以及凝胶抽提纯化，而未先使该限制性内切酶热失活。然后，根据所提供的说明，通过Antarctic磷酸酯酶(New England Biolabs)，水解线性载体的5'磷酸酯。通过乙醇沉淀来浓缩该去磷酸化的载体，该沉淀还需要加入pH为5.2的3M乙酸钠至样品(加入体积：原来样品体积的1/10th)中，然后加入无水乙醇(加入体积：2X新样品体积)。该沉淀混合物在-20℃下孵育过夜。然后，在Eppendorf miniSpin F-45-12-11转子中，将该沉淀DNA以13400rpm离心30min。移除上层清液，用70％(v/v)乙醇清洗细胞颗粒。将DNA颗粒在相同的转子中，以与之前相同的速度再离心10min。移除上层清液，将DNA颗粒在通风橱中风干20min，然后在无核酸酶的水(50μl)中重悬。通过分析琼脂糖凝胶电泳来测定该线性化载体的浓度。
1.2.4琼脂糖凝胶电泳和凝胶抽提
来自质粒消化或PCR扩增的线性DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳来纯化。将消化物或PCR产物装载至琼脂凝胶上，该琼脂凝胶由琼脂糖(1％(w/v))、溴化乙锭(1.78μM)、Tris乙酸盐(4mM)以及乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)组成。对整个凝胶施加每厘米凝胶长度7V的电位差，以分解聚核苷酸。使用透照仪使DNA在凝胶上可视，并用解剖刀切下包含有所需的聚核苷酸的凝胶切片。使用凝胶提取试剂盒将来自该凝胶切片的聚核苷酸纯化。通过分析琼脂糖凝胶电泳来测定该聚核苷酸的浓度。
1.2.5***物连接到经线性化的质粒中
在连接反应(20μl)中，将基因***物连接到经线性化的质粒中。连接反应由3:1摩尔比(对于基因***物的长度小于3kb)或1：1摩尔比(对于基因***物的长度大于3kb)的***基因和线性载体(50ng)、T4 DNA连接酶(1单位)，以及用于T4 DNA连接酶的Fermentas缓冲液(1X)组成。连接在室温下进行20min，且使用连接混合物(2.5μl)作为质粒来源，用于转化到大肠杆菌JM107中，其使用如前所述的Fermentas TransformAid细菌转化试剂盒来进行。经转化的细胞涂布到补充了羧苄青霉素的经预热的LB琼脂平板上，并在37℃下孵育16h。
1.2.6将聚核苷酸亚克隆到表达载体中
将聚核苷酸亚克隆到新的载体中，首先通过使用Fermentas TransformAidTM细菌转化试剂盒，将源载体转化到大肠杆菌JM107中来扩增该源载体，然后准备补充了羧苄青霉素的LB培养基(5ml)，用于琼脂平板上的5个独立的菌落的每一个。该5x5ml LB+羧苄青霉素培养基在37℃下，以250rpm振荡孵育16h，并使用QIAGENSpin miniprep试剂盒，如其指南所述，从培养物纯化出质粒。对于每个所需的5’和3’克隆位点，使用1μl的所需的限制性内切酶，将所需的聚核苷酸从在限制性消化反应(20μl)中制备的每个质粒中消化出来。将限制性消化产物汇集在一起，通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶抽提，将要被亚克隆到新的载体中的聚核苷酸从源载体的残留物中纯化出来。建立连接反应来将聚核苷酸***物连接到到之前制备的经线性化的表达载体中，且***物具有互补粘性末端。如前所述，该连接反应(2.5μl)可以作为用于转化到大肠杆菌JM107中的质粒的来源。通过LB+羧苄青霉素培养物(100ml)中接种来自转化子平板的单菌落，来扩增表达质粒。将该培养物在37℃下，以200rpm振荡孵育16h，并使用QIAGEN质粒MidiPrep试剂盒来纯化来自培养物的质粒。
1.2.7具有表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS的转化
表达载体(1ng)被转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达宿主中。可以从Novagen购置感受态细胞，并将冰冷的环形质粒(1ng)加入到冰冷的感受态细胞(20μl)中。该转化混合物在冰上孵育5min后，在42℃下热激30s。热激后，细胞在冰上再孵育2min。将SOC培养基(Novagen)(80μl)加入到经转化的细胞中，将细胞在37℃下，以250rpm振荡孵育60min后，再涂布到补充了羧苄青霉素(50μg.ml-1)、氯霉素(34μg.ml-1)以及葡萄糖(1％,w/v)的LB琼脂平板中。该平板在37℃下孵育16h。
1.2.8分析琼脂糖凝胶电泳
通过分析琼脂糖凝胶电泳来测定线性DNA的同源性以及浓度。琼脂凝胶由琼脂(1％(w/v))、溴化乙锭(1.78μM)、Tri乙酸盐(4mM)以及EDTA(1mM)组成。固定体积(5μl)DNA样品随着GeneRulerTM 1kb Plus DNA ladder(Thermo Scientific)(5μl)装载在凝胶上。为了估计样品的浓度，将样品带的强度与阶梯上的相同尺度且已知质量的条带的强度在视觉上进行比较，如GeneRulerTM 1kb Plus DNA阶梯的操作手册中所述。
1.2.9十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
从细胞培养物中取样品，并通过以5000g离心10min将细胞沉淀成颗粒。在取样时，细胞培养物的每OD600单位使用100μl，来将细胞颗粒在细胞裂解缓冲液中重悬。细胞裂解缓冲液包含：磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.5)、BugBuster细胞裂解去污剂(Merck-Millipore)(1X)、Benzonase核酸酶(Sigma Aldrich)(0.01％,v/v)、蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。将经重悬的细胞以250rpm振荡孵育20min，并在4℃下以18000g离心20min。将不可溶部分在磷酸钾缓冲溶液(100mM,pH 7.5)中重悬，使用与用于重悬细胞颗粒相同的体积。可溶和不可溶的部分以1:1的比例与2X Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)混合，包含β-巯基乙醇(5％,v/v)。样品在100℃下煮沸5min，并加载到Bio-Rad AnyKD TGX预制凝胶上。在200V下，在Tris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液(Bio-Rad)中进行电泳。通过在室温下将凝胶浸泡在重蒸馏水中并轻轻搅拌(50rpm)5min来洗涤。移除水，再重复该洗涤步骤4次。然后通过在室温下将凝胶浸泡在EZBlueTM凝胶染色试剂(Sigma-Aldrich)中过夜(16h)，并轻轻搅拌16h，来进行染色。
1.3实施例1-从甲基丙烯酰辅酶A生产甲基丙烯酸
通过对针对与甲基丙烯酰辅酶A在结构上相关的底物具有已知活性的硫酯酶的数据库以及文献检索后，来自节杆菌属物种菌株SU的酶4-羟基苯甲酰辅酶A硫酯酶(4HBT)(Genbank登录号AAC80224.1,Uniprot登录号Q04416,EC编号3.1.2.23)被认为是用于水解甲基丙烯酰辅酶A的候选硫酯酶。
编码4HBT的氨基酸序列的基因被密码子优化，用于在大肠杆菌中表达，并通过Biomatik公司合成，其具有NdeI限制酶切位点并入至5’端和NotI限制酶切位点接附至3’端。
所合成的聚核苷酸(SEQ.ID 1)被传递到pBMH::4HBT克隆载体中，且该4HBT基因***物被亚克隆到预先线性化的pET20b(+)表达载体中(在NdeI和NotI限制酶切位点)以形成pET20b(+)::4HBT。该新构建的pET20b(+)::4HBT质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，以形成大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT。
为了表达4-羟基苯甲酰辅酶A硫酯酶，将补充了葡萄糖、羧苄青霉素和氯霉素的LB培养基的起子培养物(20ml)，首先接种大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT的单菌落，其来自补充了葡萄糖、氯霉素和羧苄青霉素的LB琼脂平板。该起子培养物在37℃下，以200rpm振荡孵育，直到培养物的OD600达到1.0。接着，通过在4℃下以5000g离心15min来收集细胞，并将其用于接种LB培养基的中间培养物(100ml)，其也补充了葡糖糖、羧苄青霉素以及氯霉素。该中间培养物也在37℃下以200rpm振荡孵育，直至OD600为1.0。通过在4℃下以5000g离心15min收集中间培养物中的细胞，之后再将其置于2.5L振荡培养瓶中，在再次补充了葡萄糖、羧苄青霉素以及氯霉素的新鲜LB培养基(1L)中重悬。该培养物在37℃下，以200rpm振荡孵育，直至OD600为1.0，然后通过添加异丙基-β-D-硫代P砒喃半乳糖苷(IPTG)到最终浓度为0.4mM来诱导4HBT表达。该培养物在相同的条件下再孵育5.5h。将该培养物平均分至三个离心管中，且在4℃下以5000g离心20min来收集细胞。通过SDS-PAGE分析了先于收集的细胞取出的培养物样品，其表明蛋白质具有高溶解性并表达良好。将三个离心管中的细胞颗粒在缓冲液(50ml)中洗涤三次，该缓冲液由2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)(50ml)组成，并用氢氧化钾调节至pH为7.5。该细胞颗粒在-80℃下冷冻直至裂解。将空pET20b(+)载体阴性对照菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)重复上述方法。
为了制备HBT酶的无细胞提取物，将预先制备的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT细胞颗粒的一种在HEPES(50mM,pH 7.5)缓冲液中重悬，且在Constant SystemsOne Shot细胞破碎仪中裂解。将该细胞裂解物在4℃下以18000g离心15min，且在4℃下以57750g进一步离心其上清液60min。该上清液用VivaSpin Viva6 10,000分子量截留离心浓缩器清洗，在18℃下以10000g离心，直至体积减少6倍，然后在HEPES缓冲液中再稀释6倍，然后在离心浓缩器中进一步将体积减少6倍。通过使用BioRad DC分析试剂盒，用牛血清蛋白作为标准蛋白，来分析来自大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT的过表达培养物的无细胞提取物的总的蛋白质浓度。接着根据相同的方法来制备来自阴性对照菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)的细胞颗粒的无细胞提取物。
为了分析4HBT酶对甲基丙烯酰辅酶A的活性，首先制备甲基丙烯酰辅酶A。甲基丙烯酰辅酶A的合成通过辅酶A和甲基丙烯酸酐的反应来进行。该反应由磷酸钠缓冲液(100mM,pH 8.5)中的辅酶A(20mM)和甲基丙烯酸酐(40mM)组成。该反应在冰上孵育，并每2min漩涡振荡30min，且使用盐酸将最终反应混合物酸化到pH为3.5。甲基丙烯酸副产物和未反应的甲基丙烯酸酐通过4x10ml的经二***饱和的水来提取去除，甲基丙烯酰辅酶A通过反向高效液相色谱法(RP-HPLC)，在分析规模柱(Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱,4.6mm x 150mm)上纯化。将样品(75μl)注射到C18柱上，通过在0.1％三氟乙酸(TFA)中以乙腈线性梯度(1.8％-13.5％)，以1ml.min-1的流速，洗脱超过40min。其主峰是包含甲基丙烯酰辅酶A的峰，收集并汇集包含甲基丙烯酰辅酶A的部分。通过旋转蒸发(21℃,3kPa)除去乙腈，留下甲基丙烯酰辅酶A和三氟乙酸的水溶液。用氢氧化钠将该甲基丙烯酰辅酶A和三氟乙酸的溶液调至pH为7，并使用液氮快速冷冻后，进行冷冻干燥。通过将该冷冻干燥样品再溶于无核酸酶水(10ml)中，并重复冷冻-干燥-再溶解循环两次(一次在5ml无核酸酶水中，最后一次在1ml无核酸酶水中)，来移除TFA。可以通过在260nm下以16800M-1.cm-1.的摩尔消光系数以吸光度来测定甲基丙烯酰辅酶A的浓度。
4HBT的粗酶测定在含有无细胞蛋白质提取物(1mg.ml-1)、甲基丙烯酰辅酶A(大约100μM)、5',5-二巯基-(2-硝基苯甲)酸(DTNB)(500μM)的分析管(1ml)中进行。反应通过加入底物开始，并在412nm下监控。将大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)的无细胞提取物重复进行酶测定。以异丁酰辅酶A作为底物，重复进行4HBT过表达菌株和空载体对照菌株的无细胞提取物的酶分析。
4HBT的粗酶测定表明，4HBT催化甲基丙烯酰辅酶A水解，展现出以甲基丙烯酰辅酶A作为底物的选择性，优于以异丁酰辅酶A作为底物。
为了更好界定4-羟基苯甲酰辅酶A硫酯酶的特性，该酶以His标记，以致其能够作为纯酶而不是作为无细胞提取物的一部分来分析。为了以His标记该酶，建立聚合酶链式反应。用于His标记4HBT的正向与反向引物HHT.F(SEQ.ID 2)和HHT.R(SEQ.ID 3)，被设计为以(5’-GGA-3’)的序列来替换来自编码4HBT的基因的(5’-TAA-3’)终止密码子，并紧接着导入一个3’XhoI限制酶切位点。因此，将PCR产物克隆回pET20b(+)的NdeI和XhoI限制酶切位点之间时，创造出了编码具有甘氨酸-亮氨酸-谷氨酸空间序列和羧基端六组氨酸(His)标记的4HBT的开放阅读框。
聚合酶链式反应混合物包含作为模板DNA的pET20b(+)::4HBT质粒(50pg.μl-1)、KOD DNA聚合酶(1单位)、引物HHT.F(0.4μM)、引物HHT.R(0.4μM)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)(0.2mM)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)(0.2mM)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)(0.2mM)、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)(0.2mM)、MgCl2(1mM)和用于KOD DNA聚合酶的Novagen缓冲液#1(1X)。将PCR混合物加载到热循环仪中，其程序设定为以94℃下3min开始，接着通过重复30次以下步骤：在94℃下融化30s，在55℃下退火30s，在72℃下延长80s。然后在72℃下5min再结束。
该PCR产物(SEQ.ID 4)通过琼脂糖凝胶电泳后，再通过凝胶抽提来纯化，并将钝端连接到pJET1.2克隆载体中，来形成pJET1.2::CtHis-4HBT。然后，该***物从pJET1.2::CtHis-4HBT被亚克隆到pET20b(+)中的NdeI和XhoI限制酶切位点之间，来形成pET20b(+)::CtHis-4HBT。然后该大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达宿主用pET20b(+)::CtHis-4HBT转化，来形成C-端六组氨酸标记的4HBT表达宿主，大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::CtHis-4HBT。
然后纯的羧基端His标记的4HBT酶通过以下步骤来制备：首先使大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::CtHis-4HBT的培养物生长，并以和大肠杆菌BL21(DE3)pLysSpET20b(+)::4HBT完全相同的方法来诱导表达。来自表达5.5h后获取的培养物的样品，表现出羧基端His标记的4HBT酶也极易溶解且以较高的水平表达。通过将细胞培养物分至三个离心管中，并在4℃下以5000g离心20min来收集细胞。细胞颗粒不经过洗涤，而是直接在-80℃下存储。通过将大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::CtHis-4HBT的细胞颗粒中的一个在结合缓冲液(6ml)中重悬，来制备羧基端六组氨酸标记的4HBT的无细胞提取物，用于Nickel-sepharose FPLC柱。结合缓冲液由NaH2PO4(10mM)、Na2HPO4(10mM)、NaCl(500mM)以及咪唑(30mM)组成，并用HCl调节至pH为7.4。将核酸酶(0.6μl)加入到经重悬的细胞中，然后在Constant Systems One Shot细胞裂解仪中将细胞裂解。然后将该细胞裂解物在4℃下以18000g离心15min来澄清，然后在4℃下以57750g将上清液离心60min。然后将该上清液装载在GE Healthcare HisTrapTM FF粗管柱(1ml)上，该柱用结合缓冲液平衡。用5倍柱体积的结合缓冲液将未结合的蛋白质冲离管柱，并以咪唑线性浓度梯度(从30mM到500mM超过20柱体积)洗脱His标记蛋白。在280nm下监控蛋白质洗脱，且通过SDS-PAGE***分中羧基端His标记的4HTB的存在和纯度。含有纯CtHis-4HBT蛋白的部分合并，且在VivaSpin Viva6 10,000分子量截留离心浓缩器中，进行缓冲液更换，以磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.5)置换洗脱缓冲液。为了进行缓冲液更换，将合并部分在18℃下以10000g离心通过离心浓缩器的超滤膜来离心，直至合并部分的体积降至1ml。残留的蛋白质部分在磷酸钾缓冲液中稀释6倍，并在相同条件下，通过超滤膜进行进一步的离心，直到达到6倍体积的降低，来对样品进行浓缩。再进行一次磷酸钾缓冲液中的后一次稀释以及再浓缩，且通过NanoDrop ND1000分光光度仪中的UV280吸光度测定CtHIS-4HBT蛋白的浓度(摩尔消光系数为20970M-1.cm-1以及羧基端His标记的4HBT酶的分子量为17516.5mg.mmol-1)。使用ExpasyProtParam工具，使用编码pET20b(+)::CtHis-4HBT质粒中的羧基端His标记的4HBT酶的基因序列(SEQ.ID 5)的氨基酸翻译，测定摩尔消光系数和分子量的值。
对预先制备的甲基丙烯酰辅酶A和异丁酰辅酶A(从Sigma Aldrich购买的异丁酰辅酶A锂盐)，测定其经纯化的羧基端六组氨酸标记的4HBT酶的动力学特征。
在Nunc96孔板上，进行甲基丙烯酰辅酶A的水解反应(200μl)，使用经纯化的CtHis-4HBT蛋白(0.075mg.ml-1)和DTNB(0.5mM)来监控该反应。测定了起始浓度为0.375mM、0.3mM、0.225mM、0.15mM以及0.075mM的甲基丙烯酰辅酶A的初始速率。该反应从加入酶开始。
在Nunc96孔板上，进行异丁酰辅酶A的水解反应(200μl)，使用经纯化的CtHis-4HBT蛋白(1mg.ml-1)和DTNB(0.5mM)来监控该反应。测定了起始浓度为0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM以及0.1mM的甲基丙烯酰辅酶A的初始速率。该反应从加入酶开始。
绘制甲基丙烯酰辅酶A(图1)和异丁酰辅酶A(图2)二者的动力学特征的Lineweaver-Burke图。对于甲基丙烯酰辅酶A，羧基端六组氨酸标记的4HBT的动力学常数KM为1.6mM以及Vmax为470nmols.mg-1.min-1，而对于异丁酰辅酶A，其Km为3mM以及Vmax为16.7nmols.mg-1.min-1。
因此，已经证明4HBT催化甲基丙烯酰辅酶A的水解，且可以用于生产甲基丙烯酸。因为相比于异丁酰辅酶A，4HBT水解甲基丙烯酰辅酶A时具有更低的KM值和更高的Vmax值，故4HBT对甲基丙烯酰辅酶A的水解具有更高的选择性。
1.4实施例2-从异丁酰辅酶A形成甲基丙烯酰辅酶A和甲基丙烯酸
通过文献检索，来自拟南芥的短链酰基辅酶A氧化酶(ACX4)(Genbank登录号AB017643.1,Uniprot登录号Q96329,EC编号1.3.3.6)被认为是，在昆虫细胞株中表达时，对作为底物的异丁酰辅酶A具有可检测到的活性的酰基辅酶A氧化酶。
为了确认该氧化酶是否可以在大肠杆菌中功能性表达，并对作为其被整合到代谢途径中的底物的异丁酰辅酶A具有有用水平的活性，通过Life Technologies将编码ACX4的氨基酸序列的基因进行密码子优化，以在大肠杆菌中表达，将NdeI限制酶切位点整合在5’端，XhoI限制酶切位点整合在3’端。
将合成的聚核苷酸(SEQ.ID 6)传递到pMA-RQ::ACX4质粒中，且将基因***物亚克隆到预先线性化的pET20b(+)载体的NdeI和XhoI限制酶切位点，以形成pET20b(+)::ACX4。然后将该新构建的pET20b(+)::ACX4质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，以形成大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::ACX4。
为了测试ACX4的表达，以羧苄青霉素和氯霉素补充的MSX起子培养物，接种来自补充了葡萄糖、氯霉素和羧苄青霉素的LB琼脂平板的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::ACX4的单菌落。该起子培养物(20ml)在37℃下，以200rpm振荡孵育16h。接着，通过在4℃下以5000g离心15min来从起子培养物收集细胞，然后重悬到也补充了氯霉素和羧苄青霉素的新鲜的MSX培养基中间培养物(100ml)中。该中间培养物在37℃下，以200rpm振荡，孵育，直至OD600为1.0。然后，通过在4℃下以5000g离心15min，从中间培养物收集细胞，之后再将其置于2.5L振荡培养瓶中，在补充了葡萄糖、羧苄青霉素、以及核黄素的新鲜的MSX培养物(1L)中重悬。该培养物在37℃下，以200rpm振荡孵育，直至OD600为0.7，然后通过添加IPTG到最终浓度为0.4mM来诱导表达。该培养物在相同的条件下再孵育7h。之后将细胞分至三个离心管中，且在4℃下，以5000g离心20min来收集细胞。通过SDS-PAGE分析在收集细胞之前采集的培养物样品，其表示ACX4蛋白质表达良好，约三分之一的ACX4蛋白存在于可溶部分，约三分之二存在于不溶部分。将细胞颗粒在缓冲液HEPES(50mM)(用KOH调节至pH 7.5)中洗涤三次。该细胞颗粒在-80℃下冷冻直至裂解。对于大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)阴性对照菌株重复上述方法。
为了制备ACX4酶的无细胞提取物，将预先制备的细胞颗粒的一种在HEPES(50mM,pH 7.5)缓冲液(6ml)中重悬，该缓冲液补加最终浓度为10μM的黄素腺嘌呤二核苷酸(FDA)。将该经重悬的细胞在Constant Systems One Shot细胞破碎仪中裂解。该细胞裂解物在4℃下以18000g离心15min，且将其上清液在4℃下以57750rpm进一步离心60min。该上清液用VivaSpin Viva6 10,000分子量截留离心浓缩器，在18℃下以10000g离心，直至残留物体积减少6倍，通过在再次补充了FAD(10μM)的HEPES缓冲液(50mM，pH7.5)中重新稀释6倍来将残留物洗涤一次，然后进行第二浓缩步骤，在离心浓缩器中将体积减少6倍。采用BioRad DC蛋白质分析试剂盒，使用牛血清蛋白作为标准蛋白，来分析残留物的总的蛋白质浓度。
建立HPLC分析方法，来解析异丁酰辅酶A(IB-CoA)、甲基丙烯酰辅酶A(MAA-CoA)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、甲基丙烯酸(MAA)以及辅酶A(CoA-SH)。辅酶A、甲基丙烯酰辅酶A以及异丁酰辅酶A，分别在11min、30.8min和32.3min洗脱。辅酶A、甲基丙烯酰辅酶A以及异丁酰辅酶A分别具有一个小的(次要的)与主峰相关的拖尾峰，分别在12min、31.6min以及32.9min(图3)。甲基丙烯酸在13.5min洗脱，且FDA(其用于ACX4的粗测定以及作为异丁酰辅酶A和甲基丙烯酰辅酶A标准品的内标)在27.8min洗脱。
为了保证辅酶A、甲基丙烯酸、异丁酰辅酶A以及甲基丙烯酰辅酶A不与来自无细胞提取物的峰混淆，进行无底物对照，使用在HEPES缓冲液中的ACX4无细胞提取物(0.8mg.ml-1)、经纯化的CtHis-4HBT(0.6mg.ml-1)以及FAD(10μM)。在辅酶A、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰辅酶A或异丁酰辅酶A洗脱时间未观察到洗脱峰(图4)。
ACX4的活性测试在1.5ml微离心管中进行。粗酶反应由在HEPES缓冲溶液(50mM,pH为7.5)中的无细胞ACX4蛋白提取物(0.8mg.ml-1)、异丁酰辅酶A(500μM)以及黄素腺嘌呤二核苷酸(10μM)组成。该反应在1.5ml的微离心管中，在30℃下以250rpm振荡30min孵育，且通过分析HPLC来对最终反应产物进行分析(图5)。甲基丙烯酰辅酶A为主要产物，在30.7min具有峰。在粗酶测定中形成的甲基丙烯酸的浓度为74μM。
为了确认甲基丙烯酰辅酶A的峰为真的，其不是具有偏移洗脱时间的异丁酰辅酶A的峰，该样品加入异丁酰辅酶A，并再用HPLC分析。当样品被酸化后，ACX4失活，这可以保证任何加入的异丁酰辅酶A不会转化为甲基丙烯酰辅酶A。事实上，加入了异丁酰辅酶A的样品表明，不仅有原来甲基丙烯酰辅酶A的峰，而且在32mim有另外的峰，该峰具有异丁酰辅酶A的典型的拖尾峰(图6)。
为了确认甲基丙烯酸是否可以在酶偶联反应中从异丁酸来产生。构建了一种实验，该实验中粗ACX4用经纯化的CtHis-4HBT酶来孵育。相同的ACX4无细胞提取物用作为ACX4的蛋白质来源，虽然用关于实施例1的动力学特征的相同方法再次制备纯CtHis-4HBT，但最终将缓冲液更换为HEPES缓冲液(50mM,pH为7.5)，而不是之前所使用的磷酸盐缓冲液。因此，将粗ACX4(0.8mg.ml-1)与纯CtHis-4HBT(0.6mg.ml-1)，在伴随有FAD(10μM)以及异丁酰辅酶A(500μM)的HEPES缓冲液中共同孵育。该样品在30℃下以250rpm振荡30min孵育，并用HPLC来分析。甲基丙烯酸和辅酶A为主要产物。在13.45min处观察到甲基丙烯酸的峰，同时分别在11.1min和12.1min处观察到辅酶A的主峰和次要峰。在酶偶联反应期间产生的甲基丙烯酸的浓度是345μM(图7)，比其在仅含有粗ACX4的测定中高4.7倍。
这确认了ACX4氧化异丁酰辅酶A。进一步证实了，在体外将ACX4和4HBT组合能够以工业应用水平将异丁酰辅酶A转为甲基丙烯酸。
1.5实施例3-异丁酸到甲基丙烯酸的全细胞生物转化
本实施例展示了异丁酸到甲基丙烯酸的进一步生物转化，其使用酰基辅酶A合成酶，以辅酶A来活化异丁酸来形成异丁酰辅酶A。还展示了来自拟南芥的酰基辅酶A氧化酶ACX4，将异丁酰辅酶A氧化为甲基丙烯酰辅酶A，以及来自节杆菌属物种菌株SU的酰基辅酶A硫酯酶4HBT，将甲基丙烯酰辅酶A水解为甲基丙烯酸和辅酶A。
从数据库和文献检索可知，来自绿针假单胞菌B23(Genbank登录号:BAD90933.1,uniprot登录号:Q5CD72)的酰基辅酶A合成酶AcsA被认为是AMP-形成性酰基辅酶A合成酶，其可以将异丁酸活化为异丁酰辅酶A，其公开的米氏常数(Km)为0.14mM，且转换数(kcat)为10.6s-1。
在本实施例中，我们证实了基于pET20b(+)的载体(pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA)的构建，其用于基因的共表达，该基因在pET20b(+)的T7启动子的控制下，编码来自单操纵子的4HBT、ACX4以及AcsA，还证实了其用于编码异丁酸到甲基丙烯酸的全细胞生物转化的代谢途径的应用。
该操纵子的构建以两个阶段来进行。第一个阶段包括基于pET20b(+)的载体(pET20b(+)::4HBT-ACX4)的构建，用于仅编码4BHT和ACX4的基因的共表达，而第二个阶段包括将编码AcsA的基因亚克隆到pET20b(+)::4HBT-ACX4载体(其在适当位置具有自己的核糖体结合位点)，以构建最终的pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA质粒。
为了构建pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA载体，首先将编码4HBT和ACX4的基因结合成单一的聚核苷酸，其在编码4HBT和编码ACX4的基因之间具有新的核糖体结合位点，以确保之后有效的翻译。为了将两个基因结合在一起，进行重叠延伸聚合酶链式反应。该重叠延伸聚合酶链式反应在其本身以两步进行。首先，在两个分开的聚合酶链式反应中(反应“A”和“B”)，将编码4HBT的基因和编码ACX4的基因从各自的表达载体(pET20b(+)::4HBT和pET20b(+)::ACX4)中扩增出来。
用于重叠延伸聚合酶链式反应的引物为引物OE.A.F(SEQ.ID 7)，其是重叠延伸聚合酶链式反应A的正向引物；引物OE.A.R(SEQ.ID 8)是用于重叠延伸聚合酶链式反应B的逆向引物；引物OE.B.F(SEQ.ID 9)是用于重叠延伸聚合酶链式反应B和最终反应的正向引物；引物OE.B.R(SEQ.ID 10)是用于重叠延伸聚合酶链式反应B的逆向引物。OE.A.F的突出端被设计为在新的聚核苷酸的5'端维持NdeI限制酶切位点。OE.A.R和OE.B.F的突出端被设计为彼此含有互补序列，以可以使来自反应A和B的两个PCR产物连接。该互补序列被设计为，在两个PCR产物的连接时，在4HBT基因和ACX基因之间将会引入基因间序列，该序列包括用于后续基因的新的核糖体结合位点。最后，引物OE.B.R的突出端被设计为包含两个限制酶切位点(NheI限制酶切位点和XhoI限制酶切位点)。这可以允许包含4HBT和ACX4基因的连接的聚核苷酸被克隆到pET20b(+)质粒的NdeI和XhoI限制酶切位点，以形成pET20b(+)::4HBT-ACX4，并且允许AcsA基因被克隆到pET20b(+)::4HBT-ACX4质粒的NdeI和XhoI限制酶切位点，以形成pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA质粒。在引物OE.B.R的NheI和XhoI限制酶切位点之间包括富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的间隔序列，以降低引物的退火温度，以致使其与其他引物更密切匹配，并且在相邻的NheI和XhoI限制酶切位点可以进行有效的双重消化。
聚合酶链式反应A(50μl)包含作为模板DNA的pET20b(+)::4HBT(10pg.μl-1)、KODDNA聚合酶(1单位)、引物OE.A.F(0.4μM)、引物OE.A.R(0.4μM)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)(0.2mM)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)(0.2mM)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)(0.2mM)、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)(0.2mM)、MgCl2(1mM)和KOD DNA聚合酶的Novagen缓冲液#1(1X)。
聚合酶链式反应B(50μl)包含作为模板DNA的pET20b(+)::ACX4(20pg.μl-1)、KODDNA聚合酶(1单位)、引物OE.B.F(0.4μM)、引物OE.B.R(0.4μM)、dATP(0.2mM)、dTTP(0.2mM)、dCTP(0.2mM)、dGTP(0.2mM)、MgCl2(1mM)以及用于KOD DNA聚合酶(1X)的Novagen缓冲液。
两个PCR反应在相同的条件下平行进行，从95℃下3min的最初的变性步骤开始，接着25个由以下步骤组成的循环：98℃下15s的变性步骤，在50℃下2s的退火步骤，在72℃下的20s延长步骤。经25个循环后，接着在72℃下再进行5min延长步骤。这两个双链PCR产物(产物A和产物B)通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶抽提纯化，且通过分析琼脂糖凝胶电泳来确定其浓度。
PCR产物A和B在第二聚合酶链式反应中被连接，该聚合酶链式反应由：PCR产物A(15nM)、PCR产物B(15nM)、dATP(0.2mM)、dTTP(0.2mM)、dCTP(0.2mM)、dGTP(0.2mM)、MgCl2(1mM)、用于KOD DNA聚合酶(1X)的Novagen缓冲溶液#1、二甲亚砜(5％(v/v))和KOD DNA聚合酶(8nl/μl)组成。该反应在热循环仪中进行，其程序如下：以95℃下3min开始，接着15个由以下步骤组成的循环：在98℃下15s的变性步骤，在50℃下2s的退火步骤，在72℃下20s的延长步骤。经25个循环后，接着在72℃下再进行5min的延长步骤。
在这个PCR程序后，直接从浓缩存储物(50μM)加入分别用于A和B的扩增的外部正向引物和外部逆向引物，直至最终浓度为0.5μM。然后该经修饰的PCR反应混合物再进行一轮PCR，其具有如下热循环仪程序：以95℃下3min的熔化步骤开始，接着15个由以下步骤组成的循环：在98℃下15s的变性步骤，在50℃下2s的退火步骤，在72℃下20s的延长步骤。经25个循环后，接着在72℃下再进行5min的延长步骤。
通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶抽提，将该连接步骤的产物(SEQ.ID 11)纯化，且将其钝化端连接到pJET1.2克隆载体中，以形成pJET1.2::4HBT-ACX4。该聚核苷酸包含经连接的4HBT和ACX4基因，并被亚克隆到pET20b(+)形成pET20b(+)::4HBT-ACX4。然后通过在NheI和XhoI限制酶切位点的限制性消化来将该pET20b(+)::4HBT-ACX4质粒线性化。
在构建pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA质粒的下一个阶段，将编码AcsA的氨基酸序列的基因进行密码子优化用于在大肠杆菌中的表达，且通过Biomatik公司合成，其具有附加到3’端的XhoI限制酶切位点和附加到5’端的短序列。该序列包含：NheI限制酶切位点、核糖体结合位点、以胞嘧啶-腺嘌呤-胸腺嘧啶三核苷酸结束的间隔序列，其与AcsA的起始密码子一起编码NdeI限制酶切位点。
所合成的经密码子优化的AcsA聚核苷酸(SEQ.ID 12)被传递入pBMH::AcsA克隆质粒中，且AcsA基因和5’核糖体结合位点一起被亚克隆到经线性化的pET20b(+)::4HBT-ACX4载体的NheI和XhoI限制酶切位点之间，形成pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA质粒(图8)。该质粒被转化到大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS中，形成大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA。该序列在(且包括)pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA质粒中的NdeI和XhoI限制酶切位点之间，如SEQ ID NO 13所示。
为了构建用于仅表达AcsA基因的菌株，该AcsA基因被单独亚克隆出pBMH::AcsA克隆载体，且亚克隆到pET20b(+)质粒的NdeI和XhoI限制酶切位点之间，形成ET20b(+)::AcsA。接着，将pET20b(+)::AcsA质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，形成大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::AcsA。
通过在两种不同的测试温度(37℃和28℃下)，将大肠杆菌BL21(DE3)pLysSpET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA的培养物(100ml)在补加了核黄素(1mg.L-1)的MSX培养基下孵育，来确认大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA的4HBT、ACX4和AcsA的共表达。培养物生长至OD600为0.5，且添加IPTG(0.4mM)来诱导表达。在刚开始诱导表达前，以及诱导表达后1h、3h、5h以及20h收集样品。也在相同的条件下培养对照组菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::ACX4(如实施例2所制备)，以及大肠杆菌BL21(DE3)pLysSpET20b(+)::AcsA。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分析在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA中4HBT、ACX4和AcsA的共表达期间所取的样品，以及在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::ACX4中仅表达ACX4期间所取的样品，以及在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::AcsA中仅表达AcsA期间所取的样品。
通过SDS-PAGE分析(图9)表明，在诱导表达后5h，在37℃下进行表达时，可以检测到高水平的可溶性4HBT(左侧底部条带)，以及良好水平的ACX4(左侧顶部条带)，而检测到极少量不溶性蛋白质，虽然检测到了高水平的不溶性AcsA(右侧顶部条带)，且可溶性部分中未看到AcsA蛋白质。道1)空的pET20b(+)载体阴性对照。2)Spectra BR蛋白梯度。3)pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA表达0h可溶。3)3h可溶。4)5h可溶。5)0h不可溶。6)pET20b(+)::AcsA表达5h可溶。7)pET20b(+)::ACX4可溶.8)pET20b(+)::4HBT可溶.9)pET20b(+):4HBT-ACX4-AcsA 0h不可溶.10)pET20b(+):4HBT-ACX4-AcsA 3h不可溶.11)pET20b(+):4HBT-ACX4-AcsA 5h不可溶.12)pET20b(+)::AcsA 5h不可溶。
为了测试大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA将异丁酸转化为甲基丙烯酸的能力，从补加了葡萄糖、羧苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板上的来自大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA的单菌落，接种补加了羧苄青霉素和氯霉素的MSX预培养物(20ml)，并在37℃下，以200rpm振荡孵育16h。在4℃下以5000g离心15min来收集细胞，且将该细胞置于250ml振荡培养瓶中，在补充了羧苄青霉素、氯霉素和核黄素的MSX培养基(100ml)中重悬，将该细胞在37℃以200rpm振荡孵育。在OD600为0.5时，添加IPTG(0.4mM)诱导基因的共表达。该培养物继续孵育1h后，再从浓度为500mM的浓缩存储物中添加异丁酸钾(pH 7.0)，使在培养基中的最终浓度为5mM。加入异丁酸后立即取样品(0h样品)，以及在加入异丁酸后1h、2h、4h、6h、8h以及19.5h取样品。
将在异丁酸到甲基丙烯酸的生物转化期间收集的样品，在Eppendorf miniSpinF-45-12-11转子中，在6000rpm下离心5min。将该上层清液用0.2μm Sartorius RC 4mm过滤器过滤，然后用5M HCl酸化到pH 2.5。将经酸化后的上层清液注射到Agilent ZorbaxEclipse XDB C18柱(4.6mm x 150mm)上。HPLC在0.4ml.min-1下进行，且通过在KH2PO4(用HCl调至pH为2.5)中的14％乙腈进行等度洗脱，来从异丁酸中解析甲基丙烯酸。通过将流速增加到1ml.min-1以及将乙腈浓度增加到75％15min，来在运行期间冲洗该柱，之后将该条件调回0.4ml.min-1的流速以及14％的乙腈，以用于下一个样品。在注射下一个样品前，该柱允许平衡20min。
进行三个阴性对照并分析。第一个对照是阴性对照菌株，大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)，其不含有4HBT-ACX4-AcsA共表达操纵子，且在IPTG加入培养基后，不加入异丁酸来培养。第二个对照组使用与第一对照组相同的菌株，但是在加入IPTG到培养基后1h，加入异丁酸(5mM)。第三对照组使用与主生物转化培养物中使用的相同的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA，但在诱导4HBT,ACX4和AcsA共表达后，不将异丁酸加入培养基中。
图10中观察到的HPLC轨迹线的总结，是在诱导后20.5h时收集的样品的轨迹线，来自所测试的所有四个培养物(生物转化时间为19.5h)。图10C是异丁酸标准品(5mM)，图10E是与甲基丙烯酸标准品(200μM)混合的异丁酸标准品(5mM)。图10A、10B以及10D表明，在任何对照组中都无甲基丙烯酸生成，且图10F表明甲基丙烯酸确实在生物转化中生成了。
图11总结了甲基丙烯酸随时间的生产，以及在生物转化期间，大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA的生长，其中所需产物甲基丙烯酸的最终浓度约为0.25mM。
在该实施例中，已经证实了一种全细胞方法，其通过在重组大肠杆菌中体外共表达4HBT、ACX4和AcsA，以工业应用水平将异丁酸原料转化为甲基丙烯酸。
1.6实施例4-从葡萄糖形成甲基丙烯酸
之前表明，来自恶臭假单胞菌KT2440的支链酮酸脱氢酶复合物，在重组代谢途径中，催化2-酮异戊酸到异丁酰辅酶A的氧化脱羧，来用于在大肠杆菌中生产异丁酸(Zhang,K.,Xiong,M.and Woodruff,A.P.2012,Cells and methods for producing isobutyricacid,国际专利编号WO 2012/109534 A2)。编码该支链酮酸脱氢酶复合物的支链酮酸脱氢酶α亚基(bkdA1)、支链酮酸脱氢酶β亚基(bkdA1)、硫辛酰胺酰基转移酶组分(bkdB)以及硫辛酰胺脱氢酶组分(lpdV)的基因被分组成彼此相邻，且被发现都在恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA(genbank登录号AE015451.1)中的单个启动子的控制下。
编码bkdA1,bkdA2,bkdV以及lpdV基因的整个野生型序列，如同其出现在恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA的核苷酸4992042和4996988之间，通过Biomatik公司合成作为单一(ppBCKD)聚核苷酸(SEQ.ID 14)。该ppBCKD聚核苷酸包括在3’端的XhoI限制酶切位点，以及在5’端的短序列，紧接着在bkdA1基因的起始密码子前面。该5’接附序列包含XbaI限制酶切位点、间隔序列、NheI限制酶切位点、核糖体结合位点以及第二间隔序列。包含该XbaI位点，以使ppBCKD聚核苷酸能够***pET20b(+)质粒中，以构建pET20b(+)::ppBCKD，其正好可以表达恶臭假单胞菌KT2250支链酮酸脱氢酶的四个基因。包含第一间隔序列，是为了维持在pET20b(+)::ppBCKD质粒中T7启动子和核糖体结合位点之间的碱基对数目与存在于pET20b(+)质粒中的相同，且除了编码正好在核糖体结合位点前面的Nhel位点的六个核苷酸外，该间隔序列与在pET20b(+)质粒中的XbaI位点和核糖体结合位点之间的序列相同。包括该NheI限制酶切位点，使得ppBCKD聚核苷酸能够***pET20b(+)::4HBT-ACX4质粒来构建pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD质粒。当BCKD基因被表达用于生产先前报道的异丁酸时，该核糖体结合位点和间隔序列与刚刚在bkdA1基因之前使用的那些相同(Zhang,K.,Xiong,M.and Woodruff,A.P.2012,Cells and methods for producing isobutyric acid,国际专利号WO 2012/109534 A2)。
将含有恶臭假单胞菌KT2440的支链酮酸脱氢酶的四个基因的单一聚核苷酸传递到pBSK质粒(pBSK::ppBCKD)中。该四个基因被亚克隆出pBSK::ppBCKD质粒，并被亚克隆到来自实施例2的pET20b(+)::4HBT-ACX4质粒的NheI和XhoI限制酶切位点之间，以形成pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD(图12)。序列ID15表示在pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD质粒中，NheI和XhoI限制酶切位点之间的序列。该pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，以形成大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD。相同地，该四个基因也被亚克隆到pET20b(+)质粒的NheI和XhoI限制酶切位点之间，形成pET20b(+)::ppBCKD，且该质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，以形成大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::ppBCKD。在表达研究中，后者的菌株用于协助在SDS-PAGE凝胶下辨认bkdA1、bkdA2、bkdB和lpdV基因对应的条带(未示出)。
补充了羧苄青霉素和氯霉素的MSX预培养物(10ml)接种了大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD，其来自补充了葡糖糖、羧苄青霉素以及氯霉素的LB琼脂平板上的单一菌落。培养物在37℃下，以250rpm振荡16h孵育。在4℃下以5000g离心15min来收集细胞，然后将该细胞置于500ml振荡培养瓶中，在补充了核黄素以及羧苄青霉素、氯霉素的MSX培养基(100ml)中重悬。该新鲜培养物在37℃以250rpm振荡孵育，且在每个培养物中在OD600为0.5时通过添加IPTG(0.4mM)来诱导表达。该培养物继续孵育17h后，再收集样品，用于反向高效液相色谱(RP-HPLC)的分析。对大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)阴性对照的培养物进行重复培养。
将样品在Eppendorf miniSpin F-45-12-11转子中，在6000rpm下离心5min。将上层清液用0.2μm Sartorius RC 4mm过滤器过滤，然后用5M HCl酸化到pH为2.5。将经酸化后的上层清液注射到Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱(4.6mm x 250mm)上。HPLC在1ml.min-1下进行，且通过用在50mM KH2PO4(用HCl调至pH2.5)中的14％乙腈进行等度洗脱来洗脱分析物，通过将乙腈浓度增加到75％持续15min，来在运行期间冲洗该柱，之后将该条件调回14％的乙腈，用于20分钟的再平衡步骤。
甲基丙烯酸标准品(0.2mM)、异丁酸标准品(5mM)、2-酮异戊酸标准品(5mM)分别在3.6min、8.3min和8.6min洗脱，且其峰面积分别为5980mAU.min、330mAU.min以及1580mAU.min。2-酮异戊酸(5mM)、异丁酸(5mM)以及甲基丙烯酸(200μM)的混合物的HPLC分析如图13所示。
从大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)阴性对照培养物中收集的样品的HPLC分析(如图14所示)表明，在甲基丙烯酸预期位置无峰，而从大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD培养物中取的样品表明，在8.6min有峰，峰面积为0.88AU.min，其对应的甲基丙烯酸的浓度为0.11mM(图15)。
为了确认该峰确实代表甲基丙烯酸，该样品从10mM存储溶液中再加入0.24mM的甲基丙烯酸,也通过HPLC分析该加入的样品，如图16所示。在8.5min观察到峰面积为2.7AU.min的单峰，其对应于浓度为0.34mM的甲基丙烯酸，这证实大肠杆菌BL21(DE3)pLysSpET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD菌株直接从葡萄糖产生甲基丙烯酸。
为了确认以2-酮异戊酸补充的培养物是否可以提高甲基丙烯酸的产量，再制备了两个补充了羧苄青霉素和氯霉素的预培养物(10ml)，与之前一样，一个接种大肠杆菌L21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD，另一个接种大肠杆菌BL21(DE3)pLysSpET20b(+)。该预培养物在37℃下，以250rpm振荡16h孵育，然后将该细胞颗粒化，在500ml振荡培养瓶中，在补充了核黄素以及羧苄青霉素、氯霉素的新鲜MSX培养基(100ml)中重悬。在每个培养物中在OD600为0.5时，通过添加IPTG(0.4mM)来诱导表达，并将该培养物再孵育3h，之后在每个培养物中加入2-酮异戊酸(pH7.0)到5mM的最终浓度。该培养基再进一步孵育14h。取培养物样品，并用等度洗脱的高效液相色谱来分析(如未加入2-酮异戊酸的培养物的描述)。
将2-酮异戊酸加入到空的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)阴性对照培养物14h后，取出样品进行HPLC分析，如图17所示，其显示，在甲基丙烯酸通常被观察到的位置无峰，如预期一样。然而，其确实显示一些2-酮异戊酸的背景消耗(图6)，在该培养物中的2-酮异戊酸的峰面积为3353mAU.min，相对于原来的5mM，其对应于培养物中残留2.8mM的2-酮异戊酸。
将2-酮异戊酸加入到表达用于将2-酮异戊酸转化为甲基丙烯酸的基因的培养物(该培养物即大肠杆菌BL21(DE3)pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD培养物)中，14小时后，取出样品，在HPLC轨迹线中，在8.4min处具有峰面积为1890mAU.min的峰(图18)，表明产生了0.24mM浓度的甲基丙烯酸。在该样品中未检测到2-酮异戊酸，表明其在2-酮异戊酸转化为甲基丙烯酸期间被完全消耗了。
再加入0.24mM的甲基丙烯酸到该样品中，对经加入的样品的分析表明(图19)，具有峰面积为3.4AU.min的峰，其对应浓度为0.44mM的甲基丙烯酸，因此原来的甲基丙烯酸的峰是真的。
在该实施例中，支链酮酸脱氢酶(即来自恶臭假单胞菌KT2440的BCKD)在细胞***中，和酰基辅酶A(即来自拟南芥的ACX4)以及硫酯酶(即来自节杆菌属物种菌株SU的4HBT)共表达。表明了使用重组大肠杆菌从关键原料(例如可从生物质轻松得到的葡萄糖)来生产甲基丙烯酸是可能的，且进一步表明了通过用2-酮异戊酸补充生长培养基，可以促进所述甲基丙烯酸的产生。
1.7实施例5：通过重组大肠杆菌从2-酮异戊酸到甲基丙烯酸丁酯的全细胞生产
来自拟南芥的ACX4基因针对大肠杆菌进行密码子优化，被合成并克隆入pET16b(Sse)载体。该基因用NheI/Sse8387I消化，并连接至以XbaI/Sse8387I消化的pET16b(Sse)中。将所得到的质粒pMMA121(如图20)导入大肠杆菌BL21(DE3)，且如下培养该重组大肠杆菌(BL21(DE3)/pMMA121)。将BL21(DE3)/pET16b(对照载体)或BL21(DE3)/pMMA121接种在补充了氨苄青霉素(0.1mg/ml)的LB培养基中，在37℃下，在试管中生长过夜。将过夜培养的等分试样转移至烧瓶中的100ml相同培养基中，在37℃振荡2-3h。将IPTG(最终1mM)加入烧瓶中，该培养物在20℃下振荡、孵育过夜。
通过离心收集细胞，并悬浮在0.1M磷酸钠缓冲液(pH为7.0)中，然后通过超声破碎。将破碎的大肠杆菌细胞离心成上层清液和颗粒部分，且分析载体对照组和包含pMMA121的细胞二者的ACO(酰基辅酶氧化酶)活性(参见图21)，且通过SDS-PAGE分析ACX4蛋白质的表达(参见图22)。图21表明，在缓冲液中只存在IBA-CoA，在包含仅有未经改变的质粒pET16b的细胞的样品中存在IBA-CoA以及少量CoA，在含有包含质粒pMMA121的细胞的样品中存在MMA-CoA，少得多的IBA-CoA和未知化合物。因此，在BL21/pMMA121的上层清液部分中检测到高ACO活性，表明甲基丙烯酰辅酶A的产生，表明图22中通过SDS-PAGE检测到的40kDa蛋白质是ACX4蛋白质。该SDS-PAGE表明：道1-BL21/pET16b(载体)SF(可溶部分)；道2-BL21/pMMA121SF；道3-BL21/pET16b IF(不溶部分)；道4-BL21/pMMA121IF；以及道5–分子量标记。大约40kDa仅在BL21/pMMA121道中，而未在BL21/pET16b(载体)道中观察到条带(以黑框强调)。
如下从铜绿假单胞菌PA01菌株中克隆BCKAD复合物基因。通过PCR方法，通过引物BCKAD.F和BCKAD.R(在表1.1.3)，使用基因组DNA作为模板，获得含有编码BCKAD复合物的完整基因操纵子的DNA片段。用限制性酶BspHI和Sse8387I消化所获得的片段，并将其***载体pET16b(Sse)的NcoI/Sse8387I(pET16b的BamH位点被转化成Sse8387I位点)之间。所得到的质粒命名为pWA008(参见图23)。
如下构建表达苹果AAT和拟南芥ACX4的质粒。包含AAT或ACX4基因的DNA片段，通过PCR方法，分别通过引物AAT.F和AAT.R或ACX4.F和ACX4.R(在表1.1.3)，使用包含经密码子优化的AAT基因或Pmma121作为模板，来扩增。通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒(TakaraBio)，用限制酶NcoI和Sse8387I消化pET(Sse)载体，并将其与包含ATT基因的DNA片段连接。通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒，用限制性酶SpeI消化所得的质粒pAAT212，且与包含ACX4基因的DNA片段连接。所得到的质粒pMMA133包含T7启动子控制的AAT和ACX4基因(参见图23)。
如下构建用于表达BCKAD、AAT和ACX4的质粒。用限制性酶SpeI和Sse8387I消化质粒pMMA133，并得到经线性化的DNA片段。用限制性酶XbaI和Sse8387I消化质粒pWA008，且分离包含BCKAD复合物基因的5.0kb片段。该两个片段用DNA连接试剂盒“Mighty Mix”(由Takara Bio Inc.制造)连接。所得到的pMMA134质粒(参见图23)被引入大肠杆菌BL21(DE3)中，以用于甲基丙烯酸丁酯生产的实验。
以基本与上所描述的关于ACX4表达的相同的方式培养大肠杆菌BL21(DE3)/pMMA134。通过离心收集细胞，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH为7.0)冲洗，并悬浮在相同的缓冲液中，来得到细胞悬浮液。通过使用该细胞悬浮液，在各小瓶中制备大约1ml的静息细胞反应溶液，其含有40mM的2-酮异戊酸(2-氧代异戊酸)、60ml的丁醇、0.05M的磷酸钠缓冲液(pH7.0)和细胞(OD650＝12.5)。该反应在30℃、180rpm下进行3到44小时，且向小瓶中加入1ml的乙腈，并充分混合，以停止反应。使用注射过滤器DISMIC/孔径0.45微米(由ADVANTEC制造)进行过滤后，通过HPLC在ODS柱上进行分析。该HPLC条件如下：装置:Waters 2695,柱:CAPCELL PAK C18 UG120,2.0mmI.D.x 250mm,流动相:0.1％磷酸/65％甲醇,流量:0.25ml/min,运行时间:12min,柱温度:35℃和检测:UV 210nm。图24表示以下化学品随着发酵时间的浓度:■,2-酮异戊酸(2-OIV)；▲,异丁酸(IBA)；◆,甲基丙烯酸丁酯(BMA):以及×,甲基丙烯酸(MAA)。随着2-酮异戊酸(2-氧代异戊酸)原料的浓度的降低，途径中的中间体异丁酸的产生增加，最终酯产物甲基丙烯酸丁酯的产生也增加。
该实施例表明，从生物中间体2-酮异戊酸(2-氧代异戊酸)(其直接来自葡萄糖)和反应物丁醇(其为普通的工业原料)可以体内产生甲基丙烯酸的衍生物(甲基丙烯酸丁酯)。在工业应用水平上，从培养重组大肠杆菌证实了甲基丙烯酸丁酯的生产，该重组大肠杆菌表达BCKAD操纵子将2-酮异戊酸转化为异丁酰辅酶A，表达ACX4氧化酶将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A，表达AA通过与丁醇反应将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸丁酯。
请注意所有与本说明书同时或在此之前提出的与本申请有关的，以及用本说明书公开给公众查阅的所有研究报告和文件，所有这些研究报告和文件的内容皆以引用的方式纳入本文中。
所有在本说明书(包含所附申请专利范围、摘要以及图的任一)中公开的特征，及/或所有如此公开的任何方法或程序的步骤，皆可以以任何组合方式组合，除这些特征及/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。
除非另有明确说明，在本说明书(包含任何所附权利要求、摘要以及附图)中公开的每个特征可以被用于相同、相等或类似目的的替代特征所替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅是一系列通用的等同或类似特征的一个例子。
本发明并不限于以上具体实施方式。本发明扩展至本说明书(包含所附申请专利范围、摘要以及图的任一)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或者如此公开的任何方法或程序的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。
序列表
<110> 卢塞特英国国际有限公司
<120> 生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法
<130> P31059WO
<150> GB1508582.2
<151> 2015-05-19
<150> GB1517545.8
<151> 2015-10-05
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimised 4-hydroxybenzoyl-coA thioesterase (4HBT) fromArthrobacter sp. strain SU
<400> 1
tatacatatg caccgtacct ctaacggttc tcacgcgacc ggtggtaacc tgccggatgt 60
tgcttctcat tacccggttg cgtacgaaca gaccctggac ggcaccgtgg gtttcgttat 120
cgacgaaatg accccggaac gtgcgaccgc gtctgttgaa gttaccgaca ccctgcgtca 180
gcgttggggt ctggttcacg gtggtgctta ctgcgcactg gcggagatgc tggcgaccga 240
agcgaccgtt gcggttgtgc acgaaaaggg tatgatggcg gttggccagt ctaaccacac 300
ctctttcttc cgtccggtta aagaaggtca cgttcgcgcg gaagctgttc gcatccacgc 360
gggttctacc acctggttct gggacgtttc cctgcgcgat gatgcgggtc gcctgtgtgc 420
ggtgtcttct atgtctatcg cggtgcgtcc gcgtcgtgac taagcggccg c 471
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HHT.F forward primer for cloning of 4-HBT
<400> 2
tatacatatg caccgtacct ctaacggttc tcacgc 36
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HHT.R reverse primer for cloning of 4HBT
<400> 3
ctcgagtccg tcacgacgcg gacg 24
<210> 4
<211> 469
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Product of the PCR performed to modify the 4HBT gene for subcloning into the pET20b(+) plasmid to form the pET20b(+)::CtHis 4HBT plasmid.
<400> 4
tatacatatg caccgtacct ctaacggttc tcacgcgacc ggtggtaacc tgccggatgt 60
tgcttctcat tacccggttg cgtacgaaca gaccctggac ggcaccgtgg gtttcgttat 120
cgacgaaatg accccggaac gtgcgaccgc gtctgttgaa gttaccgaca ccctgcgtca 180
gcgttggggt ctggttcacg gtggtgctta ctgcgcactg gcggagatgc tggcgaccga 240
agcgaccgtt gcggttgtgc acgaaaaggg tatgatggcg gttggccagt ctaaccacac 300
ctctttcttc cgtccggtta aagaaggtca cgttcgcgcg gaagctgttc gcatccacgc 360
gggttctacc acctggttct gggacgtttc cctgcgcgat gatgcgggtc gcctgtgtgc 420
ggtgtcttct atgtctatcg cggtgcgtcc gcgtcgtgac ggactcgag 469
<210> 5
<211> 483
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> carboxy-terminal hexahistidine tagged 4HBT in the pET20b(+)::CtHis-4HBT plasmid
<400> 5
atgcaccgta cctctaacgg ttctcacgcg accggtggta acctgccgga tgttgcttct 60
cattacccgg ttgcgtacga acagaccctg gacggcaccg tgggtttcgt tatcgacgaa 120
atgaccccgg aacgtgcgac cgcgtctgtt gaagttaccg acaccctgcg tcagcgttgg 180
ggtctggttc acggtggtgc ttactgcgca ctggcggaga tgctggcgac cgaagcgacc 240
gttgcggttg tgcacgaaaa gggtatgatg gcggttggcc agtctaacca cacctctttc 300
ttccgtccgg ttaaagaagg tcacgttcgc gcggaagctg ttcgcatcca cgcgggttct 360
accacctggt tctgggacgt ttccctgcgc gatgatgcgg gtcgcctgtg tgcggtgtct 420
tctatgtcta tcgcggtgcg tccgcgtcgt gacggactcg agcaccacca ccaccaccac 480
tga 483
<210> 6
<211> 1320
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimised acyl-coA oxidase 4 (ACX4) from Arabidopsis thaliana
<400> 6
catatggcag ttctgagcag cgcagatcgt gcaagcaatg aaaaaaaagt gaaaagcagc 60
tatttcgacc tgcctccgat ggaaatgagc gttgcatttc cgcaggcaac accggcaagc 120
acctttccgc cttgtaccag cgattattat cattttaatg atctgctgac ccctgaagaa 180
caggccattc gtaaaaaagt tcgtgagtgc atggaaaaag aagtggcacc gattatgacc 240
gaatattggg aaaaagcaga attcccgttt catattaccc cgaaactggg tgcaatgggt 300
gttgccggtg gtagcattaa aggttatggt tgtccgggtc tgagcattac cgcaaatgca 360
attgcaaccg cagaaattgc acgtgttgat gcaagctgta gcacctttat tctggttcat 420
agcagcctgg gtatgctgac cattgcactg tgtggtagcg aagcacagaa agaaaaatat 480
ctgccgagcc tggcacagct gaataccgtt gcatgttggg cactgaccga accggataat 540
ggtagtgatg caagcggtct gggcaccacc gcaaccaaag ttgaaggtgg ttggaaaatt 600
aacggtcaga aacgttggat tggcaatagc acctttgcag atctgctgat tatctttgca 660
cgtaatacca ccaccaatca gattaacggc ttcatcgtta aaaaagatgc accgggtctg 720
aaagcaacca aaattccgaa caaaattggt ctgcgtatgg tgcagaatgg tgatattctg 780
ctgcagaatg tttttgtgcc ggatgaagat cgtctgcctg gtgttaatag ctttcaggat 840
accagcaaag ttctggcagt tagccgtgtt atggttgcat ggcagccgat tggtattagc 900
atgggtattt atgatatgtg ccaccgctat ctgaaagaac gtaaacagtt tggtgcaccg 960
ctggcagcat ttcagctgaa tcagcagaaa ctggttcaga tgctgggtaa tgttcaggca 1020
atgtttctga tgggttggcg tctgtgtaaa ctgtatgaaa ccggtcagat gacaccgggt 1080
caggcaagcc tgggtaaagc atggattagc agcaaagcac gtgaaaccgc cagcctgggt 1140
cgtgaactgc tgggtggtaa tggtattctg gcagattttc tggttgcaaa agcattttgt 1200
gatctggaac cgatctatac ctatgaaggc acctatgata tcaataccct ggttaccggt 1260
cgtgaagtta ccggtattgc aagctttaaa ccggcaaccc gtagccgtct gtaactcgag 1320
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OE.A.F forward primer for overlap extension polymerase chainreaction A
<400> 7
acatatgcac cgtacctcta acggttc 27
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OE.A.R reverse primer for overlap extension polymerisation chainreaction B
<400> 8
ctgccatatc tatatctcct gttagtcacg acgcggacg 39
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OE.B.F forward primer for overlap extension polymerase chainreaction B
<400> 9
gtgactaaca ggagatatag atatggcagt tctgagcagc 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OE.B.R reverse primer for overlap polymerase chain reaction B
<400> 10
ctcgagatat tatagctagc ttacagacgg ctacgggttg 40
<210> 11
<211> 1805
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> product of the overlap polymerase chain reaction to concatenate4HBT and ACX4 into one polynucleotide
<400> 11
acatatgcac cgtacctcta acggttctca cgcgaccggt ggtaacctgc cggatgttgc 60
ttctcattac ccggttgcgt acgaacagac cctggacggc accgtgggtt tcgttatcga 120
cgaaatgacc ccggaacgtg cgaccgcgtc tgttgaagtt accgacaccc tgcgtcagcg 180
ttggggtctg gttcacggtg gtgcttactg cgcactggcg gagatgctgg cgaccgaagc 240
gaccgttgcg gttgtgcacg aaaagggtat gatggcggtt ggccagtcta accacacctc 300
tttcttccgt ccggttaaag aaggtcacgt tcgcgcggaa gctgttcgca tccacgcggg 360
ttctaccacc tggttctggg acgtttccct gcgcgatgat gcgggtcgcc tgtgtgcggt 420
gtcttctatg tctatcgcgg tgcgtccgcg tcgtgactaa caggagatat agatatggca 480
gttctgagca gcgcagatcg tgcaagcaat gaaaaaaaag tgaaaagcag ctatttcgac 540
ctgcctccga tggaaatgag cgttgcattt ccgcaggcaa caccggcaag cacctttccg 600
ccttgtacca gcgattatta tcattttaat gatctgctga cccctgaaga acaggccatt 660
cgtaaaaaag ttcgtgagtg catggaaaaa gaagtggcac cgattatgac cgaatattgg 720
gaaaaagcag aattcccgtt tcatattacc ccgaaactgg gtgcaatggg tgttgccggt 780
ggtagcatta aaggttatgg ttgtccgggt ctgagcatta ccgcaaatgc aattgcaacc 840
gcagaaattg cacgtgttga tgcaagctgt agcaccttta ttctggttca tagcagcctg 900
ggtatgctga ccattgcact gtgtggtagc gaagcacaga aagaaaaata tctgccgagc 960
ctggcacagc tgaataccgt tgcatgttgg gcactgaccg aaccggataa tggtagtgat 1020
gcaagcggtc tgggcaccac cgcaaccaaa gttgaaggtg gttggaaaat taacggtcag 1080
aaacgttgga ttggcaatag cacctttgca gatctgctga ttatctttgc acgtaatacc 1140
accaccaatc agattaacgg cttcatcgtt aaaaaagatg caccgggtct gaaagcaacc 1200
aaaattccga acaaaattgg tctgcgtatg gtgcagaatg gtgatattct gctgcagaat 1260
gtttttgtgc cggatgaaga tcgtctgcct ggtgttaata gctttcagga taccagcaaa 1320
gttctggcag ttagccgtgt tatggttgca tggcagccga ttggtattag catgggtatt 1380
tatgatatgt gccaccgcta tctgaaagaa cgtaaacagt ttggtgcacc gctggcagca 1440
tttcagctga atcagcagaa actggttcag atgctgggta atgttcaggc aatgtttctg 1500
atgggttggc gtctgtgtaa actgtatgaa accggtcaga tgacaccggg tcaggcaagc 1560
ctgggtaaag catggattag cagcaaagca cgtgaaaccg ccagcctggg tcgtgaactg 1620
ctgggtggta atggtattct ggcagatttt ctggttgcaa aagcattttg tgatctggaa 1680
ccgatctata cctatgaagg cacctatgat atcaataccc tggttaccgg tcgtgaagtt 1740
accggtattg caagctttaa accggcaacc cgtagccgtc tgtaagctag ctataatatc 1800
tcgag 1805
<210> 12
<211> 1663
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimised acyl-CoA synthetase (acsA) from Pseudomonas chlororaphisB23
<400> 12
gctagcagga gatatacata tgcgcgacta cgaacacgtt gtggaatctt tcgactacct 60
gcagagcgca acccaggacc tgcatggcga actgactgct ctgaacgcgt gtgtggagtg 120
ctgtgatcgt cacgcgcacg gcgaggctgt tgctctgtat tgcgaagcgc aggatggcca 180
cgcggaacgc taccgtttcc gcgatctgca gcgccaggct gcacgttttg gcaacttcct 240
gcgtgagcag ggcgtgaaac cgggcgaccg tgttgcgggc ctgatgccgc gtaccgtgga 300
actgctgatc gcaatcctgg gcacttggcg catcggtgcg gtttatcagc cgctgtttac 360
tgcgttcggt ccgaaagcaa ttgagcagcg tctgaactgt tctaacgcac gctggattgt 420
gaccgatccg cacaaccgcc cgaaactgga cgacgttacc gactgcccgt ctattgtggt 480
taccggtggc gcaccgcaga acccggcaga ccatcacttt tggtccgcac tgaaccgtca 540
ggcggatgac tgtgcgccgg tgctgctgga cgcatctgca ccgttcctgc tgatgtgcac 600
ctccggcacc actggtccgg caaagccgct ggaagttccg ctgtctgcga ttctggcatt 660
taaaggttac atgcgtgatg caatcgacct gcgcgctgat gatcgcttct ggaacctggc 720
agatccgggt tgggcatacg gtctgtacta cgcggtgact ggcccgctgg cgtgtggcta 780
cgcgaccctg ttttacgacg gtccgttcac tgttgaatcc acccgtcaca tcatcgcgaa 840
atacgcgatt aacaacctgg cgggtagccc gaccgcttac cgctttctga ttgctgcagg 900
cgcggaattt gcggacgctg ttcgtggtcg tctgcgtgca gttagcagcg cgggtgaacc 960
gctgaacccg caggtggttc gttggtttgc tgaacagctg ggtgttgtta tccatgacca 1020
ctatggtcag accgaaattg gtatggttct gtgcaaccac cacggcctgc gtcacccggt 1080
tcgcgagggt agcgctggct atgcagtgcc gggctatcgt atcgtggtgc tggataaagc 1140
acaccgtgag ctgccggctg gtcagccggg tgttctggcg gtggaccgtg aacgctcccc 1200
gctgtgctgg tttgacggct acctgggtat gccgactcag gcgttcgcgg gtcgttatta 1260
cctgtctggt gatatcgttg aactgaacga cgatggcagc atctctttcg tgggtcgcaa 1320
cgatgatctg atcaccacct ctggttatcg tgtgggcccg ttcgacgttg agtctgcact 1380
gattgaacat ccggcagttg ttgaagctgc tgttatcggt aaaccggacc cgcagcgtac 1440
tgagctgatt aaagcgtttg ttgttctgaa cactccgtac ctgccgagcc cggaactggc 1500
ggaagaactg cgtctgcatg ttcgtcagcg cctggctgcg cacgcatatc cgcgcgagat 1560
ggagtttgtg gaccatctgc cgaaaacccc gtctggcaaa ctgcagcgtt tcattctgcg 1620
taaccaggaa atcgctaagc agcaggctct gggttaactc gag 1663
<210> 13
<211> 3447
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence between, and inclusive of, the NdeI and XhoIrestriction sites in pET20b(+)::4HBT ACX4 AcsA.
<400> 13
catatgcacc gtacctctaa cggttctcac gcgaccggtg gtaacctgcc ggatgttgct 60
tctcattacc cggttgcgta cgaacagacc ctggacggca ccgtgggttt cgttatcgac 120
gaaatgaccc cggaacgtgc gaccgcgtct gttgaagtta ccgacaccct gcgtcagcgt 180
tggggtctgg ttcacggtgg tgcttactgc gcactggcgg agatgctggc gaccgaagcg 240
accgttgcgg ttgtgcacga aaagggtatg atggcggttg gccagtctaa ccacacctct 300
ttcttccgtc cggttaaaga aggtcacgtt cgcgcggaag ctgttcgcat ccacgcgggt 360
tctaccacct ggttctggga cgtttccctg cgcgatgatg cgggtcgcct gtgtgcggtg 420
tcttctatgt ctatcgcggt gcgtccgcgt cgtgactaac aggagatata gatatggcag 480
ttctgagcag cgcagatcgt gcaagcaatg aaaaaaaagt gaaaagcagc tatttcgacc 540
tgcctccgat ggaaatgagc gttgcatttc cgcaggcaac accggcaagc acctttccgc 600
cttgtaccag cgattattat cattttaatg atctgctgac ccctgaagaa caggccattc 660
gtaaaaaagt tcgtgagtgc atggaaaaag aagtggcacc gattatgacc gaatattggg 720
aaaaagcaga attcccgttt catattaccc cgaaactggg tgcaatgggt gttgccggtg 780
gtagcattaa aggttatggt tgtccgggtc tgagcattac cgcaaatgca attgcaaccg 840
cagaaattgc acgtgttgat gcaagctgta gcacctttat tctggttcat agcagcctgg 900
gtatgctgac cattgcactg tgtggtagcg aagcacagaa agaaaaatat ctgccgagcc 960
tggcacagct gaataccgtt gcatgttggg cactgaccga accggataat ggtagtgatg 1020
caagcggtct gggcaccacc gcaaccaaag ttgaaggtgg ttggaaaatt aacggtcaga 1080
aacgttggat tggcaatagc acctttgcag atctgctgat tatctttgca cgtaatacca 1140
ccaccaatca gattaacggc ttcatcgtta aaaaagatgc accgggtctg aaagcaacca 1200
aaattccgaa caaaattggt ctgcgtatgg tgcagaatgg tgatattctg ctgcagaatg 1260
tttttgtgcc ggatgaagat cgtctgcctg gtgttaatag ctttcaggat accagcaaag 1320
ttctggcagt tagccgtgtt atggttgcat ggcagccgat tggtattagc atgggtattt 1380
atgatatgtg ccaccgctat ctgaaagaac gtaaacagtt tggtgcaccg ctggcagcat 1440
ttcagctgaa tcagcagaaa ctggttcaga tgctgggtaa tgttcaggca atgtttctga 1500
tgggttggcg tctgtgtaaa ctgtatgaaa ccggtcagat gacaccgggt caggcaagcc 1560
tgggtaaagc atggattagc agcaaagcac gtgaaaccgc cagcctgggt cgtgaactgc 1620
tgggtggtaa tggtattctg gcagattttc tggttgcaaa agcattttgt gatctggaac 1680
cgatctatac ctatgaaggc acctatgata tcaataccct ggttaccggt cgtgaagtta 1740
ccggtattgc aagctttaaa ccggcaaccc gtagccgtct gtaagctagc aggagatata 1800
catatgcgcg actacgaaca cgttgtggaa tctttcgact acctgcagag cgcaacccag 1860
gacctgcatg gcgaactgac tgctctgaac gcgtgtgtgg agtgctgtga tcgtcacgcg 1920
cacggcgagg ctgttgctct gtattgcgaa gcgcaggatg gccacgcgga acgctaccgt 1980
ttccgcgatc tgcagcgcca ggctgcacgt tttggcaact tcctgcgtga gcagggcgtg 2040
aaaccgggcg accgtgttgc gggcctgatg ccgcgtaccg tggaactgct gatcgcaatc 2100
ctgggcactt ggcgcatcgg tgcggtttat cagccgctgt ttactgcgtt cggtccgaaa 2160
gcaattgagc agcgtctgaa ctgttctaac gcacgctgga ttgtgaccga tccgcacaac 2220
cgcccgaaac tggacgacgt taccgactgc ccgtctattg tggttaccgg tggcgcaccg 2280
cagaacccgg cagaccatca cttttggtcc gcactgaacc gtcaggcgga tgactgtgcg 2340
ccggtgctgc tggacgcatc tgcaccgttc ctgctgatgt gcacctccgg caccactggt 2400
ccggcaaagc cgctggaagt tccgctgtct gcgattctgg catttaaagg ttacatgcgt 2460
gatgcaatcg acctgcgcgc tgatgatcgc ttctggaacc tggcagatcc gggttgggca 2520
tacggtctgt actacgcggt gactggcccg ctggcgtgtg gctacgcgac cctgttttac 2580
gacggtccgt tcactgttga atccacccgt cacatcatcg cgaaatacgc gattaacaac 2640
ctggcgggta gcccgaccgc ttaccgcttt ctgattgctg caggcgcgga atttgcggac 2700
gctgttcgtg gtcgtctgcg tgcagttagc agcgcgggtg aaccgctgaa cccgcaggtg 2760
gttcgttggt ttgctgaaca gctgggtgtt gttatccatg accactatgg tcagaccgaa 2820
attggtatgg ttctgtgcaa ccaccacggc ctgcgtcacc cggttcgcga gggtagcgct 2880
ggctatgcag tgccgggcta tcgtatcgtg gtgctggata aagcacaccg tgagctgccg 2940
gctggtcagc cgggtgttct ggcggtggac cgtgaacgct ccccgctgtg ctggtttgac 3000
ggctacctgg gtatgccgac tcaggcgttc gcgggtcgtt attacctgtc tggtgatatc 3060
gttgaactga acgacgatgg cagcatctct ttcgtgggtc gcaacgatga tctgatcacc 3120
acctctggtt atcgtgtggg cccgttcgac gttgagtctg cactgattga acatccggca 3180
gttgttgaag ctgctgttat cggtaaaccg gacccgcagc gtactgagct gattaaagcg 3240
tttgttgttc tgaacactcc gtacctgccg agcccggaac tggcggaaga actgcgtctg 3300
catgttcgtc agcgcctggc tgcgcacgca tatccgcgcg agatggagtt tgtggaccat 3360
ctgccgaaaa ccccgtctgg caaactgcag cgtttcattc tgcgtaacca ggaaatcgct 3420
aagcagcagg ctctgggtta actcgag 3447
<210> 14
<211> 4996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ppBCKD polynucleotide containing the four genes encoding thesubunits of the Pseudomonas putida KT2440 branched chain keto aciddehydrogenase delivered in the pBSK::ppBCKD plasmid
<400> 14
tctagaaata attttgttta actgctagca ggagaaatta actatgaacg agtacgcccc 60
cctgcgtttg catgtgcccg agcccaccgg ccggccaggc tgccagaccg atttttccta 120
cctgcgcctc aacgatgcag gtcaagcccg taaacccgcg atcgatgtcg atgctgccga 180
cactgccgac ctgtcctaca gcctggtccg cgtgctcgac gagcaaggcg atgcgcaagg 240
cccctgggcc gaagacatcg acccgcagat cctccgtcaa ggcatgcgcg ccatgctcaa 300
gacgcggatc ttcgacagcc gcatggtggt tgcccagcgc cagaagaaga tgtccttcta 360
catgcaaagc ctgggcgaag aagccatcgg cagcggccag gcgctggcgc tgaaccgcac 420
cgacatgtgc ttcccgacct accgccagca aagcatcctg atggcccgcg acgtgtcgct 480
ggtcgagatg atctgccaac tgctgtccaa cgagcgcgac cccctcaagg gccgccagtt 540
gccgatcatg tattcggtgc gcgaagccgg cttcttcacc atcagcggca acctggcgac 600
ccagttcgtg caggcggtcg gctgggccat ggcatcggcg atcaagggcg ataccaagat 660
cgcctcggca tggatcggtg acggcgctac tgccgagtcg gacttccaca ccgcccttac 720
ctttgcccac gtataccgcg ccccggtcat cctcaacgtg gtcaacaacc aatgggccat 780
ttccaccttc caggccatcg ccggtggcga gtcgaccacc tttgccggcc gtggcgtggg 840
ttgcggtatt gcttcgctgc gggttgacgg caacgacttc gtcgccgtgt acgctgcctc 900
gcgctgggcg gccgagcgcg cccgccgcgg cctgggccca agcctgatcg agtgggtcac 960
ctaccgtgcc ggcccgcact cgacgtcgga cgacccctcc aagtaccgcc ctgccgacga 1020
ctggagccac ttcccgctgg gtgacccgat cgcccgcctg aagcagcacc tgatcaagat 1080
cggccactgg tccgaggaag aacaccaggc cgtcacggcc gagctcgaag ctgcggtgat 1140
tgccgcacag aaagaagccg agcagtacgg caccctggcc aacgggcaca tcccgagcgc 1200
cgcctcgatg ttcgaggatg tgtacaagga aatgcccgac cacctgcgcc gtcaacgcca 1260
ggaactgggg gtttgagatg aacgaccaca acaacagcat caacccggaa accgccatgg 1320
ccaccactac catgaccatg atccaggccc tgcgctcggc catggatgtc atgcttgagc 1380
gcgacgacaa tgtggtggtg tacggccagg acgtcggtta cttcggcggc gtgttccgct 1440
gcaccgaagg cctgcagaac aagtacggca aatcgcgcgt gttcgacgcg cccatctccg 1500
agagcggcat cgtcggtacc gccgtgggca tgggtgccta tggcctgcgc ccggtggtgg 1560
agatccagtt cgccgactac ttctacccgg cctccgacca gatcgtctcc gagctggccc 1620
gcctgcgtta ccgttcggcc ggcgagttca ttgccccgct gaccctgcgc atgccttgcg 1680
gcggcggcat ctatggcggc cagactcaca gccagagccc ggaagcgatg ttcacccagg 1740
tgtgcggcct gcgcaccgtg atgccgtcca acccttatga cgccaaaggc ctgttgattg 1800
cctcgatcga atgcgacgac ccggtaatct tcctggagcc caaacgcctg tacaacggcc 1860
cgttcgatgg ccaccacgac cgccctgtaa ccccgtggtc gaagcacccg cacagcgccg 1920
tgcccgacgg ttattacacc gtaccgctgg acaaggccgc cattacccgc cctggcaatg 1980
acgtgaccgt gctgacctac ggcaccacgg tgtacgtggc ccaggtggcc gccgaagaaa 2040
gcggcgtcga tgccgaagtg atcgacctgc gcagcctgtg gccgctggac ctggacacta 2100
tcgtcgagtc ggtgaaaaag accggccgtt gcgtggtggt gcacgaggcc acccgcacct 2160
gcggcttcgg tgccgagctg gtgtcgctgg tgcaggagca ctgcttccac cacctggagg 2220
cgccgatcga acgcgtcacc ggctgggaca ccccctaccc tcacgcacag gaatgggctt 2280
acttcccagg cccttcgcgg gtaggtgcgg cactgaaaaa ggtcatggag gtctgaatgg 2340
gcacgcacgt catcaagatg ccggacattg gcgaaggcat cgcgcaggtc gagttggtgg 2400
aatggttcgt caaggtcggc gacatcatcg ccgaggacca ggtggtggcc gacgtcatga 2460
ccgacaaggc caccgtggaa atcccctcgc cggtcagcgg caaggtgttg gccctgggtg 2520
gccagcccgg ggaagtgatg gcggtcggta gcgaactgat ccgcatcgaa gtggaaggca 2580
gcggcaacca tgtggatgtg cctcagccaa aaccggtaga ggccccggct gcccccattg 2640
cagccaagcc ggaaccgcag aaagacgtaa aacccgccgt gtaccaggcg cccgccaacc 2700
acgaagctgc gcccatcgtg ccgcgccagc cgggcgacaa gccgctggcc tcgcctgccg 2760
tgcgcaaacg cgccctggac gccggtatcg aactgcgtta tgtgcatggt agcggcccgg 2820
ccgggcgtat tctgcacgaa gacctcgatg ccttcatgag caagccgcaa agcaatgccg 2880
ggcaagcacc tgatggttat gccaagcgca ccgacagcga gcaggtgcca gtgatcggcc 2940
tgcgccgcaa gattgcccag cgcatgcagg acgccaaacg ccgggtcgcg cacttcagtt 3000
atgtcgagga aatcgacgtc accgccctgg aggccctgcg ccagcaactc aacagcaagc 3060
acggcgacag ccggggcaag ctgaccttgc tgccattcct ggtacgcgcc ctggtcgtgg 3120
cgctgcgtga cttcccgcag atcaacgcga cctacgatga cgaagcgcag atcatcaccc 3180
gccatggcgc ggtgcatgtg ggcattgcca cccaaggtga caacggcctg atggtgcccg 3240
tgctgcgcca cgccgaagcg ggcagcctgt gggccaatgc cggcgagatt tcgcgcctgg 3300
ccaacgctgc acgtaacaac aaggccagcc gtgaagagct gtccggctcg accatcaccc 3360
tgaccagcct tggcgccctg ggtggcattg tcagcacgcc ggtggtcaac accccggaag 3420
tggcaatcgt cggggtcaac cgcatggtcg aacggccagt ggtgatcgac ggccagatcg 3480
tcgtgcgcaa gatgatgaac ctgtccagct cgttcgacca ccgcgtggtc gatggcatgg 3540
atgccgccct gttcatccag gccgtacgtg gcctgctcga acaacccgcc tgcctgttcg 3600
tggagtgagc atgcaacaga ttatccagac taccctgttg atcatcggcg gcggccctgg 3660
cggctatgta gcagccatcc gcgccgggca actgggcatt cctaccgtac tggtggaagg 3720
ccaggcactg ggcggcacct gcctgaacat cggctgcatc ccgtccaagg cgctgatcca 3780
cgtggccgag cagtttcacc aggcctcgcg ctttaccgaa ccctcgccgc tgggcatcag 3840
cgtggcttcg ccgcgcctgg acatcggcca gagcgtcacc tggaaggacg gcattgtcga 3900
ccgcctgacc acaggtgttg ccgccctgct gaaaaagcac ggggtgaaag tggtgcatgg 3960
ttgggccaag gtactggacg gcaagcaggt cgaggtcgat ggccagcgta tccagtgcga 4020
gcatctgttg ctggcgaccg gttccagcag tgtcgaactg cctatgctgc cgctgggtgg 4080
cccggtgatt tcctcgaccg aagccctggc gccgaaaacc ctgccgcaac acctggtggt 4140
ggtcggcggt ggctatatcg gcctggagct gggcattgcc tatcgcaagc tgggtgcaca 4200
ggtgagtgtg gtggaagcgc gggagcgcat cctgccgacc tacgacagcg aattgaccgc 4260
cccggtggcc gagtcgctga agaaactggg catagcgttg cacctgggcc acagcgtcga 4320
gggctacgaa aatggctgcc tgctggccag cgacggcaag ggtgggcaac tgcgccttga 4380
ggccgaccag gtactggtgg ccgtgggacg ccggccacgc accaagggct tcaacctgga 4440
atgcctggac ctgaagatga acggcgccgc cattgccatc gacgagcgct gtcacaccag 4500
catgcacaac gtctgggcca tcggcgacgt cgctggcgaa ccgatgctgg cgcaccgggc 4560
catggcccag ggcgagatgg tcgccgaaat catcgccggc aaggcccgac gctttgaacc 4620
gacagcgatt gccgccgtgt gctttaccga cccggaagtg gtggtggtcg gcaagacccc 4680
ggaacaagcc agccagcagg gcctggactg catcgtcgcg cagttcccgt ttgccgccaa 4740
tggccgggcc atgagcctgg aatcgaaaag cggtttcgtg cgggtggtgg cgcgccgtga 4800
caaccacctg atcgtgggtt ggcaggcggt tggcgtggcg gtctccgagc tatccaccgc 4860
gtttgcccaa tcgctggaga tgggcgcgtg cctggaagat gtggccggta ccattcatgc 4920
ccacccaacg ctcggtgaag cggtacagga agccgcactg cgcgccctgg gccacgcctt 4980
gcatatctga ctcgag 4996
<210> 15
<211> 6758
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence between, and inclusive of, the NdeI and XhoIrestriction sites in the pET20b(+)::4HBT ACX4 ppBCKD plasmid
<400> 15
acatatgcac cgtacctcta acggttctca cgcgaccggt ggtaacctgc cggatgttgc 60
ttctcattac ccggttgcgt acgaacagac cctggacggc accgtgggtt tcgttatcga 120
cgaaatgacc ccggaacgtg cgaccgcgtc tgttgaagtt accgacaccc tgcgtcagcg 180
ttggggtctg gttcacggtg gtgcttactg cgcactggcg gagatgctgg cgaccgaagc 240
gaccgttgcg gttgtgcacg aaaagggtat gatggcggtt ggccagtcta accacacctc 300
tttcttccgt ccggttaaag aaggtcacgt tcgcgcggaa gctgttcgca tccacgcggg 360
ttctaccacc tggttctggg acgtttccct gcgcgatgat gcgggtcgcc tgtgtgcggt 420
gtcttctatg tctatcgcgg tgcgtccgcg tcgtgactaa caggagatat agatatggca 480
gttctgagca gcgcagatcg tgcaagcaat gaaaaaaaag tgaaaagcag ctatttcgac 540
ctgcctccga tggaaatgag cgttgcattt ccgcaggcaa caccggcaag cacctttccg 600
ccttgtacca gcgattatta tcattttaat gatctgctga cccctgaaga acaggccatt 660
cgtaaaaaag ttcgtgagtg catggaaaaa gaagtggcac cgattatgac cgaatattgg 720
gaaaaagcag aattcccgtt tcatattacc ccgaaactgg gtgcaatggg tgttgccggt 780
ggtagcatta aaggttatgg ttgtccgggt ctgagcatta ccgcaaatgc aattgcaacc 840
gcagaaattg cacgtgttga tgcaagctgt agcaccttta ttctggttca tagcagcctg 900
ggtatgctga ccattgcact gtgtggtagc gaagcacaga aagaaaaata tctgccgagc 960
ctggcacagc tgaataccgt tgcatgttgg gcactgaccg aaccggataa tggtagtgat 1020
gcaagcggtc tgggcaccac cgcaaccaaa gttgaaggtg gttggaaaat taacggtcag 1080
aaacgttgga ttggcaatag cacctttgca gatctgctga ttatctttgc acgtaatacc 1140
accaccaatc agattaacgg cttcatcgtt aaaaaagatg caccgggtct gaaagcaacc 1200
aaaattccga acaaaattgg tctgcgtatg gtgcagaatg gtgatattct gctgcagaat 1260
gtttttgtgc cggatgaaga tcgtctgcct ggtgttaata gctttcagga taccagcaaa 1320
gttctggcag ttagccgtgt tatggttgca tggcagccga ttggtattag catgggtatt 1380
tatgatatgt gccaccgcta tctgaaagaa cgtaaacagt ttggtgcacc gctggcagca 1440
tttcagctga atcagcagaa actggttcag atgctgggta atgttcaggc aatgtttctg 1500
atgggttggc gtctgtgtaa actgtatgaa accggtcaga tgacaccggg tcaggcaagc 1560
ctgggtaaag catggattag cagcaaagca cgtgaaaccg ccagcctggg tcgtgaactg 1620
ctgggtggta atggtattct ggcagatttt ctggttgcaa aagcattttg tgatctggaa 1680
ccgatctata cctatgaagg cacctatgat atcaataccc tggttaccgg tcgtgaagtt 1740
accggtattg caagctttaa accggcaacc cgtagccgtc tgtaagctag caggagaaat 1800
taactatgaa cgagtacgcc cccctgcgtt tgcatgtgcc cgagcccacc ggccggccag 1860
gctgccagac cgatttttcc tacctgcgcc tcaacgatgc aggtcaagcc cgtaaacccg 1920
cgatcgatgt cgatgctgcc gacactgccg acctgtccta cagcctggtc cgcgtgctcg 1980
acgagcaagg cgatgcgcaa ggcccctggg ccgaagacat cgacccgcag atcctccgtc 2040
aaggcatgcg cgccatgctc aagacgcgga tcttcgacag ccgcatggtg gttgcccagc 2100
gccagaagaa gatgtccttc tacatgcaaa gcctgggcga agaagccatc ggcagcggcc 2160
aggcgctggc gctgaaccgc accgacatgt gcttcccgac ctaccgccag caaagcatcc 2220
tgatggcccg cgacgtgtcg ctggtcgaga tgatctgcca actgctgtcc aacgagcgcg 2280
accccctcaa gggccgccag ttgccgatca tgtattcggt gcgcgaagcc ggcttcttca 2340
ccatcagcgg caacctggcg acccagttcg tgcaggcggt cggctgggcc atggcatcgg 2400
cgatcaaggg cgataccaag atcgcctcgg catggatcgg tgacggcgct actgccgagt 2460
cggacttcca caccgccctt acctttgccc acgtataccg cgccccggtc atcctcaacg 2520
tggtcaacaa ccaatgggcc atttccacct tccaggccat cgccggtggc gagtcgacca 2580
cctttgccgg ccgtggcgtg ggttgcggta ttgcttcgct gcgggttgac ggcaacgact 2640
tcgtcgccgt gtacgctgcc tcgcgctggg cggccgagcg cgcccgccgc ggcctgggcc 2700
caagcctgat cgagtgggtc acctaccgtg ccggcccgca ctcgacgtcg gacgacccct 2760
ccaagtaccg ccctgccgac gactggagcc acttcccgct gggtgacccg atcgcccgcc 2820
tgaagcagca cctgatcaag atcggccact ggtccgagga agaacaccag gccgtcacgg 2880
ccgagctcga agctgcggtg attgccgcac agaaagaagc cgagcagtac ggcaccctgg 2940
ccaacgggca catcccgagc gccgcctcga tgttcgagga tgtgtacaag gaaatgcccg 3000
accacctgcg ccgtcaacgc caggaactgg gggtttgaga tgaacgacca caacaacagc 3060
atcaacccgg aaaccgccat ggccaccact accatgacca tgatccaggc cctgcgctcg 3120
gccatggatg tcatgcttga gcgcgacgac aatgtggtgg tgtacggcca ggacgtcggt 3180
tacttcggcg gcgtgttccg ctgcaccgaa ggcctgcaga acaagtacgg caaatcgcgc 3240
gtgttcgacg cgcccatctc cgagagcggc atcgtcggta ccgccgtggg catgggtgcc 3300
tatggcctgc gcccggtggt ggagatccag ttcgccgact acttctaccc ggcctccgac 3360
cagatcgtct ccgagctggc ccgcctgcgt taccgttcgg ccggcgagtt cattgccccg 3420
ctgaccctgc gcatgccttg cggcggcggc atctatggcg gccagactca cagccagagc 3480
ccggaagcga tgttcaccca ggtgtgcggc ctgcgcaccg tgatgccgtc caacccttat 3540
gacgccaaag gcctgttgat tgcctcgatc gaatgcgacg acccggtaat cttcctggag 3600
cccaaacgcc tgtacaacgg cccgttcgat ggccaccacg accgccctgt aaccccgtgg 3660
tcgaagcacc cgcacagcgc cgtgcccgac ggttattaca ccgtaccgct ggacaaggcc 3720
gccattaccc gccctggcaa tgacgtgacc gtgctgacct acggcaccac ggtgtacgtg 3780
gcccaggtgg ccgccgaaga aagcggcgtc gatgccgaag tgatcgacct gcgcagcctg 3840
tggccgctgg acctggacac tatcgtcgag tcggtgaaaa agaccggccg ttgcgtggtg 3900
gtgcacgagg ccacccgcac ctgcggcttc ggtgccgagc tggtgtcgct ggtgcaggag 3960
cactgcttcc accacctgga ggcgccgatc gaacgcgtca ccggctggga caccccctac 4020
cctcacgcac aggaatgggc ttacttccca ggcccttcgc gggtaggtgc ggcactgaaa 4080
aaggtcatgg aggtctgaat gggcacgcac gtcatcaaga tgccggacat tggcgaaggc 4140
atcgcgcagg tcgagttggt ggaatggttc gtcaaggtcg gcgacatcat cgccgaggac 4200
caggtggtgg ccgacgtcat gaccgacaag gccaccgtgg aaatcccctc gccggtcagc 4260
ggcaaggtgt tggccctggg tggccagccc ggggaagtga tggcggtcgg tagcgaactg 4320
atccgcatcg aagtggaagg cagcggcaac catgtggatg tgcctcagcc aaaaccggta 4380
gaggccccgg ctgcccccat tgcagccaag ccggaaccgc agaaagacgt aaaacccgcc 4440
gtgtaccagg cgcccgccaa ccacgaagct gcgcccatcg tgccgcgcca gccgggcgac 4500
aagccgctgg cctcgcctgc cgtgcgcaaa cgcgccctgg acgccggtat cgaactgcgt 4560
tatgtgcatg gtagcggccc ggccgggcgt attctgcacg aagacctcga tgccttcatg 4620
agcaagccgc aaagcaatgc cgggcaagca cctgatggtt atgccaagcg caccgacagc 4680
gagcaggtgc cagtgatcgg cctgcgccgc aagattgccc agcgcatgca ggacgccaaa 4740
cgccgggtcg cgcacttcag ttatgtcgag gaaatcgacg tcaccgccct ggaggccctg 4800
cgccagcaac tcaacagcaa gcacggcgac agccggggca agctgacctt gctgccattc 4860
ctggtacgcg ccctggtcgt ggcgctgcgt gacttcccgc agatcaacgc gacctacgat 4920
gacgaagcgc agatcatcac ccgccatggc gcggtgcatg tgggcattgc cacccaaggt 4980
gacaacggcc tgatggtgcc cgtgctgcgc cacgccgaag cgggcagcct gtgggccaat 5040
gccggcgaga tttcgcgcct ggccaacgct gcacgtaaca acaaggccag ccgtgaagag 5100
ctgtccggct cgaccatcac cctgaccagc cttggcgccc tgggtggcat tgtcagcacg 5160
ccggtggtca acaccccgga agtggcaatc gtcggggtca accgcatggt cgaacggcca 5220
gtggtgatcg acggccagat cgtcgtgcgc aagatgatga acctgtccag ctcgttcgac 5280
caccgcgtgg tcgatggcat ggatgccgcc ctgttcatcc aggccgtacg tggcctgctc 5340
gaacaacccg cctgcctgtt cgtggagtga gcatgcaaca gattatccag actaccctgt 5400
tgatcatcgg cggcggccct ggcggctatg tagcagccat ccgcgccggg caactgggca 5460
ttcctaccgt actggtggaa ggccaggcac tgggcggcac ctgcctgaac atcggctgca 5520
tcccgtccaa ggcgctgatc cacgtggccg agcagtttca ccaggcctcg cgctttaccg 5580
aaccctcgcc gctgggcatc agcgtggctt cgccgcgcct ggacatcggc cagagcgtca 5640
cctggaagga cggcattgtc gaccgcctga ccacaggtgt tgccgccctg ctgaaaaagc 5700
acggggtgaa agtggtgcat ggttgggcca aggtactgga cggcaagcag gtcgaggtcg 5760
atggccagcg tatccagtgc gagcatctgt tgctggcgac cggttccagc agtgtcgaac 5820
tgcctatgct gccgctgggt ggcccggtga tttcctcgac cgaagccctg gcgccgaaaa 5880
ccctgccgca acacctggtg gtggtcggcg gtggctatat cggcctggag ctgggcattg 5940
cctatcgcaa gctgggtgca caggtgagtg tggtggaagc gcgggagcgc atcctgccga 6000
cctacgacag cgaattgacc gccccggtgg ccgagtcgct gaagaaactg ggcatagcgt 6060
tgcacctggg ccacagcgtc gagggctacg aaaatggctg cctgctggcc agcgacggca 6120
agggtgggca actgcgcctt gaggccgacc aggtactggt ggccgtggga cgccggccac 6180
gcaccaaggg cttcaacctg gaatgcctgg acctgaagat gaacggcgcc gccattgcca 6240
tcgacgagcg ctgtcacacc agcatgcaca acgtctgggc catcggcgac gtcgctggcg 6300
aaccgatgct ggcgcaccgg gccatggccc agggcgagat ggtcgccgaa atcatcgccg 6360
gcaaggcccg acgctttgaa ccgacagcga ttgccgccgt gtgctttacc gacccggaag 6420
tggtggtggt cggcaagacc ccggaacaag ccagccagca gggcctggac tgcatcgtcg 6480
cgcagttccc gtttgccgcc aatggccggg ccatgagcct ggaatcgaaa agcggtttcg 6540
tgcgggtggt ggcgcgccgt gacaaccacc tgatcgtggg ttggcaggcg gttggcgtgg 6600
cggtctccga gctatccacc gcgtttgccc aatcgctgga gatgggcgcg tgcctggaag 6660
atgtggccgg taccattcat gcccacccaa cgctcggtga agcggtacag gaagccgcac 6720
tgcgcgccct gggccacgcc ttgcatatct gactcgag 6758
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCKAD.F forward primer for cloning of BCKAD operon
<400> 16
ggcctgtcat gagtgattac gagccg 26
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCKAD.R reverse primer for cloning of BCKAD operon
<400> 17
cggccctgca ggttcgcggg aatcagatgt gc 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAT.F forward primer for cloning of AAT
<400> 18
aggagatata ccatgaaaag cttttctgta ctc 33
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAT.R reverse primer for cloning of AAT
<400> 19
agcagccgga tcccctgcag gactagttta ctggctggtg ctac 44
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACX4.F forward primer for cloning of ACX4
<400> 20
caccagccag taagctagca aggagatata ccatggctg 39
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACX4.R reverse primer for cloning of ACX4
<400> 21
tcccctgcag gactagttta caggcgagaa cgggtag 37
<210> 22
<211> 5652
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pET16b(Sse) expression vector
<400> 22
ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 60
aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 120
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 180
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 240
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 300
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 360
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 420
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 480
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 540
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 600
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 660
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 720
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 780
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 840
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 900
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 960
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1020
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1080
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1140
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1200
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1260
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1320
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1380
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1440
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1500
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1560
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1620
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1680
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 1740
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 1800
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 1860
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 1920
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 1980
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2040
tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 2100
gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 2160
gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 2220
acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 2280
cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga 2340
tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc 2400
ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg 2460
tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca 2520
cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac 2580
tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg 2640
ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga 2700
acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga 2760
agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc 2820
gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg 2880
tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga 2940
tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg 3000
tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc 3060
cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 3120
acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt 3180
ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt 3240
taggctggta agagccgcga gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg 3300
cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat 3360
aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc 3420
ggccgccatg ccggcgataa tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt 3480
gacgaaggct tgagcgaggg cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat 3540
cgtcgcgctc cagcgaaagc ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg 3600
tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg 3660
cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg 3720
tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3780
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3840
gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc 3900
ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca 3960
ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat 4020
cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc 4080
gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct 4140
cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt 4200
ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac 4260
gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga 4320
ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg 4380
gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag 4440
caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga 4500
gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca 4560
ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg 4620
cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt 4680
gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc 4740
gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga 4800
caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt 4860
gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt 4920
ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg 4980
ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac 5040
agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg 5100
aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca 5160
cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatctcgatc 5220
ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5280
aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatgg cctgcagggg atccggctgc 5340
taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata 5400
accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc 5460
cggatatccc gcaagaggcc cggcagtacc ggcataacca agcctatgcc tacagcatcc 5520
agggtgacgg tgccgaggat gacgatgagc gcattgttag atttcataca cggtgcctga 5580
ctgcgttagc aatttaactg tgataaacta ccgcattaaa gcttatcgat gataagctgt 5640
caaacatgag aa 5652
<210> 23
<211> 1311
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimised acyl-coA oxidase 4 (ACX4) from Arabidopsis thaliana forexpression in pET16b (Sse)
<400> 23
atggctgtcc tgtcaagcgc tgaccgtgcg agcaatgaaa aaaaagtgaa atcttcttac 60
ttcgatctgc cgccgatgga aatgtctgtt gcatttccgc aggcaacgcc ggcatcaacc 120
ttcccgccgt gcacgtcgga ttattaccat tttaacgacc tgctgacccc ggaagaacag 180
gccattcgta aaaaagttcg cgaatgtatg gaaaaagaag tcgcaccgat tatgaccgaa 240
tattgggaaa aagcggaatt tccgttccac attaccccga aactgggtgc gatgggtgtg 300
gccggcggta gtatcaaagg ctacggttgc ccgggtctgt ccattacggc aaatgctatc 360
gcgaccgccg aaattgcacg tgtggatgct tcatgctcga cgttcatcct ggttcatagc 420
tctctgggta tgctgaccat tgcgctgtgt ggctcagaag cccagaaaga aaaatatctg 480
ccgtcgctgg cgcaactgaa cacggtcgca tgttgggctc tgaccgaacc ggataatggc 540
agcgacgcat ctggcctggg taccacggct accaaagtgg aaggcggttg gaaaatcaac 600
ggtcagaaac gttggattgg caatagtacc tttgcggatc tgctgattat cttcgcccgc 660
aacaccacga ccaaccagat caacggtttc atcgtcaaaa aagacgcacc gggcctgaaa 720
gctaccaaaa ttccgaataa aatcggtctg cgcatggtgc agaacggcga tattctgctg 780
caaaatgtgt ttgttccgga tgaagaccgt ctgccgggtg ttaacagttt ccaggacacc 840
agcaaagttc tggcagtcag ccgcgtcatg gtggcttggc aaccgattgg catctctatg 900
ggtatctatg atatgtgcca ccgttacctg aaagaacgta aacagtttgg tgcaccgctg 960
gcagcattcc aactgaacca gcaaaaactg gtccagatgc tgggtaatgt gcaagcaatg 1020
tttctgatgg gctggcgtct gtgtaaactg tatgaaacgg gtcagatgac cccgggtcaa 1080
gcaagcctgg gcaaagcctg gattagttcc aaagcgcgtg aaaccgcaag cctgggtcgt 1140
gaactgctgg gcggtaacgg catcctggcc gattttctgg ttgcaaaagc tttctgcgac 1200
ctggaaccga tctatacgta cgaaggtacc tacgatatta atacgctggt gaccggtcgc 1260
gaagttacgg gcattgcaag cttcaaaccg gctacccgtt ctcgcctgta a 1311
<210> 24
<211> 1368
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimised alcohol acyl transferase (AAT) from Apple for expressionin pET16b(Sse)
<400> 24
atgaaaagct tttctgtact ccaagtcaaa cgcctgcaac cagaactgat tacgccagcg 60
aaatcgaccc cgcaggaaac caaattcctg tctgacatcg atgaccaaga gagcttgcgt 120
gtgcagattc cgatcatcat gtgctataaa gacaacccga gcctgaataa gaatcgcaat 180
ccggttaagg ccattcgtga ggccctgtcc cgtgcgctgg tttactatta cccgctggcg 240
ggtcgtctgc gtgagggtcc gaatcgcaaa ctggtggtgg actgcaatgg tgagggtatt 300
ctgtttgttg aggcgagcgc ggacgtcacc ctggaacagc tgggcgacaa gatcctgccg 360
ccgtgtccgc tgttggaaga gtttctgtac aacttcccgg gcagcgatgg tatcatcgat 420
tgcccgctgc tgctgattca agtcacttgt ctgacgtgtg gtggctttat tctggctctg 480
cgcctgaacc acaccatgtg tgatgcagcg ggtttgttgc tgttcctgac cgccatcgca 540
gagatggccc gtggtgccca cgcaccgagc attctgccgg tgtgggaacg tgaactgctg 600
ttcgcacgtg acccgcctcg tattacttgc gcgcaccatg aatacgagga cgttatcggc 660
catagcgacg gcagctacgc gagcagcaac caaagcaata tggtgcagcg tagcttttac 720
ttcggcgcga aagaaatgcg tgttctgcgc aagcagatcc cgcctcacct gatcagcacg 780
tgcagcacct ttgatttgat taccgcatgc ctgtggaagt gccgtacgct ggcgctgaac 840
atcaacccga aagaagccgt ccgtgtgagc tgtatcgtta acgcgcgtgg taaacacaac 900
aatgttcgcc tgccgctggg ctattacggc aatgcgttcg cattcccggc tgctatctct 960
aaggcagagc cgctgtgtaa gaaccctctg ggttacgccc tggagttggt gaagaaggcg 1020
aaagcgacca tgaatgaaga gtatctgcgc agcgtggcgg atctgctggt tttgcgcggt 1080
cgtccgcaat actccagcac gggttcctat ctgattgtga gcgacaatac ccgcgtgggt 1140
tttggtgatg tcaacttcgg ttggggccag ccagtctttg ctggcccggt caaagcattg 1200
gacctgatta gcttctatgt tcaacataag aacaacacgg aagatggtat cttggttccg 1260
atgtgcctgc cgtcctcggc gatggagcgt ttccaacagg agctggagcg cattacccag 1320
gaaccgaaag aggatatttg caacaatctg cgtagcacca gccagtaa 1368

Claims (54)

1.一种生产甲基丙烯酸和/或其衍生物的方法，包括以下步骤：
(a)在氧化酶的作用下，将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)将甲基丙烯酰辅酶A转化为甲基丙烯酸和/或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)可以化学地或生物地实施。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯，优选为C1-C20烷基酯，更优选为C1-C12烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酯为甲基丙烯酸丁酯，例如甲基丙烯酸正丁酯。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酯在转移酶的作用下生物地形成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转移酶为醇酰基转移酶，合适地属于EC群组编号2.3.1.84。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述醇酰基转移酶源自水果来源，例如：苹果、甜瓜或番茄来源。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述醇酰基转移酶在醇的存在下作用，以形成相应的烷基酯，所述醇例如C1-C12醇，比如C1-C4醇或者C4-C12醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述醇为丁醇。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(b)中形成的甲基丙烯酸转化为甲基丙烯酸酯的进一步的步骤(c)。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)可以化学地或生物地实施。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，步骤(c)在酯酶或水解酶的作用下生物地实施。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化酶是酰基辅酶A氧化酶，合适地属于EC群组编号1.3.3.6。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述酰基辅酶A氧化酶选自以下任一酶：来自拟南芥的ACX4、来自烟草节杆菌的短链酰基辅酶A氧化酶、来自念绿豆的过氧化化酰基辅酶A氧化酶、来自念珠菌属物种的酰基辅酶A氧化酶、以及来自热带念珠菌的酰基辅酶A氧化酶。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述酰基辅酶A氧化酶是来自拟南芥的ACX4。
16.根据权利要求1、2或10-15任一项所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰辅酶A是在硫酯酶、转移酶、合成酶和/或磷酸转酰酶以及短链脂肪酸激酶的作用下，转化为甲基丙烯酸的。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰辅酶A在硫酯酶的作用下转化为甲基丙烯酸。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在在于，所述硫酯酶是4-羟基苯酰辅酶A硫酯酶，合适地属于EC群组编号3.1.2.23。
19.根据权利16或17所述的方法，其特征在在于，所述硫酯酶属于EC群组编号3.1.2.X，所述转移酶是属于EC群组编号2.8.3.X的辅酶A转移酶，所述合成酶是属于EC群组编号6.2.1.X的酸-硫醇合成酶，所述磷酸转酰酶属于EC群组编号2.3.1.X，以及所述短链脂肪酸激酶属于EC群组编号2.7.2.X。
20.根据权利要求16-19任一项所述的方法，其特征在于，所述硫酯酶选自以下任一种酶：来自节杆菌属物种的酰基辅酶A硫酯酶4HBT、来自球形节杆菌的酰基辅酶A硫酯酶4HBT、来自假单胞杆菌物种菌株CSB-3的4HBT、来自大肠杆菌的EntH、来自大肠杆菌或来自流感嗜血杆菌的YciA、来自大肠杆菌的TesA或TesB、以及来自结核分支杆菌的FcoT；所述辅酶A转移酶选自以下任一种酶：来自芽孢梭菌属物种SB4的丁酰辅酶A：乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自斯氏梭菌的丁酰基辅酶A：乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824的丁酸酯：乙酸乙酯辅酶A转移酶、来自大肠杆菌的乙酸酯辅酶A转移酶ydiF；所述磷酸转酰酶选自以下任一种酶：来自丙酮丁醇芽孢梭菌ATCC824的磷酸转丁酰酶；且所述短链脂肪酸激酶选自以下任一酶：来自螺旋体MA-2的支链脂肪酸激酶、来自海栖热袍菌的丁酸酯激酶、来自酪酸芽孢梭菌的丁酸酯激酶。
21.根据权利要求16-20任一项所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰辅酶A在硫酯酶的作用下转化为甲基丙烯酸，所述硫酯酶是来自节杆菌属物种菌株SU的酰基辅酶A硫酯酶4HBT。
22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，其中该方法的生物转化在一种或多种宿主微生物中实施。
23.一种微生物，用于根据权利要求1-22任一项所述的方法生产甲基丙烯酸和/或其衍生物。
24.一种重组微生物，适于进行以下步骤：
(a)通过表达氧化酶将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸；
其中，所述重组微生物为大肠杆菌。
25.一种微生物，其被一种或多种异源核苷酸修饰以进行以下步骤：
(a)通过氧化酶的表达将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸。
26.一种微生物，适于进行以下步骤：
(a)通过氧化酶的表达将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸和/或其衍生物。
27.根据权利要求23或26所述的微生物，其特征在于，所述甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯，优选为C1-C20烷基酯，更优选为C1-C12烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。
28.用根据权利要求23-27任一项所述的微生物生产甲基丙烯酸的方法。
29.根据权利要求23-27所述的微生物，其中所述微生物表达以下酶：
(a)(i)酰基辅酶A氧化酶；和以下各项中的一种或多种酶：
(b)(i)酰基辅酶A硫酯酶；
(ii)辅酶A转移酶；
(iii)酸-硫醇合成酶；
(iv)磷酸转移酶和短链脂肪酸激酶；
(v)醇酰基转移酶。
30.根据权利要求23-27或29任一项所述的微生物，其中所述微生物表达以下酶：
(a)酰基辅酶A氧化酶，例如ACX4，和
(b)酰基辅酶A硫酯酶，例如4HBT。
31.根据权利要求23-27、29或30任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物表达以下酶：
(a)合适地源自拟南芥的ACX4；以及
(b)合适地源自节杆菌属物种的4HBT。
32.根据权利要求23-27或29-31任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物内源地表达一种或多种酶，或所述微生物异源地表达一种或多种酶，或所微生物表达内源的和异源的酶的组合。
33.根据权利要求23-27或29-32任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物可以选自野生型或重组型微生物，例如：细菌、古细菌、酵母菌、真菌、藻类或可应用于发酵过程的多种其他微生物中的任一种。
34.根据权利要求33所述的微生物，其特征在于，所述微生物是选自以下的细菌：属于艾希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属等的变形菌门的肠杆菌；属于短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属的所谓的棒状杆菌；以及属于脂环酸芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、氢杆菌属、甲烷球菌属、醋酸杆菌属、不动杆菌属、土壤杆菌属、固氮根瘤菌属、固氮菌属、边虫属、类杆菌属、巴尔通体属、博德特氏菌属、疏螺旋体属、布鲁氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、鞘杆菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、嗜衣原体属、芽孢梭菌属、柯克斯菌属、艾里希氏体菌属、肠球菌属、弗朗西斯杆菌属、梭杆菌属、加德纳菌属、嗜血杆菌属、螺旋杆菌属、克雷伯氏菌属、甲烷杆菌属、细球菌属、摩拉克氏菌属、分枝杆菌属、支原体、奈瑟菌属、巴斯德氏菌属、蛋白胨链球菌属、牙龈卟啉菌属、普雷沃氏菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、立克次氏体菌属、罗克利马氏体菌属、罗思氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、寡氧单胞菌属、链球菌属、密螺旋体属、弧菌属、沃尔巴克氏体属、耶尔森菌属的细菌。
35.一种微生物，适于进行以下步骤：
(a)通过表达酰基辅酶A氧化酶，将异丁酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酰辅酶A；
(b)通过表达醇酰基转移酶，将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸C1-C20烷基酯，合适地为甲基丙烯酸C1-C12烷基酯，例如：甲基丙烯酸C1-C4烷基酯或甲基丙烯酸C4-C12烷基酯。
36.根据权利要求35所述的微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌。
37.根据权利要求35或36所述的微生物，其特征在于，所述酰基辅酶A氧化酶为来自拟南芥的ACX4。
38.根据权利要求35-37任一项所述的微生物，其特征在于，所述醇酰基转移酶来自水果来源，例如苹果、甜瓜或番茄来源。
39.根据权利要求35-38任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物为重组微生物。
40.根据权利要求23-27或29-39任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物被基因改造，以增进甲基丙烯酸和/或其衍生物的产生。
41.根据权利要求23-27或29-40任一项所述的微生物，其特征在于，可以通过以下修饰来对所述微生物进行基因改造：降低或消除通过竞争相同底物和/或中间体来催化除了甲基丙烯酸和/或其衍生物之外的化合物的合成的酶的活性；降低或消除代谢甲基丙烯酸或代谢甲基丙烯酸生产中的中间体的酶的活性；和/或降低或消除参与移除甲基丙烯酸和/或其衍生物的生产中的中间体的其他细胞功能的蛋白质的活性。
42.根据权利要求40或41任一项所述的微生物，其特征在于，所述甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯，优选为C1-C20烷基酯，更优选为C1-C12烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。
43.一种发酵方法，包括在发酵培养基中培养一种或多种如权利要求23-27或29-42中任一项所述的微生物，以生产甲基丙烯酸和/或其衍生物。
44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯，优选为C1-C20烷基酯，更优选为C1-C12烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。
45.一种发酵培养基，包括一种或多种如权利要求23-27或29-42任一项所述的微生物。
46.根据权利要求45所述的发酵培养基，其特征在于，所述培养基进一步包括甲基丙烯酸和/或其衍生物。
47.根据权利要求46所述的发酵培养基，其特征在于，所述甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯，优选为C1-C20烷基酯，更优选为C1-C12烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。
48.一种生物反应器，包括一种或多种权利要求23-27或29-42任一项所述的微生物和/或权利要求45-47任一项所述的发酵培养基。
49.一种制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物的方法，包括以下步骤：
(i)根据权利要求1-22或28任一项所述的方法制备甲基丙烯酸和/或其衍生物；
(ii)非必要性地，对步骤(i)中制备的甲基丙烯酸进行酯化，以生产甲基丙烯酸酯；
(iii)将步骤(i)中制备的甲基丙烯酸和/或其衍生物和/或，当步骤(ii)存在时，步骤(ii)中制备的酯，选择性地与一种或多种共聚单体聚合，以产生其聚合物或共聚物。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸的衍生物是甲基丙烯酸酯，优选为C1-C20烷基酯，更优选为C1-C12烷基酯，特别是C1-C4烷基酯或者C4-C12烷基酯。
51.从根据权利要求49或50所述的方法所形成的聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚甲基丙烯酸丁酯的均聚物或共聚物。
52.一种生产甲基丙烯酸的方法，包括以下步骤：
(a)将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)在硫酯酶、转移酶、合成酶和/或磷酸转酰酶和短链脂肪酸激酶的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸，其中所述硫酯酶合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A。
53.一种在根据权利要求52所述的方法生产甲基丙烯酸和/或其衍生物的过程中使用的微生物。
54.一种微生物，适于进行以下步骤：
(a)将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A；以及
(b)在硫酯酶、转移酶、合成酶和/或磷酸转酰酶和短链脂肪酸激酶的作用下，将甲基丙烯酰辅酶A生物地转化为甲基丙烯酸，其中所述硫酯酶合适地为4-羟基苯甲酰基辅酶A。
CN201680039064.XA 2015-05-19 2016-05-18 生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法 Pending CN108026548A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1508582.2 2015-05-19
GBGB1508582.2A GB201508582D0 (en) 2015-05-19 2015-05-19 Process for the biological production of methacrylic acid
GBGB1517545.8A GB201517545D0 (en) 2015-10-05 2015-10-05 Process for the biological production of methacrylic acid
GB1517545.8 2015-10-05
PCT/GB2016/051438 WO2016185211A1 (en) 2015-05-19 2016-05-18 Process for the biological productiion of methacrylic acid and derivatives thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108026548A true CN108026548A (zh) 2018-05-11

Family

ID=56081512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680039064.XA Pending CN108026548A (zh) 2015-05-19 2016-05-18 生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法

Country Status (15)

Country Link
US (5) US10704063B2 (zh)
EP (1) EP3298153A1 (zh)
JP (3) JP7203496B2 (zh)
KR (1) KR20180008786A (zh)
CN (1) CN108026548A (zh)
AU (1) AU2016265751A1 (zh)
BR (1) BR112017024654A2 (zh)
CA (1) CA2985279A1 (zh)
EA (1) EA201792538A1 (zh)
MY (1) MY198780A (zh)
SG (1) SG10202101577YA (zh)
TW (2) TWI801327B (zh)
UA (1) UA127403C2 (zh)
WO (1) WO2016185211A1 (zh)
ZA (1) ZA201707822B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108559721A (zh) * 2018-05-15 2018-09-21 北京师范大学 一种净化空气的复合微生物菌剂及其应用
CN112469813A (zh) * 2018-05-23 2021-03-09 三菱化学英国有限公司 用于产生甲基丙烯酸酯的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112017024654A2 (pt) 2015-05-19 2018-09-18 Lucite Int Uk Ltd processos de produzir ácido metacrílico, meio de fermentação, microorganismo, microorganismo recombinante, biorreator, método para preparar polímeros ou copolímeros de ácido metacrílico ou ésteres do ácido metacrílico, e, ácido polimetacrílico, polimetilmetacrilato e homopolímeros ou copolímeros de polibutilmetacrilato
GB201619827D0 (en) * 2016-11-23 2017-01-04 Lucite Int Uk Ltd Process for the production of methyl methacrylate
JP2018085948A (ja) * 2016-11-28 2018-06-07 国立研究開発法人理化学研究所 メタクリル酸耐性微生物及びその製造方法
CN109722405B (zh) * 2017-10-31 2023-06-23 创享(天津)生物科技发展有限公司 利用葡萄糖生产异丙基吡喃酮的重组大肠杆菌及用途
CN108048425A (zh) * 2017-12-19 2018-05-18 湖北工业大学 一种对羟基苯甲酰-coa硫酯酶及其制备方法
GB2621337A (en) 2022-08-08 2024-02-14 Mitsubishi Chemical Uk Ltd Process for the biological production of methacrylic acid and derivatives thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013044076A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Codexis, Inc. Direct biocatalytic production of acrylic acid and other carboxylic acid compounds
WO2014038214A1 (ja) * 2012-09-10 2014-03-13 三菱レイヨン株式会社 メタクリル酸エステルの製造方法
US20140107377A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-17 The Procter & Gamble Company Microorganisms And Methods For Producing Acrylate And Other Products From Propionyl-CoA
WO2015031653A2 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing methacrylate

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS5867699A (ja) 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
JPS5877895A (ja) 1981-11-02 1983-05-11 Ajinomoto Co Inc プラスミドｐｈｍ１５１９
JPS58192900A (ja) 1982-05-04 1983-11-10 Ajinomoto Co Inc 複合プラスミド
JPH07108228B2 (ja) 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
KR100697552B1 (ko) 1997-07-18 2007-03-21 아지노모토 가부시키가이샤 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법
JP4066543B2 (ja) 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
BR9917880B1 (pt) 1998-09-25 2014-02-18 Processo para produzir um ácido l-glutâmico
DE19850541C1 (de) 1998-11-03 2000-06-15 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Acrysäureestern und/oder Methacrylsäureestern von Polyoxyalkylenen und deren Verwendung
JP2000262288A (ja) 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
WO2005010175A1 (en) 2003-07-29 2005-02-03 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-lysine or l-threonine using escherichia bacteria having attnuated malic enzyme activity
JP4257730B2 (ja) * 2003-08-25 2009-04-22 キッコーマン株式会社 アシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
US8604180B2 (en) 2004-09-09 2013-12-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth DNA fragment having promoter function
MX2009012867A (es) 2007-06-01 2010-02-15 Evonik Roehm Gmbh Proceso para preparar ácido metacrílico o ésteres metacrílicos.
ES2552981T3 (es) 2010-11-24 2015-12-03 Lucite International Uk Limited Un proceso para la producción de ácido metacrílico y sus derivados y los polímeros producidos a partir de los mismos
WO2012109534A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Regents Of The University Of Minnesota Cells and methods for producing isobutyric acid
RU2013148813A (ru) * 2011-04-01 2015-06-10 Дженоматика, Инк. Микроорганизмы для получения метакриловой кислоты и сложные эфиры метакриловой кислоты и относящиеся к ним способы
JP6117576B2 (ja) 2012-04-16 2017-04-19 東洋鋼鈑株式会社 フォトリフラクティブ材料組成物、フォトリフラクティブ基材およびホログラム記録媒体
KR101980982B1 (ko) 2012-09-10 2019-05-21 미쯔비시 케미컬 주식회사 메타크릴산 및/또는 그의 에스테르의 제조 방법
JP6123196B2 (ja) * 2012-09-12 2017-05-10 凸版印刷株式会社 蓋材
JP5643383B2 (ja) 2013-05-16 2014-12-17 北越紀州製紙株式会社 インクジェット記録シート
BR112017024654A2 (pt) 2015-05-19 2018-09-18 Lucite Int Uk Ltd processos de produzir ácido metacrílico, meio de fermentação, microorganismo, microorganismo recombinante, biorreator, método para preparar polímeros ou copolímeros de ácido metacrílico ou ésteres do ácido metacrílico, e, ácido polimetacrílico, polimetilmetacrilato e homopolímeros ou copolímeros de polibutilmetacrilato

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013044076A1 (en) * 2011-09-22 2013-03-28 Codexis, Inc. Direct biocatalytic production of acrylic acid and other carboxylic acid compounds
WO2014038214A1 (ja) * 2012-09-10 2014-03-13 三菱レイヨン株式会社 メタクリル酸エステルの製造方法
CN104619851A (zh) * 2012-09-10 2015-05-13 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸酯的制造方法
US20140107377A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-17 The Procter & Gamble Company Microorganisms And Methods For Producing Acrylate And Other Products From Propionyl-CoA
WO2015031653A2 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing methacrylate

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROSHI HAYASHI ET AL: "A Novel Acyl-CoA Oxidase That Can Oxidize Short-chain Acyl-CoA in Plant Peroxisomes", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108559721A (zh) * 2018-05-15 2018-09-21 北京师范大学 一种净化空气的复合微生物菌剂及其应用
CN112469813A (zh) * 2018-05-23 2021-03-09 三菱化学英国有限公司 用于产生甲基丙烯酸酯的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20180195095A1 (en) 2018-07-12
CA2985279A1 (en) 2016-11-24
US20180171368A1 (en) 2018-06-21
EP3298153A1 (en) 2018-03-28
US20220204999A1 (en) 2022-06-30
US10724058B2 (en) 2020-07-28
AU2016265751A1 (en) 2017-12-14
US11248243B2 (en) 2022-02-15
KR20180008786A (ko) 2018-01-24
US20200308609A1 (en) 2020-10-01
US20220372527A1 (en) 2022-11-24
WO2016185211A1 (en) 2016-11-24
EA201792538A1 (ru) 2018-06-29
JP7381525B2 (ja) 2023-11-15
JP2021176338A (ja) 2021-11-11
BR112017024654A2 (pt) 2018-09-18
US10704063B2 (en) 2020-07-07
TW201713773A (zh) 2017-04-16
JP2023134574A (ja) 2023-09-27
TWI801327B (zh) 2023-05-11
JP7203496B2 (ja) 2023-01-13
US11753661B2 (en) 2023-09-12
UA127403C2 (uk) 2023-08-16
ZA201707822B (en) 2021-03-31
JP2018516561A (ja) 2018-06-28
TW202248422A (zh) 2022-12-16
SG10202101577YA (en) 2021-03-30
MY198780A (en) 2023-09-27
WO2016185211A8 (en) 2017-11-23
US11753660B2 (en) 2023-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108026548A (zh) 生物制备甲基丙烯酸及其衍生物的方法
CN108350412B (zh) 用于生产醛的方法
TWI324181B (en) Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
DK2678432T3 (en) RECOMBINANT MICROORGANISMS AND APPLICATIONS THEREOF
DK2855662T3 (en) RECOMBINANT MICROORGANISMS AND APPLICATIONS THEREOF
KR101812366B1 (ko) 신규 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나제 녹아웃 돌연변이체 및 그의 용도
CN109952380B (zh) 用于生产目标物质的方法
CN109890970B (zh) 生产目标物质的方法
CN108929886B (zh) 生产目标物质的方法
TW201233798A (en) Recombinant microorganisms and methods of use thereof
BR112021011629A2 (pt) Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído
CN106591344A (zh) 一种融合分子伴侣标签的大肠杆菌热诱导可溶性蛋白表达载体及其应用
CN109963947B (zh) 用于生产l-甲硫氨酸或需要s-腺苷甲硫氨酸进行合成的代谢物的方法
CN112553176B (zh) 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
CN101603023B (zh) 一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌及其应用
CN112226451A (zh) 枯草芽孢杆菌表达***及其生产α-L-AFs的方法
CN106011133B (zh) 一种小的dna分子量标准物、标准物质粒及其制备方法
CN111041038A (zh) 高效生物合成虾青素的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及应用
CN114426957B (zh) 一种糖醛酸脱氢酶突变体及其在制备糖二酸中的应用
AU2017213137A1 (en) Increased triacylglycerol production in microalgae
RU2723183C2 (ru) О-сукцинилгомосерин-продуцирующий микроорганизм и способ получения о-сукцинилгомосерина с его использованием
KR101936825B1 (ko) 이소프렌의 생산 방법
CN112553177B (zh) 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
CN114317473B (zh) 一种催化活性和热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
KR20230150998A (ko) Cas3 단백질을 제조하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: British platinum

Applicant after: Mitsubishi Chemical UK Ltd.

Address before: British platinum

Applicant before: LUCITE INTERNATIONAL UK Ltd.