CN108025044A - 免疫原性降钙素原前体肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由MHC呈递的携带抗原降钙素原前体的T细胞表位的肽的组合。这些肽可用于抗肿瘤免疫治疗。

Description

免疫原性降钙素原前体肽
技术领域
本发明涉及降钙素原前体(ppCT)表位的组合及其在抗肿瘤免疫治疗中的用途。
背景技术
疫苗接种或肽免疫治疗是目前在癌症预防或治疗领域中非常感兴趣的治疗方法。原理是基于通过再生由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肿瘤抗原的T细胞表位的肽的免疫，所述CTL在消除其表面表达这些抗原的癌细胞方面起主要作用。
应该记得，CTL不识别整个蛋白质抗原，而是识别在各种细胞表面表达的主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的蛋白质抗原的肽片段。这些是构成T细胞表位的肽片段。
这些肽的呈递来自称为“抗原加工”的复杂过程，其涉及三个主要步骤：
-通过称为蛋白酶体的多酶复合物使抗原胞质降解；
-通过TAP转运蛋白使由这种降解产生的肽在内质网(ER)中易位；
-将这些肽与MHC相连，以形成稳定的肽/MHC复合物，所述复合物被输出至细胞表面。
由I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递的表位一般具有8-11个氨基酸(aa)，且被代表细胞毒性反应的主要组分的CD8+T细胞识别。由II类主要组织相容性复合物(MHCII)呈递的表位一般具有13-18个氨基酸，且被CD4+T细胞识别。
鉴定这些表位是开发抗肿瘤免疫治疗组合物的必要步骤。
降钙素原前体由CALCA基因编码，其也编码神经肽(降钙素基因相关肽)的α形式(α-CGRP)。该基因包含5个内含子和6个外显子，其主要转录物是选择性组织特异性剪接的对象。外显子连接1、2、3和4在甲状腺C细胞中产生降钙素mRNA，而外显子1、2、3、5和6在神经元中产生α-CGRP mRNA(MORRIS等,Nature,308,746-8,1984)。
降钙素mRNA编码141个氨基酸的前体(降钙素原前体)，其包含25个残基的N-末端信号序列，它的切割产生116aa的降钙素原。降钙素原包含57aa的N末端区，随后是成熟的32aa的降钙素，21aa的C末端肽，钙抑肽(ROSENFELD等,Nature,304,129-35,1983)。α-CGRP的成熟形式是37aa的肽，其具有血管扩张剂作用并且在大量组织中发现(ZAIDI等,CritRev Clin Lab Sci,28,109-74,1990)。降钙素原前体信号序列也发现于激素原前体α-CGRP中。
降钙素的生理作用主要是在“钙压力”阶段，例如生长、怀孕和哺乳期间保护骨骼。甲状腺髓样癌(MTC)细胞和某些肺癌也大量产生降钙素(COOMBES等,Lancet,1,1080-3,1974；MILHAUD等.,Lancet,1,462-3,1974)。高水平的血浆降钙素是这些肿瘤的诊断和预后标志物。
已提出使用成熟降钙素诱导的树突状细胞用于MTC免疫治疗(SCHOTT等,CancerImmunol Immunother,51,663-8,2002)。最近，发明人的团队已经鉴定了一个衍生自降钙素原前体信号肽的10个氨基酸的抗原肽。该肽对应于一个在内质网中通过独立于蛋白酶体和TAP转运蛋白的机制加工的表位(专利申请WO2009010874)。
发明人现在已经鉴定了参与诱导抗肿瘤免疫反应的降钙素原前体的其他区域，并且表明不同表位的组合允许更好的抗肿瘤反应。
发明内容
本发明涉及包含至少两个选自以下的肽序列的组合物：
-MGFQKFSPFLALSIL(SEQ ID NO:1),下文也称为ppCT1-15；
-EREGSSLDSPRSKRC(SEQ ID NO:2),下文也称为ppCT71-85；
-GNLSTCMLGTYTQDF(SEQ ID NO:3),下文也称为ppCT86-100；
-FLALSILVL(SEQ ID NO:4),下文也称为ppCT9-17；
-VLLQAGSLHA(SEQ ID NO:5),下文也称为ppCT16-25；
-LLAALVQDYV(SEQ ID NO:6),下文也称为ppCT50-59；
-CMLGTYTQDF(SEQ ID NO:7),下文也称为ppCT91-100；
-EARLLLAALVQDYVQ(SEQ ID NO:8),下文也称为ppCT45-60；
-MGFQKFSPFL(SEQ ID NO:9),下文也称为ppCT1-10；
-FQKFPFLAL(SEQ ID NO:10),下文也称为ppCT3-12；
-KFSPFLALSI(SEQ ID NO:11),下文也称为ppCT5-14；
-FSPFLALSIL(SEQ ID NO:12),下文也称为ppCT6-15；
-NLSTCMLGTY(SEQ ID NO:13),下文也称为ppCT87-96；
-LSTCMLGTYT(SEQ ID NO:14),下文也称为ppCT88-97；
-YTQDFNKFHT(SEQ ID NO:15),下文也称为ppCT96-105；
-TLSEDEARLL(SEQ ID NO:16),下文也称为ppCT41-50；
-ALVQDYVQMK(SEQ ID NO:17),下文也称为ppCT53-62；和
-YVQMKASEL(SEQ ID NO:18),下文也称为ppCT58-66。
在根据本发明的组合物中，所述序列的每一个以8-15个氨基酸的肽的形式呈现，或包含于多表位嵌合多肽中。嵌合多肽在本文中定义为天然不存在的一系列氨基酸。如本文所理解，嵌合多肽可以包含选自SEQ ID NO：1-18序列的至少两个序列，在所述多肽中，所述序列相邻、由1-5个氨基酸组成的连接元件相连，或由包含不是降钙素原前体的蛋白质的表位的序列分开。
因此，根据本发明的组合物是多表位的，优选在至少一些个体中能够产生多特异性反应。
根据本发明的一个优选实施方案，组合物包含至少一个与在内质网中通过独立于蛋白酶体和TAP转运蛋白的机制加工的表位对应的序列，例如SEQ ID NO：4和5的序列。还更优选地，组合物进一步包含至少一个与在内质网中通过独立于蛋白酶体和TAP转运蛋白的机制加工的表位对应的序列，例如SEQ ID NO：3和6的序列。根据本发明的组合物优选包含SEQ ID NO：6的序列，所述序列是由该序列组成的肽的形式，或包含于如上定义的嵌合多肽中。
根据本发明的一个具体实施方案，组合物包含9-15个氨基酸的肽的混合物。该混合物可以冷冻干燥或悬浮于适于药物用途的溶液中。
根据本发明的另一个优选的实施方案，组合物包含嵌合多肽，所述嵌合多肽包含选自SEQ ID NO：1-18序列的至少两个序列，所述序列相邻、由1-5个氨基酸组成的连接元件相连，或由包含不是降钙素原前体的蛋白质的表位的序列分开。如果适用，嵌合多肽可以包含相同序列的多个拷贝。此外，在根据本发明的嵌合多肽中，至少免疫原性序列的一部分可以***百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的腺苷酸环化酶(AC)中。由于AC受体与CD11b相同，且由于树突状细胞表达CD11b受体，这种结构能够直接将免疫原性肽引导向树突状细胞(DADAGLIO等,Int.Immunol,15,1423-1430,2003)。
根据本发明的组合物任选地包含至少一个不同于之前序列的其他肽序列，尤其是能够结合HLA分子(例如HLA-B7)的序列，例如以下序列之一：SPFLALSIL(SEQ ID NO:19或ppCT7-15)、EARLLLAAL(SEQ ID NO:20或ppCT46-54)，和/或SPRSKRCGNL(SEQ ID NO:21或ppCT79-88)，所述肽序列是分离的肽的形式，或包含于根据本发明的多表位嵌合肽中。
为了广泛地用于由携带不同HLA等位基因的个体组成的群体，根据本发明的多表位组合物可以包含由不同MHC分子呈递的表位。
根据本发明的一个优选实施方案，组合物还包含至少一个免疫检查点抑制剂，例如非限制性方式的抗PD-1、抗PDL-1或抗CTLA4，尤其是抗体，优选抗分子PD-1、PDL-1或CTLA4，优选人分子hPD-1、hPDL-1或hCTLA4的单克隆抗体。根据本发明的组合物有利地包含抗PD-1，尤其是抗PD-1单克隆抗体，优选抗hPD-1。
根据本发明的嵌合多肽容易通过本身已知的方法，尤其是通过常规的重组DNA技术获得。
根据本发明的组合物优选包含选自SEQ ID NO：1-7序列的至少两个序列，更优选这些序列中的至少三个。图1示出了SEQ ID NO：1-7的肽相对于降钙素原前体完整序列的位置。
根据本发明的组合物中存在的序列组合的非限制性实例包括以下组合：
-序列SEQ ID NO:1、2、3、5和6的组合；
-序列SEQ ID NO:1、3、4、5和6的组合；
-序列SEQ ID NO:1、2、5和6的组合；
-序列SEQ ID NO:1、3、5和6的组合；
-序列SEQ ID NO:3、4、5和6的组合；所述组合包含之前的序列和至少一个例如如上定义的免疫检查点抑制剂，尤其是抗PD-1单克隆抗体，优选抗hPD-1抗体，和/或SEQ IDNO：19、20和/或21的序列之一。
本发明还涉及编码免疫原性肽的混合物或例如如上定义的嵌合多肽的核酸分子，以及包含其的组合物。这些多核苷酸可以***转录控制或适当启动子下的表达载体，以允许根据本发明的免疫原性肽或嵌合多肽在细胞或宿主生物中的表达。表达载体的选择尤其取决于其中期望表达的细胞或生物(原核生物或真核生物)。如果计划向待治疗的患者直接施用多核苷酸，则优选使用裸DNA质粒，或允许瞬时表达的载体，例如衍生自腺病毒或牛痘病毒的载体。因此，本发明还涉及包含至少一个核酸分子的组合物，所述核酸分子编码选自SEQID NO：1-18序列的至少两个9-15个氨基酸的肽，或编码如上所述的嵌合多肽。
根据本发明的其他组合物还可以包含树突状细胞，其负载有本发明的肽或多表位组合物，或用***适当表达载体的本发明的多核苷酸转化。它们还可以包含负载有本发明的肽或多表位组合物的人工抗原呈递细胞。具体地，人工抗原呈递细胞可以是申请PCTWO1999/003499中所述的衍生自肿瘤细胞的囊泡(texosome)，或如VIAUD等人(JImmunother,34,65-75,2011)的出版物中所述的衍生自树突状细胞的外泌体。
本发明的另一个方面是如上所述的组合物作为药物的用途，尤其是作为意欲用于抗肿瘤免疫治疗，更具体地在表达降钙素和/或α-CGRP的肿瘤治疗中的药物。具体地，这包括小细胞或非小细胞肺癌，以及甲状腺髓样癌。根据本发明的组合物还可以用于治疗与降钙素或降钙素原或α-CGRP前体的高血清水平相关的病理，例如以下癌性病理：肾癌、乳腺癌、胃肠道癌(TABOLLI等,Tumori,69,227-230,1983)、胰腺癌、***癌(SIM等,Ann ClinLab Sci.,26,487-95,1996)、肝癌(CONTE等,Acta Endocrinol,106,109-11,1984)、或慢性粒细胞白血病(TAKUBO等Haematologia,31,177-9,2001)、急性未分化和粒细胞性白血病(KIEFER等,Leuk Lymphoma.,13,501-507,1994)、神经内分泌肿瘤和肝癌(GHILLIANI等,Cancer Res,49,6845-6851,1989)。
根据本发明的组合物可以以尤其有利的方式用于其细胞不表达TAP肽转运蛋白的肿瘤的免疫治疗。
如上所述的组合物尤其适用于治疗HLA-A*0201患者。
本发明还涉及根据本发明的至少两个免疫原性肽表位的多表位组合物或核酸分子用于获得药物，尤其是意欲用于抗肿瘤免疫治疗(尤其是用于治疗表达降钙素和/或α-CGRP的肿瘤)的药物的用途。具体地，这包括小细胞或非小细胞肺癌，以及甲状腺髓样癌。所述药物也可以用于治疗与降钙素或降钙素前体或α-CGRP原前体的高血清水平相关的病理，例如以下癌性病理：肾癌、乳腺癌、胃肠道癌(TABOLLI等,Tumori,69,227-230,1983)、胰腺癌、***癌(SIM等,Ann Clin Lab Sci.,26,487-95,1996)、肝癌(CONTE等,ActaEndocrinol,106,109-11,1984)、或慢性粒细胞白血病(TAKUBO等Haematologia,31,177-9,2001)、急性未分化和粒细胞性白血病(KIEFER等,LeukLymphoma.,13,501-507,1994)、神经内分泌肿瘤和肝癌(GHILLIANI等,Cancer Res,49,6845-6851,1989)。
本发明还涉及包含根据本发明的至少一种免疫原性肽、组合物或核酸作为活性物质的药物。
根据本发明的一个优选实施方案，所述药物是疫苗，尤其是治疗性疫苗。
根据本发明的药物可以进一步包含普通赋形剂，以及在免疫治疗中常规使用的佐剂，其例如促进活性物质的施用、稳定它们、增加它们的免疫原性等。可用的佐剂的实例包括CpG寡脱氧核苷酸、凋亡诱导因子(AIF)、热休克蛋白(HSP)、toll样受体(TLR)例如TLR3激动剂(Poly I:C)、细胞因子和趋化因子例如IL-7、IL-12、IL-15和GM-CSF和CCL5(RANTES)。
借助于以下额外的描述将更好地理解本发明，所述额外的描述是指说明根据本发明的免疫原性肽的混合物的鉴定的非限制性实例。
附图说明
图1：SEQ ID NO：1-7的肽相对于降钙素原前体完整序列的位置。
图2：用SEQ ID NO：4-7的肽体外刺激患者的PBMC。A-C：用4种肽各自刺激9位非小细胞肺癌(NSCLC)患者的PBMC，然后通过流式细胞仪分析CD8+/IFNγ+细胞的数量。每个点(n)对应于8个独立的刺激孔。对于每位患者和每种肽，表示这些点的中值(n＝12)。示出了统计学显著的增加(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005)。
图3：在HLA-A2分子的转基因小鼠模型中体外和体内测试的不同肽组合的总结。
图4：用9-10个氨基酸的短肽或不同肽组合体外刺激患者的PBMC。A-C：用单独的SEQ ID NO：4-6的肽之一，或与图3所述的组合1-6之一一起刺激患者3(A)、10(B)和11(C)的PBMC，然后通过ELISPOT分析分泌IFNγ+的细胞的数量。示出了统计学显著的增加(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005)。
图5：用不同的肽组合免疫接种HLA-A2分子的转基因小鼠。A.用各个肽(单独或组合)离体再刺激脾细胞后，CD8+/IFNγ+T淋巴细胞的百分比。B'、B"和B"'.用不同肽组合(C1-C6)免疫接种小鼠后，CD8T淋巴细胞的细胞毒性反应。
图6：肽组合C6在HLA-A2分子的转基因小鼠模型中的抗肿瘤作用。在第0天(D0)将1x106个D122-ppCT肿瘤细胞移植到转基因小鼠侧腹的皮肤下。然后在D0、D3、D4和D14，用组合C6中包含的100μM各个肽和25μg佐剂在皮肤下接种疫苗。肿瘤大小定义为公式长度*宽度*深度。示出了肿瘤生长的统计学显著差异(*p<0.05)。
图7：联合免疫治疗的抗肿瘤反应和肿瘤生长控制的增强。A.联合治疗将肿瘤生长控制最优化。NOD-scid Il2rγnull(NSG)小鼠已经在侧腹接受Heu-nIR肿瘤片段的移植物，然后在第D10天从健康供体过继转移人PBMC，随后在第D11天用基于肽混合物C6的疫苗静脉内接种(从第D12天起，与抗PD1单克隆抗体组合或不组合)。每两天记录肿瘤生长，直到实验结束。B.与用单独的疫苗(*p<0.04)或单独的抗PD-1(*p<0.03)处理的小鼠相比，用联合治疗(疫苗+抗PD-1)处理的小鼠在肿瘤重量方面显示最强的降低。C.联合治疗体内诱导的细胞因子产生。实验结束前，通过ELISA测定处理或未处理小鼠的血清中人IFN-γ质粒的水平(*p<0.01)。D.处理和未处理小鼠的脾细胞产生的IFN-γ、颗粒酶B(GrmB)和穿孔素(Perf)。通过细胞内荧光分析评估产生IFN-γ、颗粒酶B(GrmB)和穿孔素(Perf)的CD8+T细胞。值对应于平均荧光强度(MFI)。*p<0.05；**p<0.001。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
图8：联合免疫治疗的肿瘤生长控制的增强。A.联合治疗将肿瘤生长控制最优化。NOD-scid Il2rγnull(NSG)小鼠已经在侧腹接受Heu-nIR肿瘤片段的移植物，然后在第D10天从健康供体过继转移人PBMC，随后在第D11天用基于肽混合物C6a的疫苗静脉内接种(从第D12天起，与抗PD1单克隆抗体组合或不组合)。每两天记录肿瘤生长，直到实验结束。B.与用单独的抗PD-1处理的小鼠相比，用联合治疗(疫苗+抗PD-1)处理的小鼠在肿瘤重量方面显示最强的降低。
具体实施方式
实施例1：通过降钙素原前体的9个或10个氨基酸的肽体外刺激患者的PBMC
材料和方法
肽：
选择以下肽：
ppCT9-17 FLALSILVL(SEQ ID NO:4)；
ppCT16-25 VLLQAGSLHA(SEQ ID NO:5)；
ppCT50-59 LLAALVQDYV(SEQ ID NO:6)；
ppCT91-100 CMLGTYTQDF(SEQ ID NO:7)。
使用的细胞和刺激
通过Ficoll从11位非小细胞肺癌(NSCLC)患者的外周血分离外周血单核细胞(PBMC)。对于每个肽，用20μM肽刺激PBMC两次(D0和D7)。在IL-2(20IU/ml)+IL-4(10ng/ml)+IL-7(10ng/ml)存在下，在完全培养基(RPMI 1640、10％SAB、1％丙酮酸钠、0.1％青霉素/链霉亲和素)上，以2千万个细胞/板的比率，在96孔板上培养PBMC两周。
通过细胞计数法分析
15天后，在100μg/ml布雷菲德菌素A存在下，用2.5μM第一次刺激步骤中所用的肽再次刺激PBMC，并在37℃、5％CO2下孵育6小时。然后，将细胞用抗CD8-APC抗体孵育20分钟，然后在PBS中洗涤，用PBS-2％甲醛固定，并用BSA/皂苷透化。然后，将它们与抗IFN-γ-PE抗体一起孵育。通过流式细胞仪进行分析。用Mann-Whitney检验进行统计学研究，并示出了统计学显著的增加(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005)。
结果
结果如图2所示。
通过流式细胞仪分析对各种9个或10个氨基酸的肽的刺激的反应表明，pCT9-17、ppCT16-25、ppCT50-59和ppCT91-100肽的刺激导致比测试患者中CD8+/IFNγ+T淋巴细胞的基线水平升高1-4.5倍。不同刺激孔的分析表明，这种CD8反应的升高是统计学显著的(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005)。然而，不同患者对每个肽的反应不同。患者1、2、6、8和9在所有测试肽的刺激后触发CD8T淋巴细胞分泌IFNγ，而患者4、5和7仅在肽ppCT9-17和ppCT50-59刺激后触发淋巴细胞反应，同时患者3用肽ppCT50-59和ppCT91-100触发反应。
总之，似乎肽取决于测试患者是免疫原性的，并允许经由CD8T淋巴细胞的免疫反应。由于对不同肽的反应的差异，肽组合在大多数包括的患者中将具有更好的诱导抗ppCT反应的机会。
实施例2：用短的9-aa或10-aa肽或不同肽组合体外刺激患者
材料和方法
肽
选择以下肽：
ppCT1-15:MGFQKFSPFLALSIL(SEQ ID NO:1)；
ppCT71-85:EREGSSLDSPRSKRC(SEQ ID NO:2)；
ppCT86-100:GNLSTCMLGTYTQDF(SEQ ID NO:3)；
ppCT9-17 FLALSILVL(SEQ ID NO:4)；
ppCT16-25 VLLQAGSLHA(SEQ ID NO:5)；
ppCT50-59 LLAALVQDYV(SEQ ID NO:6)；
ppCT91-100 CMLGTYTQDF(SEQ ID NO:7)。
使用的细胞和刺激
通过Ficoll从3位非小细胞肺癌(NSCLC)患者的外周血分离外周血单核细胞(PBMC)，然后用20μM的每种肽，或用等摩尔浓度的20μM的图3所述的每种肽刺激两次(D0和D7)。在IL-2(20IU/ml)+IL-4(10ng/ml)+IL-7(10ng/ml)存在下，在完全培养基(RPMI 1640、10％SAB、1％丙酮酸钠、0.1％青霉素/链霉亲和素)上，以2千万个细胞/板的比率，在96孔板上培养PBMC两周。
通过ELISPOT的分析
15天后，回收PBMC，并将其以每孔100,000个细胞的比率，在培养基和刺激所用的2.5μM的每种肽，或等摩尔浓度的2.5μM的每种肽存在下，在ELISPOT板上孵育。在37℃和5％CO2下孵育板15-18小时。按照制造商的说明(Gen-Probe Diaclone)显示IFNγ斑点。计数由IFNγ分泌细胞形成的斑点，并用CTL免疫斑点***(Cellular Technology Ltd)分析。用Mann-Whitney检验进行统计学研究，并示出了统计学显著的增加(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005)。
结果
结果如图4所示。
用图3所述的组合刺激3位患者的PBMC后，分析IFNγ分泌细胞的数量显示，不同组合允许刺激，从而允许这些肽的特异性淋巴细胞的扩增。实际上，在患者11的3个组合、患者10的4个组合和患者3的6个组合中观察到了IFNγ分泌细胞数量的显著增加。
此外，相对于单独的肽的刺激，组合C2、C5和C6的刺激也增加了IFNγ分泌细胞的数量。这些反应是患者依赖性的。实际上，用组合C2、C5和C6刺激患者3的PBMC使IFNγ分泌细胞数量对于C2增加了6倍，对于C5增加了3倍，对于C6增加了2倍，而对于患者10，只有用组合C2刺激PBMC才使IFNγ分泌细胞的数量增加了3倍，用组合C5和C6刺激患者11的PBMC使IFNγ分泌细胞数量对于C5增加了3倍，对于C6增加了2倍.
该结果表明，衍生自ppCT抗原的多个肽的组合增加了CD8T淋巴细胞产生的免疫反应。此外，这些结果还证明了与单个肽相比，使用肽组合来触发大多数患者的免疫反应的优势。
实施例3：用不同肽组合免疫接种转基因小鼠
材料和方法
肽
选择以下肽：
ppCT1-15:MGFQKFSPFLALSIL(SEQ ID NO:1)；
ppCT71-85:EREGSSLDSPRSKRC(SEQ ID NO:2)；
ppCT86-100:GNLSTCMLGTYTQDF(SEQ ID NO:3)；
ppCT9-17 FLALSILVL(SEQ ID NO:4)；
ppCT16-25 VLLQAGSLHA(SEQ ID NO:5)；
ppCT50-59 LLAALVQDYV(SEQ ID NO:6)；
ppCT91-100 CMLGTYTQDF(SEQ ID NO:7)。
使用的细胞
使用表达抗原ppCT的人TT肿瘤细胞系(来自甲状腺髓样癌)和IGR-Heu肿瘤细胞系(分离自患者Heu的NSCLC肿瘤)作为靶细胞。使用K562细胞系(来自患有慢性粒细胞白血病的患者)作为阴性对照。使用Heu-EBV系(来自患者Heu的B淋巴细胞)来测定裂解的特异性。用51Cr标记后，将Heu-EBV细胞与具有20μM各种肽的等摩尔混合物一起孵育(如图4所述)。
小鼠的免疫接种
用包含100μM各种肽的等摩尔混合物和佐剂(25μg的Poly(I:C))的100μl肽组合，在侧腹皮肤下，免疫接种HLA-A2分子的转基因小鼠4次(D0、D7、D14和D21)(图4)。第一次注射28天后，处死小鼠，回收脾细胞，并将其在IL-2(20IU/ml)存在下在完全培养基(RPMI1640、10％SAB、1％丙酮酸钠、0.1％青霉素/链霉亲和素)中培养过夜。
通过细胞计数法分析和通过细胞毒性试验分析
第二天，在10μg/ml布雷菲德菌素A存在下，用2.5μM各种肽(单独或组合)刺激脾细胞，并在37℃、5％CO2下孵育6小时。然后，将细胞用抗CD8-PE抗体孵育20分钟，然后在PBS中洗涤，用PBS-2％甲醛固定，并用BSA/皂苷透化。然后，将它们与抗IFN-γ-APC抗体一起孵育。通过流式细胞仪进行分析。
对于细胞毒性活性的分析，通过负耗竭从脾细胞分离CD8T淋巴细胞(MiltenyiBiotech)。通过铬-51(51Cr)浸出试验评估所得的CD8T淋巴细胞的细胞毒性活性。将(在上段中所述的)靶细胞在20μM的51Cr存在下于37℃孵育1小时。然后，用RPMI洗涤细胞，并与效应子/靶标比例为50:1、25:1和12:1的CD8T淋巴细胞于37℃共孵育。孵育4小时后，测量共培养上清液中浸出的51Cr的浓度。使用以下公式计算裂解百分比：
结果
用肽组合C1-C6免疫接种小鼠后分离的脾细胞的流式细胞仪分析表明，表达IFNγ的CD8T淋巴细胞的百分比增加(图5A)。这种增加取决于所用的组合，涉及3-13倍的变化(C1为4.8、C2为3、C3为3.4、C4为5.5、C5为4.3和C6为13.6)。这些结果表明，用不同肽组合免疫接种转基因小鼠允许通过诱导CD8T淋巴细胞产生免疫反应。
此外，来自组合的每种肽的离体刺激证明了组合的额外作用。对于组合C1，观察到离体刺激后的反应相对于肽ppCT1-15、ppCT71-85和ppCT86-100的离体刺激分别增加了4.2倍、5.2倍和4.6倍。对所有组合经由CD8T淋巴细胞的免疫反应的功效观察到相同结果。然而，没有组合显示对肽ppCT50-59的作用，尤其是因为其天然诱导的强烈反应。
最后，用肽组合免疫接种的小鼠产生的CD8T淋巴细胞能够以特异性的方式识别并裂解表达抗原ppCT的细胞，例如IGR-Heu和TT(图5B)。实际上，图5B表明，与来自免疫接种的小鼠的脾细胞的CD8T淋巴细胞不同，来自非免疫接种的小鼠的脾细胞的CD8T淋巴细胞不能裂解IGR-Heu肿瘤系或TT肿瘤系。取决于免疫接种的条件，淋巴细胞裂解7-15％的表达抗原ppCT的细胞。T淋巴细胞不裂解K562细胞或Heu-EBV细胞，除非这些负载有肽组合。该结果证明了从表达抗原ppCT的肿瘤细胞获得的裂解的特异性。
通过免疫接种转基因小鼠获得的所有结果表明，使用肽组合能够激活并增加由CD8T淋巴细胞施加的针对表达抗原ppCT的细胞的免疫反应。
实施例4：用组合C6免疫接种转基因小鼠
材料和方法
肽
选择以下肽：
ppCT1-15:MGFQKFSPFLALSIL(SEQ ID NO:1)；
ppCT86-100:GNLSTCMLGTYTQDF(SEQ ID NO:3)；
ppCT9-17FLALSILVL(SEQ ID NO:4)；
ppCT16-25VLLQAGSLHA(SEQ ID NO:5)；
ppCT50-59LLAALVQDYV(SEQ ID NO:6)。
使用的细胞
用表达GFP并编码人抗原ppCT的慢病毒感染分子HLA-A2(D122系)的转基因鼠系LL2(Lewis肺癌)。然后，将106个细胞注入小鼠侧腹的皮肤下。
小鼠的免疫接种
用包含100μM各种肽的等摩尔混合物和佐剂(25μg的Poly(I:C))的100μl肽组合C6在侧腹皮肤下免疫接种HLA-A2分子的转基因小鼠4次(D0、D7、D14和D21)。
监测肿瘤生长
移植肿瘤细胞后，从第7天起，每天监测小鼠的体重，且每2-3天测量肿瘤。用以下方式计算大小(以mm3表示)：长度x宽度x深度。通过t检验计算统计学显著的肿瘤生长差异，并示出(*p<0.05)。
结果
在具有表达ppCT的肿瘤的HLA-A2分子的转基因小鼠模型中，免疫接种组合C6诱导了与非免疫接种的小鼠相比显著的肿瘤生长的降低。实际上，在21天结束时，接种的三只小鼠之一的肿瘤大小为190mm3，而三只对照小鼠发生的肿瘤的平均大小为350mm3(图6)。
该结果证明了免疫接种组合C6以产生针对表达ppCT的肿瘤有效的免疫反应的能力，表明在抗肿瘤免疫治疗中使用这些组合的优势。
实施例5：用单独的组合C6或与抗PD-1联合免疫接种人源化小鼠
材料和方法
小鼠、人肿瘤移植物和人PBMC转移
在3-4周龄的NOD-scid Il2rγnull小鼠(NSG；Jackson Laboratory)的皮下移植通过植入人肿瘤细胞系IGR-Heu产生的人肿瘤Heu-nIR，所述人类肿瘤细胞系IGR-Heu预先用趋化因子CCL5(RANTES)和粘附分子ICAM-1转染，以优化T淋巴细胞对肿瘤的浸润及其与靶细胞相互作用的能力，维持在裸鼠中(Franciszkiewicz等，Cancer Res.，69，6249-6255)。然后在10天后，当肿瘤可触知时，将来自健康的同种异体人供体的2.107个外周血单核细胞(PBMC)静脉内注射到小鼠尾巴，预先在体外测试所述外周血单核细胞(PBMC)在CD8T细胞中诱导针对抗原肽ppCT的反应的能力。然后腹膜内施用重组IL-15(3μg/小鼠/天)以促进T细胞的存活。
肽：
使用的肽是：
-组合C6，其由肽ppCT9-17、ppCT16-25和包含限制于HLA-A的表位的ppCT50-59以及长肽ppCT1-15和ppCT86-100组成,和
-组合C6a，其也包含组合C6的肽，限于HLA-B7的三种肽:ppCT7-15(SEQ ID NO:19)、ppCT46-54(SEQ ID NO:20)和ppCT79-88(SEQ ID NO:21)。
免疫接种小鼠并监测肿瘤生长
在PBMC转移一天后，用含有每种肽的等摩尔混合物和佐剂(25μg的Poly(I:C))的100μl肽组合C6或C6a，间隔一周免疫接种已经接受Heu-nIR肿瘤移植物和PBMC过继转移的NSG小鼠2次。对于联合治疗，从转移PBMC后的第二天起，每两天用抗hPD-1抗体(220mg/注射)或相同同种型的对照抗体(220mg不相关的hIgG4)静脉内处理免疫接种的小鼠。
为了避免移植物抗宿主病(GVHD)，每天监测小鼠的体重，且每2天测量肿瘤仅3或4周。在处死小鼠之前，在实验的最后一天采集血浆样品，并在-80℃下储存直至使用。处死小鼠，称重肿瘤，然后将其解离，并通过流式细胞仪分析浸润性T淋巴细胞(TIL)。平行地，对脾进行取样，并测试用肽组合离体刺激之后脾细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)的能力。
ELISA试验
根据制造商的建议，使用可商购的ELISA试剂盒(人IFN-γELISA Set；BDOptEIATM,BD Biosciences)测量免疫接种和非免疫接种小鼠的血浆中人IFN-γ的水平。
抗体和免疫荧光分析
使用的抗体是人单克隆抗体抗CD45、CD3、CD8、CD4、CD44、PD-1、穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ，以及同种的小鼠和兔对照(Miltenyi)和人单克隆抗体抗CD69、CD62L、CD49a、CD45RO和CCR7(Invitrogen)。阻断实验用人单克隆抗体抗PD-1和相同类型的不相关的对照抗体进行。通过直接免疫荧光，使用BDTM LSR II流式细胞仪进行这些表型分析。使用软件分析数据。
统计学分析
使用Prism 6.0软件(GraphPad软件)进行统计分析。使用独立样品的t检验比较不同组的结果。双侧检验P<0.05的值被认为是统计学显著的。
结果
在人源化小鼠模型NOD-scid Il2rγnull(NSG)中评估基于抗原肽降钙素原前体的肽疫苗的抗肿瘤作用。为了逆转活化T淋巴细胞的耗竭并有利地增强疫苗对癌症的有益治疗效果，将该积极的免疫治疗策略与临床上使用的抗PD-1单克隆抗体联合。NSG小鼠接受Heu-nIR肿瘤移植物，随后从健康HLA-A2+供体过继转移PBMC，然后用基于组合C6或C6a的疫苗单独或与PD-1免疫检查点抑制剂联合免疫接种。
结果表明，用联合免疫治疗处理人源化小鼠诱导的针对肿瘤生长的反应比每种单一治疗强得多(图7A)。与用单独的疫苗或抗PD1处理的小鼠相比，肿瘤生长控制与用联合治疗处理的小鼠的肿瘤重量的降低相关(图7B)。
然后，评估三组小鼠产生的人IFN-γ，以分析肿瘤生长降低是否与免疫反应增加相关。当与用单独的每种治疗处理的小鼠相比，联合免疫治疗处理的小鼠的血清中检测到血浆中人IFN-γ水平增加2倍(图7C)。此外，用联合治疗处理的小鼠的脾细胞的细胞内染色表明，CD8+T细胞表达更高水平的IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素(图7D)。这些结果表明，与两种单一治疗相比，联合治疗控制肿瘤生长更有效，且这种作用与更有效的T细胞功能相关。
用测试的以下两个肽组合观察到联合治疗的抗肿瘤作用：组合C6，其包括限于HLA-A2的肽和长肽(图7A和7B)；和组合C6a，其除了组合C6的肽之外还包括限于HLA-B7的肽(图8A和8B)。
联合方法诱导通过CD8T细胞分泌IFN-γ增加和活化T细胞对肿瘤的浸润增加，这与肿瘤生长降低相关。因此，联合治疗代表用于治疗逃脱CD8T细胞免疫或常规免疫治疗的肿瘤的令人感兴趣的策略。

Claims (17)

1.一种组合物，其特征在于，它包含选自SEQ ID NO：1-18序列的至少两个肽序列，所述序列的每一个以8-15个氨基酸的肽的形式存在或包含于多表位嵌合多肽中。
2.权利要求1所述的组合物，其特征在于，它包含8-15个氨基酸的肽的混合物。
3.权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，它包含嵌合多肽，所述嵌合多肽包含选自SEQ ID NO：1-18序列的至少两个序列，所述序列相邻、由1-5个氨基酸组成的连接元件相连，或由包含不是降钙素原前体的蛋白质的表位的序列分开。
4.前述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，它包含选自SEQ ID NO：1-7序列的至少两个肽序列。
5.前述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，它包含选自SEQ ID NO：1-7序列的至少三个肽序列。
6.前述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，它包含选自SEQ ID NO：4和5序列的至少一个序列和SEQ ID NO：6的序列。
7.前述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，它包含选自以下的肽序列的组合：序列SEQ ID NO：1、2、3、5和6的组合、序列SEQ ID NO：1、3、4、5和6的组合、序列SEQ ID NO：1、2、5和6的组合、序列SEQ ID NO：1、3、5和6的组合，和序列SEQ ID NO：3、4、5和6的组合。
8.一种包含至少一个核酸分子的组合物，所述核酸分子编码选自SEQ ID NO：1-18序列的至少两个8-15个氨基酸的肽，或编码权利要求3所述的嵌合多肽。
9.权利要求1-7任一项所述的组合物，包含负载有所述多肽序列的抗原呈递细胞。
10.权利要求1-9任一项所述的组合物，进一步包含至少一种免疫检查点抑制剂。
11.权利要求1-10任一项所述的组合物，进一步包含SEQ ID NO:19、20和/或21的至少一个肽序列。
12.权利要求1-11任一项所述的组合物用作药物。
13.权利要求1-11任一项所述的组合物用于抗肿瘤免疫治疗。
14.根据权利要求13所述的组合物用于权利要求13所述的用途，其特征在于，所述组合物意欲用于以下的免疫治疗：表达降钙素的肿瘤，或与高血清水平的降钙素、降钙素前体或α-CGRP原前体相关的病理。
15.根据权利要求13所述的组合物用于权利要求13或14所述的用途，其特征在于，所述组合物意欲用于甲状腺髓样癌或肺癌的免疫治疗。
16.根据权利要求13所述的组合物用于权利要13-15任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物意欲用于具有不表达TAP肽转运蛋白的细胞的肿瘤的免疫治疗。
17.根据权利要求12所述的组合物用于权利要12-16任一项所述的用途，其特征在于，所述组合物意欲用于治疗HLA-A*0201患者。
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