CN108024967B - 格隆铵脂肪酸盐及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明开发了新的格隆铵脂肪酸盐(glycopyrronium fatty acid salts)。在形成格隆铵脂肪酸盐的方法中，二相反应条件使得在格隆溴铵与碱金属和碱土金属的脂肪酸盐之间进行所希望的平衡离子交换反应。在优选的实施方案中，反应混合物中过量游离脂肪酸稳定格隆铵脂肪酸盐，减少杂质——酸A——的形成。在一些优选的实施方案中，向反应混合物中添加0.2~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加约1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。

Description

格隆铵脂肪酸盐及其制备方法
参照的关联申请
本申请要求在2015年6月15日提交的标题为“格隆铵脂肪酸盐及其制备方法”临时申请号62/175,737中公开的1个或多个发明。在本文中要求美国临时申请案35 USC §119(e)下的权益，将上述申请案以引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请涉及格隆铵盐领域。更具体而言，本发明涉及新的亲脂性格隆铵脂肪酸盐。
背景技术
甘罗溴铵(也被称为格隆溴铵)是具有季铵平衡离子的溴化物盐，其化学名为格隆铵溴化物，分子式为C19H28BrNO3，分子量为398.34。将其化学结构示出于以下表2中。
曲司氯铵为季铵盐，其化学名为曲司氯胺氯化物。曲司氯铵的分子式为C25H30ClNO3，其分子量为427.97。曲司氯铵的化学结构如下。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
季铵抗毒蕈碱药物(QAAM)因其在乙酰胆碱过量产生期间拮抗内源性乙酰胆碱的能力，或因生理学或药理学的原因延长乙酰胆碱的作用而特别有用。这些化合物均具有不明显透过中枢神经***(CNS)的性质，甘罗溴铵和曲司氯铵特别适用于治疗需要针对抗毒蕈碱受体的外周抗毒蕈碱作用的患者。
在防止CNS分布方面具有优势的相同的生物化学性质也限制了肠吸收，需要这些药物的目前可获得的制剂在不存在食物的情况下摄入，并导致患者的生物利用度不完全且易变化。
发明概述
二相反应条件使得在格隆溴铵与脂肪酸的碱金属盐和碱土金属盐之间的所希望的平衡离子交换反应成为可能。格隆铵部分至有机相中(与脂肪酸一起)的良好分配和溴化物至水相中的分配优选使用水和甲基四氢呋喃。虽然该格隆铵脂肪酸盐在该反应条件下对于水解不稳定，作为油状产物被分离，但是反应混合物中过量脂肪酸稳定该格隆铵脂肪酸盐，减少水解副产物杂质酸A的形成。
制备格隆铵脂肪酸盐的方法优选包括使用摩尔过量脂肪酸。在一些实施方案中，在反应混合物中加热至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸，形成格隆铵脂肪酸盐。在一些优选的实施方案中，向反应混合物中添加0.2~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个优选的实施方案中，向反应混合物中添加至少0.6摩尔当量的过量游离脂肪酸。在又另1个优选的实施方案中，向混合物中添加0.6~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸，形成格隆铵脂肪酸盐。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加约1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加至少1.1摩尔当量的过量游离脂肪酸。
由于过量游离脂肪酸稳定本文所述的制剂，所以这可导致格隆铵部分的生物利用度提高。
附图简述
图1用溴化物峰示出格隆溴铵的HPLC校正曲线。
图2用“格隆铵”示出格隆溴铵的HPLC校正曲线。
图3示出格隆溴铵与硬脂酸钾的交换反应的HPLC结果。
图4示出格隆溴铵与棕榈酸钾的交换反应的HPLC结果。
图5示出使用碳酸二甲酯的甘罗溴铵碱的甲基化。
图6示出甘罗溴铵碱的HPLC校正曲线。
图7 示出格隆铵硬脂酸盐EE-008-008的HPLC数据。
图8示出格隆铵硬脂酸盐EE-008-001-3B的HPLC数据。
图9示出格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-008的气相色谱数据。
图10示出格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-001-3B的气相色谱数据。
图11示出格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-008的全波谱的NMR数据。
图12A示出图11的部分波谱的NMR数据。
图12B示出图11的部分波谱的NMR数据。
图12C示出图11的部分波谱的NMR数据。
图13A示出酸A副产物的全波谱的NMR数据。
图13B示出图13A的部分波谱的NMR数据。
图13C示出图13A的部分波谱的NMR数据。
图14A示出格隆铵水解副产物——季氨基醇(QAA)的NMR数据，DMSO-d6中的残留水在4.7ppm处。
图14B示出14A的部分波谱的NMR数据。
图14C示出季氨基醇的碳NMR数据。
图14D示出图14C的部分波谱的碳NMR数据。
图15A示出格隆铵月桂酸盐的HPLC数据。
图15B示出图15A的数据的放大图以及面积百分比报告。
图15C示出格隆铵月桂酸盐样品的另1次运行的HPLC数据。
图15D示出连同面积百分比报告的图15C的数据的放大图。
图16A示出格隆铵棕榈酸盐的HPLC数据。
图16B示出图16A的数据的放大图以及面积百分比报告。
图16C示出格隆铵棕榈酸盐样品的另1次运行的HPLC数据。
图16D示出图16C的数据的放大图以及面积百分比报告。
图17A示出格隆铵亚油酸盐的HPLC数据。
图17B示出图17A的数据的放大图以及面积百分比报告。
图17C示出格隆铵亚油酸盐样品的另1次运行的HPLC数据。
图17D示出图17C的数据的放大图以及面积百分比报告。
图18示出格隆溴铵的NMR数据，DMSO-d6中的残留水在3.33ppm处，单峰。
图19示出格隆铵月桂酸盐的NMR数据。
图20示出格隆铵棕榈酸盐的NMR数据。
图21示出格隆铵亚油酸盐的NMR数据。
图22示出相对于格隆铵峰面积的格隆铵浓度。
图23示出空白色谱图。
图24示出分离度测定溶液色谱图。
图25示出溴化物标准品的离子色谱图。
图26示出格隆铵硬脂酸盐中的溴化物的离子色谱图。
图27示出格隆铵硬脂酸盐中的钾的离子色谱数据。
图28示出硬脂酸的标准品气相色谱色谱图。
图29示出用于甘罗溴铵硬脂酸盐中的硬脂酸分析的样品气相色谱色谱图。
发明详述
目前可用的季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂组合物作为盐出现，具有季铵阳离子和非有机阴离子。
均以引用的方式并入本文中的2012年1月7日授权的标题为“Uses forQuaternary Ammonium Anticholinergic Muscarinic Receptor Antagonists inPatients Being Treated for Cognitive Impairment or Acute Delirium”的美国专利No. 8,097,633和2012年4月12日公布的标题为“New Uses for Quaternary AmmoniumAnticholinergic Muscarinic Receptor Antagonists in Patients Being Treated forCognitive Impairment or Acute Delirium”的美国专利公告2012/0088785公开了使用季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂(如甘罗溴铵或曲司氯胺((trospium)))用于治疗乙酰胆碱酯酶抑制剂的不良反应的方法。
均以引用的方式并入本文中的2015年3月3日授权的标题为“CombinedAcetylcholinesterase Inhibitor and Quaternary Ammonium Antimuscarinic Therapyto Alter Progression of Cognitive Diseases”的美国专利8,969,402和2013年7月4日公布的标题为“Combined Acetylcholinesterase Inhibitor and Quaternary AmmoniumAntimuscarinic Therapy to Alter Progression of Cognitive Diseases”的美国专利公告No. 2013/0172398公开了将季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂与乙酰胆碱酯酶抑制剂联合给药，治疗认知缺损或急性谵妄。该治疗使得认知障碍或疾病缓解，即减慢疾病进展。也公开了季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂的新制剂。
在本发明的优选实施方案中，季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂包含含有有机亲脂性阴离子作为盐的阴离子成分的盐。在一些优选的实施方案中，季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂的亲脂性阴离子优选包含含有至少8个碳分子的脂肪酸。在一些优选的实施方案中，季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂为甘罗溴铵或曲司氯胺。
季铵抗毒蕈碱药物(QAAM)因其在乙酰胆碱过量产生的期间或因生理学或药理学的原因的乙酰胆碱作用的延长的期间拮抗内源性乙酰胆碱的能力而特别有用。这些化合物均具有不明显透过中枢神经***(CNS)的性质，并且甘罗溴铵和曲司氯铵特别适用于治疗需要针对抗毒蕈碱受体的外周抗毒蕈碱作用的患者。
在防止CNS分布方面具有优势的相同的生物化学性质也限制了肠吸收，需要这些药物的目前可获得的制剂在不存在食物的情况下摄入，并导致患者的生物利用度不完全且易变化。
增加甘罗溴铵、曲司氯胺和其它的QAAMs的口服生物利用度，允许药物的给药不考虑食物，也可不考虑其它的药物。由于患者间的差异程度与吸收药物的时间成正比，所以也会减少药物疗效的个体间差异，减少胃肠蠕动的变化对药物吸收的影响。还可通过接近于食物地摄取它们而改善患者摄取药物的依从性。
QAAM用亲脂性阴离子作为盐的阴离子成分制备。结构活性分析(SAR)提示最佳的亲脂性阴离子为至少8个碳分子的脂肪酸，由此分子的疏水末端可提高脂溶性，以平衡电离的阳离子型QAAM分子的正电荷。在一些优选的实施方案中，适宜的盐来自中链和长链脂肪酸家族，其包括但不限于：花生酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、芥酸、亚油酸、花生四烯酸、月桂酸、癸酸、亚麻酸或肉豆蔻酸。
QAAM (阳离子)和脂肪酸(阴离子)的盐可通过称为“离子交换”、“平衡离子交换”或“盐置换(salt metathesis)”的有机化学反应制备。在这样的反应中，将作为目前元素的盐的QAAM化合物(甘罗溴铵氢溴酸盐、曲司氯铵)置于具有ω-3脂肪酸(如α-亚麻酸)的元素盐的二相溶液中。对于该溶液，改变温度、pH和搅拌，制备选择性地萃取至有机相中的盐。将该萃取物在减压下浓缩，除去溶剂，分离盐，进行定量和定性鉴别，然后化学计量地对动物给药。在存在食物和不存在食物的情况下，采用定量血清和/或尿分析与QAAM的元素盐比较。采用定量血清和/或尿分析的QAAM (实例：甘罗溴铵)的静脉给药可被用作100%生物利用度的参比标准，将天然化合物和合成的盐这二者与其进行比较，建立它们在食物和其它常用的联合给药的药物存在和不存在情况下的相对生物利用度。
除了上述生物利用度研究以外，在该方法中需要进行定性研究，确保在该方法中无QAAM 分子的水解。
合成的脂肪酸/QAAM盐可用作用于治疗涉及人和动物中的过量乙酰胆碱活性的各种疾病的个体产品，其中的任一个是通过病理学方法或药物的用途(包含但不限于：膀胱过度活动症、流涎、腹泻、心动过缓、多汗、过度胃液分泌、倾倒综合征、支气管痉挛、血管运动性鼻炎)产生。QAAM生物利用度的提高可改善症状而不引起显著的中枢神经***抗胆碱能毒性。生物利用度的提高允许给药不考虑食物，也可允许经皮吸收，提高至该产品的经皮制剂可实际应用的水平。这也可与乙酰胆碱酯酶抑制剂或增加乙酰胆碱健康状况(acetylcholine tone)的任何其它的药物结合使用。
二相反应条件使得在格隆溴铵与碱金属和碱土金属的脂肪酸盐之间进行所希望的交换反应，制备格隆铵脂肪酸盐。格隆铵部分至有机相中(与脂肪酸一同)的良好分配和溴化物至水相中的分配使用水和甲基四氢呋喃。虽然该格隆铵脂肪酸盐在该反应条件下对于水解适度地不稳定并作为油状产物被分离，但是反应混合物中过量脂肪酸稳定该格隆铵脂肪酸盐，并减少水解副产物杂质——酸A和季铵降解物(QAA)——的形成。
格隆铵脂肪酸盐和过量游离脂肪酸的混合物可相互分离，以制备一致、明确定义的产品。本文所述的格隆铵脂肪酸盐可潜在性地根据需要增加格隆铵生物利用度。由于过量游离脂肪酸稳定本文所述的制剂，这可导致格隆铵部分的生物利用度提高。
开发了用于制备亲脂性格隆铵脂肪酸盐的实用且可量化(scalable)的合成方法。首先，由于这对发现适宜的制备方法提供快速成功的机会，在有机溶剂(无水条件)或二相(水/有机)条件下由格隆溴铵和脂肪酸钾盐进行亲脂性格隆铵脂肪酸盐的制备。 起始材料和产物的溶解度影响这些选项，最终限制去到二相(溶剂/水)***的途径。亲脂性格隆铵脂肪酸盐的制备主要利用月桂酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸(硬脂酸钾)。该方法利用不同的盐，包含脂肪酸的Na、K和Ca盐。在其它的实施方案中，使用脂肪酸的Mg或Ba盐。
评价包含多个步骤。第一步为利用月桂酸筛选和评价亲脂性盐制备选项。使用采用硬脂酸的制备实施随后的方法开发和分析方法开发。然后，制造至少5g的利用硬脂酸的亲脂性格隆铵脂肪酸盐。用另外的脂肪酸(棕榈酸、月桂酸、亚油酸和硬脂酸-参见以下表23B)合成至少3g的亲脂性格隆铵盐的3种另外的且不同的样品。然后对得到的4种样品进行表征。
也开发了用于格隆铵脂肪酸盐的分析方法。这些方法适当且精确地评估未来的格隆铵脂肪酸盐开发样品的质量。还开发了用于格隆铵脂肪酸盐的一般合成的更精细的方法。
一些分析方法应用包括但不限于：评估盐交换效率，通过确定除去无机溴化物盐(副产物)的水洗涤的最佳数目和量确保将反应推动至>95%转化率；确定稳定活性药物成分(API)所希望的过量游离脂肪酸的最佳量(评估适宜的摩尔当量范围)；和通过评估反应产物的纯度改善反应产物的分离和纯化(例如通过用适宜的溶剂/非溶剂组合物的沉淀)。在一些优的选实施方案中，最佳的水洗涤数目为3~4次洗涤。在其它的实施方案中，优选的洗涤数目为至少3次洗涤。
分析方法开发也优选包含用于定量发色起始材料、产物和降解物的方法，用于定量弱或非发色起始材料和降解物(脂肪酸和衍生的盐、二甲基羟基吡咯烷鎓降解物)的方法，用于定量起始材料和产物中的溴化物离子的方法，和用于定量产物中的钾(或钠)离子的方法。单独地，这些方法中没有1个可独自充分评价盐交换方法的效率和衍生产物的纯度，但是联系在一起，这些正交分析方法的组合达成这两个目标。
将本申请中使用的一些缩写示出于表1中，将化学结构示出于表2中。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
将目标的亲脂性格隆铵脂肪酸盐的一般化学结构示出于以下表3A中。
表3A
Figure DEST_PATH_IMAGE007
在此列出格隆铵脂肪酸盐的一些优选实例的化学结构。
R=C11H23 (月桂酸)
Figure 241146DEST_PATH_IMAGE008
格隆铵月桂酸盐
R=C17H35 (硬脂酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE009
格隆铵硬脂酸盐
R=C17H33 (油酸)
Figure 158287DEST_PATH_IMAGE010
格隆铵油酸盐
R=C15H31 (棕榈酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE011
格隆铵棕榈酸盐
R=C9H19 (癸酸)
Figure 341DEST_PATH_IMAGE012
格隆铵癸酸盐
R=C19H31 (花生四烯酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE013
格隆铵花生四烯酸盐
R=C19H39 (花生酸)
Figure 395550DEST_PATH_IMAGE014
格隆铵花生酸盐
R=C21H41 (芥酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE015
格隆铵芥酸盐
R=C17H31 (亚油酸)
Figure 209922DEST_PATH_IMAGE016
格隆铵亚油酸盐
R=C13H27 (肉豆蔻酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE017
格隆铵肉豆蔻酸盐
R=C17H29 (α-亚麻酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE019
格隆铵 α-亚油酸盐
R=C17H29 (γ-亚麻酸)
Figure DEST_PATH_IMAGE021
格隆铵 γ-亚麻酸盐
如以下表3B所示，有两种优选的起始材料(格隆溴铵 2和甘罗溴铵碱3)。
表3B
Figure DEST_PATH_IMAGE023
格隆铵盐的合成
开发了脂肪酸的格隆铵盐的实用、可量化的合成。脂肪酸的格隆铵盐的一般化学结构如表3A中的化合物1所示。考虑3种不同的方法，从格隆溴铵(表3B中的化合物2，也称为“甘罗溴铵”)或从在本文中指定为甘罗溴铵碱的合成前体(表3B中的化合物3)起始。上述3种方法为：a) 使用离子交换树脂，从格隆溴铵(表3B中的化合物2)起始的盐置换；b) 从格隆溴铵(表3B中的化合物2)起始的直接盐置换；和c) 使用甘罗溴铵碱(表3B中的化合物3)作为起始材料，经由格隆铵甲基碳酸盐的合成。
在水/Me-THF***中将至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至具有脂肪酸盐和格隆溴铵的制品中稳定反应混合物，并允许形成格隆铵脂肪酸盐。
本文中定义的“游离脂肪酸”为游离形式的脂肪酸，其不同于解离形式(盐形式)的脂肪酸。
在优选的实施方案中，向反应混合物中添加至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸，形成格隆铵脂肪酸盐。在一些优选的实施方案中，向反应混合物中添加0.2~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个优选的实施方案中，向反应混合物中添加至少0.6摩尔当量的过量游离脂肪酸。在又另1个优选的实施方案中，向混合物中添加0.6~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸，形成格隆铵脂肪酸盐。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加约1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加至少1.1摩尔当量的过量游离脂肪酸。
在优选的实施方案中，与进料比相比，分离的格隆铵脂肪酸盐混合物具有脂肪酸的富集(相对于格隆铵的)。在使用1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸的实施方案中，分离的产物优选具有大于2.2:1 FA:GP进料比(input ratio)。在这些实施方案的一些中，该比例约为2.25:1~3.00:1。在这些实施方案的一些中，该比例约为2.29:1~2.87:1。
在1个实施例中，对于副产物(酸A)的形成，通过添加过量游离月桂酸稳定格隆溴铵与月桂酸钾的反应混合物。一些优选的脂肪酸包含但不限于：花生酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、芥酸、亚油酸、花生四烯酸、月桂酸、癸酸、亚麻酸或肉豆蔻酸。一些优选的用于该脂肪酸盐的盐包含但不限于：Na、K或Ca盐。在其它的实施方案中，也可使用Mg或Ba盐。
如本文所述，过量脂肪酸与所使用的格隆溴铵和脂肪酸盐成比例。例如，对于与钾的月桂酸反应，与所使用的格隆溴铵和月桂酸钾成比例的是过量游离脂肪酸。
过量游离脂肪酸稳定反应混合物。更多的过量游离脂肪酸(过量0.6~1.2摩尔)改善相分离，改善有机萃取溶液的稳定性，并改善分离的产物的稳定性。
存在分离格隆铵脂肪酸盐和过量游离脂肪酸的可能性，确保一致、明确定义的产物。
离子交换
一开始，由于已知格隆溴铵在pH为5.6以上的pH值下具有水解不稳定性(参见例如G Gupta, V.D., “Stability of Oral Liquid Dosage Forms of GlycopyrrolatePrepared With the Use of Powder”, International Journal of PharmaceuticalCompounding, 2003, 7(5), 386-388，以引用的方式并入本文中)及所需要的技术的复杂性和成本，使用离子交换树脂的合成方法是挑战性的。虽然格隆溴铵的水溶液在pH为5.6以下在环境温度下相当稳定，但是可预期格隆溴铵在利用树脂的盐交换方法所希望的pH值下在酯键处快速水解。
从市售的格隆溴铵(表3B中的结构2)起始，原则上可通过使用阴离子交换树脂得到相应的脂肪酸盐(表3A中的结构1)。表4提供离子交换流程图，其是示出如何实现这一点的示意图。
表4
Figure 94702DEST_PATH_IMAGE024
但是，使用树脂的离子交换法需要超出标准合成方法的专业技术。除了选择适宜的树脂以外，还需要谨慎选择许多参数，使该方法的效率达到最大。影响离子交换中的吸附-解析等温线的因素包含但不限于：基质与树脂的相对比例、溶剂***(洗脱液)、温度和基质浓度。树脂与脂肪酸主链间的疏水作用在结合效率(除了极性基团的静电引力以外)方面也可发挥重要作用。因此，树脂的选择本身可以是1个重要的考虑因素(参见例如Ihara,Y. “Adsorption of Fatty Acid Sodium Salts on Ion Exchange Resins”, Journal ofApplied Polymer Science, 1986, 32(6), 5665-5667，以引用的方式并入本文中)。在Ihara中，在聚合物中具有疏水性苯基的弱碱性树脂(IRA94)与更疏水的树脂(IRA68)比较，显示更好的性能。从C-6到C-12脂肪酸盐，脂肪酸钠盐的吸附效率显著增加。
离子交换法的另1个挑战是归因于酯水解的在水溶液中高pH下的甘罗溴铵的不稳定性。该化合物在环境温度下在pH为5.6以下相当稳定(Gupta, 2003)，但是在处理条件下预期对酯的水解敏感(因为pH值基本上会比pH 5.6高)。
评估了用于制备亲脂性格隆铵脂肪酸盐的另外两种方法。
选择月桂酸作为初始工作的模型脂肪酸。在各种溶剂***中筛选格隆溴铵与月桂酸钾的交换反应。
最佳溶剂***为水/甲基四氢呋喃(Me-THF)，其提供所希望的产物——格隆铵月桂酸盐。不幸的是，分离的油性产物不稳定，分解成副产物——酸A。将包括酸A和酸A的甲基酯的来自甘罗溴铵碱与碳酸二甲酯的尝试甲基化的分解产物示出于表5中。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE025
在改善目标盐的稳定性和以固体形式获得目标物质的尝试中，也在Me-THF/水***中研究了硬脂酸钾和棕榈酸钾。这些反应未能提供固体产物，在该方法中显示部分水解成酸A。
直接盐置换(平衡离子交换)
在有机溶剂(无水条件)和二相(水/有机)条件下进行格隆溴铵与脂肪酸盐的反应。有机溶剂中的反应不会导致任何产物形成，然而使用的二相条件在反应混合物中提供所希望的产物。
该方法的一般化学作用如下所示。
Figure 424052DEST_PATH_IMAGE026
该方法中的化学作用的实例如下所示。
实例
Figure DEST_PATH_IMAGE027
成功地开发了使用萃取方法的格隆溴铵与代表性脂肪酸的钠盐或钾盐之间的直接盐置换(“离子交换”)。在该方法中，将由溴化物与脂肪酸的羧酸根共轭碱的交换得到的水溶性无机盐分配在水相中，并从反应介质中除去以驱动该交换方法。
然后评估了格隆溴铵与适宜的脂肪酸盐之间的直接平衡离子交换。代表性盐置换反应的驱动力由从溶液中沉淀出来的难溶性盐产生。在脂肪酸盐的情况下，最可能的起始材料会是相应的银盐。例如，参见以引用的方式并入本文中的2011年12月15日公开的美国专利公告2011/0306650，其中描述了通过将格隆溴铵与醋酸银反应以生成格隆铵醋酸盐(溴化银沉淀出来)来制备格隆铵氯化物。然后将醋酸盐与HCl反应以生成格隆铵氯化物(与醋酸一起)。通过使用硫酸银的盐置换相似地生成格隆铵硫酸盐。因为对药品中的重金属残留的顾虑，认为重金属残留难以完全从所希望的格隆铵脂肪酸盐中除去，并且对于大规模地沉淀银盐需要特殊的废物处理考虑(优选经过金属回收)，这样的起始材料是不期望的。
尽管如此，为了通过所得到的溴化物盐(溴化钠、溴化钾或溴化钙)的沉淀评估平衡离子交换，考虑了与无害金属(如钠、钾或钙)的脂肪酸盐结合的适宜溶剂选择。或者，可通过将高溶解性的无机盐萃取至水相中驱动平衡离子交换反应。
为了选择反应溶剂，使用HPLC 校正曲线(参见图1和图2)测定格隆溴铵(表3B中的GPBr-结构2)在各种溶剂中的溶解度。将在室温下格隆溴铵在各种溶剂中的溶解度的结果总结于以下表6中。在多数情况下用50mg的格隆溴铵和1mL的溶剂进行实验。将混合物在室温下搅拌24小时，然后过滤得到澄清的滤液。将滤液用乙腈稀释，通过HPLC检测。
表6
溶剂 室温下 备注
水 >840mg/mL 使用额外的GPBr
甲醇 >541mg/mL 使用额外的GPBr
乙醇 142mg/mL 使用额外的GPBr
IPA 26mg/mL
2-丁醇 24mg/mL
叔丁醇 4.8mg/mL
丙酮 5.4mg/mL
MEK 0.4mg/mL
MIBK <0.1mg/mL 超出校准限度
THF <0.1mg/mL 超出校准限度
Me-THF <0.1mg/mL 超出校准限度
DCM 31mg/mL
制备3种月桂酸盐(Na、K和Ca)作为模型盐。这些盐按照以引用的方式并入本文中的Zacharie等(“A Simple and Efficient Large-Scale Synthesis of Metal Salts ofMedium-Chain Fatty Acids”, Organic Process Research & Development 2009, 13,581–583)的工序制备。
月桂酸钠的制备
在室温下将月桂酸(50.08g，1.0eq.)溶解在乙醇(500mL，10vol.，95%变性)中，在回流温度下在乙醇(500mL，10vol.，95%变性)中与NaHCO3 (18.9g，0.9eq.)反应。在回流温度(~77°C)下将反应混合物(混悬液)搅拌过夜。一些固体沉淀过夜(对比文献中报道的溶液)，将混合物用额外的乙醇(~1.5L)稀释。倾析溶液，在4小时内冷却至室温(固体产物在~55°C下沉淀)。过滤浆液，用MTBE (3×200mL)洗涤产物以除去过量游离未反应的月桂酸。将白色湿润饼状物在空气中干燥过周末，然后在真空干燥箱中在50±5°C下干燥过夜，得到27.2g (产率为54.4%)的白色固体。在产率比现有技术文献低时，可优化工序以得到更佳的产率。一些用于改善产率的方法包括但不限于：优化结晶方法中的浓度或使用反溶剂降低产物的溶解度并改善产率。
月桂酸钾的制备
在回流下在乙醇(250mL)中用25g (1.0eq.)的月桂酸和11.25g的KHCO3 (0.9eq.)进行第2实验。从乙醇/MTBE (1/1)中结晶产物，在空气中干燥过周末并在真空干燥箱中在50±5°C下干燥过夜后，得到22.1g (产率为82.5%)的月桂酸钾。
为了选择反应溶剂及其优化的体积，通过在超声下添加溶剂溶解固体来检验月桂酸钾在各种溶剂中的溶解度。在小瓶中装入月桂酸钾(~100mg)，然后在超声下逐滴添加溶剂。月桂酸钾无法被多数溶剂(200vol.)溶解。将月桂酸钾在各种溶剂中的溶解度结果总结在以下表7中。
表7
溶剂 在室温下 在50℃下
水 ~138mg/mL NA
甲醇 ~50mg/mL NA
乙醇 ~14mg/mL NA
IPA <5mg/mL <5mg/mL
醋酸甲酯 <5mg/mL <5mg/mL
醋酸乙酯 <5mg/mL <5mg/mL
醋酸异丙酯 <5mg/mL <5mg/mL
醋酸丁酯 <5mg/mL <5mg/mL
丙酮 <5mg/mL <5mg/mL
MEK <5mg/mL <5mg/mL
MIBK <5mg/mL <5mg/mL
月桂酸钙的制备
在回流下在乙醇(450mL)中用15.6g (1.0eq.)的月桂酸和2.6g的Ca(OH)2(0.9eq.)进行第3实验4小时。在回流温度下沉淀产物。进一步在回流温度下用甲醇(500mL)稀释反应混合物。将浆液冷却至室温，过滤，然后用MTBE洗液冲洗。在空气中将固体干燥过夜，然后在真空干燥箱中在50±5°C下干燥过夜，得到10.4g的白色固体(产率为67.7%)。可优化工序以增加产率。一些用于改善产率的方法包括但不限于：优化结晶方法中的浓度或使用反溶剂降低产物的溶解度并改善产率。
在有机溶剂中的反应
以丙酮、甲醇和二氯甲烷作为溶剂，使用月桂酸钾、月桂酸钠、硬脂酸钾和棕榈酸钾尝试经由沉淀的盐置换。
选择月桂酸钾作为用于该研究的模型脂肪酸盐。在无水丙酮中进行第1尝试反应。将格隆溴铵(0.508g，1.0eq.)装入250mL烧瓶中，然后装入丙酮(50mL)。向混合物中添加月桂酸钾(1.1eq.)。搅拌混合物，添加额外的丙酮(100mL)试图溶解固体。固体未能完全溶解。将混合物搅拌过夜，然后浓缩成残渣。使用醋酸乙酯(EtOAc，100mL)萃取粗残渣。将萃取物浓缩，只得到48mg (少于10 wt%回收率)的油状残渣。残渣的HPLC分析显示存在几个峰。质子NMR分析显示得到复杂的混合物。
反应未能提供所希望的产物，最可能的原因在于格隆溴铵和月桂酸钾这两者的低溶解度。
由于起始化合物均溶解于甲醇，所以在甲醇中尝试下一反应。将格隆溴铵(1.036g，1.0eq.)装入20mL小管中，然后装入甲醇(5mL)以溶解所有固体。向混合物中添加月桂酸钾的甲醇溶液(0.691g，1.1eq.，10mL的甲醇)。在环境温度下将混合物搅拌过周末，然后通过HPLC检验该溶液，HPLC显示在~47% HPLC AUC形成1个新的峰(RRT=1.37)。将该溶液浓缩以除去甲醇，然后用EtOAc (3×100mL)萃取。将EtOAc萃取物合并，浓缩成油状残渣(0.8g)。HPLC分析显示该新的峰富集于61% AUC。质子NMR分析显示在3.77ppm形成甲基酯峰。该副产物的建议结构如下。
Figure DEST_PATH_IMAGE029
通过HPLC检验EtOAc萃取后剩余的固体(0.87g)，HPLC显示主峰为具有~91% AUC的“溴化物”。但是，质子NMR分析提示该固体为以下表8中列举的至少3种可能化合物的混合物。
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE031
格隆铵脂肪酸盐在甲醇反应混合物中不稳定。但是，证实在其它化合物不存在的情况下，起始材料、格隆溴铵(表3B中的结构2)在甲醇中稳定。
为了探究在无水条件下的交换反应，通过将反应物混悬在二氯甲烷(DCM)并在室温下搅拌90h来测试4种脂肪酸盐(月桂酸钾、月桂酸钠、硬脂酸钾和棕榈酸钾)。溴化钾(或溴化钠)的任何沉淀有望在过滤的DCM溶液的HPLC分析中提供相对于溴化物峰的格隆铵峰的富集。通过注射器式过滤器过滤反应混合物(DCM，1.0mL)，浓缩，将得到的固体残渣溶解在流动相中，通过HPLC分析。将在无水DCM***中的交换反应的HPLC结果示出于以下表9中。
表9
样品名称 样品信息 “溴化物”/“格隆铵”的HPLC面积比 注释
GPBr API (溴化物盐) 1:18 标准溶液
XL-007-102 月桂酸钾 1:15.6 溴化物无损失
XL-007-103 月桂酸钠 1:17.8 溴化物无损失
XL-007-104 硬脂酸钾 1:17.0 溴化物无损失
XL-007-105 棕榈酸钾 1:16.4 溴化物无损失
溴化物/格隆铵比例 清楚地表明格隆铵相对于溴化物未发生富集。使用无水条件(DCM)与月桂酸钾、月桂酸钠、硬脂酸钾或棕榈酸钾未观察到所希望的产物。
由于溶解度问题(格隆溴铵在丙酮中的溶解度低)、不稳定性(在甲醇中的酯交换反应)和不充分的溶解度差(在二氯甲烷中)，所以所有尝试均不成功。
在二相条件下的反应
在二相溶剂混合物中完成交换方法的备选研究更成功。将经由选择性萃取的平衡离子交换示出于表10中。
表10
Figure 622952DEST_PATH_IMAGE032
在萃取工序中评估了6种溶剂：2-甲基四氢呋喃(MeTHF)、甲基叔丁基醚(MTBE)、醋酸异丙酯(IPAc)、甲基异丁基酮(MIBK)、甲苯和二氯甲烷(DCM)。使用月桂酸钠作为模型脂肪酸盐，确定MeTHF为最佳溶剂，提供高度富集于格隆铵月桂酸盐中的有机相。
使用月桂酸钾、棕榈酸钾和硬脂酸钾的进一步实验证明该方法的通用性。通过质子NMR分析表征反应产物，证实与脂肪酸盐一致。使用改良的HPLC方法的HPLC分析显示在MeTHF萃取物水洗3~4次后富集至96%面积/面积。
在常用pH (8.0~8.3)下的平衡离子交换方法中，观察到水解副反应是显著的问题。该问题通过使用过量游离脂肪酸以“缓冲”介质，使水解反应最小化，和通过进行交换和在环境温度下加工材料来解决。
由于起始化合物均非常溶于水，所以在水/Me-THF中尝试反应。将格隆溴铵(表3B中的结构2) (1.0eq.)装入20mL小管中，然后用水(2mL)溶解所有固体。在20mL小管中将格隆溴铵溶液转移至月桂酸钾的水溶液(1.1 eq.，5mL的水)中。将格隆溴铵小管用水(3×1mL)冲洗，将冲洗液转移至反应小管中。HPLC分析显示“溴化物”峰与“格隆铵”峰的面积比为20/80。向反应溶液中添加Me-THF (10mL)。将混合物搅拌1小时，然后沉降以进行相分离。两层均通过HPLC检验，发现在两层(XL-007-071-1和XL-007-071-2，以下表11)之间“溴化物”峰与“格隆铵”峰的面积比有显著差异。然后将反应混合物再混合1小时，然后沉降1小时，得到两层(XL-007-071-3和XL-007-071-4)。HPLC分析显示两个峰的比例未变。上述结果显示在水层中含有更多的“溴化物”，而“格隆铵”被萃取至Me-THF层中。除去水层，用淡水代替，混合，然后沉降，得到两层(XL-007-071-5和XL-007-071-6)。HPLC分析显示Me-THF层含有93面积%的“格隆铵”。用水将Me-THF层额外洗涤2次，将 Me-THF层中的产物富集至96面积% (XL-007-071-10)。将反应混合物的水层和有机层的HPLC结果示出于表11中。
表11
Figure DEST_PATH_IMAGE033
取来自洗涤过的Me-THF层(XL-007-071-10)的等分样品，浓缩成油，该油通过质子NMR在不同的溶剂(CDCl3、DMSO-d6和D2O)进行分析来与起始材料比较。质子NMR波谱与所希望的产物的预期波谱一致。
Figure DEST_PATH_IMAGE035
为了改善溴化物和脂肪酸盐在水层和溶剂层之间的选择溶解度和分配，在以下6种溶剂和水中筛选格隆溴铵(表3B中的结构2)与月桂酸钠的反应：甲基四氢呋喃(Me-THF)、甲基叔丁基醚(MTBE)、醋酸异丙酯(IPAc)、4-甲基-2-戊酮(MIBK)、甲苯和二氯甲烷(DCM)。
在室温下用格隆溴铵(100mg，1.0eq.)和月桂酸钠，用7mL的水和7mL的有机溶剂进行反应。将反应混合物搅拌4天，然后沉降。两层均通过HPLC检验，将月桂酸钠/格隆溴铵交换的分析结果总结在以下表12中。
表12
Figure 855612DEST_PATH_IMAGE036
[1] 通过HPLC观察到显著量的分解产物(酸A)
[2] HPLC峰面积非常小。
根据上述6个实验，Me-THF为用于选择性产物分配和萃取的最佳溶剂。不幸的是，在有机层和水层这两层中均观察到分解产物(酸A，RRT=0.74)。
Figure DEST_PATH_IMAGE037
酸A
基于溶剂筛选的结果，选择Me-THF来进行进一步的研究。在室温下，在25mL的水和53mL的甲基THF中，将使用月桂酸钾和Me-THF的反应放大至4.89g的格隆溴铵与月桂酸钾(3.07g，1.05eq.)。将混合物搅拌1小时，沉降，进行相分离。形成3层，每层均通过HPLC检验，将水/Me-THF中的放大反应的结果总结于表13中。确认检测到额外的峰(tR=5.29min，RRT=0.74)，并且该峰随时间而增加。通过与酸A的分离制备和分离比较，证实该峰为副产物——酸A。将酸A——甘罗溴铵碱(表3B中的结构3)的水解产物——通过HPLC和NMR (1H和13C)分离并表征。
除去底层(含水)，用水(3×20mL)洗涤顶部两层。观察到在第1次相分离后只形成两层。用旋转蒸发器在60℃下将最终有机层(XL-007-080-4A)浓缩，得到残渣，该残渣用甲基THF (100mL)再溶解。将不溶的固体(KBr和月桂酸钾)过滤并用水溶解，然后通过HPLC检验(XL-007-080-P1)。将滤液浓缩至干，得到油(6.12g，XL-007-080-P2)，HPLC分析显示将溴化物峰减少至1.34面积%。在真空干燥箱中在50℃下将产物干燥过周末。干燥产物的NMR分析显示有一些分解。用MTBE (100 mL)溶解干燥的油状产物，通过添加正庚烷尝试沉淀，得到两层液体层。两层均通过HPLC (底层：XL-007-082-1和底层：XL-007-082-2)检验，显示高水平的副产物——酸A。
表13
Figure 848976DEST_PATH_IMAGE038
Figure DEST_PATH_IMAGE039
证实分离的油状产物已部分地分解。最可能的是，该分解与在高温和高pH下得到促进的水解反应一致。将建议的分解反应方案示出如下。
Figure 665623DEST_PATH_IMAGE040
包括具有强发色团的组分和具有弱发色团(用于本文所有意图和目的标记为“UV惰性”)的其它组分的反应混合物的性质使得混合物中的所有组分的精确分析和定量非常具有挑战性。因此，开发了正交和互补分析法以促进反应的过程间分析(in-processanaylsis)以及分离的反应产物的纯度和组成这两者的评估。
通过Me-THF萃取从格隆溴铵和月桂酸钾的水溶液中分离所希望的产物——格隆铵月桂酸盐。不幸的是，在分离方法中，由于酸A水平随时间而增加，所以分离的产物不稳定。经过周末分离的产物在50℃下从~94面积%降低至83~86面积%。在环境温度下在2周内，格隆溴铵本身在HPLC稀释溶液(ACN/水)中稳定(通过HPLC)。
在5.0g规模(GPBr)下重复格隆铵月桂酸盐的制备。将在水/ME-THF中重复的放大反应的HPLC结果总结于以下表14中。通过HPLC证实分解产物酸A在制备和分离过程中形成。
表14
Figure DEST_PATH_IMAGE041
在添加和不添加过量游离月桂酸的情况下，在室温和50℃下将Me-THF溶液负荷试验过周末。将负荷试验的结果列举在表15中。虽然室温溶液显示远比加热样品少的降解，但是分解仍然显著。与不使用过量游离月桂酸的相应样品相比，用过量游离月桂酸稳定产物的尝试导致观察到更少的分解。发现Me-THF溶液在50℃下分成两层。这可能是由于在加热时水在混合物中的溶解度限度下降。
在不使用过量游离月桂酸的情况下，在环境温度下在Me-THF溶液中产物从90.67面积%产物成分缓慢分解至87.72%。在50°C下，产物显著地分解至顶层中的仅57面积%和底层中的~50%。在环境温度下存在过量游离月桂酸的情况下，产物只显示轻微的分解(实验2A)，而在50°C下，即使在过量游离月桂酸存在的情况下，产物分解，只剩余~65-70面积%。
表15
Figure 402634DEST_PATH_IMAGE042
在Me-THF中所希望的产物随时间而降解。在50℃下产物降解显著加快。在存在过量游离月桂酸(约过量1.0摩尔当量)的情况下，特别是在环境温度下产物分解更慢。
格隆溴铵和月桂酸钾的水溶液的Me-THF萃取物产生所希望的产物，但是所希望的产物在室温下在萃取过程中不稳定。通过独立的制备和分离证实观察到的分解产物为水解产物(酸A)。证实该产物在50℃下显著地更快分解。分离的粗产物为油状，未能从庚烷和其它溶剂(MTBE、IPAc和EtOAc)中沉淀。
由于从月桂酸钾获得的油状产物不稳定，所以测试具有更长链的脂肪酸，尝试得到具有潜在改善的稳定性的固体产物。
制备硬脂酸钾和棕榈酸钾，在Me-THF/水***中用格隆溴铵测试。
使用硬脂酸和棕榈酸作为钾盐。硬脂酸钾和棕榈酸钾的制备按照来自Zacharie等的工序(“A Simple and Efficient Large-Scale Synthesis of Metal Salts ofMedium-Chain Fatty Acids”, Organic Process Research & Development 2009, 13,581–583)制备，其总结如下。
为了制备硬脂酸钾，在2L圆底烧瓶中在45℃下将硬脂酸(25.0g，1.0eq.)溶解在乙醇(500mL，20vol.，95%变性)中。向溶液中添加KHCO3 (7.88g，0.9eq.)，然后将反应混合物加热至回流(~77°C)。在回流下将反应搅拌过夜(21小时)。在65℃下向溶液中添加MTBE(500mL)。产生一些泡沫，需要剧烈搅拌以破坏泡沫。然后在50℃下添加第2份的MTBE(500mL)，在约3小时内将得到的浆液冷却至室温。过滤浆液，用MTBE (3×125mL)洗涤湿润饼状物。在真空干燥箱中在~50°C下将白色的湿润饼状物干燥过夜，得到白色固体产物(25.4g，定量产率)。
为了制备棕榈酸钾，在1L圆底烧瓶中在40℃下将棕榈酸(15.0g，1.0eq.)溶解在乙醇(200mL，95%变性)中。向溶液中添加固体KHCO3 (5.27g，0.9eq.)，然后将反应混合物加热至回流(~77°C)。在回流下将反应搅拌过夜(20小时)。在65℃下向溶液中添加MTBE(100mL)，沉淀固体产物。然后添加第2份的MTBE (100mL)，在约3小时内将得到的浆液冷却至室温。过滤浆液，用MTBE (3×100mL)洗涤湿润饼状物。在真空干燥箱中在~50°C下将白色的湿润饼状物干燥过夜，得到白色固体产物(14.7g，产率为94.8%)。
通过以下方法进行交换反应：在Me-THF/水中溶解脂肪酸盐和格隆溴铵，在室温下搅拌5.0h，然后分离相，用水洗涤有机相。将Me-THF层和水层这两层的HPLC分析结果示出于图3 (硬脂酸钾)和图4 (棕榈酸钾)中。与硬脂酸钾和棕榈酸钾的交换反应未提供无酸A杂质的所希望的产物。在将萃取物浓缩后，两个反应均得到难以分离的粘性油状残渣。均未提供超过由月桂酸钾得到的结果的优势。
通过添加过量游离脂肪酸稳定交换反应
为了稳定格隆铵月桂酸盐产物并避免格隆铵分解为酸A，用过量游离月桂酸(相对于格隆溴铵过量1.1摩尔当量)测试Me-THF/水反应***。通过在室温下将格隆溴铵(1.04g，1.0eq.)的水(5mL)溶液和月桂酸钾(1.1eq.)的水(5mL)溶液这两种溶液与有过量月桂酸(1.1eq.)和没有过量月桂酸的Me-THF (20mL)混合过夜来进行有过量游离月桂酸和没有过量游离月桂酸的两个实验。对于每个反应，两层均通过HPLC进行检验，将有过量游离脂肪酸的交换反应的HPLC的结果总结于以下表16中。有过量游离月桂酸的反应显示在混合过夜后未形成副产物——酸A，但是不使用过量游离月桂酸的实验在两层中均有酸A。
表16
Figure DEST_PATH_IMAGE043
[1] 在Me-THF层中观察到5.5面积%的酸A。
[2] 在水层中观察到2.2面积%的酸A。
[3] 月桂酸峰在格隆铵峰中共洗脱。
向在水/ Me-THF***中用月桂酸钾和格隆溴铵的制备中添加1.1摩尔当量的过量游离月桂酸稳定反应混合物。
二相反应使得可在格隆溴铵与脂肪酸的碱金属盐和碱土金属盐之间进行所希望的交换反应。格隆铵部分向有机相(与脂肪酸一起)的良好的分配和溴化物向水相的分配使用水和甲基四氢呋喃实现。格隆铵脂肪酸盐在反应条件下对水解不稳定，并且作为分离的油状产物不稳定。随时间记录杂质酸A的形成。在反应混合物中的过量游离脂肪酸稳定格隆铵脂肪酸盐并减少杂质——酸A的形成。
与碳酸甲酯的反应
在现有技术中，在表面活性剂和去污剂工业中以及在具有不同于卤化物的平衡离子的离子液体的制备中主要采用碳酸二甲酯化学作用。
甘罗溴铵碱与碳酸甲酯的反应和随后的用脂肪酸的处理未能提供任何所希望的产物，并且只产生来自甘罗溴铵的分解产物。
将在该研究中包括的化学作用的1个实例如下示出。
实例
Figure 988337DEST_PATH_IMAGE044
由于起始的甘罗溴铵碱(表17中的化合物3)及其季铵化反应产物(格隆铵碳酸甲酯盐，表17中的化合物4)在与碳酸二甲酯成功地进行季铵化反应所希望的高温和高压条件下的不稳定性，通过碳酸甲酯进行的合成方法并不成功。
由于无法实现所需要的格隆铵的碳酸甲酯盐的清洁合成，所以中断该研究，并且随后的努力集中在使用格隆溴铵的直接盐置换。
叔胺可用碳酸二甲酯烷基化，高产率地产生对应的季铵碳酸甲酯盐。随后的与质子源的反应经由碳酸甲酯平衡离子分解为CO2和甲醇引起清洁离子置换反应，所述CO2和甲醇容易从反应混合物中除去以产生高纯度产品。
表17
Figure DEST_PATH_IMAGE045
表17示出用于经由碳酸甲酯从甘罗溴铵碱合成脂肪酸的格隆铵盐的步骤的顺序。
由于碳酸二甲酯具有90℃的沸点，所以烷基化反应需要高温(通常为80~150°C，依赖于叔胺的反应性)，并且在高压下进行。报告了杂环叔胺反应更快，并且在比空间拥挤的脂族叔胺相对较低温度下反应。例如，以引用的方式并入本文中的在1990年1月9日授权的Mori等的美国专利No. 4,892,944报告了N-甲基吡咯烷(与甘罗溴铵碱3最接近的结构基元)可在120℃下季铵化，在6小时后以97%分离产率得到相应的碳酸甲酯盐。已知更亲核的在桥头承载氮原子的双环胺容易在大气压下在回流条件(80~90°C)下反应，以高产率得到碳酸甲酯(参见以引用的方式并入本文中的2012年12月20日公开的Friesen等的美国专利公开2012/0321969)。
在纯碳酸二甲酯中以及两种非亲核溶剂——叔戊醇和二甲基乙酰胺——中评估季铵化反应，所述溶剂被认为对起始的甘罗溴铵碱是惰性的。甘罗溴铵碱(化合物3)基于公开的工序(参见以引用的方式并入本文中的Allmendinger et al., “Carry Over ofImpurities: A Detailed Exemplification for Glycopyrrolate (NVA237)”, OrganicProcess Research & Development 2012, 16, 1754~1769)由上海睿智化学研究有限公司(中国)定制。
尝试甘罗溴铵碱(表3B中的结构3)与碳酸二甲酯(示出于表18中)的4种反应。对于一般工序，将甘罗溴铵碱(表3B中的结构3)装入Fisher-Porter耐压瓶中，然后装入碳酸甲酯和溶剂。在轻度真空下将溶液用氮气净化3次，然后将反应器密封。将反应混合物搅拌，用油浴加热。将详细的反应条件和结果总结于图5中。
表18
Figure 418181DEST_PATH_IMAGE046
在所有4个实验(参见图5)中，观察到甘罗溴铵碱3在反应条件下分解，产生环戊基扁桃酸衍生物(“酸A”)和对应的甲基酯(表5)。分析结果显示在任何反应混合物中未观察到所希望的产物。
由于起始的甘罗溴铵碱的不稳定性，放弃经由格隆铵碳酸甲酯盐的盐置换方法。
甘罗溴铵碱和格隆溴铵的HPLC校正曲线的制备
基于起始材料的分析结果报告，建立HPLC方法，制备甘罗溴铵碱(表3B中的结构3)以及格隆溴铵 (表3B中的结构2)的3条HPLC校正曲线。将它们总结于表19以及图1-2和图6中。
表19
Figure DEST_PATH_IMAGE047
备注：格隆溴铵在色谱图中得到两个不同的峰。峰#1 (RRT=0.20)对应于“溴化物”(Br-离子)且峰#2 (RRT=1.00) 对应于“格隆铵”部分。
进一步的合成和分析
还开发了用于格隆铵脂肪酸盐的分析方法。这些方法适当且精确地评估格隆铵脂肪酸盐样品的质量。还开发了用于格隆铵脂肪酸盐的一般合成的更精细的方法。
分析包括格隆铵脂肪酸盐的合成的改善和分析这些盐的方法的开发这两者。
通过原位生成所需要的脂肪酸的钠盐或钾盐(经由用氢氧化钠或氢氧化钾处理脂肪酸)，而不是使用在独立的步骤中制备的脂肪酸的钠盐或钾盐，改善并简化合成方法。花费了大量努力来明确合适量的过量游离脂肪酸，所述合适量的过量游离脂肪酸通过最小化产物的水解来稳定产物，同时还通过最小化在一些情况下相当严重的乳液的形成来促进萃取方法。在该方案的第2阶段中的多数开发工作使用硬脂酸来进行。除了均为饱和脂肪酸的月桂酸、棕榈酸和硬脂酸之外，还将亚油酸(C-18不饱和脂肪酸，顺式,顺式-9,12双键)成功地转化为格隆铵盐，进一步证明了该方法的通用性。
分析方法开发解决来自反应混合物的组分的性质引起的挑战，这需要使用互补分析方法来评估盐置换方法和产物的质量。利用已开发的方法，目前可很好地监测盐置换方法，可靠地评估获得的脂肪酸盐的质量 。已开发的方法可被优化以允许大规模生产。
一些分析方法应用包括但不限于：评估盐交换效率，通过确定除去无机溴化物盐(副产物)的水洗涤的最佳数目和量确保将反应推动至>95%转化率，确定需要稳定活性药物成分(API)的过量游离脂肪酸的最佳量(评估适宜的摩尔当量范围)，和通过评估反应产物的纯度改善反应产物的分离和纯化(例如通过用适宜的溶剂/非溶剂组合物的沉淀)。在一些优的选实施方案中，最佳的水洗涤数目为3~4次洗涤。在其它的实施方案中，优选的洗涤数目为至少3次洗涤。
分析方法开发也优选包含用于定量发色起始材料、产物和降解物的方法，用于定量弱或非发色起始材料和降解物(脂肪酸和衍生的盐、二甲基羟基吡咯烷鎓降解物)的方法，用于定量起始材料和产物中的溴化物离子的方法，和用于定量产物中的钾(或钠)离子的方法。
利用二相(有机/含水)***来选择性地将无机盐分配至水相并从分离的有机相中分离亲脂性有机盐(格隆铵脂肪酸盐)，成功地从格隆溴铵和脂肪酸盐制备格隆铵脂肪酸盐(GPFA)。但是，如上所述，反应混合物对水解不稳定，脂肪酸盐在甲醇溶液中也不稳定(形成酯交换副产物)。分离的格隆铵脂肪酸盐(GPFA)也被证实因随时间形成的降解物“酸A”(CAS427-49-6，α-环戊基-α-羟基-苯乙酸)水平增加而内在地不稳定。过量游离脂肪酸稳定反应混合物，显著地降低水解的速度(限制“酸A”的形成)。也挑战从反应混合物中精确地定量所有组分以评估合成效率。
进一步的实验探讨格隆铵脂肪酸盐(GPFA)与过量游离脂肪酸的分离，证实改善分离产物的稳定性，也开发表征分离材料的适宜分析方法。这些实验包括：制备用于开发分析方法的样品，开发表征格隆铵脂肪酸产物的分析方法，限定分离产物的适宜的制备工序和特征，和制备一系列的GPFA样品。这些努力是成功的，得到适宜制备工序以及分析和表征分离产物的分析方法。
开发的分析方法可靠且简便，足以适应各种脂肪酸的格隆铵盐(对于使用的每种脂肪酸的GC方法条件进行预期的小修饰)。
如上所述，只1个研究(平衡离子交换或经由在二相含水/有机溶剂***中的选择性分配的盐置换)证明在制备格隆铵脂肪酸盐方面有效。由于甘罗溴铵碱在甲基化条件下分解，所尝试的从甘罗溴铵碱的合成不成功，所述合成经由在升高的温度下用碳酸甲酯的季铵化和随后使用脂肪酸对预期的季铵碳酸甲酯盐的处理。由于格隆溴铵和脂肪酸盐在评估的有机溶剂(丙酮和二氯甲烷)中的低溶解度，在无水条件下在有机溶剂中的盐交换失败。观察到的格隆铵部分的水解不稳定性排除了用离子交换树脂的含水离子交换的考虑。
甚至在选择性的二相分配研究中，对于所测试的多数***观察到严重的乳液和不佳的分配。选择性的溴化物向水相的分配和格隆铵向有机相的分配不容易实现。在所筛选的溶剂***(2-Me-THF、MTBE、IPAc、甲苯、MIBK和DCM)中，只有2-Me-THF对所希望的分配提供充分的选择性。另外，由于在萃取溶液和分离产物这两者中均随时间形成“酸A”，所以在反应和分离过程中注意到了水解不稳定性。分离的格隆铵脂肪酸混合物的稠度范围从粘稠的油至糊膏至硬蜡状固体。
初始合成实验测试了月桂酸(C-12链)、硬脂酸(C-18链)和棕榈酸(C-15链)。进一步的合成和分析实验测试了硬脂酸、月桂酸、棕榈酸和亚油酸(C-18多不饱和,顺式,顺式-9,12-十八碳二烯酸)。
该方法通过在二相反应混合物中使格隆溴铵与脂肪酸盐反应和在反应混合物中包括至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸来合成格隆铵脂肪酸盐。在优选的实施方案中，向反应混合物中添加至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸，形成格隆铵脂肪酸盐。在一些优选的实施方案中，向反应混合物中添加0.2~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个优选的实施方案中，向反应混合物中添加至少0.6摩尔当量的过量游离脂肪酸。在又另1个优选的实施方案中，向反应混合物中添加0.6~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸，形成格隆铵脂肪酸盐。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加约1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。在另1个实施方案中，向反应混合物中添加至少1.1摩尔当量的过量游离脂肪酸。
如上所述，过量游离脂肪酸与所使用的格隆溴铵和脂肪酸盐成比例。例如，对于月桂酸反应，与所使用的格隆溴铵和月桂酸钾成比例的是过量游离月桂酸。
过量游离脂肪酸稳定反应混合物。更多的过量游离脂肪酸(过量0.6~1.2摩尔)改善相分离，改善有机萃取溶液的稳定性，改善分离产物的稳定性。
在优选的实施方案中，经由用金属氢氧化物的脂肪酸盐处理，而不是使用钠、钾或钙，产生所需要的脂肪酸的钠盐、钾盐或钙盐。在该步骤中，在二相反应混合物(优选水和2-甲基-四氢呋喃)中将脂肪酸与金属氢氧化物混合直至所有固体溶解，形成脂肪酸盐。金属氢氧化物优选碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙)。
该方法也优选包括添加格隆溴铵并混合直至固体溶解。保留上部有机相，同时除去反应混合物的下部水相。然后用水洗涤上部有机相。优选重复保留上部有机相和除去下部水相的步骤。在优选的实施方案中，这2个步骤重复至少3次以增加格隆铵脂肪酸盐的纯度。在其它优选的实施方案中，这2个步骤重复3~4次。
优选对上部有机相进行真空蒸馏并添加新的2-甲基-四氢呋喃。真空蒸馏步骤优选重复至少1次(总共2次)，除去痕量的残留水，直至观察不到馏出物。在优选的实施方案中，添加非极性烃溶剂以沉淀不溶解的组分，所述组分过滤除去。然后将滤液进一步在减压下蒸馏，获得固体。在优选的实施方案中，非极性烃溶剂为正庚烷或庚烷异构体的混合物。在备选的实施方案中，可使用正己烷、异辛烷或石油醚代替庚烷。
需要可充分表征成分和分离产物的纯度并能进一步开发的分析方法。无单一方法适合于所有组分，需要互补(正交)方法以充分地表征分离产物。
由于脂肪酸组分和任意的3-羟基-1,1-二甲基吡咯烷鎓降解物缺乏发色团，所以妨碍纯度和分析方法的开发。在溴化物与3-羟基-1,1-二甲基吡咯烷鎓降解物之间也缺乏利用HPLC的保留/分离。甘罗溴铵混合物的具有挑战性的溶解度性质、样品沉淀、色谱柱填塞法和色谱柱性能的加速损失也妨碍方法开发。最终，这些挑战通过用于表征格隆铵脂肪酸盐的下述方法的开发得到克服。
由于遇到挑战，目标格隆铵脂肪酸盐的制备并不简单，需要发明才能实现适合于作为API产品进一步开发的稳定的良好表征的产物的制备。
用于制备格隆铵脂肪酸盐的方法
二相反应条件使得在格隆溴铵与脂肪酸的钠盐和钾盐之间进行所希望的交换反应。使用水和2-甲基四氢呋喃实现格隆铵部分向有机相(与脂肪酸一起)的良好分配和溴化物向水相的分配。格隆铵脂肪酸盐在反应条件下对水解不稳定，在存在过量游离脂肪酸的情况下作为分离的油状产物。随时间记录杂质“酸A”的形成。反应混合物中的过量游离脂肪酸稳定格隆铵脂肪酸盐，减少杂质“酸A”的形成。稳定的1个原因可能是格隆铵脂肪酸盐与过量游离脂肪酸之间的聚集，用亲脂性脂肪酸链屏蔽酯链，保护其免受水的接近。虽然具有挑战性，但是实现了已知产物的分离。
进一步确定制备工序，使用分析方法表征分离产物。另外，制备一系列的格隆铵脂肪酸样品，包括格隆铵月桂酸盐、格隆铵硬脂酸盐、格隆铵棕榈酸盐和格隆铵亚油酸盐。
首先，在用于格隆铵脂肪酸混合物的制备之前，制备并分离碱金属脂肪酸盐。优选无脂肪酸金属盐的分离的用于格隆铵脂肪酸混合物的简单制备工序。由于在2-Me-THF/水混合物中混合脂肪酸金属盐、过量游离脂肪酸和格隆溴铵，所以修饰的工序在溶液中制备脂肪酸金属盐。目标量的脂肪酸和金属氢氧化物容易溶解在水和2-Me-THF的混合物中，以直接提供所希望的脂肪酸盐和过量游离脂肪酸的溶液。
该研究在在以下实施例中详细描述。将硬脂酸(6.26g，22mmol，2.2eq.)和氢氧化钾(0.726g，11mmol，1.1eq.)溶解在水(50mL)和2-Me-THF (50mL)的混合物中。假设氢氧化钾的纯度为100% (此情况少见)，本实施例中的摩尔过量的游离脂肪酸为1.2摩尔当量的过量游离硬脂酸(相对于格隆溴铵)和相对于氢氧化钾为1.1摩尔当量的过量游离硬脂酸。在约30分钟内机械搅拌使其完全溶解。在不搅拌的情况下，将混合物沉降成2个澄清的相，在约30分钟后无剩余的乳液。添加格隆溴铵(3.98g，10mmol，1.0eq.)，混合，溶解(立即完全溶解)。停止混合，在不到30分钟内完成相分离。除去下部水相(pH=7)，用20mL的水将上部有机相洗涤3次。每次相分离需要不到1小时。在除去最后一次水洗后，在20~25°C/25~30Torr下将富集的有机相真空浓缩成糊状物。添加2-Me-THF (30mL)，重复真空浓缩。添加庚烷(50mL)，得到稀浆液。由于格隆溴铵和硬脂酸钾这两者在庚烷中均不溶，所以在庚烷中的溶解证实格隆铵硬脂酸盐的亲脂性。当在冰浴中冷冻该庚烷溶液时，形成浓浆液，但是其通过重新加热至环境温度变为稀浆液。在冰浴中冷却约30分钟后，将冷冻的浆液用玻璃粉漏斗过滤，但是过滤非常慢，在过滤过程中将内容物加热至室温。分离的固体证实为硬脂酸，在氮气层下吸干，干燥的固体称重为0.9g。在20~25°C/25~30Torr下将滤液真空浓缩成油状糊料。滤液证实为格隆铵硬脂酸盐和过量游离硬脂酸。
将这些样品用于分析方法开发。在分析方法开发过程中，观察到格隆铵硬脂酸盐样品(EE-008-001-3B)显著比在初始可行性工作阶段过程中制备的先前的样品更稳定(“酸A”形成速度更慢)。但是，仍观察到样品随时间缓慢降解，到完成方法开发为止(~4个月)，用最终方法分析样品，记录“酸A”的形成(2.44 w/w%，9.29% AUC HPLC酸A相对于格隆铵含量)。
进一步的实验测试对用于制备格隆铵硬脂酸盐的过量游离硬脂酸的变更。如格隆铵硬脂酸盐样品(EE-008-001-3B)中所述，这些实验使用相同的一般工序。更具体而言，从1.2至2.0摩尔当量(从0.2至1.0过量摩尔当量)，以0.2摩尔当量的增量，测试不同摩尔当量的硬脂酸。将所测试的过量游离脂肪酸的不同变更示出于表20中。样品为3次水洗后的来自甲基-THF/GPBr/硬脂酸/硬脂酸钾混合物的蜡状固体。
表20
样品ID 概述
EE-008-004-A 来自1.0eq. GPBr、1.1eq. KOH、1.2eq.硬脂酸
EE-008-004-B 来自1.0eq. GPBr、1.1eq. KOH、1.4eq.硬脂酸
EE-008-004-C 来自1.0eq. GPBr、1.1eq. KOH、1.6eq.硬脂酸
EE-008-004-D 来自1.0eq. GPBr、1.1eq. KOH、1.8eq.硬脂酸
EE-008-004-E 来自1.0eq. GPBr、1.1eq. KOH、2.0eq.硬脂酸
样品A和B在反应混合物的初始相分离后，对于水洗相分离困难(非常慢)。相反，样品C、D和E的所有相分离在约1小时内完成。与较早制备的EE-008-001-3B比较，用2.2摩尔当量的硬脂酸，从最终庚烷溶解中未观察到可过滤的固体，只注意到油相的一些分离，在分离过程中维持这种情况。分析样品，将来自可变的脂肪酸进料量的比较分析结果总结于表21中。包括样品EE-008-001-3B用于比较。
表21
Figure 659806DEST_PATH_IMAGE048
虽然证明溴化物得到有效清除且残留的钾少，但是样品中的格隆铵或硬脂酸盐含量结果无明显的趋势。由于使用少于2.2摩尔当量的硬脂酸(相对于格隆铵)显示没有优势，下一实验重复EE-008-001-3B (2.2eq.硬脂酸)的条件。
分析从重复使用2.2eq.硬脂酸制备格隆铵硬脂酸盐得到的样品EE-008-008，与EE-008-001-3B比较。将结果示出于表22中。
表22
样品EE-008-008 (新) 样品EE-008-001-3B (再测试)
GP %w/w HPLC 31.4% 31.7%
GP %AUC纯度 95.89% 87.33%
“酸A” %w/w 0.13% 2.44%
“酸A”AUC% 0.50% 9.29%
硬脂酸w/w% GC 74.1% 67.6%
钾w/w% IC 1.40% 0.60%
溴化物w/w% IC 0.008% 0.002%
GP/硬脂酸盐摩尔比NMR 1:2.35 -----
通过H<sup>1</sup>NMR得到的GPw/w% 32.2% -----
通过H<sup>1</sup>NMR得到的硬脂酸盐w/w% 67.7% -----
虽然在新分离产物中通常降解物“酸A”的水平低，但是在环境条件下该杂质随时间增加(约4个月)。
对于EE-008-008，进料量为3.98g (10mmol)格隆溴铵(用22mmol硬脂酸和11mmolKOH)。产量为5.35g 格隆铵硬脂酸盐混合物。质量回收率为56.7%。格隆铵回收率为54.2%(通过H1NMR得到)和52.8% (通过HPLC分析得到)。
将格隆铵硬脂酸盐EE-008-008的HPLC数据示出于图7中。将格隆铵硬脂酸盐EE-008-001-3B的HPLC数据示出于图8中。峰1，最大的峰，在EE-008-001-3B中具有87.6482面积%和在EE-008-008中具有96.0360面积%，为格隆铵硬脂酸盐。酸A峰出现在约17.6分钟的保留时间处(图7中的峰5和图8中的峰8)。
将格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-008的气相色谱数据示出于图9中。将格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-001-3B的气相色谱数据示出于图10中。图9和图10中的最左侧峰为气相色谱扫描中的溶剂。该数据显示样品中的硬脂酸(在EE-008-008中19.827处的峰和在EE-008-001-3B中19.836处的峰)的总量。硬脂酸的总量包括格隆铵硬脂酸盐中的硬脂酸以及仍存在于样品中的任何过量游离硬脂酸。过量游离硬脂酸的量可通过确定多少硬脂酸已被化学计量地掺入格隆铵硬脂酸盐中来计算。
以相对于四甲基硅烷(TMS)的ppm提供所有NMR化学位移。将格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-008的NMR数据示出于图11和图12A~12C中。1H NMR (400MHz, CDCl3) 0.88 (3H, t,CH3-)，1.20-1.70 (30H, m, 来自脂肪酸链的15个-CH2基和8H, m, 来自环戊基环的4个-CH2基)，2.0-2.25 (1H, m, -CH-C-N+)，2.24 (2H, t, -CH2C=O)，2.7-2.9 (1H, m, -CH-C-N+和1H, m, 来自环戊基的CH基)，2.93、3.11、3.33、3.37 (6H, 4组单峰, 2个-CH3-N+；化学位移可能因脂肪酸盐的不同聚集状态而在带电界面处不同)，3.6-3.8 (2H, m, -CH2-N+)，3.8-4.0 (1H, m, -CH-N+)，4.1-4.3 (1H, m, -CH-N+)，5.40-5.55 (1H, m, -CH-OH, 甲川质子)，7.2-7.7 (5H, m, 芳香质子/苯基)。
将副产物酸A的NMR数据示出于图13A~13C中。1H NMR (400MHz, CDCl3) 1.2-1.8(8H, m, 来自环戊基环的4个CH2基)，2.9-3.0 (1H, m, 来自环戊基环的CH基)，6.2 (1H,br s, OH/叔醇)，7.2-7.7 (5H, m, 芳香质子/苯基)。
将格隆铵水解副产物、季氨基醇(QAA)的NMR数据示出于图14A~14D中。1H NMR(400MHz, D2O) 2.1-2.3 (1H, m, -CH-C-N+)，2.5-2.7 (1H, m, -CH-C-N+)，3.2 (3H, s,CH3-N+)，3.3 (3H, s, CH3-N+)，3.5-3.7 (2H, m, -CH2-N+)，3.7-3.9 (2H, m, -CH2-N+)，4.75-4.85 (1H, m, -CH-OH, 甲川质子)。
当格隆铵硬脂酸盐水解时，其生成酸A和QAA。由于不具有强发色团且在HPLC分析中非常早地除去，所以QAA非常难使用HPLC分析。
格隆铵脂肪酸盐向水性洗涤液的损失比预期高，但是该工序仍可用于制备样品。改善盐回收率的一些方法包括但不限于：进行反萃取、盐析或选择备选的萃取溶剂。格隆铵部分和硬脂酸这两者均损失至水性洗涤液，但是与进料水平比较，在分离产物中的硬脂酸与格隆铵的比例得到富集(进料：2.2:1，分离：2.35:1)。最终比例可通过调整游离脂肪酸进料量来进一步调整。
在反应和分离过程中有效地清除溴化物。更具体而言，反应和分离工序一直提供非常低水平(<0.1%)的溴化物。这可优化洗涤，以提高该方法中的格隆铵回收率，同时仍可将残留溴化物控制在可接受水平。
将得到的格隆铵硬脂酸盐通过HPLC和GC表征，与NMR结果一致。通过分离、互补分析方法证实的结果验证了该结果。与初始研究比较样品稳定性得到改善。与较高过量游离脂肪酸分离的样品的稳定性得到改善，在环境条件下只在数月后观察到降解。过量游离脂肪酸表现出缓冲剂的作用，减慢所希望的脂肪酸盐的降解。
格隆铵脂肪酸盐的制备
作为用于制备格隆铵脂肪酸盐的更一般的描述，将计算目标量的脂肪酸(FA)与水(约8mL/g FA进料量)、2-甲基-四氢呋喃(2-Me-THF，约8mL/g FA进料量)和金属氢氧化物(如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钾KOH，1.1摩尔当量))混合。在优选的实施方案中，计算目标量为2.2摩尔当量(过量1.2摩尔当量)。在其它的实施方案中，计算量大于或等于1.2摩尔当量(过量0.2摩尔当量)。搅拌混合物直至所有固体溶解。添加格隆溴铵(“GPBr”，1.0摩尔当量)，混合直至固体溶解。停止混合，使相分离。除去下部水相(pH约为7)，保留上部有机相。将上部有机相用水洗涤3次(每次洗涤~3.2mL/g脂肪酸进料量)。除去每次下部水相(pH为~7)，保留上部有机相。
通过使用最小限度的加热的真空蒸馏(20~25°C/25~30Torr)将富集的上部有机相浓缩，获得糊状物。添加新鲜的2-Me-THF (约4.8mL/g FA进料量)，进行真空浓缩(20~25°C/25~30Torr)直至不再观察到馏出物。
添加庚烷(约8mL/g脂肪酸进料量)，搅拌混合物直至多数固体溶解。剩余一些过量游离脂肪酸作为稀浆液，将该稀浆液通过过滤器，除去剩余的固体。通过使用最小限度的加热的真空蒸馏(20~25°C/25~30Torr)将富集的过滤的庚烷溶液浓缩，获得蜡状固体。
使用本文中描述的方法，使用额外的脂肪酸制备格隆铵脂肪酸盐。更具体而言，除了上述硬脂酸(样品EE-008-008)样品以外，使用月桂酸(样品PSG-008-002)、棕榈酸(样品PSG-008-204)和亚油酸 (样品PSG-008-206)作为起始材料。将结果示出于表23A和23B中。计算理论最大回收率作为格隆铵脂肪酸和过量游离脂肪酸的总回收率。
表23A
Figure DEST_PATH_IMAGE049
表23B
Figure 997247DEST_PATH_IMAGE050
*计算作为GPFA和过量游离FA的总回收率
将格隆铵硬脂酸盐的HPLC数据示出于图7和8中。将格隆铵月桂酸盐的HPLC数据示出于图15A~15D中。峰1表示格隆铵月桂酸盐，在2次操作中分别包括90.8652面积%和90.8662面积%。峰7表示副产物酸A，其在2次操作中包括5.7508面积%和5.758面积%。其它的小峰为未鉴别的杂质或产物。
将格隆铵棕榈酸盐的HPLC数据示出于图16A~16D中。峰1表示格隆铵棕榈酸盐，在2次操作中分别包括91.2525面积%和91.3890面积%。峰5表示副产物酸A，其在2次操作中分别包括4.1180面积%和4.0100面积%。其它的小峰为未鉴别的杂质或产物。
将格隆铵亚油酸盐的HPLC数据示出于图17A~17D中。峰1表示格隆铵亚油酸盐，在2次操作中分别包括39.7889面积%和39.5620面积%。在第1次操作中峰4表示副产物酸A(图17A~17B)，在第2次操作中峰5表示副产物酸A (图17C~17D)，在2次操作中分别包括2.4126面积%和2.4171面积%。峰15 (图17A~17B)和峰17 (图17C和17D)实际上具有最高的面积百分比(分别为55.1974和55.4318)。这些峰与反应中使用的过量游离亚油酸一致，这些亚油酸因共轭C=C双键发色团而在此HPLC中被检测到。在所测试的脂肪酸中，只有亚油酸对UV检测器显示显著响应。其它的小峰为未鉴别的杂质或产物。可通过对用于分析硬脂酸的参数做小的优化的气相色谱法进行游离亚油酸量的更精确分析。
作为分析工具，HPLC只能够鉴别样品中的所希望的产物(格隆铵硬脂酸盐、格隆铵月桂酸盐、格隆铵棕榈酸盐和格隆铵亚油酸盐)和酸A。考虑到反应物和产物的复杂性，需要其它的方法鉴别样品中的脂肪酸(气相色谱法)、所希望的产物副产物(NMR)以及残留的溴化物和钾(离子色谱法)。
以相对于四甲基硅烷(TMS)的ppm提供所有NMR化学位移。将格隆溴铵的NMR数据示出于图18中。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 1.1-1.7 (8H, m, 来自环戊基的4个CH2)，2.0-2.2 (1H, m, -CH-C-N+)，2.6-2.8 (1H, m, -CH-C-N+)，2.8-3.0 (1H, m, 来自环戊基的CH基)，3.1 (3H, s, CH3-N+)，3.2 (3H, s, CH3-N+)，3.45-3.65 (2H, m, -CH2-N+)，3.65-3.85 (1H, m, -CH-N+)，3.85-3.95 (1H, m, -CH-N+), 7.20-7.65 (5H, m, 芳香质子/苯基)。格隆铵的NMR数据如上所述，示出于图11和12A~12C中。
将格隆铵月桂酸盐的NMR数据示出于图19中。1H NMR (400MHz, CDCl3) 0.87 (3H,t, CH3-)，1.20-1.70 (18H, m, 来自脂肪酸链的9个-CH2基和8H, m, 来自环戊基环的4个-CH2基)，2.1-2.25 (1H, m, -CH-C-N+)，2.23 (2H, t, -CH2C=O)，2.7-3.0 (1H, m, -CH-C-N+和1H, m, 来自环戊基的CH基)，2.95、3.10、3.28、3.30 (6H, 4组单峰, 2个-CH3-N+；化学位移可能因脂肪酸盐的不同聚集状态而在带电界面处不同)，3.6-3.85 (2H, m, -CH2-N+和1H, m, -CH-N+)，3.95-4.1 (1H, m, -CH-N+)，5.4-5.5 (1H, m, -CH-OH, 甲川质子)，7.2-7.6 (5H, m, 芳香质子/苯基)。
将格隆铵棕榈酸盐的NMR数据示出于图20中。1H NMR (400MHz, CDCl3) 0.88 (3H,t, CH3-)，1.20-1.70 (26H, m, 来自脂肪酸链的13个-CH2基和8H, m, 来自环戊基环的4个-CH2基)，2.0-2.2 (1H, m, -CH-C-N+)，2.25 (2H, t, -CH2C=O)，2.7-2.95 (1H, m, -CH-C-N+和1H, m, 来自环戊基的CH基)，2.93、3.11、3.34、3.37 (6H, 4组单峰, 2个-CH3-N+；化学位移可能因脂肪酸盐的不同聚集状态而在带电界面处不同)，3.6-3.8 (2H, m, -CH2-N+)，3.8-4.0 (1H, m, -CH-N+)，4.1-4.25 (1H, m, -CH-N+)，5.40-5.55 (1H, m, -CH-OH, 甲川质子)，7.2-7.6 (5H, m, 芳香质子/苯基)。
将格隆铵亚油酸盐的NMR数据示出于图21中。1H NMR (400 MHz, CDCl3) 0.88(3H, t, CH3-)，1.20-1.70 (16H, m, 来自脂肪酸链的8个-CH2基和8H, m, 来自环戊基环的4个-CH2基)，2.0-2.1 (4H, m, 烯丙基质子-CH2-C=C)，2.0-2.2 (1H, m, -CH-C-N+)，2.2(2H, t, -CH2C=O)，2.85 (2H, t, 双重烯丙基质子C=C-CH2-C=C)，2.7-2.9 (1H, m, -CH-C-N+和1H, m, 来自环戊基的CH基)，2.91、3.09、3.29、3.31 (6H, 4组单峰, 2个-CH3-N+；化学位移可能因脂肪酸盐的不同聚集状态而在带电界面处不同)，3.6-3.9 (2H, m, -CH2-N+和1H, m, -CH-N+)，4.0-4.15 (1H, m, -CH-N+)，5.25-5.50 (2H, m, 烯属质子)，5.35-5.50 (1H, m, -CH-OH, 甲川质子)，5.6-5.75 (2H, m, 烯属质子)，7.2-7.6 (5H, m, 芳香质子/苯基)。
NMR分析可有效地用于精确地分析格隆铵与脂肪酸组分总量的摩尔比(即化学计量结合的脂肪酸阴离子和游离脂肪酸)。将格隆铵脂肪酸盐样品的H1NMR结果的比较示出于表24中。在硬脂酸样品的芳族区域记录了干扰峰，但是格隆铵多重峰清晰而无干扰。
表24
Figure DEST_PATH_IMAGE051
格隆铵HPLC分析(GP wt%含量)适用于多种脂肪酸盐。虽然该HPLC方法用 格隆铵硬脂酸盐开发，但是在由月桂酸、棕榈酸和亚油酸制备的格隆铵脂肪酸盐的分析中未观察干扰峰或其它的问题，允许定量这些混合物中的格隆铵含量。
类似地，NMR有效地表征使用多种不同脂肪酸基质的各种脂肪酸盐。在格隆铵的情况下，脂肪酸链的末端甲基(3H)提供适合与格隆铵(GP)多重峰(4H总和，3.5-4.2ppm)比较的积分(integration)，来计算由月桂酸、棕榈酸和亚油酸制备的格隆铵脂肪酸盐的分离材料中存在的摩尔比(GP:FA)。
格隆铵脂肪酸盐样品较稳定。在初始分离中所有样品中的降解物“酸A”的水平低，但是只对格隆铵硬脂酸盐进行了经时稳定性(数月)实验。对于格隆铵硬脂酸盐，在环境条件下在~4个月内观察到降解。
质量回收率对于不同脂肪酸是可变的。对于格隆铵脂肪酸样品，质量回收率从较差变为好得多(棕榈酸<硬脂酸<月桂酸<亚油酸)。这提醒有通过进一步改善保留格隆铵盐活性和在分离的格隆铵脂肪酸盐中的回收率来额外优化工序的可能性。改善盐回收率的一些方法包括但不限于：进行反萃取，盐析，或选择备选萃取溶剂。
需要延长干燥来实现低水平的残留正庚烷(干燥直至无法通过NMR检测到庚烷)，特别是用月桂酸和棕榈酸。干燥条件的进一步优化可改善该方法。例如，可调整干燥条件的真空度和/或温度来改善该方法，同时避免降解。
对于最终产物中的脂肪酸:格隆铵(FA:GP)，记录了类似的摩尔比。与进料比比较，所有分离的格隆铵脂肪酸盐混合物均显示脂肪酸的一些富集(相对于格隆铵)。分离产物均具有大于2.2:1 FA:GP进料比。
脂肪酸享有GRAS (Generally Regarded as Safe)状态，广泛用于药物制剂中，在许多目前消费的食物中也能找到。因此，格隆铵脂肪酸中的大量过量游离脂肪酸不可能对格隆铵脂肪酸在药物开发中的使用造成问题。
目前的制备和分析方法可应用于其它的脂肪酸、优选具有至少8个碳分子的脂肪酸。一些实例包括但不限于花生酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、芥酸、花生四烯酸、月桂酸、癸酸、亚油酸、亚麻酸或肉豆蔻酸，制备格隆铵脂肪酸盐。
产物和降解物的分析
需要足以表征组成和纯度的分析方法，以满足调节需要，实现进一步的开发。缺少用于脂肪酸组分和3-羟基-1,1-二甲基吡咯烷鎓降解物的发色团需要开发用于HPLC/UV的备选方案。缺少通过HPLC的溴化物和3-羟基-1,1-二甲基吡咯烷鎓的保留/分离需要开发和使用单独的、补充方法来定量这些组分。
活性药物成分混合物的具有挑战性的溶解度性质(样品沉淀、色谱柱堵塞、色谱柱性能的加速损失)阻碍方法开发，但是这些问题最终得到解决。无单一方法适合于分析的所有组分，因而需要并成功地开发了补充(正交)方法。
制备粗产物混合物和各种关键水解副产物的样品，与起始材料样品一起分析，以实现方法开发。将所制备的样品示出于表25中。
表25
Figure 640718DEST_PATH_IMAGE052
副产物(降解物)样品制备
进行格隆溴铵的水解和副产物的分离。在室温下将由3.98g (10mmol，1.0eq.)格隆溴铵、0.80g (20mmol，2.0eq.)氢氧化钠和20mL水构成的混合物搅拌过夜。将得到的溶液通过滤纸过滤，除去痕量的粘性固体，然后通过滴加4.78g (28.35mmol，2.835equiv.)的48%含水氢溴酸来酸化。形成粘稠的白色浆液，然后将其过滤，用~5 mL的水洗涤。将分离的白色固体空气干燥，得到2.025g的“酸A”(CAS 427-49-6，α-环戊基-α-羟基-苯乙酸)。在40°C/9Torr下将合并的滤液和清洗液真空浓缩，得到3.87g的以~0.95/1 w/w比例含有季氨基醇副产物(CAS 51052-74-5, 3-羟基-1,1-二甲基吡咯烷鎓溴化物)和NaBr的油状糊料。
Figure DEST_PATH_IMAGE053
HPLC方法
开发了独特的HPLC方法以分析反应的产物。表26示出HPLC方法条件的筛选。
表26
Figure 539666DEST_PATH_IMAGE054
除了列举的筛选以外，评估了甘罗溴铵的USP方法。该方法使用Kinetex C18, 4.6×100mm, 2.6µ，流动相A：含有H3PO4的0.025M KH2PO4的pH为2.5的DI H2O溶液，和流动相B：100% ACN。根据USP方法，稀释剂为1:1流动相A和B，样品浓度为0.5mg/mL。
格隆铵硬脂酸盐的第1样品(EE-008-001-3b，来自GPBr/硬脂酸/硬脂酸钾的蜡状固体，表25)看起来在USP稀释剂中可溶，但是为了所有所筛选条件的一致性而使用甲醇，所有样品均以0.5mg/mL用MeOH制备。
采用USP方法，基线不好(非常不规则的基线)。另外，在重复注入中也观察到大量小峰。怀疑在色谱柱上的沉淀是导致该问题的原因，因此针对沉淀检验流动相。发现在梯度的高端(15%流动相A和85%流动相B)，KH2PO4缓冲剂沉淀。多数C18色谱柱充分地保留甘罗溴铵(GP)。在较低pH (磷酸)下发现峰形更好。
根据所筛选的条件，Agilent, ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6×150mm, 5μm, P/N: 993967-902和0.1% H3PO4的H2O/乙腈溶液溶剂***提供最佳性能(基线和峰形)。但是，降解物“QAA”(示出于表2中，条目8，样品EE-008-001-4b)与溴化物峰共洗脱。虽然进行了广泛的努力，但是仍无法改善溴化物和QAA峰的保留和分离。
将格隆铵和“酸A”降解物容易从其它的组分中分辨出，并通过HPLC定量，开发了用于格隆铵含量的重量百分比分析。虽然需要通过HPLC直接定量QAA含量，但是仍然需要通过单独的方法(IC)确定溴化物，然后采用减去溴化物含量的计算通过HPLC估算QAA含量。在HPLC方法开发的过程中，观察到在第1个月的使用中在样品EE-008-001-3b中未观察到“酸A”。
开发的分析方法为用于定量发色起始材料、产物和降解物的方法。该方法使用利用光电二极管阵列检测(PDA)的HPLC。
开发了格隆铵硬脂酸盐HPLC方法，该方法提供用于通过HPLC确定格隆铵或3[(环戊基羟基苯基乙酰氧基]-1,1-二甲基吡咯烷鎓(GP)硬脂酸盐分析和杂质曲线的工序。
将用于Agilent, ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6×150mm, 5μm, P/N: 993967-902色谱柱的HPLC操作条件示出于表27中，将流动相梯度示出于表28中。0.1%的0.25mg/mLGPBr，平均S/N=11.2。从25%至120%的0.25mg/mL GPBr的线性为直线。相关系数=1.000。
表27
注入体积 10μL
流动相A 0.1% H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>的H<sub>2</sub>O溶液
流动相B 0.1% H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>的ACN溶液
梯度 参见下表
流速 1mL/min
运行时间 40分钟
柱温 30°C
UV波长 210nm，用于二极管阵列检测，使用210nm Bw=8，参比360nm，Bw=100
表28
时间(分钟) A% B%
0.0 90 10
5.0 90 10
25.0 5 95
35.0 5 95
35.1 90 10
40.0 90 10
图22示出格隆铵 浓度与格隆铵峰面积关系。图23示出空白色谱图，图24示出分离度测定溶液色谱图。将方法精确度示出于表29中。
表29
名称 回收率
80%-1 100.77%
80%-2 101.37%
100%-1 101.20%
100%-2 99.909%
120%-1 101.35%
120%-2 100.94%
平均 100.92%
标准差 0.5%
用于溴化物含量的离子色谱法
另1种方法利用离子色谱法(阴离子模式)定量产物中的残留溴化物。格隆铵硬脂酸盐样品EE-008-001-3b (19页表10)的第1次粗检验显示<1% w/w溴化物(限度检查)。进行全校准序列和分析(full calibration sequence and analysis)。所有结果表明有效地除去溴化物。最终溴化物分析方法可检验和控制残留溴化物离子至<0.1%。
开发了该方法以提供使用离子色谱法确定格隆铵硬脂酸盐/硬脂酸混合物中的残留溴化物离子的痕量的工序。该分析方法应用于定量格隆铵硬脂酸盐/硬脂酸混合物中的残留溴化物离子。该方法对应于0.5mg/mL样品浓度的溴化物离子的0.1% (1000ppm)限度。
将该离子色谱法的参数和条件示出于表30中。
表30
Figure DEST_PATH_IMAGE055
将溴化物标准品的离子色谱数据示出于图25中。将格隆铵硬脂酸盐中的溴化物的离子色谱数据示出于图26中。图26中的非标记峰为样品基质(人造，与溴化物标准品痕量比较)中存在的非溴化物荷电种类。如图26所示，在样品中残留非常少的溴化物，这表明在制备所希望的盐格隆铵硬脂酸盐方面反应是成功的。
用于钾含量的离子色谱法
又另1种方法利用离子色谱法(阳离子模式)定量产物中的残留钾(或钠)。关键的挑战为样品在适宜稀释剂中有限的溶解度和钾保留时间附近的干扰峰的初始观察。这些得到解决，对于0.5mg/mL API样品，该方法可检测低至0.1%水平的定量限的钾离子。
将格隆铵硬脂酸盐中的钾的离子色谱数据示出于图27中。峰1显示钾仍然存在于样品中。峰2是未知的，但是也存在于空白样品中。如图27所示，在样品中残留非常少的钾，这表明在制备所希望的盐格隆铵硬脂酸盐方面，反应是成功的。将图26和27中示出的结果组合在一起合并考虑，也表明了成功的反应。
用于脂肪酸含量的气相色谱法
开发的另1个分析方法为用于定量弱或非发色起始材料和降解物(脂肪酸及其衍生的盐、二甲基羟基吡咯烷鎓降解物)的方法。该方法使用GC (FID)方法确定硬脂酸含量。
使用气相色谱法确定格隆铵硬脂酸盐中的硬脂酸含量。对于硬脂酸Wt%分析，开发了直接注入气相色谱法。将格隆铵硬脂酸盐溶解于THF中，用冰醋酸酸化。该方法可潜在地应用于其它的脂肪酸(对温度梯度进行修饰)。未检测到格隆铵脂肪酸盐混合物的其它的组分(但是因此也不干扰)。样品分析得到表31中示出的结果。
表31
Figure 268587DEST_PATH_IMAGE056
从盐中分离过量游离脂肪酸有一点困难。为了确定多少过量游离脂肪酸仍然在混合物中，可减去与格隆铵(其可采用化学计量计算来确定)结合的量来得到多余量。表31中的可滤过固体表示沉淀出去的物质，主要为游离脂肪酸(表中的硬脂酸)。将相当纯(以硬脂酸的重量计为98.3%)的该可滤过固体废弃。所希望的产物(格隆铵硬脂酸盐)在蜡状固体中。虽然一些多余量已在可滤过固体中被过滤出去，但是在蜡状固体中测定的硬脂酸是属于格隆铵硬脂酸盐的一部分的硬脂酸和过量游离硬脂酸这两者。
虽然图9和10和表31只示出硬脂酸含量的气相色谱结果，但是在对于气相色谱方法进行小修饰的情况下，气相色谱法也可用于定量其它的脂肪酸。可修饰的一些参数包括但不限于：维持时间、注入温度、注入浓度和上升至所述温度的时间。或者，可将NMR结果用于定量脂肪酸的量。可使用化学计量法确定结合脂肪酸的量。特定脂肪酸的长度确定格隆铵脂肪酸盐中的多少为脂肪酸，多少为格隆铵。将气相色谱操作示出于表32中。
表32
参数 条件
进样口 分流，分流比为50:1
进样口温度 250ºC
热程序 初始235ºC (等温维持30分钟)
检测 火焰离子化
检测温度 300ºC
载气 氦气
补气 氦气，30mL/min
空气流量 350mL/min
氢气流量 30mL/min
点火下限 0.5
模式 恒流
流量 3.1mL/min
运行时间 21min
图28示出标准品色谱图，图29示出样品色谱图。硬脂酸的峰ID的近似保留时间为20.1分钟。
由生成感兴趣的格隆铵脂肪酸盐的化学反应得到的复杂混合物无法直接分析。例如，其包括含有游离脂肪酸的油状混合物。多数色谱方法使用化合物的检测，但是单个的方法不能获取有关所有材料(包括起始材料、降解物和最终产物)的信息。例如，UV可看到起始材料和最终产物，但是不能看到降解物QAA。最终产物包括发色团，这就是为什么其可用UV检测，但是无发色团的降解产物无法用UV检测方法检测。由于各种组分的化学性质，需要多种分析策略。串联使用多种方法来定量起始材料、最终产物和降解产物。可针对反应中使用的每种脂肪酸优化分析。
开发了用于格隆铵脂肪酸盐的工序，这些工序使得可由多种脂肪酸制备格隆铵脂肪酸盐。脂肪酸盐的分析包括各种工序。这些工序包括利用光电二极管阵列检测的HPLC、用于硬脂酸的GC (FID)方法、利用离子色谱法(阴离子模式)的溴化物含量和利用离子色谱法(阳离子模式)的钾含量。除了这些方法以外，发现利用NMR (在d6-DMSO中)的分析可用于分离材料的表征。
虽然本文中描述的实施例主要讨论格隆溴铵，但是其它的季铵抗胆碱能毒蕈碱受体拮抗剂(例如曲司氯铵)可在反应中代替格隆溴铵来制备季铵脂肪酸盐(例如曲司氯胺脂肪酸盐)。
在制备这样的盐的1种方法中，在二相反应混合物中使曲司氯铵与脂肪酸盐反应，向反应混合物中添加至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸。该方法优选将脂肪酸与水、2-甲基-四氢呋喃(或另1种适宜的溶剂)以及选自碱金属氢氧化物和碱土金属氢氧化物的金属氢氧化物混合，直至所有固体溶解，形成脂肪酸盐。可备选地采用关于格隆铵脂肪酸盐所描述的步骤和变形中的任一种来制备曲司氯胺脂肪酸盐。
所有引用的参考文献以引用的方式并入本文中。
相应地，可理解的是，本文所描述的本发明的实施方案只是说明本发明原理的应用。本文提及的所说明的实施方案的细节并不旨在限制权利要求的范围，所述权利要求本身记载了被认为对于本发明必需的特征。

Claims (18)

1.合成至少1种格隆铵脂肪酸盐产物的方法，其包括在二相反应混合物中将格隆溴铵与脂肪酸盐混合的步骤，其中，将至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至所述反应混合物；
其中，所述混合步骤包括以下子步骤：
i) 将脂肪酸与水、2-甲基-四氢呋喃及选自碱金属氢氧化物和碱土金属氢氧化物的金属氢氧化物混合，直至所有固体溶解，以形成脂肪酸盐。
2.权利要求1的方法，其中，所述混合步骤进一步包括以下子步骤：
ii) 添加格隆溴铵并混合，直至固体溶解；
iii) 除去所述反应混合物的下部水相，并保留上部有机相；
iv) 用水洗涤所述上部有机相；
v) 重复步骤iii)和iv)至少1次；
vi) 对所述上部有机相进行真空蒸馏；
vii) 添加新的2-甲基-四氢呋喃；
viii) 重复步骤vi)，直至观察不到馏出物；
ix) 添加非极性烃溶剂并过滤得到的混合物以除去任何的悬浮固体；和
x) 对来自步骤ix)的滤液进行真空蒸馏以得到产物。
3.权利要求2的方法，其中，在步骤v)中，将子步骤iii)和iv)重复至少2次。
4.权利要求2的方法，其中，所述非极性烃溶剂选自正庚烷、庚烷异构体的混合物、正己烷、异辛烷和石油醚。
5.权利要求1的方法，其中，所述产物选自油、油状固体和蜡状固体。
6.权利要求1的方法，其中，所述脂肪酸盐的阳离子选自Na、K和Ca。
7.权利要求1的方法，其中，所述脂肪酸选自：花生酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、芥酸、亚油酸、花生四烯酸、月桂酸、癸酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸和肉豆蔻酸。
8.权利要求1的方法，其中，所述脂肪酸包括至少8个碳分子。
9.权利要求1的方法，其中，与进料比相比，分离的格隆铵脂肪酸盐混合物具有脂肪酸相对于格隆铵的富集。
10.权利要求1的方法，其中，将至少0.6摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至所述反应混合物。
11.权利要求1的方法，其中，将0.6摩尔当量的过量游离脂肪酸~1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至所述反应混合物。
12.权利要求1的方法，其中，将至少1.1摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至所述反应混合物。
13.权利要求1的方法，其中，将1.2摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至所述反应混合物。
14.权利要求13的方法，其中，分离的格隆铵脂肪酸盐混合物的所述脂肪酸相对于格隆铵的比例为2.25:1~3.00:1。
15.权利要求14的方法，其中，分离的格隆铵脂肪酸盐混合物的所述脂肪酸相对于格隆铵的比例为2.29:1~2.87:1。
16.权利要求1的方法，其中，所述二相反应混合物包含水和2-甲基-四氢呋喃。
17.权利要求1的方法，其进一步包括分析所述格隆铵脂肪酸盐产物的步骤，所述步骤包括以下子步骤：
i) 进行高压液相色谱法，以定量存在于所述产物中的格隆铵成分和水解降解物酸A；
ii) 进行气相色谱法，以定量所述产物中的总脂肪酸成分；
iii) 进行阴离子型离子色谱法，以定量所述产物中的溴化物成分；
iv) 进行阳离子型离子色谱法，以定量所述产物中的钾成分；
v) 结合从子步骤i)、ii)、iii)和iv)得到的结果进行化学计量计算，以确定过量游离脂肪酸的量和季氨基醇降解物的量；和
vi) 进行核磁共振，以确定所述产物中的格隆铵与总脂肪酸的摩尔比。
18.合成曲司铵脂肪酸盐的方法，其包括在二相反应混合物中将曲司氯铵与脂肪酸盐混合的步骤，其中，将至少0.2摩尔当量的过量游离脂肪酸添加至所述反应混合物；
其中，所述混合步骤包括以下子步骤：
i) 将脂肪酸与水、2-甲基-四氢呋喃及选自碱金属氢氧化物和碱土金属氢氧化物的金属氢氧化物混合，直至将所有固体溶解，以形成脂肪酸盐。
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