CN108018277A

CN108018277A - 重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN108018277A
Application number: CN201610973326.1A
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 赵珊珊; 胡婷
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2018-05-11

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种重组牛胰蛋白酶突变体的制备方法以及所用的重组牛胰蛋白酶突变体。本发明是在大肠杆菌***中表达重组牛胰蛋白酶突变体，表达量高，进一步提供了冷诱导表达载体和无需经过变性和复性的可溶性表达方法，并且纯化步骤简单方便；本发明的特点是重组牛胰蛋白酶突变体活性高、特异性强，且制备工艺简单、成本低。

Description

重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法。

背景技术

胰蛋白酶( Trypsin，EC 3. 4. 21. 4) 是一种以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，拥有丝氨酸蛋白酶的一些典型特征：具有高度催化活性的三联体氨基酸( His-40，Asp-84，Ser-177)；稳定催化中间产物的氧离子孔 ( Gly-175，Ser-177＆Ser-192)；底物特异性结合口袋( Asp-171、Gly-194＆Gly-204)； 12 个半胱氨酸残基构成的 6 对二硫键。在胰脏中，其以胰蛋白酶原的前体形式被合成和分泌。胰蛋白酶原在肠激酶或有活性的胰蛋白酶的催化下分解成为有活性的胰蛋白酶。不同物种的胰蛋白酶分子大小有一定差异，牛胰蛋白酶有223个氨基酸残基组成，分子量为23.3kDa，等电点为10.1-10.5.

胰蛋白酶水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键，在基因工程胰岛素的生产过程中，胰蛋白酶能将胰岛素原转化为有活性的胰岛素。但是由于胰蛋白酶对底物( Arg、Lys) 的切割选择性不强，在胰岛素的生产中就会产生副产物。而提高胰蛋白酶对 Arg 的切割选择性，降低对 Lys的切割选择性可以减少副产物的产生。Sichler 等分析人胰蛋白酶特异性结合口袋时发现：位于口袋底部的 Asp171可与 Arg 的侧链胍基形成强的离子键，与侧链较短的 Lys 只能以水桥的形式相互作用；口袋中的 Ser172 能够与 Arg 或Lys 形成氢键，加固底物与特异性结合口袋的结合。由于水桥作用力弱，Lys 与Asp171 的结合不牢固，Ser172 与 Lys 形成的氢键对于酶与底物 Lys 残基的稳定性结合起至关重要的作用。改变Ser172为其他氨基酸，或许可以降低对 Lys的切割选择性。

目前制备胰蛋白酶的方法主要有两类：一是从猪、牛等的胰脏中提取，因其方法相对简单，被广泛采用，但是该方法因不能完全除去其他蛋白质酶，且产品中的动物源病毒如***病毒、疯牛病病毒等不能完全除去，因此其应用存在一定的局限性及风险性；另一种是采用基因重组的方法制备。目前基因重组的方法大多数是在大肠杆菌中通过基因重组的方法制备人源、猪或牛源胰蛋白酶，该方法先经表达得到不具活性的胰蛋白酶原包涵体，然后使胰蛋白酶原包涵体经过变性、复性过程，再经过酶切切去酶原的前体部分才能得到有活性的酶。而在所述变性、复性过程中，复性率不可能达到100%，因此该方法费时费力，产率不高。专利201410440706.X公开了一种应用毕赤酵母分泌表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，省去变性和复性过程，可直接从培养基中获得酶原，通过肠激酶酶切，再经纯化等步骤得到了高活力的牛胰蛋白酶，但由于牛胰蛋白酶原分子量较大，分泌量有限，故最终获得酶含量较低。专利201310043541.8公开了一种应用大肠杆菌可溶性表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，解决了因分子量大而难分泌表达的难题，但是该可溶性表达的牛胰蛋白酶因对大肠杆菌毒性较大而表达量较低。

本领域需要提供一种牛胰蛋白酶突变体来加强对Arg 的切割选择性，降低对 Lys的切割选择性，同时需要一种提高牛胰蛋白酶突变体活性和含量的制备方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组牛胰蛋白酶突变体以及制备重组牛胰蛋白酶突变体的方法。

本发明的另一个目的是提供一种在大肠杆菌中可溶性表达牛胰蛋白酶突变体的方法，将该方法制备得到的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体直接酶切去除融合蛋白GST后即可得到有活性的牛胰蛋白酶突变体，并且后续的纯化步骤也简单方便。

因此，为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：首先，本发明提供一种包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3-A4，其中A1序列为融合蛋白GST，A2为A1和A3之间的柔性连接蛋白GSGS，A3为肠激酶识别位点DDDDK，A4为重组牛胰蛋白酶突变体。

本发明A1序列为融合蛋白GST序列，该序列可以增加重组牛胰蛋白酶突变体的可溶性。

本发明A2序列为A1和A3之间的柔性连接蛋白GSGS序列，该序列防止 A1和A3直接相连形成刚性结构而折断。

本发明A3序列为肠激酶酶切位点DDDDK序列，为本领域技术人员公知的技术。

本发明A4序列为牛胰蛋白酶突变体序列，该序列是将牛胰蛋白酶第 172 位丝氨酸突变为丙氨酸的突变体。将此胰蛋白酶突变体用于对胰岛素原的切割，以期减少切割反应中副产物的量。

本发明还提供编码所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体的核苷酸序列Seq ID No.11。融合蛋白GST和牛胰蛋白酶的核苷酸序列在本领域是已知的，公布在Genbank中，具体参见Seq ID No.6和Seq ID No.8。

本发明是采用大肠杆菌为宿主，为了增加宿主的表达效率，本发明将重组牛胰蛋白酶突变体的核苷酸序列进行密码子偏好性优化。该优化方法为本领域技术人员所公知的技术，可参见例如内蒙古大学学报:大肠杆菌和酵母密码子使用对比,2006,vOI.37,NO.1:34-39。在本发明优选的实施方式中，编码所述的融合蛋白GST和牛胰蛋白酶突变物的优化后核苷酸序列分别为为Seq ID No.7和Seq ID No.10。

本发明进一步提供一类冷诱导表达载体，包含编码所述的含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体的优化核苷酸序列。该表达载体属于pCOLD系列，包含pCOLDI (含TEE序列，His tag序列、Factor Xa切断序列)、pCOLDII (含TEE序列，His tag序列)、pCOLDIII(含TEE序列)、pCOLDIV。为于便于纯化，本发明优选的实施方式为pCOLDI。

为***pCOLDI中，在合成包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体的核苷酸序列时，两端分别添加了SacI/HindIII酶切位点，核苷酸序列参见Seq ID No.11，再将其***质粒pCOLDI的SacI/HindIII酶切位点，其核苷酸序列：SacI:GAGCTC ， HidIII:AAGCTT。

另外，本发明提供一种重组牛胰蛋白酶原突变体的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：

(1) 培养包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶突变体的表达；

(2) 收集菌体；

(3) 破碎菌体；

(4) 收集上清；

(5)纯化上述包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体；

(6) 酶切上述纯化后的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，产生有活性的重组牛胰蛋白酶突变体；

(7)纯化上述重组牛胰蛋白酶突变体。

所述的(1)中工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，本发明的方法对大肠杆菌宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确的目的蛋白的宿主。将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCL2转化法等。

所述的(1)中的诱导宿主表达蛋白的方法可采用本领域技术人员所公知的技术。在本发明优选的实施方式中，是在诱导表达过程中，使用浓度为0.1mM至10mM的诱导剂IPTG，在10-15℃下进行冷诱导，使得目的蛋白更高效的表达。

所述的(3)破碎菌体的方法包括高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等。

本发明中的pCOLDI载体含有His tag，所述的(5)中纯化步骤是采用Ni²⁺-NTA基质，并通过梯度为20mM至200mM的咪唑溶液洗脱带有His tag的包含融合蛋白GST的牛胰蛋白酶突变体。

所述的(6)牛胰蛋白酶突变体的活化包括前述包含融合蛋白GST的牛胰蛋白酶突变体经肠激酶(1:200，肠激酶(g)：包含融合蛋白GST的牛胰蛋白酶突变体 (g))在室温下酶解8-16小时后即可得到具有活性的重组牛胰蛋白酶突变体。

所述的(7)活性重组牛胰蛋白酶的纯化步骤包括离子交换层析。

所述步骤(1)培养包含重组牛胰蛋白酶突变体基因的工程菌并诱导重组牛胰蛋白酶突变体基因表达。具体为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为6.5-7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1 -1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10-24h后出罐，收集菌体。

活性测定表明利用大肠杆菌可溶性表达制备得到的重组牛胰蛋白酶突变体与牛胰蛋白酶对照品的活性相似。切割胰岛素的特异性较牛胰蛋白酶对照品高。

与现有技术相比，本发明所提供的重组牛胰蛋白酶突变体，以及制备重组牛胰蛋白酶突变体的方法具有以下优点：

通过在重组牛胰蛋白酶中引入A1序列，提高了重组牛胰蛋白酶的可溶性。

通过在重组牛胰蛋白酶中将172Ser突变为Ala，提高了重组牛胰蛋白酶对Arg 的切割选择性，降低对 Lys的切割选择性，以减少胰岛素切割反应中副产物的量。

在可溶性表达***中进行冷诱导表达时，温度控制在10-15℃。

表达产物重组牛胰蛋白酶结构与牛胰蛋白酶相似，无需经过变性和复性，且产量较高，其存在于菌体中，在直接酶切去除前肽后即可得到有活性的牛胰蛋白酶。

重组牛胰蛋白酶对菌体有蛋白降解，本方法所获得的是没有活性的酶突变体前体，因此减弱了上述现象的出现。

附图说明

图1.包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体cDNA序列，1-6和1354-1359为SacI /HindIII酶切位点，7-654为融合蛋白GST基因序列，655-666为GSGS基因序列，667-681为DDDDK基因序列，682-1353为牛胰蛋白酶突变体基因序列。

图2. 包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体氨基酸序列，1-216为融合蛋白GST氨基酸序列，217-220为GSGS序列，221-225为DDDDK序列，226-448为牛胰蛋白酶突变体氨基酸序列。

图3. 包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体的重组质粒构建与酶切验证图。

图4. 重组牛胰蛋白酶突变体工程菌表达与破碎后电泳图。其中:1为marker，2为一级种子，3为二级种子，4为诱导10h菌体，5为诱导15h菌体，6为诱导20h菌体，7为诱导24h菌体，8为破碎后菌体悬液，4为破碎后菌体离心上清。

图5. 包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体经Ni-NTA层析纯化。

图6. 活化的重组牛胰蛋白酶突变体阴离子层析纯化。

图7. 重组牛胰蛋白酶突变体阴离子层析纯化峰电泳分析，其中:1为marker，2为峰1（重组牛胰蛋白酶），3为峰2，4为峰3，5为峰4。

具体实施方式

以下结合具体实施例详细说明本发明，这些具体实施例均为说明性的，不以任何方式限制本发明的保护范围。

材料：

菌株和质粒：表达菌株BL21 (DE3)，质粒pCOLDI购自TakaRa。

酶和试剂：

实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于TakaRa，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

实施例中所涉及的编码包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体的核苷酸序列的合成和DNA的测序工作由南京金斯瑞有限公司完成。

其他未标明来源的原、辅料均为市售产品。

实施例1重组牛胰蛋白酶突变体的制备：

一、重组牛胰蛋白酶突变体表达载体和工程菌的构建

1、构建包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体基因序列：融合蛋白GST的氨基酸和核苷酸序列分别如下Seq ID No.1和Seq ID No.6，牛胰蛋白酶的氨基酸和核苷酸序列分别如下Seq ID No.4和Seq ID No.8。将牛胰蛋白酶中172Ser突变为Ala获得牛胰蛋白酶突变体，牛胰蛋白酶突变体的氨基酸和核苷酸序列分别如下（Seq ID No.6和Seq ID No.10）。按照大肠杆菌密码子偏好性对融合蛋白GST 和牛胰蛋白酶突变体的核苷酸进行优化，得到最终的核苷酸序列如下（Seq ID No.7和Seq ID No.10）。在融合蛋白GST基因3’末端和牛胰酶突变体的基因5’端加入柔性连接蛋白GSGS序列（基因序列为Seq ID No.2）和肠激酶酶切位点DDDDK序列（基因序列为Seq ID No.3），获得包含融合蛋白GST的牛胰蛋白酶突变体核苷酸序列。在包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体基因序列两端引入Sacl/HindIII酶切位点，具体核苷酸序列如下Seq ID No.11。

2、人工合成上述基因序列。通过SacI/HindIII酶切位点***到质粒pCOLDI相因酶切位点中，构建成重组质粒，构件图和酶切验证图如图3所示。

3、构建重组牛胰蛋白酶突变体工程菌：将上述重组质粒通过CaCl₂转化的方法导入到BL21(DE3)中，构建重组牛胰蛋白酶突变体工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致。

二、工程菌的高密度发酵

工艺1：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.8，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料6hr后，降温至15℃，调节pH至7.0，加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10h后出罐，收集菌体。

出罐后离心得菌体湿重100g/L，发酵过程中菌体取样点电泳如4，表达量达全菌蛋白的60%以上。

发酵结束离心收集的菌体按重量体积比1:10加入破碎缓冲液(含250mM Nacl，50mMNaH₂PO₄，Ph8.0)，高压均质机850bar破碎后，40min，8500rpm离心收集上清，电泳如图4。

工艺2：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为7.5，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料8hr后，降温至10℃，调节pH至7.5，加入终浓度1 mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养24h后出罐，收集菌体。

工艺3：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于35℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，35℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度35℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.5，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr后，降温至13℃，调节pH至6.5，加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养15h后出罐，收集菌体。

三、重组牛胰蛋白酶突体的纯化

将破碎离心上清用0.45um滤膜过滤，用Ni²⁺-NTA预装柱(上海博格隆)进行纯化，首先使用20mM咪唑进行洗脱以除去杂蛋白，然后200mM咪唑洗脱目的蛋白(包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶酶突变体)，收集组分峰，得到含有咪唑的牛胰蛋白酶突变体溶液。

将上述溶液用超滤柱(GE Healthcare)去除咪唑，洗脱液为包20mMTris-HCL,pH为8.0的溶液，收集组分峰，如图5。

四、重组牛胰蛋白酶突变体活化

将脱盐后的重组牛胰蛋白酶突变体经肠激酶(1:200)在室温下过夜即可得到具有活性的重组牛胰蛋白酶突变体。

五、重组牛胰蛋白酶突变体的纯化

重组牛胰蛋白酶突变体溶液经阴离子交换进行纯化(图6)，阴离子交换条件：缓冲液A-20mMTris-HCI,pH8.0；缓冲液B-20mMTris-HCI+0.5MNaCI ,pH8.0；0-100%B线性梯度10个CV。纯化的胰蛋白酶经电泳分析，纯度达到95%以上(图7)。

效果例:重组牛胰蛋白酶突变体的活性

以苯甲酰L-精氨酸乙酯盐酸盐(英文缩写为BAEE)为底物，用紫外吸收法进行测定。

取2个光程为1厘米的石英比色皿，分别加入25℃预热过的3ml底物溶液"向一只比色皿中加入200ul 0.001mol/LHCI，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色皿中加入200ul待测酶液，立即混匀并记时，每30秒读数一次，共读5min，控制△A253/min在0.05-0.100左右为宜。

绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率△A253/min。

胰蛋白酶活力单位的定义规定为:以BAEE为底物反应液pH8.0,25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定△A253/min，每分钟使△A253/min增加0.001，反应液中所加入的酶量为一个BAEE单位，具体公式如下：

胰蛋白酶溶液的活力单位(BAEE单位/ml)= △A253/min*(0.001x加入酶液体积) x稀释倍数

胰蛋白酶比活力(BAEE单位/mg)= 酶液活力*（胰酶浓度（mg/ml）x加入酶液体积）

经测定，纯化后的重组牛胰蛋白酶的每毫克为125000BAEE单位活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏万邦生化医药股份有限公司；上海复星医药（集团）股份有限公司

<120> 重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法

<130> 2016

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> mitochondrion Portunus trituberculatus（GST序列）

<400> 1

Met Pro Ile Asp Phe Tyr Tyr Leu Leu Ile Ser Pro Pro Cys Arg Ala

1 5 10 15

Val Met Leu Thr Ala Glu Ala Val Gly Val Lys Leu Asn Met Lys Glu

20 25 30

Leu Asp Ile Phe Lys Gly Glu Gln Met Lys Pro Glu Phe Val Ala Leu

35 40 45

Asn Pro Gln His Cys Ile Pro Thr Leu Val Asp Gly Asp Phe Val Ile

50 55 60

Trp Glu Ser Arg Pro Thr Cys Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Tyr Gly Lys

65 70 75 80

Asp Asp Ser Leu Phe Pro Asn Asp Pro Arg Ala Arg Ala Glu Val Glu

85 90 95

Arg Leu Asn Tyr Phe Asp Met Gly Thr Leu Phe His Arg Phe Gly Glu

100 105 110

Tyr Val Phe Pro Val Met Phe Arg Gly Glu Lys Glu Phe Asn Pro Asp

115 120 125

Lys Leu Glu Arg Leu Gln Glu Ala Leu Gly Trp Leu Asp Gly Phe Leu

130 135 140

Ser Gly Asn Lys Phe Ala Val Gly Asp Asn Ile Thr Ile Ala Asp His

145 150 155 160

Thr Leu Leu Ala Thr Val Ser Thr Ile Lys Glu Ala Asn Val Asp Leu

165 170 175

Ser Lys His Ala Asn Ile Leu Ala Trp Leu Glu Lys Cys Lys Ala Glu

180 185 190

Val Pro Gly Tyr Glu Thr Asn Gln Lys Gly Ala Glu Asp Trp Gly Lys

195 200 205

Phe Phe Lys Ser Arg Cys Asn Leu

210 215

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 未知（GSGS序列）

<400> 2

ggtagcggca gc 12

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 未知（DDDDK序列）

<400> 3

gacgatgacg ataag 15

<210> 4

<211> 223

<212> PRT

<213> Bos taurus（牛胰蛋白酶）

<400> 4

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala

100 105 110

Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met

145 150 155 160

Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn

210 215 220

<210> 5

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列（重组牛胰蛋白酶突变体）

<400> 5

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser

20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val

35 40 45

Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe

50 55 60

Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr

65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu

85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala

100 105 110

Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly

115 120 125

Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser

130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met

145 150 155 160

Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys

195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn

210 215 220

<210> 6

<211> 648

<212> DNA

<213> mitochondrion Portunus trituberculatus（GST序列）

<400> 6

atgcccattg acttttacta cctgctcatc tccccgccct gccgtgctgt gatgctgacg 60

gccgaggcgg tgggtgtgaa gctcaacatg aaggagctgg acattttcaa gggggagcag 120

atgaagccag agtttgtggc cctcaatcct cagcactgca tccccacact ggtggatggc 180

gactttgtca tctgggagag ccgacccaca tgctcctacc tggcatcaaa gtatggcaag 240

gatgactcgc tcttcccaaa tgatcctcgt gccagagctg aagtggaacg actcaattac 300

tttgacatgg gcacactctt ccatcgcttc ggggagtatg tgttcccagt aatgttcaga 360

ggtgagaagg aattcaaccc agacaagctg gaacgtttac aggaagctct tggttggctg 420

gatggcttcc tctcgggcaa caagtttgct gttggtgaca atattaccat tgctgaccac 480

actctcttgg ccactgtctc taccataaag gaggcaaatg tggacttgag caagcatgcc 540

aacatccttg cctggctgga gaagtgcaag gctgaggtgc caggctatga gaccaatcag 600

aagggtgctg aggattgggg aaagttcttc aagtctcgtt gcaacctg 648

<210> 7

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列（优化后GST融合蛋白）

<400> 7

atgccgatcg acttctacta tctgctgatt agcccgccgt gccgtgcggt gatgctgacc 60

gcggaagcgg tgggcgttaa gctgaacatg aaagagctgg atatcttcaa gggcgagcag 120

atgaaaccgg aatttgttgc gctgaacccg caacactgca tcccgaccct ggtggacggc 180

gattttgtta tttgggaaag ccgtccgacc tgcagctacc tggcgagcaa gtatggtaaa 240

gacgatagcc tgttcccgaa cgacccgcgt gcgcgtgcgg aagtggaacg tctgaactac 300

tttgatatgg gcaccctgtt ccaccgtttt ggcgagtatg tgttcccggt tatgtttcgt 360

ggcgagaagg aattcaaccc ggacaaactg gagcgtctgc aggaagcgct gggttggctg 420

gatggcttcc tgagcggtaa caagtttgcg gtgggtgaca acatcaccat tgcggatcac 480

accctgctgg cgaccgtgag caccatcaag gaagcgaacg ttgacctgag caaacacgcg 540

aacattctgg cgtggctgga gaagtgcaaa gcggaagttc cgggctacga gaccaaccaa 600

aaaggcgcgg aggattgggg caagttcttt aaaagccgtt gcaacctg 648

<210> 8

<211> 672

<212> DNA

<213> Bos taurus（牛胰蛋白酶）

<400> 8

atcgtgggcg gctacacctg tggggcaaat actgtcccct accaagtgtc cctgaactct 60

ggctaccact tctgcggggg ctccctcatc aacagccagt gggtggtgtc tgcggctcac 120

tgctacaagt ccggaatcca agtgcgtctg ggagaagaca acattaatgt cgttgagggc 180

aatgagcaat tcatcagcgc atccaagagt atcgtccatc ccagctacaa ctcaaacacc 240

ttaaacaacg acatcatgct gattaaactg aaatcagctg ccagtctcaa cagccgagta 300

gcctctatct ctctgccaac atcctgtgcc tctgctggca cccagtgtct catctctggc 360

tggggcaaca ccaaaagcag tggcaccagc taccctgatg tcctgaagtg tctgaaggct 420

cccatcctat cagacagctc ttgcaaaagt gcctacccag gccagatcac cagcaacatg 480

ttctgtgcgg gctacctgga gggcggaaag gactcctgcc agggtgactc cggtggccct 540

gtggtctgca gtggaaagct ccagggcatt gtctcctggg gctctggctg cgctcagaaa 600

aacaagcctg gtgtctacac caaggtctgc aactacgtga gctggattaa gcagaccatc 660

gcctccaact aa 672

<210> 9

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列（牛胰蛋白酶突变体）

<400> 9

atcgtgggcg gctacacctg tggggcaaat actgtcccct accaagtgtc cctgaactct 60

ggctaccact tctgcggggg ctccctcatc aacagccagt gggtggtgtc tgcggctcac 120

tgctacaagt ccggaatcca agtgcgtctg ggagaagaca acattaatgt cgttgagggc 180

aatgagcaat tcatcagcgc atccaagagt atcgtccatc ccagctacaa ctcaaacacc 240

ttaaacaacg acatcatgct gattaaactg aaatcagctg ccagtctcaa cagccgagta 300

gcctctatct ctctgccaac atcctgtgcc tctgctggca cccagtgtct catctctggc 360

tggggcaaca ccaaaagcag tggcaccagc taccctgatg tcctgaagtg tctgaaggct 420

cccatcctat cagacagctc ttgcaaaagt gcctacccag gccagatcac cagcaacatg 480

ttctgtgcgg gctacctgga gggcggaaag gacgcgtgcc agggtgactc cggtggccct 540

gtggtctgca gtggaaagct ccagggcatt gtctcctggg gctctggctg cgctcagaaa 600

aacaagcctg gtgtctacac caaggtctgc aactacgtga gctggattaa gcagaccatc 660

gcctccaact aa 672

<210> 10

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列（优化后牛胰蛋白酶突变体）

<400> 10

atcgttggtg gctacacctg cggtgcgaac accgtgccgt accaagttag cctgaacagc 60

ggctatcact tctgcggtgg cagcctgatt aacagccagt gggtggttag cgcggcgcac 120

tgctacaaga gcggtatcca agttcgtctg ggcgaggaca acattaacgt ggttgagggt 180

aacgaacaat ttatcagcgc gagcaaaagc attgtgcacc cgagctataa cagcaacacc 240

ctgaacaacg atatcatgct gattaagctg aaaagcgcgg cgagcctgaa cagccgtgtt 300

gcgagcatca gcctgccgac cagctgcgcg agcgcgggca cccagtgcct gattagcggt 360

tggggcaaca ccaagagcag cggcaccagc tatccggacg tgctgaagtg cctgaaagcg 420

ccgatcctga gcgatagcag ctgcaaaagc gcgtacccgg gtcagattac cagcaacatg 480

ttctgcgcgg gctatctgga aggtggcaag gacgcgtgcc aaggtgatag cggtggcccg 540

gtggtttgca gcggtaaact gcagggtatc gtgagctggg gtagcggttg cgcgcaaaag 600

aacaaaccgg gcgtgtacac caaggtttgc aactatgtga gctggatcaa acaaaccatt 660

gcgagcaact aa 672

<210> 11

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列（包含GST融合蛋白的重组牛胰蛋白酶突变体）

<400> 11

gagctcatgc cgatcgactt ctactatctg ctgattagcc cgccgtgccg tgcggtgatg 60

ctgaccgcgg aagcggtggg cgttaagctg aacatgaaag agctggatat cttcaagggc 120

gagcagatga aaccggaatt tgttgcgctg aacccgcaac actgcatccc gaccctggtg 180

gacggcgatt ttgttatttg ggaaagccgt ccgacctgca gctacctggc gagcaagtat 240

ggtaaagacg atagcctgtt cccgaacgac ccgcgtgcgc gtgcggaagt ggaacgtctg 300

aactactttg atatgggcac cctgttccac cgttttggcg agtatgtgtt cccggttatg 360

tttcgtggcg agaaggaatt caacccggac aaactggagc gtctgcagga agcgctgggt 420

tggctggatg gcttcctgag cggtaacaag tttgcggtgg gtgacaacat caccattgcg 480

gatcacaccc tgctggcgac cgtgagcacc atcaaggaag cgaacgttga cctgagcaaa 540

cacgcgaaca ttctggcgtg gctggagaag tgcaaagcgg aagttccggg ctacgagacc 600

aaccaaaaag gcgcggagga ttggggcaag ttctttaaaa gccgttgcaa cctgggtagc 660

ggcagcgacg atgacgataa gatcgttggt ggctacacct gcggtgcgaa caccgtgccg 720

taccaagtta gcctgaacag cggctatcac ttctgcggtg gcagcctgat taacagccag 780

tgggtggtta gcgcggcgca ctgctacaag agcggtatcc aagttcgtct gggcgaggac 840

aacattaacg tggttgaggg taacgaacaa tttatcagcg cgagcaaaag cattgtgcac 900

ccgagctata acagcaacac cctgaacaac gatatcatgc tgattaagct gaaaagcgcg 960

gcgagcctga acagccgtgt tgcgagcatc agcctgccga ccagctgcgc gagcgcgggc 1020

acccagtgcc tgattagcgg ttggggcaac accaagagca gcggcaccag ctatccggac 1080

gtgctgaagt gcctgaaagc gccgatcctg agcgatagca gctgcaaaag cgcgtacccg 1140

ggtcagatta ccagcaacat gttctgcgcg ggctatctgg aaggtggcaa ggacgcgtgc 1200

caaggtgata gcggtggccc ggtggtttgc agcggtaaac tgcagggtat cgtgagctgg 1260

ggtagcggtt gcgcgcaaaa gaacaaaccg ggcgtgtaca ccaaggtttg caactatgtg 1320

agctggatca aacaaaccat tgcgagcaac taaaagctt 1359

<210> 12

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列（包含GST融合蛋白的重组牛胰蛋白酶突变体）

<400> 12

Met Pro Ile Asp Phe Tyr Tyr Leu Leu Ile Ser Pro Pro Cys Arg Ala

1 5 10 15

Val Met Leu Thr Ala Glu Ala Val Gly Val Lys Leu Asn Met Lys Glu

20 25 30

Leu Asp Ile Phe Lys Gly Glu Gln Met Lys Pro Glu Phe Val Ala Leu

35 40 45

Asn Pro Gln His Cys Ile Pro Thr Leu Val Asp Gly Asp Phe Val Ile

50 55 60

Trp Glu Ser Arg Pro Thr Cys Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Tyr Gly Lys

65 70 75 80

Asp Asp Ser Leu Phe Pro Asn Asp Pro Arg Ala Arg Ala Glu Val Glu

85 90 95

Arg Leu Asn Tyr Phe Asp Met Gly Thr Leu Phe His Arg Phe Gly Glu

100 105 110

Tyr Val Phe Pro Val Met Phe Arg Gly Glu Lys Glu Phe Asn Pro Asp

115 120 125

Lys Leu Glu Arg Leu Gln Glu Ala Leu Gly Trp Leu Asp Gly Phe Leu

130 135 140

Ser Gly Asn Lys Phe Ala Val Gly Asp Asn Ile Thr Ile Ala Asp His

145 150 155 160

Thr Leu Leu Ala Thr Val Ser Thr Ile Lys Glu Ala Asn Val Asp Leu

165 170 175

Ser Lys His Ala Asn Ile Leu Ala Trp Leu Glu Lys Cys Lys Ala Glu

180 185 190

Val Pro Gly Tyr Glu Thr Asn Gln Lys Gly Ala Glu Asp Trp Gly Lys

195 200 205

Phe Phe Lys Ser Arg Cys Asn Leu Gly Ser Gly Ser Asp Asp Asp Asp

210 215 220

Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln

225 230 235 240

Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn

245 250 255

Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln

260 265 270

Val Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln

275 280 285

Phe Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn

290 295 300

Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser

305 310 315 320

Leu Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser

325 330 335

Ala Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser

340 345 350

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu

355 360 365

Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn

370 375 380

Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly

385 390 395 400

Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val

405 410 415

Ser Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr

420 425 230

Lys Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn

435 440 445

Claims

1.一种包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3-A4，氨基酸序列为Seq IDNo.12，其中A1为融合蛋白GST，A2为A1和A3之间的柔性连接蛋白GSGS，A3为肠激酶识别位点DDDDK，A4为重组牛胰蛋白酶突变体。

2.根据权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A1氨基酸序列为Seq ID No.1。

3.根据权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A2核苷酸序列为Seq ID No.2。

4.根据权利要求1所述包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A3核苷酸序列为Seq ID No.3。

5.根据权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A4氨基酸序列为Seq ID No.5。

6.一种冷诱导表达载体pCOLDI，包含权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：包括包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，基因序列为Seq ID No.11，***质粒pCOLDI的SacI/HindIII酶切位点。

8.一种包含重组牛胰蛋白酶突变体的工程菌，其特征在于：其包含权利要求7所述的表达载体。

9.一种包含重组牛胰蛋白酶突变体的工程菌，其特征在于：由将权利要求7所述的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。

10.一种重组牛胰蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)培养权利要求8或9任一所述的包含重组牛胰蛋白酶突变体的工程菌并诱导重组牛胰蛋白酶突变体基因的表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集上清；

(5)纯化上清中的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体；

(6)重组牛胰蛋白酶突变体的活化；

(7)重组牛胰蛋白酶突变体的纯化。

11.根据权利要求10的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)培养包含重组牛胰蛋白酶突变体基因的工程菌并诱导重组牛胰蛋白酶突变体基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为6.5-7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10-24h后出罐，收集菌体。