CN108017614A

CN108017614A - Dpp-4抑制剂及其在制备治疗2型糖尿病药物中的应用

Info

Publication number: CN108017614A
Application number: CN201810072317.4A
Authority: CN
Inventors: 史大永; 李宁; ***; 江波; 郭书举; 李祥乾; 马丽娜
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2018-05-11

Abstract

本发明涉及三种新型DPP‑4抑制剂以及在治疗2型糖尿病药物领域的应用，所属DPP‑4抑制剂以下述三种化合物中的一种或两种以上为活性成分，三种化合物的结构：该化合物通过抑制二肽基肽酶‑4的活性，增加肠促胰岛素样肽‑1和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽的水平，对于2型糖尿病有着较好的治疗作用。

Description

DPP-4抑制剂及其在制备治疗2型糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药，具体地说是三种海洋来源的芳环衍生物2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(1)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(2)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(3)及其药理活性、药学用途。以上化合物及其衍生物作为DPP-4抑制剂，可以用于治疗2型糖尿病。

背景技术

糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，目前患病人数快速增长。国际糖尿病联盟的最新资料显示，截止至2017年，世界上约有4.25亿成年糖尿病患者，据预测，至2045年，这个数字将增长至7.00亿。糖尿病的治疗显得尤为迫切。

二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)也称CD26，是一种多功能的跨膜丝氨酸蛋白酶，主要通过降解肠促胰岛素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)调节葡萄糖代谢。口服的二肽基肽酶Ⅳ抑制剂通过抑制二肽基肽酶Ⅳ的活性可以延长GLP-1和GIP在体内的半衰期，GLP-1和GIP的水平，延长其降糖作用时间，并且抑制胰高血糖素分泌，延长GLP-1对胰岛素分泌的刺激持续时间，发挥降糖作用。DPP-4抑制剂可稳定控制血糖，改善β细胞功能，并且不会引起患者体质量增加，避免低血糖风险，在用药安全方面具有显著优势，被普遍认为是最有希望的治疗2型糖尿病的新靶点。

海洋来源的天然产物一直是降糖药物的重要来源。从热带和亚热带地区红藻Laurencia similis分离得到的苯基取代类化合物(芳环取代类化合物)，降糖活性IC₅₀为2.66(Wang L J等，Rsc Advances.5(2015),48822)；从海藻Rhodomela confervoides乙醇提取物中分离得到的芳环类化合物，也具有显著的降糖活性(Shi D.Y.等,ChinaJ.Chin.Mater.Med.33(2008),2238)。据此，我们合成了海洋来源的具有显著DPP-4抑制活性的芳环衍生物2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(1)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(2)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(3)。

发明内容

本发明目的在于提供三种新型的DPP-4抑制剂，三种化合物通过抑制DPP-4的活性，延长GLP-1和GIP的作用时间，达到降低血糖的目的，可用于治疗2型糖尿病。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

DPP-4抑制剂，其以下述三种化合物中的一种或二种以上为活性成分，三种化合物的结构式如下：

即2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(1)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(2)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(3)。

本发明的目的是提供3种海洋来源的芳环衍生物在治疗2型糖尿病药物制备中的应用。

本发明的另一目的是提供以化合物1～3中的一种或两种化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，用于制备或预防2型糖尿病的药物组合物。

上述的药物组合物(即DPP-4抑制剂)，其组成含有治疗有效量的化合物1～3中的一种或两种或其药学上可接受的盐，所说的化合物在药物组合物中可以单独使用，也可以与其他药物配合使用。该药物组合物含有0.1～99％，优选为0.5～90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)、口服和外用三种形式给药。

化合物通过抑制二肽基肽酶-4的活性，增加肠促胰岛素样肽-1和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽的水平，对于2型糖尿病有着较好的治疗作用。

本发明具有如下优点：

所述目标化合物是具有显著DPP-4酶抑制活性的化合物，是2型糖尿病的治疗新药；本发明引入海洋来源的芳环衍生物，资源丰富，低毒，具有较好的降血糖活性，实现了目标化合物高收率、低成本的合成，且工艺操作简单，具有良好的产业化生产前景。

附图说明

图1为化合物1抑制DPP-4的剂量依赖性图。

图2为化合物2抑制DPP-4的剂量依赖性图。

图3为化合物3抑制DPP-4的剂量依赖性图。

1.化合物的合成与结构鉴定

以6-氯尿嘧啶和2-氰基-5-氟溴苄为起始原料，采用取代反应合成中间体；然后与三种不同的芳环衍生物溴苄在嘧啶二酮1位氮上发生芳环衍生物取代，生成芳环衍生物取代中间体；再在嘧啶二酮6位与(R)-3-(Boc-氨基)哌啶反应，最后用三氟乙酸脱去叔丁氧羰基得粗品，然后用氯仿-甲醇-三乙胺***做洗脱剂，硅胶柱色谱精制得白色固体。经波谱数据等结构鉴定为化合物2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(1)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(2)，2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(3)；英文名称分别为:2-[6-(3(R)-aminopiperidin-1-yl)-3-(3,5-difluorobenzyl)-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethyl]-4-fluorobenzonitrile(1),2-[6-(3(R)-aminopiperidin-1-y l)-3-(3,5-dimethyl)-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethyl]-4-fluorobe nzonitrile(2),2-[6-(3(R)-aminopiperidin-1-yl)-3-(3,4-dimethoxybenzyl)-2,4-diox o-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethyl]-4-fluorobenzonitrile(3).

2.二肽基肽酶4抑制活性测定

运用具有聚集诱导发光特性的新型小分子荧光探针来筛选DPP-4抑制剂活性。该小分子荧光探针在反应体系中自身不发荧光，当DPP-4切断荧光探针的N端二肽后，残基水溶性降低，发生聚集而产生荧光。该方法对DPP-4的活性检测具有较高的灵敏度和特异性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的实施例来说明此五种化合物的药理作用结果，但不以此实施例来限定本发明。

化合物的合成路线具体如下所示：

(a)2-氰基-5-氟溴苄与化合物6摩尔比为1:1～1:1.5,二异丙基乙胺，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，室温；(b)化合物18(或19，或20)与化合物7摩尔比为1:1～1:1.5，碳酸钾，碘化钾，室温；(c)(R)-3-(Boc-氨基)哌啶与化合物21(或22，或23)摩尔比为1:1～1:1.5，碳酸钾，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，惰性气体保护，80～100℃；(d)三氟乙酸，溶剂为二氯甲烷，室温；

实施例1“2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(化合物1)”的化学全合成与结构鉴定

(1)2-{[6-氯-3,4-二氢-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成及结构鉴定

室温搅拌下，向80mL溶有10克6-氯尿嘧啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入13.53mL二异丙基乙胺，逐滴加入20mL溶有16克2-氰基-5-氟溴苄(质量浓度15～20％)的N,N-二甲基甲酰胺溶液，避光条件下持续搅拌24小时后，TLC检测，原料点消失后反应结束，向反应液中加10倍量蒸馏水，有沉淀析出，20min加完，持续搅拌15min，将沉淀过滤，冰水洗涤沉淀，抽干得白色固体，混合物用无水乙醇重结晶，得白色固体14.78克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-氯-3,4-二氢-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；

(2)2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

室温条件下，向5mL溶有1克2-{[6-氯-3,4-二氢-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入0.59克无水碳酸钾、0.10克碘化钾，逐滴加入5mL溶有0.82克3,5-二氟苄溴的N,N-二甲基甲酰胺溶液,避光下反应24小时，TLC检测，原料点消失后，向反应液中加10倍量蒸馏水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并用质量浓度20％盐水洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。柱层析色谱分离，石油醚：乙酸乙酯10:1洗脱后得白色固体1.09克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈。

(3)2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

在50mL三颈瓶中，将0.51克无水碳酸钾、0.55克(R)-3-(Boc-氨基)哌啶加到15mL溶有1克2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氩气保护，90℃回流反应3个小时，TLC检测，原料点消失后，冷却反应液至室温。加10倍量蒸馏水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并用质量浓度20％盐水洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，混合物经柱层析色谱分离，石油醚：乙酸乙酯4:1洗脱，得白色固体1.2克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；

(4)2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

0℃搅拌下，将4.5mL溶有0.9mL三氟乙酸的二氯甲烷溶液加入5mL溶有0.5克2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的二氯甲烷溶液中，TLC检测，原料点消失后，加冰水猝灭反应，用质量浓度10％的NaOH溶液调PH至碱性，加入30mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，质量浓度20％盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，混合物经柱层析色谱分离，二氯甲烷-甲醇-三乙胺***洗脱，得白色固体0.35克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈，称之为化合物1。

该化合物理化性质如下：白色固体，熔点70-72℃；核磁共振氢谱：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.65(dd,J＝8.5,5.3Hz,1H),7.12–7.02(m,1H),6.99–6.85(m,1H),6.84(s,1H),6.82(s,1H),6.65(t,J＝9.0Hz,1H),5.40(s,1H),5.23(t,J＝10.0Hz,2H),4.99(s,2H),3.98(s,1H),3.29–3.17(m,2H),2.94(d,J＝12.0Hz,1H),2.70(s,2H),2.03(d,J＝13.0Hz,1H),1.82(s,1H),1.66–1.59(m,1H),1.45(d,J＝25.0Hz,1H),1.26(d,J＝8.0Hz,1H).核磁共振碳谱：¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.2(d,J＝12.7Hz),163.8(d,J＝12.7Hz),162.5,161.9(d,J＝12.4Hz),159.7,152.1,143.9(d,J＝8.7Hz),140.2(d,J＝8.9Hz),135.6(d,J＝9.5Hz),116.5,115.9(d,J＝22.7Hz),115.4(d,J＝22.7Hz),111.3(dd,J＝19.7,6.0Hz),106.6(d,J＝3.2Hz),103.1(dd,J＝25.2,26.5Hz),90.2,56.1,51.8,47.2,46.6,43.6,30.4,29.7.

实施例2“2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(化合物2)”的化学全合成与结构鉴定

(1)2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

室温条件下，向5mL溶有1克2-{[6-氯-3,4-二氢-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入0.59克无水碳酸钾、0.10克碘化钾，逐滴加入5mL溶有0.79克3,5-二甲基苄溴的N,N-二甲基甲酰胺溶液,避光下反应24小时，TLC检测，原料点消失后，向反应液中加10倍量蒸馏水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并用质量浓度20％盐水洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。柱层析色谱分离，石油醚：乙酸乙酯8:1洗脱后得白色固体1.15克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈。

(2)2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

在50mL三颈瓶中，将0.49克无水碳酸钾、0.52克(R)-3-(Boc-氨基)哌啶加到15mL溶有1克2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氩气保护，90℃回流反应4个小时，TLC检测，原料点消失后，冷却反应液至室温。加10倍量蒸馏水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并用质量浓度20％盐水洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，混合物经柱层析色谱分离，石油醚：乙酸乙酯3:1洗脱，得白色固体1.18克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；

(3)2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

0℃搅拌下，将4.5mL溶有0.9mL三氟乙酸的二氯甲烷溶液加入5mL溶有0.5克2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的二氯甲烷溶液中，TLC检测，原料点消失后，加冰水猝灭反应，用质量浓度10％的NaOH溶液调PH至碱性，加入30mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，质量浓度20％盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，混合物经柱层析色谱分离，二氯甲烷-甲醇-三乙胺***洗脱，得白色固体0.34克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈，称之为化合物2。

该化合物理化性质如下：白色固体，熔点115～117℃；核磁共振氢谱：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.63(dd,J＝8.5,5.3Hz,1H),7.03(t,J＝7.0Hz,1H),6.90(s,1H),6.90(s,1H),6.88(s,1H),6.84(s,1H),5.44(s,1H),5.24–5.16(m,2H),4.94(s,2H),3.43(s,1H),3.41(s,1H),3.38(s,1H),2.92(s,1H),2.86(d,J＝11.5Hz,1H),2.65(s,1H),2.22(s,6H),2.10(s,1H),1.79(s,1H),1.66–1.56(m,2H),1.27–1.23(m,1H).核磁共振碳谱：¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.1(d,J＝259.56Hz),163.0,159.2,152.1,144.2(d,J＝8.82Hz),137.9,136.4,135.6(d,J＝10.8Hz),129.3,126.0,116.7,115.8(d,J＝23.94Hz),115.5(d,J＝25.2Hz),106.6,90.6,54.0,53.4,51.8,47.3,46.6,44.4,28.6,21.2.

实施例3“2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈(化合物3)”的化学全合成与结构鉴定

(1)2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

室温条件下，向5mL溶有1克2-{[6-氯-3,4-二氢-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入0.54克无水碳酸钾、0.10克碘化钾，逐滴加入5mL溶有0.75克3,4-二甲氧基苄溴的N,N-二甲基甲酰胺溶液,避光下反应24小时，TLC检测，原料点消失后，向反应液中加10倍量蒸馏水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并用质量浓度20％盐水洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。柱层析色谱分离，石油醚：乙酸乙酯3:1洗脱后得白色固体1.15克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈。

(2)2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

在50mL三颈瓶中，将0.62克无水碳酸钾、0.6克(R)-3-(Boc-氨基)哌啶加到15mL溶有1.28克2-{[6-氯-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氩气保护，90℃回流反应3个小时，TLC检测，原料点消失后，冷却反应液至室温。加10倍量蒸馏水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，并用质量浓度20％盐水洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，混合物经柱层析色谱分离，石油醚：乙酸乙酯3:2洗脱，得白色固体1.16克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；

(3)2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的化学合成

0℃搅拌下，将4.5mL溶有0.9mL三氟乙酸的二氯甲烷溶液加入5mL溶有0.55克2-{[6-[(3R)-3-Boc-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈的二氯甲烷溶液中，TLC检测，原料点消失后，加冰水猝灭反应，用质量浓度10％的NaOH溶液调PH至碱性，加入30mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，质量浓度20％盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，混合物经柱层析色谱分离，二氯甲烷-甲醇-三乙胺***洗脱，得白色固体0.39克。经过波谱分析，确证该化合物为2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈，称之为化合物3。

该化合物理化性质如下：白色固体，熔点75～77℃；核磁共振氢谱：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.67(dd,J＝8.5,5.3Hz,1H),7.07(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),7.05(s,1H),7.03(d,J＝8.0Hz,1H),6.80(d,J＝2.0Hz,1H),6.77(d,J＝8.0Hz,1H),5.37(s,1H),5.25(s,2H),5.02(s,2H),3.84(s,3H),3.83(s,3H),3.00(d,J＝11.0Hz,1H),2.91(d,J＝4.5Hz,1H),2.90(s,1H),2.59(s,1H),2.39(s,1H),1.93(d,J＝9.5Hz,1H),1.76(dd,J＝10.0,3.9Hz,1H),1.60(dd,J＝10.5,3.4Hz,1H),1.50(s,2H),1.24(d,J＝5.0Hz,1H).核磁共振碳谱：¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.2(d,J＝259.6Hz),162.6,159.4,152.5,148.7,148.5,144.4(d,J＝8.7Hz),135.5(d,J＝9.6Hz),129.4,121.8,116.3,115.6(d,J＝22.7Hz),114.5(d,J＝24.0Hz),112.6,110.8,106.7,90.8,59.4,55.8,53.4,51.8,47.3,46.2,44.2,33.3,23.2.

实施例4二肽基肽酶-4抑制活性测定

将待测化合物1～3分别用DMSO溶解，HEPES缓冲液稀释配制成不同浓度的供试品溶液。实验分为样品组(含10μmol·L^-1小分子荧光探针四苯基乙烯、5U·L^-1DPP-4溶液、10μL待测化合物溶液)、样品对照组(含10μmol·L^-1小分子荧光探针四苯基乙烯、25mg·L^-1待测化合物溶液)、对照组(含10μmol·L^-1小分子荧光探针四苯基乙烯、5U·L^-1DPP-4溶液)、空白组(10μmol·L^-1小分子荧光探针四苯基乙烯)，反应溶剂为HEPES缓冲液(0.5mmol·L^-1,PH 7.0)，总反应体积为100μL。阳性对照药为Sitagliptin。37℃孵育30分钟后，酶标仪检测各组荧光强度(λex＝320nm，λem＝450nm)，按下式计算各组分对DPP-4的抑制率，其中I表示荧光强度。实验结果用表示。

表1二肽基肽酶-4抑制率(％)

如图1-3所示。

试验结果表明：以上化合物对二肽基肽酶-4表现出显著的抑制作用，具有潜在的抗2型糖尿病临床应用前景。

实施例5：化合物1～3注射液的制备

化合物1～3分别用少量的DMSO(重量比为：1：0.1-1：0.5，在此为1：0.4)溶解后，按常规加注射用水(重量比为1:20-1:200，在此为1:200)，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例6：化合物1～3粉针剂的制备

化合物1～3分别用少量的DMSO(重量比为：1：0.1-1：0.5，在此为1：0.5)溶解后，将其溶于无菌注射用水(重量比为：1：20-1：60，在此为1:60)中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例7：化合物1～3粉剂的制备

化合物1～3分别按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂(重量比，吐温80:丙二醇:环糊精:乳糖＝1:2:4:12)，制成粉剂。

实施例8：化合物1～3片剂的制备

化合物1～3分别按其与赋形剂(重量比，羟丙甲基纤维素E5：微晶纤维素MCC102:硬脂酸镁:(8％聚维酮K30)＝15:15:2:0.1)重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：化合物1～3口服液的制备

化合物1～3分别加入到含质量浓度20％单糖浆和0.1％苯甲酸钠的蒸馏水中，按常规口服液制法制成浓度为15μg/mL口服液。

实施例10：化合物1～3胶囊剂的制备

化合物1～3分别按其与赋形剂(重量比，药用淀粉:葡萄糖:水解明胶:甘氨酸＝30:10:1:1)重量比为5:1的比例混合，制成胶囊。

实施例11：化合物1～3丸剂的制备

化合物1～3分别按其与赋形剂(重量比，PEG2000:PEG6000＝4:1)重量比为1:10的比例混合，制成丸剂。

Claims

1.DPP-4抑制剂，其特征在于：其以下述三种化合物或下述三种化合物分别对应的药物学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，三种化合物结构式分别如下：

2.按照权利要求1所述DPP-4抑制剂，其特征在于：

化合物1:其中嘧啶二酮1位氮和3,5-二氟苄基相连，化学名称中文为：2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二氟苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；英文为：2-[6-(3(R)-aminopiperidin-1-yl)-3-(3,5-difluorobenzyl)-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-ylmethyl]-4-fluorobenzonitrile；

化合物2：其中嘧啶二酮1位氮和3,5-二甲基苄基相连，化学名称中文为：2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,5-二甲基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；英文为：2-[6-(3(R)-aminopiperidin-1-yl)-3-(3,5-dimethyl)-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyr imidin-1-ylmethyl]-4-fluorobenzonitrile；

化合物3：其中嘧啶二酮1位氮和3,4-二甲氧基苄基相连，化学名称中文为：2-{[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-(3,4-二甲氧基苄基)-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基}-4-氟苯甲腈；英文为：2-[6-(3(R)-aminopiperidin-1-yl)-3-(3,4-dimethoxybenzyl)-2,4-dioxo-3,4-dihydr o-2H-pyrimidin-1-ylmethyl]-4-fluorobenzonitrile；

所述化合物1～3中的一种或二种混合具有DPP-4抑制活性，在此所指的化合物1～3可为化合物1～3本身以及化合物1～3的药物学上可接受的盐等化学等价物中的一种，但不局限于以上化学等价物。

3.根据权利要求1或2所述DPP-4抑制剂，其特征在于

所述DPP-4抑制剂中包括药学上可接受的药物辅料或载体。

4.根据权利要求3所述DPP-4抑制剂，其特征在于

所述DPP-4抑制剂包括稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调节剂及其他药学上或食品学上可接受的辅料中的一种或多种。

5.根据权利要求3或4所述DPP-4抑制剂，其特征在于

所述化合物1～3或它们分别对应的药物学上可接受的盐中的一种或二种混合可与医药上可接受的药物辅料或载体混合可制成治疗相关疾病的片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、丸剂或注射剂，但不局限于以上剂型。

6.根据权利要求3或4所述DPP-4抑制剂，其特征在于

所述药物组合物的单剂量含活性成分化合物1～3中的一种或两种或其药学上可接受的盐在药物组合物中的有效含量为1～95％。

7.权利要求1-6任一所述DPP-4抑制剂在治疗2型糖尿病药物中的应用，其特征在于：

所述DPP-4抑制剂以下述三种化合物或下述三种化合物分别对应的药物学上可接受的盐中的一种或两种以上为活性成分，三种化合物结构式分别如下：

所述2型糖尿病包括由胰岛素抵抗的发生引起的糖尿病或者由胰岛素分泌缺陷引起的糖尿病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于

所述药物中包括药学上可接受的药物辅料。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于

所述药物中包括稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调节剂及其他药学上或食品学上可接受的辅料；

所述化合物1～3中的一种或二种混合可与医药上可接受的药物载体混合可制成治疗相关疾病的片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、丸剂或注射剂，但不局限于以上剂型。

10.根据权利要求4或9所述的应用，其特征在于

所述药物组合物的单剂量含活性成分化合物1～3或它们药学上可接受的盐中的一种或两种以上在药物组合物中的有效质量含量为1～95％。