CN108017514B - 两步盐析萃取分离发酵液中1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的方法 - Google Patents
两步盐析萃取分离发酵液中1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，提供了一种两步盐析萃取分离发酵液中1,3‑丙二醇、乙酸和丁酸的方法。该方法为：将可溶性酸性无机盐溶解于1,3‑丙二醇发酵液中，加入疏水性有机溶剂，振荡混合，室温下静置分相，进行第一步盐析萃取，上相为富含丁酸的有机相，下相为富含1,3‑丙二醇和乙酸的盐相；用碱溶液或碱性无机盐溶液反萃取上相中的丁酸；向下相加入亲水性有机溶剂，进行第二步盐析萃取，萃取1,3‑丙二醇和乙酸。本发明解决了目前发酵法生产1,3‑丙二醇分离工艺中存在的1,3‑丙二醇与副产物难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单，分离时间短，回收率高，分离成本低，是一种很有工业应用前景的分离方法。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物发酵液的分离技术，特别涉及一种利用盐析萃取技术分离发酵液中1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的方法。
背景技术
1,3-丙二醇、乙酸和丁酸作为生产前景广阔的化工原料和中间体，在很多领域都有广阔的应用。1,3-丙二醇可用作溶剂、粘合剂、化妆品、保鲜剂以及合成聚酯、聚氨酯的单体，其中与对苯二甲酸合成的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，由于不易产生静电、抗紫外、良好的回弹性、耐污性以及生物可降解性等优点，在地毯、纺织和工程塑料等行业有巨大的应用前景。乙酸主要用于生产醋酸乙烯、醋酸酯、醋酐、双乙烯酮、氯乙酸、醋酸纤维等，或作为对苯二甲酸、农药、医药和燃料等工业生产过程中的溶剂或原料。丁酸可用于制造丁酸酯类、丁酸纤维素酯，也用作乳化剂、杀菌剂和萃取剂，丁酸及其衍生物还可以应用在食品、医药和饲料等领域。
传统上，1,3-丙二醇主要由化学法生产，随着化石能源的逐渐枯竭以及由此带来的环境和安全问题引起人们越来越多的担忧，因此生物转化法发酵生产1,3-丙二醇成为了研究的热点。目前国内多采用克雷伯肺炎杆菌将甘油转化为1,3-丙二醇的方法，该法所用的细菌是条件致病菌，且副产物有2,3-丁二醇、乙酸、乙醇、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、甲酸等，产物分离比较困难。自然界中丁酸梭菌也能将甘油转化为1,3-丙二醇，该菌是益生菌，且副产物只有乙酸和丁酸。如果将发酵液中1,3-丙二醇分离的同时回收有机酸，那么将有利于降低分离成本，提高经济效益。
目前，从发酵液中分离1,3-丙二醇的方法主要是发酵液经过离心、絮凝处理或者膜过滤去除菌体和部分生物大分子，然后经过有机溶剂沉淀、有机溶剂萃取、反应萃取或者电渗析除盐等进行粗分离，除去部分杂质，最后通过精馏得到1,3-丙二醇。向浓缩的发酵液中加入乙醇能够析出大量沉淀，洗涤沉淀，洗涤液和上清液精馏可以得到1,3-丙二醇，但是此步骤需要消耗大量有机溶剂，且溶剂容易挥发损耗。用乙酸乙酯可以萃取1,3-丙二醇，其分配系数为0.22，加入少量乙醇作助溶剂可将分配系数提高到0.33，但是回收率依然很低。原因是1,3-丙二醇的亲水性太强，很难找到合适的溶剂将其高效萃取出来。反应萃取能将1,3-丙二醇转化成疏水性产物，从而被有机溶剂萃取，但是发酵液中成分复杂，多种副反应伴随进行，同时催化剂也容易失活，降低催化效率。若先将发酵液超滤去除部分杂质，然后利用电渗析去除小分子盐类，则有助于反应萃取，但电渗析能耗大，膜易污染，成本较高。由亲水性有机溶剂和无机盐组成的盐析萃取体系能够从发酵液中一步将1,3-丙二醇高效萃取出来，但有机酸(如乙酸、乳酸)同时也被萃取进入上相，使后续分离仍有困难。
常见的有机酸分离方法主要有成盐法、吸附法、膜分离法、酯化法和液液萃取法等。成盐法是向有机酸溶液中加入大量碱或无机盐，形成沉淀或热稳定性的盐，再通过过滤、加热脱水、酸化、蒸馏得到纯品，成盐法工艺成熟，但需要消耗大量酸碱，容易产生二次污染。发酵液中含有大量杂质，成分复杂，这使得离子交换和膜分离过程面临着树脂和膜易污染、再生频繁、产生大量废液的问题，目前工业化生产有一定困难。用固定化脂肪酶(如Novozym 435)催化，将发酵液中的丁酸转化成丁酸乙酯，再用三辛胺(TOA)-环己烷为萃取剂萃取丁酸乙酯，但存在酯化率不高、工艺比较复杂的问题。用中链脂肪酸萃取水溶液中的乙酸，然后通过分馏得到乙酸，同时脂肪酸可以回收利用，但是乙酸的分配系数不高，回收率过低，采用多级萃取需要消耗大量脂肪酸。盐析被应用于丁酸的分离，但是体系需要较低的pH和较高浓度的丁酸，因此通常要求将发酵液浓缩；而盐析萃取可用于乳酸、琥珀酸等分离，前者在碱性条件下可以进行，后者则需要酸性条件。
盐析萃取技术是以有机溶剂为萃取剂，无机盐为盐析剂，在两者的综合作用下，从水溶液中萃取亲水性目标产物的一种分离方法。有机溶剂多使用亲水性的短链醇、酮等，因此常将这类盐析萃取体系称为双水相体系。盐析萃取技术具有分配系数大、回收率高、有机溶剂用量少、条件温和、对设备腐蚀性低等诸多优点，已用于丁酸、乳酸、琥珀酸、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇以及丙酮和丁醇等多种生物基化学品的分离，也有两步盐析萃取分离1,3-丙二醇和乳酸的报道。由于两步盐析萃取所用的有机溶剂均为亲水性的，乳酸的总收率仅为73.8％，且第二步需要将pH从10.0调至6.5，导致K2CO3损失。目前尚没有从丁酸梭菌发酵液中分离1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前从发酵液中提取1,3-丙二醇的过程中存在的副产物难以回收利用、分离成本高、菌体和蛋白回收困难等问题，提出了利用两步盐析萃取技术提取分离发酵液中1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的新方法。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种两步盐析萃取分离发酵液中1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的方法，所述方法包括以下步骤：
1)第一步盐析萃取：将可溶性酸性无机盐溶解于1,3-丙二醇发酵液中，加入疏水性有机溶剂，振荡混合，室温下静置分相，上相为富含丁酸的有机相，下相为富含1,3-丙二醇和乙酸的盐相；
2)向步骤1)得到的有机相中加入碱溶液或碱性无机盐溶液，反萃取丁酸；
3)第二步盐析萃取：向步骤1)得到的盐相中加入亲水性有机溶剂，萃取1,3-丙二醇和乙酸。
进一步地，在上述技术方案中，所述1,3-丙二醇发酵液为含菌体的1,3-丙二醇发酵原液或去除菌体的1,3-丙二醇发酵清液，在所述1,3-丙二醇发酵液中，1,3-丙二醇浓度为50～100g/L，乙酸浓度为6～15g/L，丁酸浓度为10～20g/L。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤1)中所述的可溶性酸性无机盐为硫酸铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的一种，优选为磷酸二氢钠。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤1)中所述的疏水性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或甲基异丁基甲酮中的一种，优选为乙酸丁酯。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤1)中所述的可溶性酸性无机盐的加入量为萃取体系质量的15％～27.5％，优选为25％。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤1)中所述的疏水性有机溶剂的加入量为萃取体系质量的15％～35％，优选为30％。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤2)中所述的碱溶液中的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种，所述的碱性无机盐溶液中的碱性无机碱为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种。
进一步地，在上述技术方案中，当步骤1)中使用的疏水性有机溶剂是乙酸乙酯或乙酸丁酯时，在步骤2)中，所述的有机相中加入碱性无机盐溶液，所述的碱性无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种；当步骤1)中使用的疏水性有机溶剂是甲基叔丁基醚或甲基异丁基甲酮中的一种时，在步骤2)中，所述的有机相中加入碱溶液或碱性无机盐溶液，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种，所述的碱性无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种，优选碳酸钠。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤2)中所述的有机相中的有机酸与所述碱或碱性无机盐的摩尔比为5:1～8；有机相与碱溶液或碱性无机盐溶液的体积比为1～5:1，优选为2:1。其中所述有机酸是指乙酸和丁酸的总和。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤3)中所述的亲水性有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、碳酸二甲酯或四氢呋喃中的一种，优选为乙醇。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤3)中所述的亲水性有机溶剂的加入量为萃取体系体积的20％～52％，优选为50％。
本发明中，所述的1,3-丙二醇发酵液是指采用常规的生物转化法发酵生产1,3-丙二醇时的含有1,3-丙二醇的发酵液，主要含有1,3-丙二醇、乙酸和丁酸，也可以含有少量甲酸、乳酸、琥珀酸和乙醇。优选，利用丁酸梭菌将甘油转化为1,3-丙二醇时的发酵液，该发酵液含有1,3-丙二醇、乙酸和丁酸。
本发明中，1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的萃取操作方式可以是间歇的，也可以是连续的；对于分配系数较小的体系可以采用多级萃取的方式。
本发明中，所述1,3-丙二醇发酵液可以用絮凝、微滤或离心的方法进行预处理，除去菌体和部分蛋白；如果不经预处理直接进行萃取操作，菌体和蛋白分布于中间。
本发明的有益效果：
本发明的方法，通过两步盐析萃取解决了目前从发酵液中分离1,3-丙二醇时存在的副产物有机酸难以回收的问题。与无机盐/亲水性有机溶剂体系相比，第一步盐析萃取中所用的无机盐/疏水性有机溶剂体系直接处理发酵液，在萃取丁酸的同时，对菌体和蛋白的去除效果更好。利用碱(或碱性无机盐溶液)反萃有机相中的丁酸和乙酸，回收率高，有机溶剂几乎无损失，可直接循环利用，且丁酸盐价值高于丁酸。第二步盐析萃取中，1,3-丙二醇和乙酸分配到上相(有机相)，可通过蒸馏等常规分离方法将其分离。该方法工艺简单，在分离1,3-丙二醇的同时回收有机酸，达到降低成本、提高经济效益的目的，是一种具有工业前景的分离方法。
附图说明
图1为不同有机溶剂和磷酸二氢钠形成的盐析萃取体系对丁酸与乙酸、1,3-丙二醇分离度的影响。
图2为盐浓度对磷酸二氢钠/乙酸丁酯盐析萃取体系分离发酵清液中丁酸、乙酸和1,3-丙二醇的影响，其中图2A为对丁酸分配系数和回收率的影响；图2B为对乙酸分配系数和回收率的影响；图2C为对1,3-丙二醇分配系数和回收率的影响。
图3为有机溶剂浓度对磷酸二氢钠/乙酸丁酯盐析萃取体系分离发酵清液中丁酸、乙酸和1,3-丙二醇的影响，其中图3A为对丁酸分配系数和回收率的影响；图3B为对乙酸分配系数和回收率的影响；图3C为对1,3-丙二醇分配系数和回收率的影响。
图4为碳酸钠浓度对丁酸、乙酸和1,3-丙二醇反萃取收率的影响。
图5为乙醇体积分数对模拟发酵液中乙酸和1,3-丙二醇分配系数和回收率的影响。
图6为乙醇体积分数对发酵清液中乙酸和1,3-丙二醇分配系数和回收率的影响。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。
1.1,3-丙二醇发酵液的制备
1,3-丙二醇发酵液，是以常规方法制备得到的含有1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的发酵液。
下述实施例采用丁酸梭菌(Clostridium butyricum)为主的混菌批式流加粗甘油发酵得到的，根据调整底物浓度或补料时间，得到含有适当组分含量的1,3-丙二醇发酵液，混菌组成及发酵方式见CN106399204A，其中1,3-丙二醇(1,3-PD)、乙酸(HAc)和丁酸(BA)的浓度分别为50～100g/L、6～15g/L和10～20g/L。将1,3-PD发酵液经中空纤维膜过滤，除去菌体和部分蛋白，得发酵清液。
2.从1,3-PD发酵液或发酵清液中分离1,3-PD的方法，包括以下的步骤：
1)将可溶性酸性无机盐溶解于1,3-PD发酵液中，加入疏水性有机溶剂，振荡混合，室温下静置分相，进行第一步盐析萃取，上相即为富含BA的有机相，下相为富含1,3-PD和HAc的盐相；
2)向步骤1)得到的有机相中加入碱溶液或碱性无机盐溶液，反萃取BA；
3)向步骤1)得到的盐相中加入亲水性有机溶剂，进行第二步盐析萃取，振荡混合，室温下静置分相，上相为含有1,3-PD和HAc的有机相，下相为盐相。
在步骤2)中，反萃取得到的反萃取液(盐相)中富含丁酸盐以及少量乙酸盐和1,3-PD，反萃取液经蒸馏除水、烘干，得到丁酸盐(丁酸钠或丁酸钾)。
对于步骤3)得到的有机相，根据物质沸点的不同，可以采用蒸馏等常规分离方法分离1,3-PD和HAc。优选地，用氢氧化钠或氢氧化钾将有机相pH调为7.0，过滤除去析出的磷酸盐，将滤液进行蒸馏，在真空度0.094～0.096MPa的条件下收集110℃塔顶馏分1,3-PD，几乎全部乙酸以乙酸盐(钠盐或钾盐)形式保留在塔釜。
在上述方法中，步骤1)所述的酸性无机盐为硫酸铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的一种，无机盐的加入量为萃取体系质量的15～27.5％；所述疏水性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或甲基异丁基甲酮中的一种，有机溶剂的加入量为萃取体系质量的15～35％。
在上述方法中，步骤2)中所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种，所述的碱性无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种。
在上述方法中，步骤3)中所述的亲水性有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、碳酸二甲酯或四氢呋喃中的一种，所述亲水性有机溶剂的加入量为萃取体系体积的20～52％。
各步骤分别取样，测定上下相中1,3-PD、HAc和BA的浓度。计算分配系数(K)、回收率(Y)和去除率(R)。
分配系数(K)，相比(P)，回收率(Y)和去除率(R)的计算公式如下：
Ri＝100％-Yi (式4)
式(1)～式(4)中，i代表1,3-PD、HAc或者BA，Ct和Cb为平衡后上下相质量浓度(g/L)，Vt和Vb为平衡后上下相体积(mL)。分离度为两种物质的分配系数之比。
经过整个分离过程，1,3-PD、HAc和BA最终回收率(Yf)的计算公式如下：
Yf，1，3-PD＝RIYIII (式5)
Yf，HAc＝YIYII+RIYIII (式6)
Yf，BA＝YIYII (式7)
式(5)～式(7)中，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别表示第一步盐析萃取、反萃取和第二步盐析萃取。
各步盐析萃取中细胞和蛋白质的去除率(R)定义如下：
第一步盐析萃取：
第二步盐析萃取：
式(8)～式(9)中，s代表细胞或者蛋白质，Mm表示上下相界面处细胞或蛋白的质量，Mt表示细胞或蛋白在上相中的质量，M1、M2表示该步盐析萃取体系中细胞或蛋白的总质量。
3.分析方法
在盐相中，1,3-PD、HAc和BA含量采用液相色谱法进行检测。AminexHPX-87H色谱柱，300mm x7.8mm；流动相5mM硫酸；流速0.6mL/min，示差检测器在410nm处检测，进样量20μL，柱温65℃，检测时间23min。
在疏水性有机溶剂中，1,3-PD、HAc和BA含量采用气相色谱法进行检测，色谱条件为：BGB-174毛细管柱(30m×0.25mm I.D.0.25μm df)；FID检测器，检测器温度220℃；进样口温度210℃，分流比1:8；载气为高纯氮；采用外标法；进样量2μL。
菌体的测定采用分光光度法，650nm下测定浊度。蛋白测定采用考马斯亮蓝法。
实施例1第一步盐析萃取中的无机盐和有机溶剂的选择
1,3-PD发酵清液中1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为67.76g/L、7.07g/L、11.94g/L。先将无机盐溶解于1,3-PD发酵清液中，将分别加入NaCl、(NH4)2SO4、NaH2PO4的发酵清液的pH调节为4.5，分别加入Na2CO3和K3PO4的发酵清液保持自然pH值；再加入有机溶剂(无机盐和有机溶剂种类，如表1)。振荡混合，室温下静置分相，上相为有机相，下相为盐相。目的是将BA萃取到上相，1,3-PD和HAc留在下相。取样测定上相和下相中各物质的浓度，计算其分配系数(K)和回收率(Y)，结果如表1。萃取体系中无机盐、1,3-PD发酵清液和有机溶剂的质量百分含量分别为10％、60％和30％。
表1. 1,3-PD、HAc和BA在不同盐析萃取体系中的分配行为
从表1的结果可知，在Na2CO3和K3PO4等碱性盐组成的盐析萃取体系中，除了亲水性的正丙醇体系，BA均分配在下相(回收率<30％)。这是因为当pH＜4.82(BA的pKa值)时，BA主要以分子形态存在，更容易被萃取到有机相；pH＞4.82时，BA主要以离子形态存在，更倾向于分配在水相。在碱性盐/正丙醇体系中，BA与1,3-PD的分离度都约为1，分离效果较差，所以Na2CO3和K3PO4形成的碱性盐析萃取体系不适于BA与1,3-PD、HAc的分离。
在NaCl、(NH4)2SO4和NaH2PO4组成的酸性盐析萃取体系中，BA主要分配在上相(回收率在65.30％～94.10％之间)。其中，NaCl的成相能力较差，与乙醇难以形成盐析萃取体系，影响第二步盐析萃取。NaH2PO4作为盐析剂时，对BA的萃取效果优于(NH4)2SO4，同时1,3-PD和HAc的萃取效果接近。发酵液是一个大的缓冲体系，其中包含多种无机盐、有机盐、蛋白质和核酸等，调节pH需要加入大量的酸，而NaH2PO4是酸性较强的酸性盐(50g/L NaH2PO4溶液的pH值在4.2-4.6之间)，在萃取BA的过程中可以不添加酸而达到较低的pH。
接着，以NaH2PO4作为盐析剂，在其与五种有机溶剂组成的盐析萃取体系中，观察体系对BA的萃取效果，按照体系有机溶剂的萃取效果为：正丙醇＞异丁醇＞正丁醇＞甲基异丁基甲酮＞甲基叔丁基醚＞乙酸乙酯＞乙酸丁酯，这与溶剂的亲水性顺序几乎是一致的。当有机溶剂选择亲水性较强的醇类时，BA的分配系数和回收率较高，但同时也至少有29％的1,3-PD和HAc被萃取到有机相，不适于将BA和1,3-PD分离。当有机溶剂选择疏水性溶剂时，BA的分配系数和回收率会有一定程度的降低，但是1,3-PD的分配系数和回收率急剧下降。图1显示的是NaH2PO4与不同有机溶剂形成的盐析萃取体系对发酵清液中BA与HAc、1,3-PD分离度的影响，乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚和甲基异丁基甲酮与NaH2PO4组成的盐析体系对BA与1,3-PD的分离度优于极性有机溶剂正丙醇、异丁醇、正丁醇的盐析体系，其中甲基叔丁基醚的沸点太低(常压下55℃)，挥发性较强。还有，与NaH2PO4/乙酸乙酯以及NaH2PO4/甲基异丁基甲酮盐析萃取体系相比，NaH2PO4/乙酸丁酯体系对BA与1,3-PD的分离度更高，BA与HAc的分离度略高。
实施例2丁酸的盐析萃取(第一步盐析萃取)
1.按照实施例1所述的方法配制由不同浓度乙酸丁酯和NaH2PO4以及1,3-丙二醇发酵清液组成的萃取体系，乙酸丁酯的质量百分含量分别为25％、30％和35％，NaH2PO4的质量百分含量在15～27.5％之间，1,3-PD发酵清液中1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为79.36g/L、9.30g/L、14.22g/L。萃取体系搅拌均匀，静置分相，考察NaH2PO4浓度变化对三种物质分配系数和回收率的影响，结果如图2所示，其中，图2A为对BA分配系数和回收率的影响，图2B为对HAc分配系数和回收率的影响，图2C为对1,3-PD分配系数和回收率的影响。图2中可见，随着盐的质量分数增加，BA、HAc和1,3-PD的分配系数和回收率都在不断提高。BA主要分配在上相，最大回收率可达到96.89％；HAc和1,3-PD主要分配在下相，HAc的最大回收率为40.12％，而1,3-PD的回收率均在6％以下。
2.按照实施例1所述的方法配制由不同浓度NaH2PO4和乙酸丁酯以及1,3-丙二醇发酵清液组成的萃取体系，NaH2PO4的质量百分含量分别为20％和25％，乙酸丁酯的质量百分含量在15～35％之间，1,3-PD发酵清液中1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为79.36g/L、9.30g/L、14.22g/L，考察乙酸丁酯浓度变化对三种物质分配系数和回收率的影响，结果如图3所示，其中，图3A为对BA分配系数和回收率的影响；图3B为对HAc分配系数和回收率的影响；图3C为对1,3-PD分配系数和回收率的影响。图3中可见，整体上，三种物质的分配系数和回收率都随有机溶剂质量分数的增大而提高，只是对于1,3-PD的分配系数，当乙酸丁酯浓度增大时，会出现降低的现象，这是因为，过高的酯浓度导致上相中1,3-PD的浓度降低，使分配系数下降。
当使用25％(w/w)NaH2PO4/35％(w/w)乙酸丁酯体系时，BA的回收率最高为97.48％；HAc和1,3-PD的回收率分别为42.11％、5.13％。
当使用25％(w/w)NaH2PO4/30％(w/w)乙酸丁酯盐析萃取体系时，BA的分配系数和回收率为42.21和96.42％，相应的HAc和1,3-PD的回收率分别为33.21％、3.71％，考虑到提高BA回收率的同时，既要减少主产物1,3-PD的损失，又要避免使用过多的有机溶剂时更适合选择该体系。
实施例3丁酸和乙酸的反萃取
1.按照实施例2所述的方法，在25％(w/w)NaH2PO4/30％(w/w)乙酸丁酯盐析萃取体系条件下对1,3-PD发酵清液(1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为79.36g/L、9.30g/L、14.22g/L)进行第一步盐析萃取，萃取BA，BA富集在有机相，其中BA、HAc和1,3-PD的浓度分别为16.24g/L、3.96g/L、3.64g/L。利用碱溶液或碱性无机盐溶液反萃有机相中的有机酸，由于碱作为催化剂和反应剂能够导致酯水解，因此选择碳酸钠溶液作反萃剂。由于此步骤要有浓缩效果，反萃相比(有机相与碱(或碱性无机盐)溶液的体积比)暂定为2:1，碳酸钠浓度变化范围为0～0.8mol/L，考察碳酸钠浓度对物质反萃的影响。如图4所示，随着碳酸钠浓度的升高，三种物质的回收率都在逐渐增大，其中受碳酸钠浓度影响最大的是BA，HAc次之，1,3-PD最小。碳酸钠浓度从0增加到0.3mol/L时，BA回收率由9.98％增至91.28％，此时，继续增加碳酸钠浓度，BA的回收率变化不大。HAc与BA的变化规律相似，0.3mol/L碳酸钠溶液能取得93.96％的HAc回收率。1,3-PD亲水性最强，其在溶液中的存在状态几乎不受pH值的影响，故其回收率随碳酸钠浓度的变化不明显，维持在90％左右。因此采用0.3mol/L的碳酸钠溶液能取得较好的反萃效果，此时碳酸钠与乙酸丁酯溶液中有机酸(HAc和BA)的摩尔比为3:5。
2.按照实施例2所述的方法，在25％(w/w)NaH2PO4/30％(w/w)乙酸丁酯盐析萃取体系条件下对1,3-PD发酵清液(1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为79.36g/L、9.30g/L、14.22g/L)进行第一步盐析萃取，萃取BA，BA富集在有机相，其中BA、HAc和1,3-PD的浓度分别为16.12g/L、3.22g/L、4.96g/L。按照碳酸钠与乙酸丁酯溶液中有机酸的摩尔比为3:5的比例，考察乙酸丁酯溶液与碳酸钠溶液初始相比对反萃的影响，由于BA的反萃取要有浓缩效果，所以选择的初始相比为2:1，2.4:1，3:1和4:1，结果如表2所示。随着相比的增加，三种物质在下相中的浓度不断升高，显示了良好的浓缩效果，但其回收率也随之降低。这是因为相比增大影响分子间的接触和相间的传质，并且较高相比使残余碳酸钠浓度升高，导致一定程度的盐析效应。在本实施例中乙酸丁酯溶液和碳酸钠溶液的初始相比为2:1时可以获得较高回收率的BA和HAc，回收率90％以上；同样在所述其他相比时也可以收到较好的效果，回收率85％以上，但相比不宜超过5:1，相比过大反萃取溶液不能和有机相充分接触，降低产品回收率，造成损失，不能达到较好的分离目的。将反萃后的下相溶液浓缩，烘干得到丁酸钠和少量乙酸钠的混合物，BA和HAc是肠道重要的短链脂肪酸，发挥多种生理作用，因此丁酸钠和乙酸钠可作为饲料添加剂，应用于动物饲料。
表2.反萃相比对BA、HAc和1,3-PD分配行为的影响
实施例4 1,3-丙二醇和乙酸的萃取(第二步盐析萃取)
1.将HAc和1.3-PD标准品溶解在去离子水中，配制HAc和1,3-PD的模拟液，HAc和1.3-PD的浓度分别为8.05g/L，61.60g/L。实施例2中第一步盐析萃取使用的是疏水性有机溶剂，萃取后几乎全部的水和无机盐保留在下相，因此采用25％(w/w)NaH2PO4/30％(w/w)乙酸丁酯盐析萃取体系萃取1,3-PD发酵清液后，下相中水和NaH2PO4的质量之比约为9:5，按此比例，向模拟液中加入NaH2PO4，待溶解，再向其中加入纯度为95％的乙醇，形成盐析萃取体系。在萃取体系中，乙醇体积分数变化范围为20～50％，考察其对模拟液中1,3-PD和HAc分配的影响。如图5所示，整体上，HAc和1,3-PD的分配系数和回收率随着乙醇的体积分数的增加而增大，当乙醇的体积分数是40％时，HAc和1,3-PD的回收率可达到89.59％、92.32％。
2.按照实施例2所述的方法，在25％(w/w)NaH2PO4/30％(w/w)乙酸丁酯盐析萃取体系条件下对1,3-PD发酵清液(1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为78.62g/L、6.41g/L、12.93g/L)进行第一步盐析萃取，1,3-PD和HAc分配在下相，其浓度分别为6.41g/L、78.62g/L。向下相添加95％乙醇，乙醇的体积分数变化范围为40％～52％，考察其对发酵清液中1,3-PD和HAc萃取的影响。结果如图6所示，两种目标物在模拟液和发酵清液中的回收率相似，但在发酵清液中，其分配系数明显比在模拟液中的大，HAc的分配系数维持在6.71～7.74之间，1,3-PD的保持在9.3左右，这是因为发酵清液中存在的残余蛋白，核酸和盐等物质增大了盐析效应。50％(v/v)乙醇体系中，HAc和1,3-PD的回收率分别为94.40％、95.50％。
实施例5发酵液的两步盐析萃取
发酵液中1,3-PD、HAc和BA的浓度分别为87.21g/L、6.66g/L和17.64g/L。向225g的发酵液中加入125g NaH2PO4，待溶解，再加入150g乙酸丁酯，混合均匀，室温静置，进行第一步盐析萃取，分为三相，上相为富含BA的有机相，下相为富含1,3-PD和HAc的盐相，中间相主要为菌体和蛋白。BA的分配系数和回收率分别为23.34、93.78％；95.20％的1,3-PD和69.04％的HAc分配在盐相；菌体和蛋白去除率分别为99.63％、95.78％。
向有机相中加入79mL 0.76mol/L氢氧化钠溶液，BA和HAc的反萃收率为87.33％、181.44％，HAc的回收率远远超过理论值，这是因为强碱性的氢氧化钠溶液导致乙酸丁酯水解，产生大量乙酸而导致的，所以当第一步盐析萃取使用的疏水性有机溶剂是酯类时，反萃取溶液不能是氢氧化钠或氢氧化钾溶液；向有机相中加入79mL 0.38mol/L碳酸钠溶液，BA和HAc的反萃收率为88.72％、82.70％。
向盐相加入251mL 95％乙醇进行第二步盐析萃取，上相中1,3-PD收率为96.29％，HAc收率为97.26％，全部的菌体和77.89％蛋白被去除。整个过程中1,3-PD、HAc和BA的回收率分别为91.67％、92.75％、83.20％，全部菌体和97.16％的蛋白被去除。三种物质在每个步骤中的回收率如表3所示。
表3.发酵液中1,3-PD、HAc和BA在不同单元操作中的分配
表3中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别表示第一步盐析萃取、反萃取和第二步盐析萃取。
反萃取液中的BA经蒸发除水、烘干，能取得94％以上的回收率，最终得到丁酸钠和少量乙酸钠的混合物。
乙醇相的1,3-PD和HAc可通过蒸馏分离。用氢氧化钠将有机相pH调为7.0，过滤除去析出的磷酸盐，将滤液进行蒸馏，在真空度0.094-0.096MPa的条件下收集110℃塔顶馏分1,3-PD，92％以上的1,3-PD被回收，几乎全部乙酸以乙酸钠形式保留在塔釜。
Claims (6)
1.一种两步盐析萃取分离发酵液中1,3-丙二醇、乙酸和丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)第一步盐析萃取：将可溶性酸性无机盐溶解于1,3-丙二醇发酵液中，加入疏水性有机溶剂，振荡混合，室温下静置分相，上相为富含丁酸的有机相，下相为富含1,3-丙二醇和乙酸的盐相；
2)向步骤1)得到的有机相中加入碱溶液或碱性无机盐溶液，反萃取丁酸；
3)第二步盐析萃取：向步骤1)得到的盐相中加入亲水性有机溶剂，萃取1,3-丙二醇和乙酸；
在步骤1)中所述的可溶性酸性无机盐为硫酸铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的一种，加入量为萃取体系质量的15％～27.5％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1,3-丙二醇发酵液为含菌体的1,3-丙二醇发酵原液或去除菌体的1,3-丙二醇发酵清液，所述1,3-丙二醇发酵液中1,3-丙二醇浓度为50～100g/L，乙酸浓度为6～15g/L，丁酸浓度为10～20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中所述的疏水性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或甲基异丁基甲酮中的一种，加入量为萃取体系质量的15％～35％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当步骤1)中使用的疏水性有机溶剂是乙酸乙酯或乙酸丁酯时，在步骤2)中，所述的有机相中加入碱性无机盐，所述的碱性无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种；当步骤1)中使用的疏水性有机溶剂是甲基叔丁基醚或甲基异丁基甲酮中的一种时，在步骤2)中，所述的有机相中加入碱溶液或碱性无机盐溶液，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种，所述的碱性无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中所述的有机相中的有机酸与碱溶液或碱性无机盐溶液中的碱或碱性无机盐的摩尔比为5:1～8，有机相与碱溶液或碱性无机盐溶液的体积比为1～5:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中所述的亲水性有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、碳酸二甲酯或四氢呋喃中的一种，加入量为萃取体系体积的20％～52％。
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