CN108004248A - 一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用 - Google Patents

一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用，所述基因的编码核苷序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明根据植物的钙结合蛋白基因序列，设计引物，从黄瓜中克隆出黄瓜钙结合蛋白基因，并且转化黄瓜，获得过表达黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM的转基因植株。转基因黄瓜植株的耐热性得到提高，培育出了高抗热性的黄瓜品种。

Description

一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用
技术领域
本发明涉及提高植物抗性领域技术领域，更具体地，涉及一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用
背景技术
黄瓜(cucumis sativus L.)是葫芦科(cucurbitaceae)的重要蔬菜作物，以幼嫩果实供食，果实脆嫩爽口、风味独特，含有丰富的碳水化合物、矿物盐和抗坏血酸，具有食用、美容、药用等功效，深受人们的喜爱。黄瓜栽培历史悠久，是世界上栽培面积最广的蔬菜之一，既可露地种植，也可保护地栽培，我国是世界上黄瓜生产面积最大、总产量最高的国家，据农业部数据统计，全国黄瓜播种面积125.3万hm2左右。黄瓜原产于温暖地区，性喜温，但不耐热，在有关黄瓜抗逆研究中，以往的研究多偏重于黄瓜耐低温和冷害方面。
近年来，随着全球性温室效应不断加剧，极度高温已成为限制黄瓜长的主要因素之一，华南地区高温热害给黄瓜生产带来严重影响，己经成为露地和保护地黄瓜生产中经常遇到和函待解决的难题之一。高温使幼苗徒长，植株长势变弱，花期缩短，花器发育不良，花粉生活力下降，授粉受精不正常，产生落花、落果，果实木栓化加重或形成畸形果，感染各种病害，使植株早衰，严重影响黄瓜的产量和品质。
目前对35℃以上的高温逆境表现抗性的黄瓜品种及相关研究仍然不多，强耐热性的黄瓜品种仍然缺乏，不能满足生产上的需求。有关黄瓜耐热性研究主要集中在高温热害对黄瓜外部形态和主要经济性状的影响、黄瓜耐热生理、耐热性遗传规律和耐热性鉴定方法等方面，对黄瓜的耐热分子机理和耐热资源的创新方面研究不多。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有黄瓜耐热品种缺乏以及耐热相关研究的不足，根据植物的钙结合蛋白基因序列，进行分析，通过设计特异引物，从黄瓜中克隆出黄瓜钙结合蛋白基因，并且转化黄瓜中，转基因植株的耐热性得到显著提高，研究结果为创制黄瓜抗热材料提供了新的方法和思路。
本发明的第一个目的是提供一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种黄瓜钙结合蛋白CsCaM在提高植物耐热性中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体在提高植物耐热性中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在构建耐热黄瓜品种中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种重组载体在构建耐热黄瓜品种中的应用
本发明的第七个目的是提供一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控叶绿素代谢途径相关基因CBR1，PAO，RCCR和CLH基因的表达量的应用。
本发明的第八个目的是提供一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控抗逆相关基因CsSOD，CsPOD，CsCAT，CscAPX，AOX，H SP70和HSP90基因的表达量的应用。
本发明的第九个目的是提供一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控ABA代谢途径的CsABI1，CsABI2和CsABI3基因的表达量的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示。
一种黄瓜钙结合蛋白CsCaM在提高植物耐热性中的应用，所述氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
一种重组载体在提高植物耐热性中的应用，所述重组载体含有权利要求1所述的黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM。
优选地，所述植物为黄瓜。
优选地，将黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM遗传转化黄瓜。
优选地，遗传转化的步骤为：
S1.取无菌萌发8天的黄瓜子叶，在培养基(MS+6-BA 1.0mg·L-1+AgNO32.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH5.8)上，25℃，黑暗中预培养2天；
S2.然后把预培养的子叶在OD0.5的农杆菌中浸泡20分钟，吸干菌液，转到筛选培养基上(MS+6-BA1.0mg·L-1+AgNO 3 2.0mg·L-1+Kan 70mg·L-1+cef300mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH5.8)；
S3.筛选培养基上培养4周，将获得的候选抗性不定芽转移至分化培养基上(MS+6-BA 1.0mg·L-1+AgNO 3 2.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH5.8)培养2～3次，每次25天左右；
S4.把不定芽在生根培养基上(MS+Kan 70mg·L-1+cef 200mg·L-1)进行生根，获得候选苗，用于后续鉴定。
一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在构建耐热黄瓜品种中的应用，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示。
一种黄瓜钙结合蛋白CsCaM在构建耐热黄瓜品种中的应用，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
一种重组载体在构建耐热黄瓜品种中的应用，所述重组载体含有所述的黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM。
一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控叶绿素代谢途径相关基因CBR1，PAO，RCCR和CLH基因的表达量的应用，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。。
一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控抗逆相关基因CsSOD，CsPOD，CsCAT，CscAPX，AOX，HSP70和HSP90基因的表达量的应用，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控ABA代谢途径的CsABI1，CsABI2和CsABI3表达量的应用，所述基因的核苷序列如SEQID NO：1所示，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明根据植物的钙结合蛋白基因序列，进行分析，通过设计引物，从黄瓜中克隆出黄瓜钙结合蛋白基因，并且转化黄瓜中，转基因植株的耐热性得到提高，为创制黄瓜抗热材料提供新的方法和思路。
附图说明
图1为基因CsCaM编码的氨基酸序列同源性比较和进化树分析。
图2为蛋白CsCaM的表达特性研究；A：表示该基因在黄瓜植株不同组织器官根、茎、叶中的表达分析；B：黄瓜植株在5μM ABA处理不同时间后，该基因在叶片中表达分析；C：43℃高温诱导不同时间后，该基因在叶片中的表达分析；D：黄瓜植株在100μM SA处理不同后，该基因在叶片中的表达分析。
图3为蛋白CsCaM的亚细胞定位分析。
图4为A、B表示该基因在正常和高温诱导6h后，在叶片中的原位杂交检测结果；C、D表示该基因在正常和高温诱导6h后，在根中的原位杂交检测结果。
图5为转基因黄瓜的分子检测；A为转化植株的southern blotting检测；B为转化植株的Northern blotting检测；C为转基因植株。
图6为转基因黄瓜耐热性鉴定；A为转基因黄瓜T1植株和未转化植株在43℃高温处理下5d，10d后，植株死亡率统计；B为转基因黄瓜OE-1和未转植株在43℃高温处理下3d的表现；C为转基因黄瓜OE-1和未转化植株种子在43℃高温下的萌发情况比较；D为转基因黄瓜OE-1和未转化植株根尖在高温逆境下活性比较，红褐色的部位表示死细胞。
图7为高温逆境下转基因黄瓜叶片ROS，H2O2，超氧离子检测；A为DAB检测H2O2分布；B为用NBT检测超氧离子分布；C为示用DCFH-DA法检测ROS分布。
图8为高温逆境下，转基因黄瓜中相关基因表达分析；CK为未转化植株；1～3为转基因T1植株OE-1，OE-2，OE-3。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
材料：
黄瓜自交系“02-8”，pBI121表达载体，大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，由本实验室保存；DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)(购自Roche公司，上海)。Southern blotting和Northernblotting试剂盒the DNAlabelling and detection kit(购自Boehringer Mannheim公司.,Mannheim,德国)。
实施例1黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM的获得及表达分析
1、黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM的基因序列分析
(1)以黄瓜自交系“02-8”基因组DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增：
上游引物：ATGGCGGATCAGCTCACCGA；
下游引物：CCTTAGCCATCATGACCTTAAC；
PCR反应体系：94℃1个循环3min；94℃1min，55℃45s，72℃90s，共35循环；72℃延伸7min，PCR产物放置4℃保存。
从黄瓜基因组中扩增出特异片段，连接到表达载体上，转入感受态大肠杆菌DH5α，获得阳性重组菌，进行测序。
(2)经过测序后，该基因阅读框架为450bp，如SEQ ID NO：1所示，编码149个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。经过同源性分析发现，该基因编码的氨基酸序列与黄瓜的CsCaM基因(XM_011655459.1)的开放阅读框相似性达到100％，命名为CsCaM。
其与甜瓜的CmCaM(XM_008466393)基因，拟南芥(Arabidopsis)的AtCaM3(AY091301)，核桃(Juglans regia)的JrCaM7(XM_018967153.1)，马铃薯(Solanumtuberosum)StCaM(JX576246.1)，烟草(Nicotiana tabacum)NtCaM7(XM_016640697.1)，结球甘蓝(Brassica oleracea)BoCaM(XM_013776345)，番茄(Solanum lycopersicum)SlCaM3(NM_001321494)具有较高的同源性。结果见图1。
2、CsCaM的qRT-PCR分析
(1)为了研究CsCaM的表达特性，以黄瓜的自交系02-8为材料，分析该基因在黄瓜根、茎、叶中，以及在43℃高温逆境、100μM SA、5μM ABA中的表达情况。
PCR反应体系如下：94℃预热3min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸90s，28个循环；72℃延伸7min。
上游引物：ATGGCGGATCAGCTCACCGA；
下游引物：CTTAGCCATCATGACCTTAAC。
(2)结果显示：该基因在黄瓜的根、茎、叶中均有表达，其中在叶中表达最高，在根中表达最低，具有表达特异性，同时ABA，43℃高温逆境能够诱导该基因的表达，而SA不能诱导该基因的表达。原位杂交结果表明，43℃高温处理6h后，该基因在叶片和根的表达量均有上升。结果表明该基因可能与黄瓜耐热性的调控有关，也涉及到ABA信号途径的调控(见图2)。
3、亚细胞定位分析
(1)将CsCaM基因亚克隆到pEZS-NL-GFP载体上，并将重组质粒转化到农杆菌GV3101中，取新鲜的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)表皮进行侵染。引物序列如下：
上游引物：ATGGCGGATCAGCTCACCGA；
下游引物：CTTGGCCATCATGACCTTCA。
(2)结果显示：亚细胞定位结果表明，该蛋白在细胞膜和细胞核中均有分布(见图3)。
4、RNA原位杂交检测
CsCaM原位杂交检测参考Ma等人(2012)方法。按照DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)(Roche,Shanghai,China)进行。
扩增探针引物序列为：
CsCaM-SP6：
ATTTAGGTGACACTATAGAAGATGGCGGATCAG CTCACCGA；
CsCaM-T7：
TAATACGACTCACTATAGGGAGA CCTTAGCCATCATGACCTTAAC。
(2)结果：(见图4)原位杂交结果表明，43℃高温处理6h后，该基因在叶片和根的表达量均有上升。
实施例2黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM的过表达株系的获得
1、表达载体的构建
以上一步得到的阳性重组菌为模板，进行PCR，扩增CsCaM基因，所用特异引物为：
P1：5′-CTCTAGAATGGCGGATCAGCTCACCGA-3′；
P2：5′-CGGATCCCCTTAGCCATCATGACCTTAAC-3′；
划线部分为XbaI和BamHI酶切位点。pBI121载体用XbaI和BamHI进行双酶切，电泳，回收大片段，CsCaM基因PCR产物，也用XbaI和BamHI进行双酶切，回收片段，然后，CsCaM片段和pBI121混合，用T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选重组子，提取质粒pBI-CsCaM，把pBI-CsCaM转化到农杆菌中，用于转化黄瓜。
2、遗传转化黄瓜
(1)取无菌萌发8天的黄瓜子叶作外植体，1500个外植体先在培养基(MS+6-BA1.0mg·L-1+AgNO3 2.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH5.8)上，25℃，黑暗中预培养2天，然后把预培养的子叶在OD600为0.5的农杆菌中浸泡20分钟，吸干菌液，转到筛选培养基上(MS+6-BA 1.0mg·L-1+AgNO3 2.0mg·L-1+Kan 70mg·L-1+cef 300mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH5.8)，4周后，可以获得候选抗性不定芽。抗性不定芽在分化培养基上(MS+6-BA 1.0mg·L-1+AgNO3 2.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.5g·L-1，pH5.8)培养2～3次，每次25天左右，然后把不定芽在生根培养基上(MS+Kan70mg·L-1+cef 200mg·L-1)进行生根，获得候选苗，用于后续鉴定。
(2)结果显示：遗传转化黄瓜，获得4株转化植株。经过southern blotting和Northern blotting检测表明，该基因已经整合到黄瓜“02-8”中，并且在转化植株中，目的基因的表达量得到提高(见图5)。
实施例3CsCaM在黄瓜中超表达提高黄瓜耐热性
1、转基因植株的耐热性鉴定
(1)转基因植株经过自交后，获得T1转化植株，选取3个转基因株系(OE-1，OE-2，和OE-3)的T1代植株进行耐热性鉴定。
(2)结果表明，在43℃高温处理5天后，非转基因植株的死亡率超过30％，而转基因植株的死亡率则低于5％。高温处理10天后，非转基因植株全部死亡，而转基因植株存活率仍然超过60％(图6中A和B)；高温处理下，转基因植株的种子萌发胚根长度比非转基因植株的种子要长(见图6中C)，表明，超表达CsCaM基因，能够提高黄瓜的耐热性。
2、叶绿素及各种酶活性检测
(1)叶绿素，叶绿素a，叶绿素b测定参考Porra等人(1989)的方法；MDA，POD测定按照Velikova等人(2000)方法；SOD测定按照Attar等人(2006)方法；CAT测定按照Dong等人(2014)方法。为了研究转基因黄瓜和未转化植株在高温逆境下的一些生理生化指标和抗氧化酶的活性差异，选取3个转基因黄瓜的T1代植株进行分析。
(2)结果表明在43℃高温处理3d后，所有转基因黄瓜的叶片叶绿素，叶绿素a和叶绿素b含量均高于未转化植株，抗氧化酶的活性SOD，POD，CAT均高于未转化植株，而MDA含量较未转化植株低，差异均达到显著水平。高温逆境处理3d后，转基因植株ROS，H2O2，超氧离子含量均低于未转化植株，而在正常条件下，转基因植株和未转化植株差异不显著(见表2)。
表2
3、超氧离子、H2O2和ROS积累分布测定
(1)超氧离子检测采用硝基四氮唑蓝(NBT)法，H2O2检测采用二氨基联苯胺(DAB)法，参考Lei等人(2010)方法；ROS检测采用2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐染色法(DCFH-DA，黄瓜叶片表皮在50μM DCFH-DA溶液中浸泡30分钟，而后在荧光显微镜Leica MZ FL III下观察，拍照。(激发波长，450±490nm；重叠波长520±560nm)。
(2)结果显示：高温逆境处理3d后，转基因植株ROS，H2O2，超氧离子含量均低于未转化植株，而在正常条件下，转基因植株和未转化植株差异不显著(见图7)。
4、根系活力检测分析
(1)根系活性采用荧光素二乙酸法(FDA/PI)，具体操作参考Pan等人(2001)方法；在荧光显微镜(Olympus CamediaC-5060)下观察，激发波长为460～495nm，吸收波长为510nm。
(2)结果显示：高温逆境处理3天后，未转化植株的根尖活力下降，而转基因植株的根尖仍然保持较高的活性(图6中D)，表明，超表达CsCaM基因，能够提高黄瓜的耐热性。
5、高温逆境下转基因植株中抗逆和叶绿素代谢相关途径相关基因表达分析
主要分析了叶绿素代谢途径中CLH，CBR1，PAO和RCCR等基因。具体的引物序列见表1。
PCR反应体系如下：℃预热3min，1个循环；94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸90s；28个循环，72℃延伸7min。
表1qRT-PCR分析所用特异引物
结果表明，高温处理3天后，转基因植株中CBR1，PAO和RCCR基因的表达量均高于未转化植株，而CLH的表达量则低于未转化植株；同时与调控抗逆相关的一些基因CsSOD，CsPOD，CsCAT，CscAPX，AOX，HSP70和HSP90在转基因植株中的表达水平均高于未转化植株，转基因植株中ABA代谢途径的CsABI1，CsABI2和CsABI3表达量也高于未转化植株(图8)，ABA信号途径可能涉及到抗高温逆境的调控。
以上结果表明，超表达CsCaM基因，不仅影响了叶绿素代谢途径的相关基因的表达，也影响抗逆相关各种基因，ABA途径基因的表达，但是有关如何影响的机理有待深入研究。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 450
<212> DNA
<213> 黄瓜(cucumis sativus L.)
<400> 1
atggcggatc agctaaccga tgaccagatc tctgagttca aggaggcctt cagcttgttt 60
gacaaggacg gcgacggttg tatcacaacc aaggagcttg gtactgttat gaggtcgtta 120
ggtcagaatc caacagaggc ggagcttcag gacatgatca atgaggtgga tgctgatgga 180
aatggaacaa tcgactttcc agagttccta aacctcatgg cgaggaagat gaaggatacg 240
gactcagagg aagagttgaa agaggcgttc cgtgtgttcg ataaggatca gaatggattc 300
atctccgctg ctgagctccg ccatgtgatg acaaatcttg gcgagaaact gacagaggag 360
gaggtggatg agatgatcag agaagctgat gtggatggcg atgggcagat taactacgat 420
gaatttgtga aggtcatgat ggccaagtga 450
<210> 2
<211> 149
<212> PRT
<213> 黄瓜(cucumis sativus L.)
<400> 2
Met Ala Asp Gln Leu Thr Asp Asp Gln Ile Ser Glu Phe Lys Glu Ala
1 5 10 15
Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Thr Lys Glu
20 25 30
Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu
35 40 45
Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile
50 55 60
Asp Phe Pro Glu Phe Leu Asn Leu Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr
65 70 75 80
Asp Ser Glu Glu Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp
85 90 95
Gln Asn Gly Phe Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn
100 105 110
Leu Gly Glu Lys Leu Thr Glu Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu
115 120 125
Ala Asp Val Asp Gly Asp Gly Gln Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Val Lys
130 135 140
Val Met Met Ala Lys
145

Claims (10)

1.一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在提高植物耐热性中的应用，其特征在于，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种黄瓜钙结合蛋白CsCaM在提高植物耐热性中的应用，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组载体在提高植物耐热性中的应用，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM。
4.根据权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜。
5.根据权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，将黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM遗传转化黄瓜。
6.一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM在构建耐热黄瓜品种中的应用，其特征在于，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示。
7.一种重组载体在构建耐热黄瓜品种中的应用，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM。
8.一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控叶绿素代谢途径相关基因CBR1，PAO，RCCR和CLH基因的表达量的应用，其特征在于，所述基因的核苷序列如SEQID NO：1所示，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
9.一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控抗逆相关基因CsSOD，CsPOD，CsCAT，CscAPX，AOX，HSP70和HSP90基因的表达量的应用，其特征在于，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
10.一种黄瓜钙结合蛋白基因CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM或黄瓜钙结合蛋白CsCaM在调控ABA代谢途径的CsABI1，CsABI2和CsABI3基因的表达量的应用，其特征在于，所述基因的核苷序列如SEQ ID NO：1所示，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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