CN103698320A - 一种测定铅离子的dna酶组装的手性传感器的构建方法 - Google Patents

Abstract

一种测定铅离子的DNA酶组装的手性传感器的构建方法，属于纳米生物技术检测领域。本发明包括：10nm和20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰，修饰的银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体，银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用圆二色光谱（CD）进行检测。本发明应用了一种银纳米粒子探针，借助于Pb²⁺依赖的DNA酶的作用下，大小银纳米粒子组装成不对称的手性二聚体，通过CD信号对Pb²⁺进行检测。本发明方法能够实现对Pb²⁺的超灵敏检测，检测灵敏度高、特异性好，同时可以检测水溶液中的痕量目标物。

Description

一种测定铅离子的DNA酶组装的手性传感器的构建方法

技术领域

一种测定Pb²⁺的DNA酶组装的手性传感器的构建方法，属于纳米生物技术检测领域。

背景技术

Pb²⁺是最具毒性的重金属离子之一，铅的污染来自矿山开采、冶炼、橡胶生产、染料、印刷、陶瓷、铅玻璃、焊锡、电缆及铅管等生产废水和废弃物。另外，汽车尾气中的四乙基铅是剧毒物质。随着我国工农业的迅速发展，环境中重金属的污染越来越严重。重金属污染引起的毒害持久存在，会随土壤、水体再次循环而进入食物链，对食品安全构成威胁，危害人类生命和健康。目前为止，铅在生物体内没有已知的生理作用，任何人体内的铅均被视为污染，铅中毒会引发肠胃紊乱，肝、肾以及神经损伤。美国环保署规定饮用水中Pb²⁺的最高含量不得超过72nM。国家环保部的调查显示，我国水体重金属污染问题十分突出，江河湖库底质的污染率高达80.1%。针对重金属污染的特点，对其发现和检测是至关重要的。

传统的Pb²⁺检测方法包括电感偶合等离子体法(ICP)和原子吸收光谱法，这些方法具有灵敏度高、定量准确等优点，但是所需仪器昂贵、样品预处理复杂、耗时，且要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本高。化学、生物传感器由于具有灵敏度高、选择性好、体积小、造价低等特点，受到了人们的青睐。近年来，随着纳米技术的发展，基于寡核苷酸功能化的纳米粒子在食品危害因子检测方面进行了大量的研究和应用。由于纳米粒子具有特殊的性质，如：光学特性、电化学特性、荧光特性、顺磁性等，可以利用这些性质所特有的信号进行放大来达到检测目标物的目的。等离子纳米粒子组装成的手性纳米结构具有CD信号，这一发现对纳米材料在检测领域的应用成为一个新的进展，可以应用手性纳米材料组装体的CD信号作为检测信号对有害物进行检测。

DNA酶是经体外筛选得到的一种功能化的DNA分子，这种酶不同于蛋白酶，可以通过化学合成得到，具有良好的热稳定性和反应活性，同时DNA分子可以修饰多种功能基团，并且可以固定到固相支持物上，目前，大量的目标物具有能够识别的DNA酶。在重金属离子存在的条件下，重金属依赖的DNA酶的底物链在RNA碱基切割位点处被切开，Pb²⁺依赖的DNA酶被称作“17 E”DNA酶，由一条酶链和一条底物链组成，应用DNA酶建立的Pb²⁺检测传感器引起了人们广泛的研究兴趣。

本发明是借助于DNA酶的作用将DNA探针修饰的大小银纳米粒子组装成不对称的银纳米粒子二聚体，在不同浓度Pb²⁺存在的条件下，二聚体发生不同程度的解聚，随着Pb²⁺浓度的增加，二聚体的解聚程度越大，从而CD信号随之降低，根据CD信号的强度与Pb²⁺浓度之间的建立的对应关系，从而对Pb²⁺含量进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对Pb²⁺进行检测与定量的手性传感器方法，借助于DNA酶的作用将DNA探针修饰的大小银纳米粒子组装成不对称的银纳米粒子二聚体，在不同浓度Pb²⁺存在的条件下，二聚体发生不同程度的解聚，最后通过CD光谱对银纳米粒子组装体进行测定，从而间接检测目标Pb²⁺的含量。

本发明的技术方案：一种测定Pb²⁺的DNA酶组装的手性传感器的构建方法，包括：10nm和20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰，银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体，该银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用CD光谱进行检测；具体步骤为：

（1）10nm和20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰

将新合成的10nm、20nm的银纳米粒子分别在10000r/min、8000r/min的转速条件下通过离心浓缩十倍，然后将银纳米粒子分别重悬到包含有50mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液中，使得10nm、20nm的银纳米粒子的终浓度分别为50 nM、20 nM；然后将DNA探针和银纳米粒子按照10:1的摩尔比例进行偶联，具体如下：1μL的20 μM S1核酸片段加入到100 μL 20 nM 的20 nm银纳米粒子中，1 μL的50 μM S2核酸片段加入到100 μL 50 nM 的10 nm银纳米粒子中，孵育12h后，成功偶联的银纳米粒子离心三次，将未偶联的DNA去除，最后纳米粒子均重悬到50 μL 25 mM Tris-醋酸缓冲液中 (pH 8.2，包含100 mM NaCl)，最终得到偶联好的银纳米粒子；

S1：5'-TCACAGATGA GT-SH-3'；

S2：5'-SH-CACGAGTTGA CA-3'；

（2）银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体

整个组装体系包括：70 μL S1修饰的20 nm的银纳米粒子，30 μL S2修饰的10 nm的银纳米粒子，1 μL 100 μM 底物链（Sub），2 μL 100 μM 酶链（17E）；首先将整个反应体系加热到70℃，然后将其自然冷却至室温以促进银纳米粒子的组装；杂交8h后，将组装产物离心三次，获得纯化好的不对称银纳米粒子二聚体；

Sub：5'-ACTCATCTGT GAACTCACTA T(rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3'；

17E：5'-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3'；

（3）银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用CD光谱进行检测

在不对称银纳米粒子二聚体中加入一系列不同浓度的Pb²⁺，在Pb²⁺的作用下，底物链断裂，从而导致二聚体被***成单个的粒子，CD信号的强度降低，将不同目标物浓度下的反应体系用CD光谱进行检测，得到200nm-800nm的CD光谱图，随着Pb²⁺浓度的增加，不对称银纳米粒子二聚体的数量逐渐减少，CD信号逐渐降低，根据Pb²⁺浓度与CD信号强度之间的对应关系，绘制Pb²⁺浓度与CD信号强度的标准曲线，从而应用CD信号对Pb²⁺的浓度进行定量。

所述的10nm、20nm的银纳米粒子通过硼氢化钠还原硝酸银的方法进行合成，合成步骤：0.6 mL 0.1 M硼氢化钠溶解到20 mL冰水中，再加入5 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为保护剂，另加入600 μL 1%的柠檬酸三钠以得到20nm银纳米粒子，以上混合物在冰浴中处于持续搅拌状态。然后用两个恒流泵以30 mL/h的速率，同时分别加入5 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和5 mL 10 mM的硝酸银。最后将反应溶液在80℃条件下孵育以去除过量的硼氢化钠，3 h后得到合成好的10nm的银纳米粒子，并放入4℃待用。

本发明的有益效果：本发明提供一种对Pb²⁺进行检测与定量的手性传感器方法，借助于DNA酶的作用将DNA探针修饰的大小银纳米粒子组装成不对称的银纳米粒子二聚体，在不同浓度Pb²⁺存在的条件下，二聚体发生不同程度的解聚，最后通过CD光谱对银纳米粒子组装体进行测定，从而间接检测目标Pb²⁺的含量。

附图说明

图1  Pb²⁺检测的CD光谱；

图2  Pb²⁺检测的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

测定Pb²⁺的DNA酶组装的手性传感器的构建方法。包括：10nm、20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰，银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体，该银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用CD光谱进行检测；具体步骤为：

（1）10nm、20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰

将新合成的10nm、20nm的银纳米粒子分别在10000r/min、8000r/min的转速条件下通过离心浓缩十倍，然后将银纳米粒子分别重悬到包含有50mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液中，使得10nm、20nm的银纳米粒子的终浓度分别为50 nM、20 nM；然后将DNA探针和银纳米粒子按照10:1的摩尔比例进行偶联，具体如下：1μL的20 μM S1核酸片段加入到100 μL 20 nM 的20 nm银纳米粒子中，1 μL的50 μM S2核酸片段加入到100 μL 50 nM 的10 nm银纳米粒子中，孵育12h后，成功偶联的银纳米粒子离心三次，将未偶联的DNA去除，最后纳米粒子均重悬到50 μL 25 mM Tris-醋酸缓冲液中 (pH 8.2，包含100 mM NaCl)，最终得到偶联好的银纳米粒子；

S1：5'-TCACAGATGA GT-SH-3'；

S2：5'-SH-CACGAGTTGA CA-3'；

（2）银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体

整个组装体系包括：70 μL S1修饰的20 nm的银纳米粒子，30 μL S2修饰的10 nm的银纳米粒子，1 μL 100 μM 底物链（Sub），2 μL 100 μM 酶链（17E）；首先将整个反应体系加热到70℃，然后将其自然冷却至室温以促进银纳米粒子的组装；杂交8h后，将组装产物离心三次，获得纯化好的不对称银纳米粒子二聚体； 

Sub：5'-ACTCATCTGT GAACTCACTA T(rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3'；

17E：5'-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3'；

（3）银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用CD光谱进行检测

在不对称银纳米粒子二聚体中加入一系列不同浓度的Pb²⁺，在Pb²⁺的作用下，底物链断裂，从而导致二聚体被***成单个的粒子，CD信号的强度降低。将不同目标物浓度下的反应体系用CD光谱进行检测，得到200nm-800nm的CD光谱图，随着Pb²⁺浓度的增加，不对称银纳米粒子二聚体的数量逐渐减少，CD信号逐渐降低，根据Pb²⁺浓度与CD信号强度之间的对应关系，绘制Pb²⁺浓度与CD信号强度的标准曲线，从而应用CD信号对Pb²⁺的浓度进行定量。

（4）检测灵敏度研究

根据每个目标Pb²⁺浓度下对应的CD信号强度，以DNA浓度为横坐标，CD信号强度为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出Pb²⁺的检测限为0.02 ng mL^-1。

（5）特异性研究

以Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺为检测对象，进行特异性分析，加入浓度均为5 ng mL^-1，操作方法与Pb²⁺检测的操作方法一致，反应体系的CD信号与阴性空白样品即未加入任何重金属离子的CD信号进行对比，得到的CD信号与空白样品的CD信号没有明显差别，由此得出其它重金属离子不能识别Pb²⁺依赖的DNA酶，此方法的特异性良好。

（6）添加回收实验

将不同浓度的Pb²⁺加入到阴性自来水中，用以上方法建立的Pb²⁺检测传感器进行水样品中的添加回收测定，最终得到的回收率范围在94%-100%，可以进行实际样品的检测。

S1：5'-TCACAGATGA GT-SH-3'；

S2：5'-SH-CACGAGTTGA CA-3'；

Sub：5'-ACTCATCTGT GAACTCACTA T(rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3'；

17E：5'-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3'；

 

Claims (1)

1.一种测定Pb²⁺的DNA酶组装的手性传感器的构建方法，其特征在于包括：10nm和20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰，银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体，该银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用CD光谱进行检测；具体步骤为：

（1）10nm、20nm的银纳米粒子分别用一对DNA探针进行修饰

将新合成的10nm、20nm的银纳米粒子分别在10000r/min、8000r/min的转速条件下通过离心浓缩十倍，然后将银纳米粒子分别重悬到包含有50mM NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液中，使得10nm、20nm的银纳米粒子的终浓度分别为50 nM、20 nM；然后将DNA探针和银纳米粒子按照10:1的摩尔比例进行偶联，具体如下：1μL的20 μM S1核酸片段加入到100 μL 20 nM的 20 nm银纳米粒子中，1 μL的50 μM S2核酸片段加入到100 μL 50 nM 的10 nm银纳米粒子中，孵育12h后，成功偶联的银纳米粒子离心三次，将未偶联的DNA去除，最后纳米粒子均重悬到50 μL pH 8.2，包含100 mM NaCl 的25 mM Tris-醋酸缓冲液中，最终得到偶联好的银纳米粒子；

S1：5'-TCACAGATGA GT-SH-3'；

S2：5'-SH-CACGAGTTGA CA-3'；

（2）银纳米粒子在DNA酶的作用下组装成不对称手性二聚体

整个组装体系包括：70 μL S1修饰的20 nm的银纳米粒子，30 μL S2修饰的10 nm的银纳米粒子，1 μL 100 μM 底物链Sub，2 μL 100 μM 酶链17E；首先将整个反应体系加热到70℃，然后将其自然冷却至室温以促进银纳米粒子的组装；杂交8h后，将组装产物离心三次，获得纯化好的不对称银纳米粒子二聚体； 

Sub：5'-ACTCATCTGT GAACTCACTA T(rA)GGAAGAGAT GTGTCAACTC GTG-3'；

17E：5'-CATCTCTTCT CCGAGCCGGT CGAAATAGTG AGT-3'；

（3）银纳米粒子组装体作为检测传感器用于Pb²⁺的检测，应用CD光谱进行检测

在不对称银纳米粒子二聚体中加入一系列不同浓度的Pb²⁺，在Pb²⁺的作用下，底物链断裂，从而导致二聚体被***成单个的粒子，CD信号的强度降低，将不同目标物浓度下的反应体系用CD光谱进行检测，得到200nm-800nm的CD光谱图，随着Pb²⁺浓度的增加，不对称银纳米粒子二聚体的数量逐渐减少，CD信号逐渐降低，根据Pb²⁺浓度与CD信号强度之间的对应关系，绘制Pb²⁺浓度与CD信号强度的标准曲线，从而应用CD信号对Pb²⁺的浓度进行定量。

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