CN107988388B - 一种与猪悬蹄过度生长性状相关的snp标记及其用途 - Google Patents

一种与猪悬蹄过度生长性状相关的snp标记及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记，所述SNP标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点，该位点的碱基是T或G。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够减少大白悬蹄过度生长的发生，加快遗传进展，有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记及其用途
技术领域
本发明涉及一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记及其用途。
背景技术
猪是典型的偶蹄目哺乳动物，其第1趾完全退化；第3、4趾特别发达，长短相等，称之为主蹄；第2、5趾不发达，正常情况下悬立在空中，称之为悬蹄(见图1)。悬蹄的主要作用在于辅助主蹄承受猪的体重以及维持其身体平衡，当母猪悬蹄过长时(大于7cm)，极易发生机械损伤，进而造成无法站立及饮食，继发引起怀孕母猪流产、哺乳母猪营养不良等(见图2)，从而对母猪的各方面产生影响，严重时母猪直接被淘汰，给养殖企业带来了巨大的经济损失。
由于猪悬蹄的最终长度在成年后才能观察到，而种猪的选种却在此之前，因此早期选择的准确性就显得尤为重要。而分离和鉴定猪悬蹄过度生长易感位点则是猪悬蹄过度生长抗病育种的关键。目前，全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)被广泛应用于寻找与畜禽复杂性状高度关联的位点，所筛选出的分子标记可对难以测量的性状(如悬蹄过度生长)进行早期的分子标记辅助选择(marker assistedselection，MAS)育种。目前，该方法已成为规模化养猪业分子育种的重要手段。
悬蹄过度生长广泛分布于瘦肉型猪种中，是造成能繁母猪被提前淘汰的决定因素之一。大白是世界上著名的瘦肉型猪种之一，因其较高的繁殖力、较好的生长育肥性和适应性等特点，常被作为诸多商品猪合成系的母本。多项研究表明，大白母猪群体存在明显的悬蹄过度生长现象。因此，对大白母猪的悬蹄生长性状进行遗传改良，将可以有效避免母猪因肢蹄异常而被提前淘汰，最大限度的提高母猪的使用年限，从而减少母猪因趾蹄疾患而提前被淘汰所带给养殖企业的经济损失。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记及其用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记，所述SNP标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点，该位点的碱基是T或G。
优选地，所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第332位碱基是T或G。所述分子标记的SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903处的T>G突变；所述分子标记的SNP位点为SEQ ID NO1:所示，其中序列中的M是T或G，导致悬蹄生长性状的不同。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够减少大白悬蹄过度生长的发生，加快遗传进展，有效提高种猪育种的经济效益。
本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP标记的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP标记的试剂盒，包括上述所述的引物对。
本发明提供了一种减少猪悬蹄过度生长的方法，所述方法包括以下步骤：
检测猪的国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点的基因型，选择第133470903个核苷酸位点的GG型个体作为种猪。
优选地，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：
(1)提取待测猪的基因组DNA；
(2)采用权利要求3所述的引物对，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的如权利要求1或2所述的SNP标记的基因型。
优选地，所述种猪包括大白及其合成系。
本发明提供了上述所述的SNP标记在减少猪悬蹄过度生长中的用途。
本发明提供了上述所述的引物对或所述的试剂盒在减少猪悬蹄过度生长中的用途。
本发明提供了上述所述的SNP标记、或者所述的引物对或所述的试剂盒在鉴定猪悬蹄过度生长性状中的用途。
本发明的有益效果在于：
本发明研究并确定影响大白母猪悬蹄过度生长相关的分子标记，提供一种用于鉴定影响大白母猪悬蹄过度生长性状分子标记的引物对，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪悬蹄生长性状遗传改良中，从而减少猪悬蹄过度生长，减少母猪发生机械损伤，继发引起怀孕母猪流产、哺乳母猪营养不良等，从而对母猪和后代仔猪的各方面性能产生影响；提高母猪使用年限，提高企业利润，增加核心竞争力。
附图说明
图1为猪悬蹄示意图；
图2为悬蹄正常和悬蹄过度生长示意图；
图3为大白母猪在13号染色体上关于悬蹄生长性状的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的上述发明目的具体是这样实现的：
1、实验猪群
本发明所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的475头纯种大白母猪，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。采用相同的饲养方式由专业人员进行饲养以及管理。猪群按照统一的猪营养标准饲养，自由采食和饮水。试验猪只健康，生长良好，无临床症状。
2、样本收集及表型记录
收集上述猪只耳组织样品，浸泡于75％乙醇中置于-20℃冰箱备用。
记录猪只悬蹄生长性状：所有猪只的两条后腿悬蹄测定均采用软皮尺按照统一方法进行精确度量，精确度为毫米。以猪目视前方的方向记为左右方向，左右后蹄的悬蹄均测定外侧悬蹄的长度，每个悬蹄测定均测量3次，取其平均值分别记录为猪左右后蹄悬蹄的悬蹄长度。
3、组织DNA的抽提与猪全基因组80K SNP判型
采集上述大白母猪的耳组织，及时将耳组织浸泡于75％乙醇中置于-20℃冰箱备用。参照苯酚-氯仿法提取大白母猪的全基因组DNA，用Nanodrop-ND1000核酸浓度仪和琼脂糖凝胶电泳对大白母猪的DNA进行浓度测定和质量检测。具体地是将核酸浓度仪测得的A260/280比值在1.8-2.0，A260/230比值在1.7-1.9判定为纯度合格，将浓度高于300纳克/微升判定为浓度合格；将纯度及浓度合格的DNA样品统一稀释成50纳克/微升。再6μl稀释过的DNA样品与2μlLoading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整度。将浓度、纯度及完整度都合格的DNA样品判定为质量合格样品。
GeneSeek Genomic Profiler Porcine 80K SNP分型平台，采用IlluminaInfinium的使用说明和标准流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过GenomeStudio软件读取基因型数据。用PLINK v1.07对获得的基因型数据进行质量控制，具体标准如下：
(1)哈迪-温伯格平衡(HWE，Hardy-Weinberg equilibrium)检验P值大于10-6
(2)SNP检出率大于90％
(3)个体SNP检出率大于90％
(4)SNP最小等位基因频率(MAF，Minor Allele Frequency)大于5％
(5)删除未知位置和性染色体上的SNP
4、全基因组关联(GWAS)分析
采用基于SNP标记的病例-对照(Case-Control)全基因组关联分析，通过检测全基因组范围内每一个SNP标记位点上病例个体和对照个体中等位基因及基因型频率的差异，以此搜寻与控制目标性状的基因座位处于连锁不平衡的位点。本研究选择来自美国密歇根大学的Xiang Zhou和芝加哥大学的Matthew Stephens共同研发的GEMMA软件对大白母猪悬蹄过度生长群体和正常悬蹄群体进行全基因组关联分析。GEMMA软件是一个在进行全基因组关联分析中可以解释群体分层和亲缘关系的强力软件，适合用单变量线性混合模型(Univariate Linear Mixed Model)对单个表型与标记进行关联检测，以此解释群体分层和样本结构效应，以及用于估算基因型解释表型的比例。考虑到亲缘关系以及群体分层效应对关联分析造成的假阳性结果的可能性，本研究采用单变量混合线性模型加以控制，通过GEMMA软件进行全基因组关联分析。单变量混合线性模型：
Y＝Wα+xβ+u+ε
Y为表型向量；W表示以场际效应和采样时的日龄为协变量的指示矩阵，α为协变量对应的相关系数；x为SNP的指示矩阵(为校正后亲缘关系矩阵，由全基因组标记基因型计算而得)，β为SNP的效应；μ为预测的随机效应，ε为残差。采用Bonferroni法确定全基因组关联分析得显著性阈值，基因组水平的显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即0.05/50227＝9.9548E-07；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即1/50227＝1.9910E-05。GWAS分析结果如图3所示。从图3可知，在大白母猪群体中，在13号染色体中存在显著影响悬蹄生长性状的位点，最强关联的SNP为g.332T>G(P＝1.04E-06)。
5、不同基因型与悬蹄生长表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点g.332T>G与悬蹄生长性状极显著相关(P＝1.04E-06)，说明此分子标记显著影响猪的悬蹄生长性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而减少该群体悬蹄过度生长。此外，正常生长组在SNP g.332T>G位点的等位基因T的等位基因频率极显著低于过度生长组(5.4％<20.5％，P<0.0001)。因此，我们在进行育种的过程中，需要淘汰TT和TG型的种猪，保留GG型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因G的频率。
表1不同等位基因频率及对应的表型差异
6、目的DNA序列扩增及测序
(1)含有与大白悬蹄过度生长显著相关SNP位点的目的片段的扩增目的片段为13号染色体中的一段483bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：
上游引物5’-AGAAGAATCTATGGGAAACTAC-3’(SEQ ID NO:2)；
下游引物5’-GTAAGTGGGAGCGGGTAG-3’(SEQ ID NO:3)。
(2)PCR扩增的体系与条件设置
配置20ul体系，其中DNA样品3.5ul，上游引物0.6ul，下游引物0.6ul，PCR mix10ul,ddH2O 5.3ul,PCR条件为98℃预变性2min，98℃变性30s，50.8℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后延伸为72℃10min。
(3)DNA序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。
测序结果如下所示(SEQ ID NO:1)：
注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列。
所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华南农业大学；广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记及其用途
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> 猪
<220>
<221> misc_feature
<223> m=T或G
<400> 1
agaagaatct atgggaaact accaaaaccc cccacaaaac accaaggaga ggaaaaaaca 60
caagttgcgt ttgatttaaa aaatatttat aggacacggt ttttattttc atagaatgtc 120
aataaatatt ttaccaggat gatacggata tatcacaatg atgggaggaa gaatttggga 180
tcgctaaggg atggaaacat ttcgaccttt aatttaaacc tcgattcagc aggcttatcc 240
ttggcagtgg gggggtcttg aaatctggca gagaaagcgt ccttacgtgc acagaccaga 300
tttctaacgt gggcacgctg ccagatcagt amatggagga ccagtggcac cggctcttga 360
tgacctgaag caaaggcttc ctgaaagtga ggaagatgac agtgcaggcc accagcaggg 420
tgaggcagct gggaagaatg agcacgaggt acagcaggcc catgtctacc cgctcccact 480
tac 483
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agaagaatct atgggaaact ac 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtaagtggga gcgggtag 18

Claims (6)

1.一种与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记在猪悬蹄生长遗传育种中的用途，其特征在于，所述SNP标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点，该位点的碱基是T或G。
2.根据权利要求1所述的与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记在猪悬蹄生长遗传育种中的用途，其特征在于，所述SNP标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第332位碱基是T或G。
3.根据权利要求1或2所述的与猪悬蹄过度生长性状相关的SNP标记在猪悬蹄生长遗传育种中的用途，其特征在于，一种用于检测如权利要求1或2中所述的SNP标记的引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
4.一种减少猪悬蹄过度生长的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
检测猪的国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点的基因型，选择第133470903个核苷酸位点的GG型个体作为种猪；
所述方法用于非疾病治疗与诊断目的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上第133470903个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：
(1)提取待测猪的基因组DNA；
(2)采用权利要求3中所述的引物对，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的如权利要求1或2中所述的SNP标记的基因型。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种猪包括大白及其合成系。
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