CN102241737B - 内***肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 - Google Patents
内***肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102241737B CN102241737B CN 201110089179 CN201110089179A CN102241737B CN 102241737 B CN102241737 B CN 102241737B CN 201110089179 CN201110089179 CN 201110089179 CN 201110089179 A CN201110089179 A CN 201110089179A CN 102241737 B CN102241737 B CN 102241737B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tyr
- gly
- ala
- cbz
- amidino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明合成了四个新型的内***肽-1类似物,属于生物化学技术领域。该内***肽-1类似物是将内***肽-1的一位Tyr进行N端胍基化;二位Pro被D-Ala替换;三位Trp被Gly替换;四位Phe分别被Trp替换或是Phe的苯环对位氯化、氟化修饰或未修饰。本发明合成的内***肽-1类似物通过放射配体受体结合实验,离体器官生物活性鉴定实验,离体酶解稳定性实验,温浴甩尾镇痛实验和药物耐受实验等一系列的生理学和药理学活性鉴定,显示出了高亲和活性,高酶解稳定性,高镇痛活性及不易引起耐受性。因此,可以用于制备临床镇痛药物。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域,涉及一类新的内***肽-1类似物及其合成;本发明同时还涉及该内***肽-1类似物在制备镇痛药物中的应用。
背景技术
现代医学所谓的疼痛,是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的症状之一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉,以及机体对伤害性刺激的痛反应。长期疼痛给患者带来痛苦和不安,剧痛还可以引起失眠或其他生物功能紊乱,影响患者的生活质量。因此,疼痛药物的研发一直是全球性的热点和难点。阿片类药物因其止痛作用强,在缓解重度疼痛具有无可取代的地位。然而它们在起到镇痛作用的同时往往伴随很多副作用,很大程度上限制了其在镇痛方面的应用。临床上镇痛最常应用的是阿片药物,除了众所周知的副作用外,不同的阿片药物治疗还可产生急性耐受性。因此,发现新型的低副作用的阿片类镇痛药物是目前科学研究的难点,尤其是能够产生强效的无耐受现象的镇痛作用的药物。
阿片类镇痛药物主要是通过μ阿片受体发挥镇痛作用,所以自从μ阿片受体的内源性配体内***肽被发现后,科学家们对其进行了广泛而深入的研究。研究表明:内***肽通过与G蛋白偶联的μ阿片受体结合,可参与对痛觉、呼吸、心血管、胃肠、行为、运动、内分泌及免疫等诸多功能的调节,但其主要药用作用体现在镇痛功能上。同时发现,在中枢给药情况下,内***肽可产生强度与***相当而副作用较少的镇痛作用。其中内***肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)具有优于内***肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)的治疗学特性,如奖赏行为与镇痛作用的分离,耐受的形成较内***肽-2发展更慢一些,镇痛剂量明显低于引起呼吸抑制及心血管作用的剂量等,因此推测内***肽-1比内***肽-2更适于作为新的安全阿片类镇痛药物先导化合物。
内***肽-1(Endomorphin-1,EM-1)具有酶解稳定性差,血脑屏障通透能力差的缺点,从而限制其在临床上的应用。因此,通过对内***肽-1进行结构改造,在尽量不降低或提高其亲和活力的前提下,提高酶解稳定性和血脑屏障通透能力;从而得到外周给药产生高效镇痛活性的内***肽-1类似物成为近年研究的方向。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的问题,提供一类种具有高亲和力、酶解稳定性好、镇痛作用强并且作用时间长、低副作用的内***肽-1类似物。
本发明的另一目的是提供一种该内***肽-1类似物的合成方法。
本发明还有一个目的,就是提供该内***肽-1类似物在制备镇痛药物中的应用。
(一)内***肽-1类似物
本发明的内***肽-1类似物,是以内***肽-1为母体进行改造而成,其结构式如下:
其中,第一个结构式的内***肽-1类似物命名为[GAGS]-EM-1。
第二个结构式中,R=Cl、F或H。
当R=Cl,内***肽-1类似物命名为[GAGP]-EM-1,其结构式如下:
当R=F,内***肽-1类似物命名为[GAGF]-EM-1,其结构式如下:
当R=H,内***肽-1类似物命名为[GAGD]-EM-1,其结构式如下:
从上述结构式可以看出,四种内***肽-1类似物是将内***肽-1的一位Tyr进行N端胍基化;二位Pro被D-Ala替换;三位Trp被Gly替换;四位Phe分别被Trp替换或是Phe的苯环对位氯化、氟化修饰或未修饰。
四个类似物都为白色固体粉末,其理化特征见表1。
表1.EM-1及其类似物的理化特征
a.HPLC测定的保留时间:分析柱:Waters Delta-Pak C18 column(3.9mm×150mm);流动相流速0.6ml/min,流动相=含0.05%TFA的水(A)+0.05%TFA的乙腈(B)。流动相A∶B=90∶10→90∶10;洗脱梯度:0-30min;A∶B=90∶10→90∶10,洗脱梯度:30-35min。
b.高效硅胶板上的Rf值;展开体系为:乙酸乙酯/甲醇/氨水=20∶10∶1。
(二)内***肽-1类似物的合成
本发明内***肽-1类似物的合成方法如下:
(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成
以二氯甲烷(DCM)与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液为溶剂,在三乙胺(Et3N)或二异丙基乙胺(DIEA)的作用下,脒基吡唑盐酸盐与苄氧羰酰氯以1∶1~1∶1.3的摩尔比于室温反应0.5~1.5小时,反应完全后减压浓缩除去溶剂,用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度为3~8%的柠檬酸、饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩;粗产物用乙酸乙酯/石油醚(1∶4,v/v)结晶得白色晶体——单苄氧羰酰脒基吡唑。
所述二氯甲烷(DCM)与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液中,二者的体积比为1∶0.5~1∶1.5;三乙胺(Et3N)或二异丙基乙胺(DIEA)的用量为脒基吡唑盐酸盐的1.5~3倍。
(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成
以四氢呋喃(THF)为溶剂,在氩气保护下,将单苄氧羰酰脒基吡唑与氢化钠(NaH)以1∶3~1∶5的摩尔比于0~5℃反应20~40分钟,再加单苄氧羰酰脒基吡唑摩尔量1.5~2.5倍的苄氧羰酰氯,于室温反6~10小时;反应完全后,用0~5℃冰水淬灭反应,反应完全后减压浓缩除去四氢呋喃,用乙酸乙酯萃取,再依次用质量浓度为3~8%的柠檬酸、饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,粗产物依次用乙酸乙酯、***、正己烷结晶,得白色晶体——双苄氧羰酰脒基吡唑。
(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成
以无水甲醇为溶剂,在钯碳催化剂和持续通氢气的作用下,将Cbz-Tyr-D-Ala-OH于室温反2~4小时,抽滤,除去钯碳,减压抽去甲醇,得到油状物,即为脱保护二肽——Tyr-D-Ala-OH。
将双苄氧羰酰脒基吡唑与脱保护二肽Tyr-D-Ala-OH以1∶1~1∶1.3的摩尔比溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,加入双苄氧羰酰脒基吡唑摩尔量2~5倍的三乙胺,室温反应48~72小时;反应完全后,用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和NaCl水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸=50∶85∶2,v/v),得无色油状化合物——Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH。
所述钯碳催化剂的含钯量为10~40%;钯碳的用量为Cbz-Tyr-D-Ala-OH质量的20~40%。
所述Cbz-Tyr-D-Ala-OH的合成如下:
将Cbz-Tyr-OH与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)以1∶1~1∶1.3的摩尔比溶于无水四氢呋喃或二氯甲烷中,于0~5℃下搅拌15-20分钟后,加入摩尔量为Cbz-Tyr-OH 1~1.2倍的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC),反应5~15分钟,室温下搅拌反应6~10小时,过滤,除去反应生成的环二己基脲(DCU),得到化合物Cbz-Tyr-OSU活化酯的四氢呋喃(THF)溶液;将摩尔量为Cbz-Tyr-OH1.1~1.3倍的D-丙氨酸(D-AIa)溶于2mol/L的NaOH水溶液,调节PH值至9~10,于0~5℃下加入到上述化合物Cbz-Tyr-OSU的四氢呋喃(THF)溶液中,先在0~5℃下反应20~40分钟后,再于室温反应6~10小时;反应完全后,减压浓缩、过滤除去THF,用乙酸乙酯溶解,再依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯∶石油醚=2∶1,(v/v)),既得Cbz-Tyr-D-Ala-OH。
(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或
Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2的合成
将Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与N-羟基琥珀酰亚胺以1∶1~1∶1.3的摩尔比溶于四氢呋喃(THF)或二氯甲烷(DCM)中,于0~5℃下反应10~20分钟;再加入Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH摩尔量1~1.2倍的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC),于0~5℃下反应20~40分钟,然后于室温搅拌反应6~10小时,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的活化酯溶液,即Cbz2GUPy-Tyr-D-AIa-OSU溶液;
将Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH摩尔量1.1~1.3倍的Boc-Gly-Phe(4-R)-NH2或Boc-Gly-Trp-NH2用乙酸乙酯溶解,在0~5℃下加入乙酸乙酯体积0.2~0.5倍的浓盐酸,反应20~40分钟后,室温下反应1.5~2小时;然后用碱液调Ph至9~10,得脱保护二肽溶液,即Gly-Phe(4-R)-NH2或Gly-Trp-NH2溶液;
将上述Cbz2GUPy-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe(4-R)-NH2或Gly-Trp-NH2溶液中,于0~5℃下反应20~40分钟后,再于常温反应6~10小时;反应完全后,减压浓缩除去四氢呋喃,用乙酸乙酯溶解,再依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇=2∶1∶0.2,v/v),得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2。
所述Boc-GIy-Phe(4-R)-NH2或者Boc-GIy-Trp-NH2的合成如下:
在0~5℃下,将Boc-Gly-OH与HOSU以1∶1~1∶1.3的摩尔比溶于四氢呋喃(THF)或二氯甲烷(DCM)中,加入Boc-Gly-OH摩尔量为1.1~1.3倍量的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC),先在0~5℃下反应20~40分钟后,再于室温搅拌反应6~10小时,得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液,即Boc-Gly-OSU溶液;
将Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH与苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)以1∶1~1∶1.3的摩尔比溶于N,N-二甲基甲酰胺中,加入Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH摩尔量1~1.2倍的1-羟基苯并三氮唑(HOBT);再加入Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH摩尔量1.5~3倍的二异丙基乙胺(DIEA),于室温反应10~30分钟;然后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)体积2~5倍的浓氨水,搅拌反应6~10小时;反应完全后抽去氨水,再用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度3~8%的柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,得白色固体;用PE∶EA=5∶1结晶得白色固体,即为Boc-Phe(4-R)-NH2或Boc-Trp-NH2;
将Boc-Phe(4-R)-NH2或Boc-Trp-NH2溶解于乙酸乙酯中,在0~5℃下加入乙酸乙酯体积0.2~0.5倍的浓盐酸,反应1~2小时;再用碱液调Ph至9-10,得脱保护氨基酸Phe(4-R)-NH2或者Trp-NH2溶液;
在0~5℃,将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-R)-NH2或者Trp-NH2溶液,反应20~40分钟;再于室温反应6~10小时;反应完全后,减压浓缩除去四氢呋喃(THF),再加乙酸乙酯溶解残留物,依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(石油醚(PE)∶乙酸乙酯(EA)=1∶2。),得Boc-GIy-Phe(4-R)-NH2或Boc-GIy-Trp-NH2。
(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2的合成
将Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2溶于无水甲醇中,加入钯碳催化剂,通氢气搅拌反应1~2小时,真空抽滤除钯碳,减压浓缩滤液,柱层析分离(乙酸乙酯∶甲醇∶氨水=45∶20∶8(v/v)),得白色固体化合物,既为目标产物脱保护四肽N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-R)-NH2或N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2。
其合成路线如下:
本发明采用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)/DCC(环己基羰二亚胺)活化酯法接肽,N端二肽和C端二肽可以同时合成,然后将两端合成好的片段对接,这样合成类似物可以简化合成线路,节约时间,我们将这种方法简称“2+2法”。此外,采用HOSu/DCC活化酯法具有成本低,不易消旋,产率高,易纯化等特点。
本发明制备的中间产物以及终产物都经过质谱检测,证明得到的产品的结构与结构式一致。
内***肽-1具有极高的μ阿片受体亲和力是其发展为阿片镇痛药物的基础;而极低的酶解稳定性和不能通过血脑屏障(外周给药不能产生镇痛作用)则是限制其成为镇痛药物的主要原因。在体内,降解内***肽的主要酶是DPPⅣ,此酶的识别位点为Pro2,所以提高内***肽的酶解稳定性最有效的改造就是替换或改造二位的Pro。同时,二位的Pro对内***肽保持其活性构象起着非常重要的作用。采用D-Ala替换Pro提高酶解稳定性,同时保持或提高其μ阿片受体亲和力。由于提高药物的整体脂溶性可以提高药物的血脑屏障的通透能力,所以应用C末端的氯化或氟化修饰来提高类似物的整体脂溶性,从而提高血脑屏障的通透能力。此外,对类似物采用了N端胍基化修饰,脑毛细血管内壁带有负电荷,因此使肽类物质带上正电荷可提高其血脑屏障通透性,胍基化修饰可提高多肽的膜渗透性和酶解稳定性等药理活性。同时,我们还通过计算机辅助模拟设计分析出未引入胍基时Trp3的吲哚基处于受体一个π-π相互作用区域中,增加了配体亲和力。而引入胍基后,受主链变化影响,Trp3的吲哚基偏离了原有π-π相互作用区域,这样不但没有形成π-π相互作用来增加亲和,反而使吲哚基对配体受体的结合造成了空间位阻。因此,我们用Gly取代Trp3,消除吲哚基对配体受体结合造成的空间位阻。
(三)***肽-1类似物的药理学活性鉴定实验
本发明的类似物在镇痛方面的应用以生物活性鉴定实验说明。生物活性鉴定实验包括放射配体受体结合实验,离体生物活性功能鉴定实验,离体代谢稳定性实验,温浴甩尾镇痛实验和药物耐受实验。实验过程中类似物都被溶解于生理盐水中。
1.放射配体受体结合试验
1.1大鼠脑膜蛋白的制备
成年Wistar大鼠(250-300g)断头取出大脑,用冰冷的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)冲洗大脑三次,除去溢血后,用滤纸擦干,称重。加20倍体积的(v/w)Tris-HCl缓冲液,冰浴下,匀浆器匀浆。匀浆液在4℃下1000g离心10min后,上清液在4℃下20000g离心25min,除去上清液,加入原体积的Tris-HCl缓冲液,吹打使重新悬浮,再次在冰浴下匀浆。匀浆液先在37℃水浴孵育30min后,在4℃下20000g离心25min后,除去上清液,再加入原体积的Tris-HCl缓冲液混匀。使用考马斯亮蓝G-250法测定提取的脑膜蛋白含量。将匀浆液分批放在细胞冻存管里,-80℃下保存待用。
1.2受体结合试验
取-80℃保存脑膜蛋白,37℃水浴1min快速解冻。实验分为总结合管,竞争结合管和非特异性结合管。每个反应管中依次加入放射配体,纳洛酮(Naloxone,Nx)/非放射性药物,Tris-HCl(含PMSF和Captoril)和膜蛋白(300-500μg/ml)。其中,在总结合管中,只加入[3H]DAMGO(0.5nM)和固定的膜蛋白(300-500μg/ml),在非特异性结合管和竞争结合管中,分别另加入10μM Nx和不同浓度的类似物,最后补充Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)至总体积0.5ml。振荡器混匀反应液。37℃摇床反应时间为1h,取出离心管,反应液经ZT-II型细胞收集器收集,GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后,取出滤膜,放入24孔板中,每孔加入0.7ml闪烁液,封盖膜封盖。隔夜用β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。计算类似物对特异性结合的抑制率,以浓度的负对数为横坐标,抑制率为纵坐标,线性回归求得IC50值,根据公式Ki=IC50/(1+[L]/KD)计算Ki值。每个实验数据为分别平行做3组实验求平均值。
1.3实验结果
EM-1及其类似物的μ阿片受体解离常数Ki值见表2。
表2.EM-1及其类似物的μ阿片受体解离常数Ki值
表2的结果表明,类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1的μ阿片受体亲和解离常数为母体EM-1的12.7%,5.78%,6.78%和6.78%,可见其亲和活性都比母体EM-1提高了十倍以上。可见N端胍基化和二位、三位的替换使类似物的结构更易于与μ阿片受体结合。
2.离体生物活性功能鉴定
2.1 GPI试验
豚鼠250-300g,雌雄不限,实验前禁食12h,饮水不限。棒击枕部处死,剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段,浸入持续通入95%O2和5%CO2混合气的Krebs液(g/L:NaCl 6.9,CaCl2 0.28,KCl 0.35,KH2PO4 0.16,MgSO4·7H2O 0.30,NaHCO3 2.1,苯海拉明50×10-6,氯化胆碱2.8×10-3,葡萄糖1.98)中,湿润后套在一根玻璃棒上,沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离,然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上,另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上,制备好后立即放入盛有持续通入气体(95%O2和5%CO2)的Krebs液、恒温37±0.2℃的玻璃浴管中,预负荷500mg。前30min每5min换一次营养液,以后每15min换液一次,平衡2h后开始实验。给予电刺激,刺激参数:波宽0.3-0.5ms,频率6次·min-1,负载电压50V。记录基础收缩强度,再给予适量***鉴定其活性;然后分别给予不同剂量的待试药物,记录收缩强度,计算抑制百分率。每次药物作用后,用营养液冲洗5次,平衡15min。每个实验数据为分别平行做6-8组实验求平均值。
2.2实验结果
EM-1及其类似物GPI实验的IC50值见表3。
表3.EM-1及其类似物GPI实验的IC50值。
表3的实验数据显示,类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1的IC50值为母体EM-1的80%,61%,可见类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1的离体激动活性高于母体;而类似物[GAGD]-EM-1的IC50值要比母体的高,可见类似物[GAGD]-EM-1的离体激动活性要低于母体。这说明C-末端苯丙氨酸的修饰有助于提高类似物的激动活性。[GAGS]-EM-1的离体激动活性略低于母体。
3.离体酶解稳定性实验
3.1.血浆/脑质膜标本制备
3.1.1100%血浆标本制备
向离心管加入2mg/ml的浓度的肝素钠溶液,烘干待用;30-35g成年雄性小白鼠,用***麻醉,取眼球取血到处理的离心管中,轻微振荡,4℃2000g离心20min。收集上清液,-80℃冻存待用。
3.1.215%小鼠脑质膜标本制备
取30-35g成年雄性小鼠,颈椎脱臼处死,取大脑(去除小脑及脑桥),滤纸吸干,称重。用冰冷的1mM的Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)冲洗几次,除去溢血。加入50倍体积(v/w)的冰冷1mM Tris-HCl(pH=7.4)缓冲液,0℃下,用匀浆器使之成胞浆匀浆。匀浆液置于冰浴中放置30分钟以促进细胞溶解。然后按每1ml匀浆液补加0.5ml 50mM冰冷的Tris-HCl,再次匀浆,吹打悬浮。49000g离心45min,弃上清,沉淀重新悬浮于50倍体积的冰冷50mM Tris-HCl中,吹打悬浮。49000g再次离心45min,弃上清,沉淀悬浮于适当体积的50mM Tris-HCl中,使脑膜蛋白浓度约为2mg/ml。振荡器震荡涡旋混匀,分装,-80℃冻存。
3.2血浆/脑质膜孵育试验
取10μl多肽母液(10-2M),加入到190μl血浆或脑质膜中,立即振荡混匀,然后迅速取出20μl混合液,加入离心管中计时为0min,余者于37℃下继续孵育,并分别在5min,10min,15min,30min,60min,120min,240min,300min,360min,420min取出20μl。酶解过程的终止:于取出的样品中加入90μl乙腈振荡混匀,样品置于冰上放置5分钟,再用90μl 0.5%的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13000g离心15min,收集上清,-80℃冻存,直至RP-HPLC分析。
3.3反相-高效液相色谱(reversed-phase high performance liquidchromatography,RP-HPLC)分析
运用RP-HPLC分析各个时间点的离体稳定性样品。RP-HPLC***由WatersDelta 600控制器,紫外监测器和Waters Delta Pak C18柱(3.9mm×150mm)组成。血浆样品用波长280nm检测,流动相流速0.6ml/min,流动相=乙腈含0.05%TFA(A)+水含0.05%TFA(B)。流动相A∶B=30∶70→70∶30,洗脱时间0-30min;A∶B=70∶30→30∶70;洗脱时间30-35min。脑膜样品用波长280nm检测,流动相流速0.6ml/min,流动相=乙腈含0.05%TFA(A)+水含0.05%TFA(B)。流动相A∶B=5∶95→95∶5,洗脱时间:0-30min;A∶B=95∶5→5∶95;洗脱时间30-35min。分别测定每个时间点样品药物浓度,并根据药物代谢公式以各个时间点的药物浓度和时间绘制药物变化曲线计算求得药物得半衰期。每个实验数据为分别平行做3组实验求平均值。
3.4实验结果
EM-1及其类似物的生物半衰期的实验数据见表4。
表4.EM-1及其类似物的生物半衰期
表4的实验数据显示,所有EM-1类似物在小鼠脑质膜和血浆半衰期都显著高于母体EM-1。其中,[GAGS]-EM-1在脑匀浆中的半衰期最长,约是母体的21倍;[GAGP]-EM-1的稳定性也很高,在脑匀浆中约是母体的16倍,在血浆中约是母体的38倍。可见,二位、三位用D-Ala-Gly替换和N端胍基化都显著增强了类似物的抗酶解能力。C-末端苯丙氨酸的修饰有助于提高血浆半衰期。
4.镇痛实验
4.1实验方法
采用小鼠温浴甩尾法。昆明系雄性小鼠,18-20g,环境温度:20℃,水浴温度:50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency,CL),将小鼠鼠尾的1/3浸入水浴,记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<2.5s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用,截止时间10s,以防止小鼠烫伤。侧脑室(i.c.v.)分别注射类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1,EM-1和***,注射体积4μl,类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1,EM-1和***分别用10只小鼠测定数据。给药后第5,10,15,20,30,40,60,70,80,90,100,110,120min各测一次甩尾潜伏期(test latency,TL);药物浓度有10nmol/kg,20nmol/kg。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect,%MPE)。皮下(s.c.)分别注射类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1,EM-1和***,注射浓度有10mg/kg,5mg/kg,注射体积为100μl,类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1,EM-1和***分别用10只小鼠测定数据。给药后测定5,10,15,20,30,40,60,70,80,90,100min的甩尾潜伏期。结果以最大镇痛效应百分率(maximum possible effect,%MPE)表示:%MPE=100×(TL-CL)/(10-CL),分别注射等体积的生理盐水都无镇痛活性产生。
4.2实验结果
图1显示了侧脑室注射类似物[GAGS]-EM-1,及母体EM-1产生的镇痛时效曲线图。[GAGS]-EM-1的镇痛效果强于母体EM-1。
图2显示了侧脑室注射类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1及母体EM-1和***产生的镇痛时效曲线图。图2的结果显示,类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1均产生强效的镇痛作用,镇痛效力和镇痛持续时间都明显高于母体EM-1和***。
图3~图6显示了皮下注射类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1及母体EM-1和***产生的镇痛时效曲线图。图2的结果显示:其中10mg/kg EM-1最大镇痛活性仅有11.4%(见表5),基本无镇痛活性。而类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1都表现出了明显强于***的镇痛作用,而且作用时间都比***强。[GAGS]-EM-1的最大镇痛效应略低于***,但是作用时间比***长。
EM-1及其类似物分别在侧脑室注射和皮下注射后最大的镇痛效应的实验数据见表5。
表5.EM-1及其类似物分别在侧脑室注射和皮下注射后最大的镇痛活性
表5显示侧脑室注射10nmol/kg类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1最大镇痛活力就能达到100%,[GAGS]-EM-1最大镇痛活力能达到82%,20nmol/kg母体EM-1是51.1%,20nmol/kg***是44.3%。可见类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1,[GAGS]-EM-1最大镇痛活力明显高于母体EM-1和***。同时,表5也显示皮下注射5mg/kg类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1最大镇痛效应也都明显高于母体EM-1(10mg/kg)和***(5mg/kg)。
5.药物耐受实验
5.1实验方法
选取18-20g的雄性昆明系小鼠30只,分3组,每组10只,分别注射类似物5mg/Kg[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1和***,连续7天每天皮下注射一次,分别在给药后的1,3,5,7天测定镇痛活性,对比判断其镇痛活性降低情况。
5.2实验结果
图6为皮下注射[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1与***1-7天的耐受性柱图。从图6可以看出类似物[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1的镇痛活性降低程度明显小于***。
表6表示1-7天皮下注射***,[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值,数据如下:
表6.1-7天皮下注射***,[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值
表6显示出了第一天注射***的镇痛时效曲线下面积值为2460.1,而第3天,第5天,第7天的时效曲线下面积值分别为1296.2,1219.7,992.3,分别是第1天的52.6%,49.5%,40.3%。与第1天相比,从第三天开始就有显著性差异了。
第一天注射[GAGF]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值为3509.4,而第3天,第5天,第7天的值分别为2596.2,2716.9,2542.9,分别是第1天的73.9%,77.4%,72.4%。与第1天相比,数值没有明显的差异。
第一天注射[GAGD]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值为2828.2,而第3天,第5天,第7天的值分别为3100.5,2941.5,2262.3,分别是第1天的109.6%,104%,80%。与第1天相比,数值没有明显的差异。
可见皮下注射相同剂量的***,[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1能产生基本相同的镇痛效果,[GAGF]-EM-1的略高一点。但是***第三天就产生了明显的耐受。而[GAGF]-EM-1和[GAGD]-EM-1在连续给药7天的情况下几乎没有产生耐受。在第7天给药后依然能产生较强的镇痛效果,与第1天相比没有明显的降低。
上述实验结果表明:本发明的四个内***肽-1类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1的亲和活性明显高于母体;在离体酶解稳定性上也都明显高于母体EM-1;四个类似物在侧脑室和皮下给药的情况下,镇痛效果都高于***;特别是在皮下给药的情况下,四个类似物表现出了明显高于***的镇痛活性,并且作用时间明显比***长。与***相比,四个类似物无耐受现象的发生。总之,[GAGS]-EM-1的镇痛作用时间比***更长;其它三个内***肽-1类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1与***相比好处在于:镇痛效果更强,作用时间更长,其中[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1与***相比不易引起耐受性,主要体现在长期外周给药能够产生强效的无耐受现象的镇痛作用。因此,这四个类似物可以作为临床镇痛药物来开发。
附图说明
图1是侧脑室注射母体EM-1及内***肽-1类似物[GAGS]-EM-1的镇痛效应-时间曲线。
图2是侧脑室注射***,母体EM-1及内***肽-1类似物[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1的镇痛效应-时间曲线。
图3~图6是皮下注射***及内***肽-1类似物[GAGS]-EM-1,[GAGP]-EM-1,[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1的镇痛效应-时间曲线。
图7是皮下注射***及内***肽-1类似物[GAGF]-EM-1,[GAGD]-EM-1的1-7天的耐受性柱图。*表示与第一天的数值相比差异显著(T检验,*P<0.01;**P<0.001)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明内***肽-1类似物的合成方法作详细说明。
其合成路线如下:
实施例1:类似物[GAGS]-EM-1的合成
(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成
0.73g(5mmol)化合物脒基吡唑盐酸盐加入到等体积二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰氨(DMF)的混合液中,加入三乙胺(10mmol),冰浴下缓慢滴加845ul(6mmol)苄氧羰酰氯,冰浴反应30分钟,室温反应1.5小时。反应完全后,减压浓缩DCM,加大量乙酸乙酯溶解残留物,依次用5%的柠檬酸水溶液和饱和NaCl水溶液萃取三次,无水硫酸钠干燥,浓缩。粗产物用乙酸乙酯/石油醚(1∶4,v/v)结晶得到白色晶体单苄氧羰酰脒基吡唑1.127g。产率为92%。ESI-MS m/z=245[M+H]+。
(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成
0.61g(2.5mmol)化合物单苄氧羰酰脒基吡唑和0.24g(10mmol)NaH溶解于THF中,氩气保护,冰浴搅拌下,反应30min后,缓慢滴加5mmol苄氧羰酰氯(Cbz-Cl),冰浴下反应30min,室温反应6h。反应完全后,冰浴下冰水萃灭反应,减压浓缩THF,乙酸乙酯萃取水相三次,合并乙酸乙酯层,饱和NaCl洗涤三次,无水硫酸钠干燥,浓缩。粗产物用乙酸乙酯/***/正己烷结晶,得白色晶体Cbz2GUPy 0.616g。产率为65%。ESI-MS m/z=379[M+H]+。
(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成
1.39g(3.6mmol)化合物Cbz-Tyr-D-Ala-OH(苄氧羰酰保护的酪氨酸D-丙氨酸二肽)和0.28g的10%Pd/C在40ml无水甲醇中反应,持续通氢气搅拌反应2小时,抽滤,除去钯碳,减压抽去甲醇,得到脱保护二肽Tyr-D-Ala-OH,再加入1.134g(3mmol)化合物双苄氧羰酰脒基吡唑(Cbz2GUPy),并使二者溶解于3ml无水DMF中,加入5mmol三乙胺,室温反应48小时;反应完全后,用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度5%柠檬酸和饱和NaCl水溶液萃取,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸=50∶85∶2(v/v)),得无色油状化合物Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH。ESI-MS m/z=563[M+H]+。
其中,Cbz-Tyr-D-Ala-OH的合成如下:
将1.575g(5mmol)Cbz-Tyr-OH与0.633g(5.5mmol)HOSU溶于无水四氢呋喃或二氯甲烷中,于0~5℃下搅拌15分钟后,加入1.133g(5.5mmol)的DCC,反应30分钟,室温下搅拌反应8小时,过滤,除去反应生成的DCU(环二己基脲),得到化合物Cbz-Tyr-OH的活化酯溶液,即Cbz-Tyr-OSU溶液;将0.534g(6mmol)D-AIa(D型丙氨酸)溶于饱和碳酸氢钠水溶液,于0~5℃下搅拌10分钟后,加入到上述化合物Cbz-Tyr-OSU溶液中,先在0~5℃下反应30分钟后,再于室温反应9小时;反应完全后,减压浓缩除去溶剂、溶于乙酸乙酯,依次用5%的柠檬酸,饱和氯化钠萃取三次,并用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥。过滤,减压蒸发掉溶剂,硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚=2∶1,v/v),油泵减压得无色油状产物Cbz-Tyr-D-Ala-OH。ESI-Ms m/z=387[M+H]+。
(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2的合成
将0.562g(1mmol)的Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF中,于0~5℃下搅拌10分钟;再加入0.227g(1.1mmol)的DCC,0~5℃下搅拌20分钟,然后于室温搅拌反应6小时,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液。
将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Trp-NH2溶于2ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.5ml浓盐酸,反应30分钟;然后于室温下反应2小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得Gly-Trp-NH2;
搅拌下,将上述Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Trp-NH2溶液中,于0~5℃下反应30分钟,再于常温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,再依次用质量浓度5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(PE∶EA=1∶2(v/v)),得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2。ESI-Ms m/z=805[M+H]+。
上述Boc-GIy-Trp-NH2的合成如下:
将0.283g(1mmol)的Boc-Trp-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于5mlDMF中,之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT;再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA(二异丙基乙胺),反应溶液的颜色从无色变为淡黄色,最后变为红色;然后加入15ml的浓氨水,搅拌反应6小时;反应完全后抽去氨水,再用乙酸乙酯萃取,依次用质量浓度5%的柠檬酸、饱和NaHCO3,饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,得白色固体;用PE∶EA=5∶1结晶得到白色固体Boc-Trp-NH2;在0~5℃下,将Boc-Trp-NH2溶于1ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.2ml的浓盐酸,反应0.5小时;再于室温下反应1.5小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得到脱Boc保护Trp-NH2溶液;
在0~5℃下,将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF,加入0.227g(1.1mmol)的DCC,搅拌10分钟;再于室温搅拌反应6小时,得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液,即Boc-Gly-OSU溶液;
在0~5℃,将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Trp-NH2溶液中,反应0.5小时;再与室温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,依次用5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离,得Boc-GIy-Trp-NH2。柱层析的展开剂为PE∶EA=1∶2。
步骤(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2的合成
将0.10g Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2溶于20ml无水甲醇中,加入0.02g 10%钯碳,通氢气搅拌反应2小时,抽滤除去钯碳,减压除去甲醇,得到脱保护四肽;柱层析分离(开剂体系为EA∶PE=4∶1(v/v)),取Rf=1/4处的荧光带展,用甲醇溶解,抽滤,浓缩,即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Trp-NH2。ESI-Ms m/z=537[M+H]+。
实施例2:类似物[GAGP]-EM-1的合成
(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成
同实施例1步骤(1)
(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成
同实施例1步骤(2)
(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成
同实施例1步骤(3)
(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH2的合成
将0.562g(1mmol)的Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF中,于0~5℃下搅拌10分钟;再加入0.227g(1.1mmol)的DCC,0~5℃下搅拌20分钟,然后于室温搅拌反应6小时,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液。
将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Phe(4-Cl)-NH2溶于2ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.5ml浓盐酸,反应30分钟;然后于室温下反应2小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得Gly-Phe(4-Cl)-NH2;
搅拌下,将上述Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe(4-Cl)-NH2溶液中,于0~5℃下反应30分钟,再于常温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,再依次用质量浓度5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(PE∶EA=1∶2v/v),得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH2。ESI-Ms m/z=800[M+H]+。
上述Boc-GIy-Phe(4-Cl)-NH2的合成如下:
将0.283g(1mmol)的Boc-Phe(4-Cl)-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于5mlDMF中,之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT;再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA(二异丙基乙胺),反应溶液的颜色从无色变为淡黄色,最后变为红色;然后加入15ml的浓氨水,搅拌反应6小时;反应完全后抽去氨水,再用乙酸乙酯萃取,依次用质量浓度5%的柠檬酸、饱和NaHCO3,饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,得白色固体;用PE∶EA=5∶1结晶得到白色固体Boc-Phe(4-Cl)-NH2;在0~5℃下,将Boc-Phe(4-Cl)-NH2溶于1ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.2ml的浓盐酸,反应0.5小时;再于室温下反应1.5小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得到脱Boc保护Phe(4-Cl)-NH2溶液;
在0~5℃下,将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF,加入0.227g(1.1mmol)的DCC,搅拌10分钟;再于室温搅拌反应6小时,得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液,即Boc-Gly-OSU溶液;
在0~5℃,将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-Cl)-NH2溶液中,反应0.5小时;再与室温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,依次用5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(PE∶EA=1∶2),得Boc-GIy-Phe(4-Cl)-NH2。
(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH2的合成
将0.10g Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-Cl)-NH2溶于20ml无水甲醇中,加入0.02g 10%钯碳,通氢气搅拌反应2小时,抽滤除去钯碳,减压除去甲醇,得到脱保护四肽;柱层析分离(开剂体系为EA∶PE=4∶1),取Rf=1/4处的荧光带展,用甲醇溶解,抽滤,浓缩,即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-PhePhe(4-Cl)-NH2。ESI-Ms m/z=532[M+H]+。
实施例3:类似物[GAGF]-EM-1的合成
(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成
同实施例1步骤(1)
(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成
同实施例1步骤(2)
(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成
同实施例1步骤(3)
(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH2的合成
将0.562g(1mmol)的Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF中,于0~5℃下搅拌10分钟;再加入0.227g(1.1mmol)的DCC,0~5℃下搅拌20分钟,然后于室温搅拌反应6小时,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液。
将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Phe(4-F)-NH2溶于2ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.5ml浓盐酸,反应30分钟;然后于室温下反应2小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得Gly-Phe(4-F)-NH2;
搅拌下,将上述Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe(4-F)-NH2溶液中,于0~5℃下反应30分钟,再于常温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,再依次用质量浓度5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(PE∶EA=1∶2),得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH2。ESI-Ms m/z=784[M+H]+。
上述Boc-GIy-Phe(4-F)-NH2的合成如下:
将0.283g(1mmol)的Boc-Phe(4-F)-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于5mlDMF中,之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT;再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA(二异丙基乙胺),反应溶液的颜色从无色变为淡黄色,最后变为红色;然后加入15ml的浓氨水,搅拌反应6小时;反应完全后抽去氨水,再用乙酸乙酯萃取,依次用质量浓度5%的柠檬酸、饱和NaHCO3,饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,得白色固体;用PE∶EA=5∶1结晶得到白色固体Boc-Phe(4-F)-NH2;在0~5℃下,将Boc-Phe(4-F)-NH2溶于1ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.2ml的浓盐酸,反应0.5小时;再于室温下反应1.5小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得到脱Boc保护Phe(4-F)-NH2溶液;
在0~5℃下,将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF,加入0.227g(1.1mmol)的DCC,搅拌10分钟;再于室温搅拌反应6小时,得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液,即Boc-Gly-OSU溶液;
在0~5℃,将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-F)-NH2溶液中,反应0.5小时;再与室温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,依次用5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离,得Boc-GIy-Phe(4-F)-NH2。柱层析的展开剂为PE∶EA=1∶2。
(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH2的合成
将0.10g Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH2溶于20ml无水甲醇中,加入0.02g 10%钯碳,通氢气搅拌反应2小时,抽滤除去钯碳,减压除去甲醇,得到脱保护四肽;柱层析分离(EA∶PE=4∶1),取Rf=1/4处的荧光带展,用甲醇溶解,抽滤,浓缩,即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH2。ESI-Msm/z=516[M+H]+。
实施例4:类似物[GAGD]-EM-1的合成
(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成
同实施例1步骤(1)
(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成
同实施例1步骤(2)
(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成
同实施例1步骤(3)
(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH2的合成
将0.562g(1mmol)的Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF中,于0~5℃下搅拌10分钟;再加入0.227g(1.1mmol)的DCC,0~5℃下搅拌20分钟,然后于室温搅拌反应6小时,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OH的活化酯溶液即Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液。
将0.374g(1.1mmol)的Boc-Gly-Phe-NH2溶于2ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.5ml浓盐酸,反应30分钟;然后于室温下反应2小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得Gly-Phe-NH2;
搅拌下,将上述Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-OSU溶液加入到Gly-Phe-NH2溶液中,于0~5℃下反应30分钟,再于常温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,再依次用质量浓度5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(PE∶EA=1∶2),得Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH2。ESI-Ms m/z=766[M+H]+。
上述Boc-GIy-Phe-NH2的合成如下:
将0.283g(1mmol)的Boc-Phe-OH与0.417g(1.1mmol)HBTU溶解于5mlDMF中,之后加入0.179g(1.1mmol)的HOBT;再缓慢滴加329ul(2mmol)DIEA(二异丙基乙胺),反应溶液的颜色从无色变为淡黄色,最后变为红色;然后加入15ml的浓氨水,搅拌反应6小时;反应完全后抽去氨水,再用乙酸乙酯萃取,依次用质量浓度5%的柠檬酸、饱和NaHCO3,饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,得白色固体;用PE∶EA=5∶1结晶得到白色固体Boc-Phe-NH2;在0~5℃下,将Boc-Phe-NH2溶于1ml乙酸乙酯中,在0~5℃下加入0.2ml的浓盐酸,反应0.5小时;再于室温下反应1.5小时,减压浓缩乙酸乙酯,2N氢氧化钠调节残留物pH至8~9,得到脱Boc保护Phe-NH2溶液;
在0~5℃下,将0.175g(1mmol)的Boc-Gly-OH与0.126g(1.1mmol)的HOSU溶于THF,加入0.227g(1.1mmol)的DCC,搅拌10分钟;再于室温搅拌反应6小时,得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液,即Boc-Gly-OSU溶液;
在0~5℃,将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe-NH2溶液中,反应0.5小时;再与室温反应6小时;反应完全后,减压浓缩除去THF,用乙酸乙酯萃取,依次用5%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离(PE∶EA=1∶2),得Boc-GIy-Phe-NH2。
(5)N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH2的合成
将0.10g Cbz2-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe(4-F)-NH2溶于20ml无水甲醇中,加入0.02g 10%钯碳,通氢气搅拌反应2小时,抽滤除去钯碳,减压除去甲醇,得到脱保护四肽;柱层析分离(开剂体系为EA∶PE=4∶1),取Rf=1/4处的荧光带展,用甲醇溶解,抽滤,浓缩,即得目标产品N-Amidino-Tyr-D-AIa-GIy-Phe-NH2。ESI-Ms m/z=498[M+H]+。
Claims (8)
2.如权利要求1所述内***肽-1类似物的合成方法,包括以下工艺步骤:
(1)单苄氧羰酰脒基吡唑的合成
以二氯甲烷与N, N-二甲基甲酰胺的混合液为溶剂,在三乙胺或二异丙基乙胺的作用下,脒基吡唑盐酸盐与苄氧羰酰氯以1:1~1:1.3的摩尔比于室温反应0.5~1.5小时,反应完全后减压浓缩除去溶剂,用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度为3~8%的柠檬酸、饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩;粗产物用乙酸乙酯与石油醚的混合液结晶,得白色晶体——单苄氧羰酰脒基吡唑;所述乙酸乙酯与石油醚的混合液中二者的体积比为1:4;
所述三乙胺或二异丙基乙胺的用量为脒基吡唑盐酸盐摩尔量的1.5~3倍;
(2)双苄氧羰酰脒基吡唑的合成
以四氢呋喃为溶剂,在氩气保护下,将单苄氧羰酰脒基吡唑与氢化钠以1:3~1:5的摩尔比于0~5℃反应20~40分钟,再加单苄氧羰酰脒基吡唑摩尔量1.5~2.5倍的苄氧羰酰氯,于室温反应6~10小时;反应完全后,用0~5℃冰水淬灭反应,反应完全后减压浓缩除去四氢呋喃,用乙酸乙酯萃取,再依次用质量浓度为3~8%的柠檬酸、饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,粗产物依次用乙酸乙酯、***、正己烷结晶,得白色晶体——双苄氧羰酰脒基吡唑;
(3)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的合成
以无水甲醇为溶剂,在钯碳催化剂和持续通氢气的作用下,将Cbz-Tyr-D-Ala-OH于室温反应2~4小时,抽滤,除去钯碳,减压抽去甲醇,得到油状物,即为脱保护二肽——Tyr-D-Ala-OH;
将双苄氧羰酰脒基吡唑与脱保护二肽Tyr-D-Ala-OH以1:1~1:1.3的摩尔比溶解于无水N, N-二甲基甲酰胺中,加入双苄氧羰酰脒基吡唑摩尔量2~5倍的三乙胺,室温反应48~72小时;反应完全后,用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和NaCl水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得无色油状化合物——Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH;
(4)Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(4-R)-NH2 或Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-NH2的合成
将Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH与N-羟基琥珀酰亚胺以1:1~1:1.3的摩尔比溶于四氢呋喃或二氯甲烷中,于0~5℃下反应10~20分钟;再加入Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH摩尔量 1~1.2倍的N,N’-二环己基碳二亚胺,于0~5℃下反应20~40分钟,然后于室温搅拌反应6~10小时,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH的活化酯溶液,即Cbz2GUPy-Tyr-D-Ala-OSU溶液;
将Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-OH摩尔量1.1~1.3倍的Boc-Gly-Phe(4-R)-NH2 或Boc-Gly-Trp-NH2用乙酸乙酯溶解,在0~5℃下加入乙酸乙酯体积0.2~0.5倍的浓盐酸,反应20~40分钟后,室温下反应1.5~2小时;然后用碱液调pH至9~10,得脱保护二肽溶液,即Gly- Phe(4-R)-NH2或Gly-Trp-NH2溶液;
将上述Cbz2GUPy-Tyr-D-Ala-OSU溶液加入到Gly-Phe(4-R)-NH2或Gly-Trp-NH2溶液中,于0~5℃下反应20~40分钟后,再于常温反应6~10小时;反应完全后,减压浓缩除去四氢呋喃,用乙酸乙酯溶解,再依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析分离,得Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(4-R)-NH2或Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-NH2;
(5)N-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(4-R)-NH2或N -Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-NH2的合成
将Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(4-R)-NH2或Cbz2-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-NH2溶于无水甲醇中,加入钯碳催化剂,通氢气搅拌反应1~2小时,真空抽滤除钯碳,减压浓缩滤液,柱层析分离,得白色固体化合物,即为目标产物脱保护四肽N-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(4-R)-NH2或N -Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-NH2。
3.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(1)所述二氯甲烷与二甲基甲酰胺的混合液溶中,二氯甲烷与二甲基甲酰胺的体积比为1:0.5~1:1.5。
4.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(3)所述钯碳催化剂的含钯量为10~40%;钯碳的用量为Cbz-Tyr-D-Ala-OH质量的20~40%。
5.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(3)所述硅胶柱层析纯化采用的展开剂:石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸的体积比为50: 85:2。
6.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(4)所述硅胶柱层析分离采用的展开剂为:乙酸乙酯、石油醚、甲醇的体积比为2: 1:0.2。
7.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(5)所述柱层析分离采用的展开剂:乙酸乙酯、甲醇、氨水的体积比为45:20: 8。
8.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(3)所述Cbz-Tyr-D-Ala-OH的合成如下:
将Cbz-Tyr-OH与N-羟基琥珀酰亚胺以1:1~1:1.3的摩尔比溶于无水四氢呋喃或二氯甲烷中,于0~5℃下搅拌15-20分钟后,加入Cbz-Tyr-OH 摩尔量1~1.2倍的N,N’-二环己基碳二亚胺,反应5~15分钟,室温下搅拌反应6~10小时,过滤,除去反应生成的环二己基脲,得到化合物Cbz-Tyr-OSU的四氢呋喃溶液;将Cbz-Tyr-OH摩尔量 1.1~1.3倍的D-丙氨酸溶于2mol/L的NaOH水溶液,调节pH值至9~10,于0~5℃下加入到上述化合物Cbz-Tyr-OSU的四氢呋喃溶液中,先在0~5℃下反应20~40分钟后,再于室温反应6~10小时;反应完全后,减压浓缩、过滤除去四氢呋喃,用乙酸乙酯溶解,再依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,即得Cbz-Tyr-D-Ala-OH;所述硅胶柱层析分离采用的展开剂:乙酸乙酯、石油醚的体积比为2: 1。
9.如权利要求2所述内***肽-1类似物的合成方法,其特征在于:步骤(4)所述Boc-Gly- Phe(4-R)-NH2或者Boc-Gly-Trp- NH2的合成如下:
在0~5℃下,将Boc-Gly-OH与N-羟基琥珀酰亚胺以1:1~1:1.3的摩尔比溶于四氢呋喃或二氯甲烷中,加入Boc-Gly-OH摩尔量为 1.1~1.3倍量的N,N’-二环己基碳二亚胺,先在0~5℃下反应20~40分钟后,再于室温搅拌反应6~10小时,得化合物Boc-Gly-OH的活化酯溶液,即Boc-Gly-OSU溶液;
将Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH与苯并三氮唑-N,N, N′, N′-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1~1:1.3的摩尔比溶于N, N-二甲基甲酰胺中,加入Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH 摩尔量1~1.2倍的1-羟基苯并三氮唑;再加入Boc-Phe(4-R)-OH或Boc-Trp-OH摩尔量1.5~3倍的二异丙基乙胺,于室温反应10~30分钟;然后加入N, N-二甲基甲酰胺体积2~5倍的浓氨水,搅拌反应6~10小时;反应完全后抽去氨水,再用乙酸乙酯溶解,依次用质量浓度3~8%的柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和氯化钠洗涤,无水硫酸钠干燥,得白色固体;用石油醚:乙酸乙酯=5:1结晶得白色固体,即为Boc-Phe(4-R)-NH2或Boc-Trp- NH2;
将Boc-Phe(4-R)-NH2或Boc-Trp-NH2溶解于乙酸乙酯中,在0~5℃下加入乙酸乙酯体积0.2~0.5倍的浓盐酸,反应1~2小时;再用碱液调pH至9-10,得脱保护氨基酸Phe(4-R)-NH2或者Trp-NH2溶液;
在0~5℃,将Boc-Gly-OSU溶液加入到上述Phe(4-R)-NH2或者Trp-NH2溶液,反应20~40分钟;再于室温反应6~10小时;反应完全后,减压浓缩除去四氢呋喃,用乙酸乙酯萃取,依次用质量浓度3~8%柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析分离,得Boc-Gly-Phe(4-R)-NH2或Boc-Gly-Trp-NH2;所述柱层析的展开剂为石油醚:乙酸乙酯=1:2。
10.如权利要求1所述内***肽-1类似物用于制备镇痛药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110089179 CN102241737B (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 内***肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110089179 CN102241737B (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 内***肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102241737A CN102241737A (zh) | 2011-11-16 |
CN102241737B true CN102241737B (zh) | 2013-07-03 |
Family
ID=44960007
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110089179 Active CN102241737B (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 内***肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102241737B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111363012A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-03 | 兰州大学 | 具有强的酶解稳定性和镇痛活性的环状内***肽-1类似物及其应用 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102558297B (zh) * | 2011-12-31 | 2013-07-17 | 兰州大学 | α-烯基-β-氨基酸修饰的内***肽-1类似物及其合成和应用 |
CN102659920A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-09-12 | 兰州大学 | C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内***肽-1类似物及其制备和应用 |
CN103214552B (zh) * | 2012-10-31 | 2015-01-21 | 兰州大学 | 多位点修饰的内***肽-1类似物的合成和应用 |
JP6364025B2 (ja) * | 2013-01-15 | 2018-07-25 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | 骨関節炎を処置するためのアシルグアニジン |
CN104650182A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-05-27 | 哈尔滨工业大学 | 偶联寡聚精氨酸及2位取代的内***肽-1类似物及其合成方法和应用 |
CN105131084B (zh) * | 2015-09-25 | 2018-05-01 | 兰州大学 | 基于内***肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用 |
CN110194785B (zh) | 2016-04-21 | 2023-02-24 | 上海天慈生命科学发展有限公司 | 一种阿片和神经肽ff受体的多靶点肽类分子及其制备和应用 |
CN108101978B (zh) * | 2017-12-18 | 2018-12-11 | 哈尔滨工业大学 | C-末端芳香酯化修饰的内***肽-1类似物及其合成方法和应用 |
CN110776555B (zh) * | 2019-11-28 | 2023-10-13 | 王锐 | 一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 |
CN113929734B (zh) * | 2021-09-22 | 2023-09-05 | 湖北泓肽生物科技有限公司 | 二肽-2的合成方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1754890A (zh) * | 2004-09-30 | 2006-04-05 | 兰州大学 | C末端修饰的内***肽1,内***肽2 |
CN101134774A (zh) * | 2006-08-31 | 2008-03-05 | 兰州大学 | 组合化学修饰的内***肽-1及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007112492A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-11 | The University Of Queensland | Compounds and methods for the treatment of pain |
-
2011
- 2011-04-06 CN CN 201110089179 patent/CN102241737B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1754890A (zh) * | 2004-09-30 | 2006-04-05 | 兰州大学 | C末端修饰的内***肽1,内***肽2 |
CN101134774A (zh) * | 2006-08-31 | 2008-03-05 | 兰州大学 | 组合化学修饰的内***肽-1及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Chang-lin Wang et al..Synthesis and antinociceptive effects of endomorphin-1 analogswith C-terminal linked by oligoarginine.《Peptides》.2010,第32卷293-299. |
Differential cardiovascular effects of synthetic peptides derived from endomorphin-1 in anesthetized rats;Hongmei Liu et al.;《peptides》;20080203;第29卷;1048-1056 * |
Hongmei Liu et al..Differential cardiovascular effects of synthetic peptides derived from endomorphin-1 in anesthetized rats.《peptides》.2008,第29卷1048-1056. |
Synthesis and antinociceptive effects of endomorphin-1 analogswith C-terminal linked by oligoarginine;Chang-lin Wang et al.;《Peptides》;20101103;第32卷;293-299 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111363012A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-03 | 兰州大学 | 具有强的酶解稳定性和镇痛活性的环状内***肽-1类似物及其应用 |
CN111363012B (zh) * | 2020-03-30 | 2023-05-09 | 兰州大学 | 具有酶解稳定性和镇痛活性的环状内***肽-1类似物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102241737A (zh) | 2011-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102241737B (zh) | 内***肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 | |
CN104812772A (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
CN103068841A (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
CN101456911A (zh) | ***模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途 | |
CN101134774B (zh) | 组合化学修饰的内***肽-1及其制备方法 | |
CN110194785A (zh) | 一种阿片和神经肽ff受体的多靶点肽类分子及其制备和应用 | |
JPH06501950A (ja) | 環状ペプチド、その調製法およびその薬理組成物としての使用 | |
CN102234315B (zh) | 一种修饰内***肽-1化合物及其在镇痛方面的应用 | |
CN104710508B (zh) | 基于内***肽2和npff受体拮抗剂rf9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用 | |
CN106967151A (zh) | 多位点组合修饰的内***肽类似物及其合成和应用 | |
CN104650182A (zh) | 偶联寡聚精氨酸及2位取代的内***肽-1类似物及其合成方法和应用 | |
CN109232743A (zh) | 一类长效化降糖减重肽、其制备方法及其作为药物的用途 | |
CN104877005A (zh) | 非天然氨基酸修饰的内***肽-1类似物及其合成和应用 | |
CN103012596B (zh) | 具有血脑屏障通透性的内***肽衍生肽及其合成和应用 | |
CN102659920A (zh) | C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内***肽-1类似物及其制备和应用 | |
CN103214552B (zh) | 多位点修饰的内***肽-1类似物的合成和应用 | |
CN107987126B (zh) | 4位苯丙酰胺羟基化修饰的内***肽类似物及其合成方法和应用 | |
CN102558297B (zh) | α-烯基-β-氨基酸修饰的内***肽-1类似物及其合成和应用 | |
CN107964047B (zh) | 基于内***肽-1和神经降压素(8-13)的嵌合肽及其合成方法和应用 | |
CN100378126C (zh) | C末端修饰的内***肽1 | |
WO2022188628A1 (zh) | 一类阿片/神经肽ff受体多靶点环肽分子及其制备和应用 | |
CN109232748B (zh) | 多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用 | |
CN101139383B (zh) | C末端修饰的内***肽2 | |
CN108976287A (zh) | 一类阿片和神经肽ff受体多靶点分子bn-9的二硫键环化类似物及其制备方法与应用 | |
CN109721653A (zh) | 一种胰高血糖素样肽-1片段类似物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |