CN107942065B - 一种检测降钙素的试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种检测降钙素的试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测降钙素的试剂盒,该试剂盒包含试剂R1、试剂R2,其中试剂R1中包含0.5‑24μg/mL包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体,试剂R2中包含0.05‑10μg/mL标记的抗人降钙素抗体,本发明还提供该试剂盒的检测方法。本发明的试剂盒灵敏度高、线性范围宽、有效的避免了PCT的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析领域,特别是涉及一种检测降钙素的试剂盒及检测方法。
背景技术
降钙素原(procalcitionin,PCT)是一种由116个氨基酸组成、分子量为13kDa的糖蛋白,在人体内半衰期约为20-24小时,稳定性好。正常条件下,PCT在甲状腺C细胞中生成并裂解成降钙素,人血清PCT含量极低,约2.5pg/ml。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时,PCT在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致PCT升高。PCT作为一种新的、具有创新意义的严重细菌感染等疾病的实验指标,PCT提高了临床诊断的准确性,为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了及其重要的诊断、进一步的检查和治疗的临床依据,PCT可广泛应用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科、介入诊断和治疗实验室等。
降钙素(calcitonin,CT)是甲状腺的滤泡旁细胞(明亮细胞或C细胞)产生和分泌,它由32个肽组成,它在1,7位上半胱氨酸之间有一个二硫键,分子量约为3418,主要由甲状腺的滤泡旁细胞(C细胞)分泌。它在肝脏和肾脏中代谢,受血清钙水平调节,主要功能是抑制破骨细胞的骨吸收,降低血钙的水平,防止钙应激(例如妊娠、哺乳和生长)时的骨丢失。正常人血清降钙素浓度为10~20pg/mL。
降钙素含量的测定对于骨质疏松的评估、监测甲状腺功能具有重要意义。降钙素水平的升高可见于各种病理学状况,伴有降钙素无序大量分泌的最显著临床病症是甲状腺髓质癌(MTC)。该病发病率低,但致死率高,可能为散发性,也可能是常染色体显性遗传病。通过检测血清降钙素水平,可以对MTC进行早期诊断,从而使得早期亚临床疾病的完全治愈成为可能,血清降钙素水平还是观察和评价治疗疗效,以及预后的重要指标。
降钙素水平的异常升高还可见于肺癌,特别是小细胞肺癌、乳腺癌、神经嵴起源的肿瘤、甲状旁腺功能亢进、高胃泌素血症、肾衰和慢性炎性疾病。
目前,常用的检测方法是免疫学检测,免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段,其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示,因此常被用于检测蛋白质,激素等生物活性物质。免疫学检测经历了放射免疫检测、酶联免疫检测以及光生物学标记免疫检测技术三个阶段,使免疫学检测向着敏感性、准确性以及操作简捷性的方向发展。
化学发光免疫分析是近年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大***并借助其发光强度直接测定免疫结合。该方法灵敏度高、检测范围宽,是免疫学检测重要的发展方向。
由于CT的氨基酸序列是PCT的氨基酸序列的60-91部分,所以CT的检测容易受到PCT的交叉干扰,目前CT的检测多采用双抗体夹心法,该方法易受类风湿因子(RF)等物质的干扰。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,本发明提供采用识别降钙素N端或者C端的抗人降钙素抗体,有效的避免了PCT的干扰,本发明采用重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体,有效的避免了RF因子这类与Fc片段结合导致的干扰,而且本发明的检测降钙素的试剂盒灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强。
为实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供的检测降钙素的试剂盒,所述试剂盒包含:
试剂R1:
包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体 0.5-24μg/mL
磷酸缓冲液 10-50mM
氯化钠 4-40g/L
蔗糖 5-200g/L
牛血清白蛋白 5-30g/L
吐温20 0.05-5mL/L
丙三醇 5-30mL/L
ProClin300 0.5-5mL/L
试剂R2:
标记的抗人降钙素抗体 0.05-10μg/mL
磷酸缓冲液 10-50mM
氯化钠 4-40g/L
酪蛋白 5-30g/L
甘露醇 5-200g/L
果绿色素 0.05-0.5g/L
吐温20 0.05-5mL/L
丙三醇 5-30mL/L
ProClin300 0.05-5mL/L。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒,所述试剂盒包含:
试剂R1:
包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体3μg/mL
磷酸缓冲液 30mM
氯化钠 9g/L
蔗糖 5g/L
牛血清白蛋白 20g/L
吐温20 0.1mL/L
丙三醇 20mL/L
ProClin300 3mL/L
试剂R2:
标记的抗人降钙素抗体 0.5μg/mL
磷酸缓冲液 30mM
氯化钠 9g/L
酪蛋白 5g/L
甘露醇 15g/L
果绿色素 0.2g/L
吐温20 0.1mL/L
丙三醇 20mL/L
ProClin300 1mL/L。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒,其中所述磁微粒为亲和素磁微粒、甲苯磺酰基磁微粒或羧基磁微粒中的一种。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒,其中所述磁微粒粒径为0.5~3.0μm。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒,其中所述标记的抗人降钙素抗体的标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯或吖啶酯衍生物中的一种。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒检测降钙素的方法,包括如下步骤:
(a)反应:将样本和包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体及标记的抗人降钙素抗体混合反应;
(b)检测:加入免疫分析仪底物液,检测其化学发光光子强度。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体包被磁微粒,具体过程如下:取适量重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体,加入磁微粒,混匀反应,加入缓冲液,得到包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体。
(2)标记抗人降钙素抗体,具体过程如下:取适量抗人降钙素抗体,加入标记物,混匀反应,加入缓冲液,得到标记的抗人降钙素抗体。
本发明提供的检测降钙素的试剂盒在降钙素检测中的应用。
由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果在于:
1.提供采用识别降钙素N端或者C端的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体,有效的避免了PCT的干扰。
2.采用重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体,有效的避免了RF因子这类与Fc片段结合导致的干扰。
3.试剂盒灵敏度高、线性范围宽。
本发明中所涉及到的具体试剂如下:
本发明中使用的仪器如下:
名称 | 来源 |
标准型滚轴混匀仪 | 大龙兴创实验仪器(北京)有限公司 |
实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案,下面结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
试剂R1:
其中亲和素磁微粒粒径为0.5μm。
试剂R2:
原料 | 用量 |
吖啶酯标记的抗人降钙素抗体 | 0.05μg/mL |
磷酸缓冲液 | 10mM |
氯化钠 | 4g/L |
酪蛋白 | 5g/L |
甘露醇 | 5g/L |
果绿色素 | 0.05mL/L |
吐温20 | 0.05mL/L |
丙三醇 | 5mL/L |
ProClin300 | 0.05mL/L |
实施例2
试剂R1:
原料 | 用量 |
包被于亲和素磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体 | 24μg/mL |
磷酸缓冲液 | 50mM |
氯化钠 | 40g/L |
蔗糖 | 200g/L |
牛血清白蛋白 | 30g/L |
吐温20 | 5mL/L |
丙三醇 | 30mL/L |
叠氮钠 | 5mL/L |
其中亲和素磁微粒粒径为3.0μm。
试剂R2:
原料 | 用量 |
碱性磷酸酶标记的抗人降钙素抗体 | 10μg/mL |
磷酸缓冲液 | 50mM |
氯化钠 | 40g/L |
酪蛋白 | 30g/L |
甘露醇 | 200g/L |
果绿色素 | 0.5mL/L |
吐温20 | 5mL/L |
丙三醇 | 30mL/L |
ProClin300 | 5mL/L |
实施例3
试剂R1:
其中亲和素磁微粒粒径为1.5μm。
试剂R2:
原料 | 用量 |
吖啶酯标记的抗人降钙素抗体 | 0.5μg/mL |
磷酸缓冲液 | 30mM |
氯化钠 | 9g/L |
酪蛋白 | 5g/L |
甘露醇 | 15g/L |
果绿色素 | 0.2mL/L |
吐温20 | 0.1mL/L |
丙三醇 | 20mL/L |
ProClin300 | 1mL/L |
实施例4(对比例1)
试剂R1:
原料 | 用量 |
包被于亲和素磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体 | 0.3μg/mL |
磷酸缓冲液 | 8mM |
氯化钠 | 2g/L |
蔗糖 | 2g/L |
牛血清白蛋白 | 3g/L |
吐温20 | 0.02mL/L |
丙三醇 | 3mL/L |
ProClin300 | 0.3mL/L |
其中亲和素磁微粒粒径为0.4μm。
试剂R2:
原料 | 用量 |
吖啶酯标记的抗人降钙素抗体 | 0.03μg/mL |
磷酸缓冲液 | 8mM |
氯化钠 | 3g/L |
酪蛋白 | 4g/L |
甘露醇 | 4g/L |
果绿色素 | 0.03mL/L |
吐温20 | 0.03mL/L |
丙三醇 | 4mL/L |
ProClin300 | 0.03mL/L |
实施例5(对比例2)
试剂R1:
原料 | 用量 |
包被于亲和素磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体 | 30μg/mL |
磷酸缓冲液 | 55mM |
氯化钠 | 45g/L |
蔗糖 | 210g/L |
牛血清白蛋白 | 35g/L |
吐温20 | 6mL/L |
丙三醇 | 35mL/L |
ProClin300 | 6mL/L |
其中亲和素磁微粒粒径为4.0μm。
试剂R2:
原料 | 用量 |
吖啶酯标记的抗人降钙素抗体 | 15μg/mL |
磷酸缓冲液 | 55mM |
氯化钠 | 45g/L |
酪蛋白 | 35g/L |
甘露醇 | 205g/L |
果绿色素 | 1.0mL/L |
吐温20 | 7mL/L |
丙三醇 | 35mL/L |
ProClin300 | 7mL/L |
不同实施例检测结果比较。
灵敏度:
检测“0”浓度样本,重复检测20次,计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD),并计算M+2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限。
表1
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
灵敏度(pg/mL) | 0.153 | 0.151 | 0.026 | 0.231 | 0.255 |
由表1可见,实施例1、实施例2、实施例3的灵敏度显著高于实施例4和实施例5,且实施例3的灵敏度最好。
精密度:
检测浓度为45pg/mL的样本,重复检测10次,其中CV值=STDEV/均值。
表2
由表2可见,实施例1、实施例2、实施例3测定的结果均接近真实值,并且测得的变异系数均小于5%,且实施例3测得的CV值小于2%,实施例4、实施例5测得的变异系数均大于5%,说明本发明的试剂盒重复性好、性能稳定,测量准确。
线性:
将接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释,其中稀释的最低浓度样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本至少重复测定2次,计算其平均值,将测定浓度的平均值与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数。
表3
由表3可见,本试剂盒结果准确性可靠,相关性良好,可以应用于降钙素(CT)的检测。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (7)
1.一种检测降钙素的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包含:
试剂R1:
包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体 0.5-24μg/mL
磷酸缓冲液 10-50mM
氯化钠 4-40g/L
蔗糖 5-200g/L
牛血清白蛋白 5-30g/L
吐温20 0.05-5mL/L
丙三醇 5-30mL/L
ProClin300 0.5-5mL/L
试剂R2:
标记的抗人降钙素抗体 0.05-10μg/mL
磷酸缓冲液 10-50mM
氯化钠 4-40g/L
酪蛋白 5-30g/L
甘露醇 5-200g/L
果绿色素 0.05-0.5g/L
吐温20 0.05-5mL/L
丙三醇 5-30mL/L
ProClin300 0.05-5mL/L。
2.根据权利要求1所述的检测降钙素的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包含:
试剂R1:
包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体 3μg/mL
磷酸缓冲液 30mM
氯化钠 9g/L
蔗糖 5g/L
牛血清白蛋白 20g/L
吐温20 0.1mL/L
丙三醇 20mL/L
ProClin300 3mL/L
试剂R2:
标记的抗人降钙素抗体 0.5μg/mL
磷酸缓冲液 30mM
氯化钠 9g/L
酪蛋白 5g/L
甘露醇 15g/L
果绿色素 0.2g/L
吐温20 0.1mL/L
丙三醇 20mL/L
ProClin300 1mL/L。
3.根据权利要求1或2所述的检测降钙素的试剂盒,其特征在于:所述磁微粒为亲和素磁微粒、甲苯磺酰基磁微粒或羧基磁微粒中的一种。
4.根据权利要求3所述的检测降钙素的试剂盒,其特征在于:所述磁微粒粒径为0.5~3.0μm。
5.根据权利要求1或2所述的检测降钙素的试剂盒,其特征在于:所述标记的抗人降钙素抗体的标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯或吖啶酯衍生物中的一种。
6.一种用于非诊断目的的使用权利要求1所述的检测降钙素的试剂盒进行降钙素检测的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(a)反应:将样本和包被于磁微粒的重组鼠抗人降钙素单克隆Fab抗体及标记的抗人降钙素抗体混合反应;
(b)检测:加入免疫分析仪底物液,检测其化学发光光子强度。
7.权利要求1所述的检测降钙素的试剂盒在降钙素检测中非诊断目的的应用。
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