CN107937597B

CN107937597B - 与控制亚麻株高主效qtl共分离的ssr分子标记及其应用

Info

Publication number: CN107937597B
Application number: CN201810008553.XA
Authority: CN
Inventors: 邓欣; 陈信波; 王玉富; 梅时勇
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Current assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS
Priority date: 2018-01-04
Filing date: 2018-01-04
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2038-01-04
Also published as: CN107937597A

Abstract

本发明公开了与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记，所述SSR分子标记选自GD264、GD282和GD201中的至少一个。本发明的3个SSR分子标记在124份亚麻核心种质资源中均表现出与株高呈现显著性关联，是稳定存在的株高主效应位点，可以直接利用本发明提供的用于扩增所述SSR分子标记的引物筛选优良种质、基因定位和克隆以及分子标记辅助育种，在培育高产纤维亚麻品种或研究中具有重要意义。同时，本发明为分子标记育种提供了有益的借鉴。

Description

与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记及其应用。

背景技术

分子标记是以生物体的遗传物质核酸的多态性为基础的遗传标记，具有数量丰富、遗传稳定、不受基因表达与否的限制以及操作简便等特点，并可通过分子标记直接检测基因组的遗传变异。目前已有多种分子标记技术被应用于亚麻的基础性研究中,包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SRAP、ISSR、IRAP以及SNPs等。然而以上研究中获得的标记数量还较少，这些标记中使用最广的是SSR标记，SSR标记具有扩增稳定，特异性高，共显性，开发成本相对低等优点。

关联分析是基于自然变异群体，利用连锁不平衡规律来研究遗传变异与目标性状相关关系的研究方法(Mackay et al.，2007)。与传统的QTL(数量性状位点)相比，关联分析不需要构建作图群体、广度大、精度高、能检测到同一位点多个等位基因。2001年，Thornsberry等(2001)首次成功地将关联分析应用于植物，发现dwarf8基因不但与赤霉素新陈代谢有关，而且可以影响玉米株高。Kraakman等用236个AFLP标记对春大麦的产量及产量稳定性进行了关联分析，发现8个与大麦产量及5个与产量稳定性相关联的AFLP标记(Kraakman et al.,2004)。在对小麦的叶枯病(Stagonospora nodorum glume blotch)抗性进行研究中，经关联分析表明SUN2-3B的SNG抗性与标记QSng.sfr-3BSg相关系数很大，这与连锁分析的结果一致(Tommasini et al.,2007)。黄秦军等通过关联分析，在1年生欧洲黑杨和4年生欧洲黑杨中分别发现10和8个SSR标记分别与4个和6个材性性状显著相关(黄秦军等，2007)。Jing等分析了二倍体小麦的农艺品质性状与普通小麦中46个SSR标记的相关性，发现多个标记显著关联，包括一些已知的标记(Jing et al.,2007)。Beló等对玉米553分优良自交系的8950个SNP位点采用全基因组扫描的方法进行相关分析，结果表明油酸去饱和酶(fatty acid desaturase)基因fad2与油酸含量相关联(Belóet al.,2008)。文自翔等在对栽培和野生大豆SSR标记与农艺品质性状进行关联分析时，分别发现27个和34个SSR位点与16个农艺性状显著相关，并发掘了一些优异等位基因(文自翔等，2008)。目前基于AFLP、SSR、SNP等标记，采用基因组扫描方法，在甜菜、大麦、小麦、玉米、大豆等作物重要性状的关联分析研究上取得了重要进展(王荣焕等，2007)，通过关联分析的方法，可以避免等位基因间显隐性状关系的干扰，选择结果可靠、准确。利用分子标记一般可在育种早代进行并完成辅助选择过程，大大缩短育种周期，可以显著提高育种效率。但在既往的研究中，关联分析的方法还很少用于亚麻的研究中。

株高是衡量纤用亚麻产量的重要指标，株高越高，亚麻的纤维产量越高，而株高越矮，亚麻的抗倒伏性能越好。纤用亚麻一般需要高株高的品种，而油用亚麻需要低株高的品种，如何根据亚麻生产的需要，培育出适合生产生活使用的亚麻新品种是目前亚麻育种迫切需要解决的问题。改良新品种的方法之一就是从分子水平上改良亚麻品种的遗传结构，使之产生对生产有利的遗传变异。

利用分子标记对亚麻株高性状进行关联分析的研究不多，找到的分子标记也比较少。此前，杨学等(2011)对亚麻9801-1采用RAPD技术进行分析，筛选出了两个株高候选基因，这些基因的发掘和克隆为亚麻品种的遗传改良和种质创新奠定了基础。但亚麻的株高是数量性状遗传，受为数甚多的基因支配；各个基因对性状的作用都很微小，这些基因彼此间没有显隐性关系，而其作用一般是累加的，而目前发现的与亚麻株高关联的遗传标记非常少，在分子辅助育种中受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供更多的亚麻中控制株高的主效数量性状位点(QTL)。

本发明的另一目的是提供与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记，所述SSR分子标记选自GD264、GD282和GD201中的至少一个；各分子标记的信息如表1所示：

表1

注：扩增产物大小对应于株高亚麻品系。

本发明还提供含有所述SSR分子标记的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供含有用于扩增所述SSR分子标记的引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述SSR分子标记单独或组合使用在亚麻株高的早期预测和筛选中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)提取待测亚麻的基因组DNA；

2)以提取的DNA为模板，利用扩增所述SSR分子标记的引物进行PCR反应；

3)分析PCR扩增产物。

步骤2)PCR扩增体系为：2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，含10mM Mg²⁺的10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTP各0.2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，40ng/μL DNA模板0.5μL，ddH₂O补足10μL。

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，Tm退火45s，72℃延伸90s，共36个循环；72℃延伸10min，4℃保温。

前述的应用，步骤3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

本发明还提供所述SSR分子标记单独或组合使用在亚麻分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述SSR分子标记单独或组合使用在株高较高的亚麻品种选育中的应用。

本发明还提供控制亚麻株高主效QTL，共包括3个主效QTL，分别为QTL1、QTL2和QTL3，用于扩增各主效QTL的引物分别如下：

QTL1：F:5'-CAGCTCTTGCTCGTTCTTCC-3'

R:5'-CTCATTCCTTTCCATTCCGA-3'

QTL2：F:5'-CATATACCCATTCATCCCGC-3'

R:5'-GAACCCCTTACTCTCCGTCC-3'

QTL3：F:5'-CCACAATCTAACCCTTGCGT-3'

R:5'-TTTGTTCAATGTGGTAGCATGA-3'

本发明进一步提供一种获得亚麻中与株高相关的主效数量性状位点的方法，包括如下步骤：

步骤一、利用基因组测序序列开发的350对亚麻SSR引物，对124份亚麻种质进行检测得到亚麻种质具有多态性的378个SSR标记的基因型；

步骤二、利用Tassel软件的连锁不平衡分析程序，分析步骤一中得到的该多份亚麻种质的SSR标记的基因型，计算出连锁不平衡配对检测的K矩阵图，SSR标记的基因型相互连锁的基因只保留一个；

步骤三、利用Structure软件和该多份亚麻种质具有多态性的378个SSR标记的基因型对所述多份亚麻种质进行群体结构分析生成Q值矩阵；

步骤四、利用Tassel软件的GLM程序，以步骤三中得到的Q值作为协方差，在显著性水平P＜0.01下，将分子标记数据和所述多份亚麻种质株高的数量性状数据进行GLM程序线性模型的逻辑回归率检验，输出各SSR位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R2数据；

步骤五、重复步骤四，对连续两年(2011～2012年)种植的不同亚麻品系的表型变异进行分析；

步骤六、选取步骤五中在两年的表型中共同存在的显著性水平P＜0.01的SSR位点，得到亚麻中控制株高的主效数量性状基因。

优选地，前述方法步骤三中，利用Structure软件进行群体结构分析时，设定亚群数目k＝1-10，每个K值运行3次，通过计算ΔK确定亚麻的最合适种群结构。

优选地，前述方法步骤五中，所述多份亚麻种质的多年株高的数量性状数据为两年的各个亚麻品种的株高数据。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的3个SSR分子标记在124份亚麻核心种质资源中均表现出与株高呈现显著性关联，是稳定存在的株高主效应位点，可以直接利用本发明提供的用于扩增所述SSR分子标记的引物筛选优良种质、基因定位和克隆以及分子标记辅助育种，在培育高产纤维亚麻品种或研究中具有重要意义。同时，本发明为分子标记育种提供了有益的借鉴。

附图说明

图1为本发明实施例1中350对SSR引物的变性聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳条带图的部分结果。

图2本发明实施例1中全基因组连锁不平衡直观图的结果。

图3为本发明实施例1中群体结构分析中对数似然值随亚群个数的变化的结果图。

图4为本发明实施例1中群体结构分析中△K值随亚群个数变化的结果图。

图5为利用标记GD201检测不同株高亚麻品种的PCR产物电泳图，其中，特征条带大小已用数字标出。

图6为利用标记GD264检测不同株高亚麻品种的PCR产物电泳图，其中，特征条带大小已用数字标出。

图7为利用标记GD282检测不同株高亚麻品种的PCR产物电泳图，其中，特征条带大小已用数字标出。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记的获得1材料和方法

1材料

表2 124份亚麻核心种质

1.2方法

1.2.1株高性状基本统计分析

亚麻分别于2011年和2012年种植于云南省祥云试验地种植，采用随机区组设计，每份资源种植在4m²小区内，每份资源每个小区随机调查20株。调查亚麻的株高，调查方法参考《亚麻种质资源描述规范和数据标准》采集和整理(王玉富等，2006)。

将124份亚麻核心种质株高性状的数据导入SPSS18.0软件，进行描述性统计分析，输出最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数、偏度值和峰度值。

1.2.2DNA的提取、电泳及检测

1.2.2.1基因组DNA的提取(用omega试剂盒提取)

1)将亚麻种子置于培养箱中培养出苗，待幼苗长到4-5cm左右，取1-2克幼苗置于一个1.5ml的离心管中，用镊子夹住离心管，浸入液氮以冷冻样本，用研磨棒研成粉末。加入600μL Buffer P1涡旋混匀，确保所有的组织团都分散均匀。置于65℃水浴10min，中途混匀2次。

2)加入140μL Buffer P2，涡旋混匀，13000rpm离心10min，小心取上清(不超过700μL)，转入新的1.5ml离心管中，加入500μL异丙醇，颠倒混匀。

3)13000rpm离心2min，弃上清，用纸巾将多余上清液吸干。加入300μL 65℃的超纯水(已加入RNase)涡旋混匀，溶解DNA，65℃水浴5min。加入150μL Buffer P3及300μL冰乙醇，混匀。

4)将结合柱和收集管置好，结合柱标号(GPS预处理：取新的结合柱装在收集管中，加入200μL Buffer GPS平衡缓冲液，室温放置5min，13000rpm离心2min，弃滤液。加入700μL灭菌水，室温放置5min，13000rpm离心2min，弃滤液，结合柱处理好)，将约750μL混匀液转入处理好的结合柱中，13000rpm离心1min，弃收集管及液体。

5)将结合柱置于新的收集管中，加入650μL DNA Wash Buffer，13000rpm离心1min，弃液体，重复一次，13000rpm空甩柱子离心4min，以甩干柱子的膜基质。

6)将结合柱转入新的1.5ml离心管中，加入100μL65℃预热的Elution Buffer至新的柱子膜中央，在65℃温箱中置5min，13000rpm离心1min以洗脱DNA。再用100μL洗脱液重复一次，共收集200μLDNA洗脱液，编号，装盒置-20℃冷藏。

1.2.2.2SSR引物合成

利用基因组测序序列开发的350对亚麻SSR引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物。

1.2.2.3SSR-PCR扩增

1)PCR反应体系：Eppendorf PCR管中反应总体积为10μL，具体反应体系如下：

灭菌超纯水补足10μL。

2)PCR扩增条件

1 94℃预变性4min

2 94℃变性45s

3 Tm 45s

4 72℃1.5min，回复到第2步进行36个循环

5 72℃10min

最后保温在4℃。扩增反应均在Biometra PCR仪上进行。

1.2.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳

对SSR引物扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1)所需试剂的配制

①45％丙烯酰胺溶液200mL，用棕色瓶装置室温。

配制方法：丙烯酰胺86.8g，N,N-亚甲双丙稀酰胺3.2g，加水至120mL，37℃促溶，用硝酸纤维素膜(0.45μm)过滤，随后蒸馏水定容至200mL，pH保持在7以下。

②10×TBE贮存液1L

配制方法：Tris碱108g，硼酸55g，EDTA(0.5mol/L，pH8.0)40mL，加蒸馏水定容至1L。

③10％过硫酸铵

配制方法：0.4g过硫酸铵加水定容至4mL。

④显色液

配制方法：氢氧化钠6g，硼砂0.07g，加水定容至400mL。

2)凝胶的制备

①玻璃板的清洗及硅化

用去污粉将玻璃板洗净，再用蒸馏水冲洗，随后用无水乙醇擦净晾干，最后用擦镜纸蘸取玻璃硅烷将其硅化，晾干。

②电泳槽组装

最后加入过硫酸铵600μL，TEMED 45μL，混匀后立即灌胶。

3)电泳

将样品与适量6×Loading buffer混合，点入加样孔中，使用1×TBE缓冲液，在恒功率9W下电泳4～5个小时，待二甲苯青到达胶板末端。

4)银染

①染色：将胶放入含有400mL染色液(0.5％AgNO₃)的托盘中，再将托盘放置到摇床上，轻摇30min。

②漂洗：用蒸馏水水洗2次，以洗净表面所含银离子。

③显色：将胶板转入含有400mL显色液和1.6mL甲醛的托盘中，在摇床上摇至显带为止。

5)照相：将胶放入加有蒸馏水的白瓷盘中，用数码相机照相，然后取出用保鲜膜保存。

6)数据分析：

利用QuantityOne 4.6.3软件，结合人工读带，同一位置上清晰的条带记为1,无条带记为0，确定变异数目，获得位点等位变异矩阵。采用Powermarker 3.25(Liu,et al.)计算多态信息含量(PIC)，多态性条带数。利用Structure 2.2(Pritchard,et al.,2007)软件，计算材料相应的Q值(第i个材料其基因组变异源于第k个群体的概率)，采用混合模型和等位变异发生频率相关模型进行群体遗传结构分析。

1.2.3连锁不平衡分析

基因间的连锁不平衡是关联分析的基础。连锁不平衡程度通常用R²(squaredallele-frequency correlations)和D'(standardized disequilibrium coefficients)两个参数来表示，R²和D'的取值范围介于0～1。通常，R²和D'值越大、越接近1，说明两基因位点间的连锁不平衡程度越大。然而当R²和D'都等于0时，两基因座处于遗传平衡状态即不连锁，而R²和D'都等于1时，两基因位点处于完全连锁状态。

利用TASSEL软件的Linkage Disequilibrium分析程序，将统计的分子标记的条带转换为等位基因形式，计算LD配对检测的K矩阵图，分析群体LD水平，输出R²和显著性水平P值，对存在完全连锁的标记只保留其中一个。

1.2.4群体结构分析方法

利用STRCTURE软件对124份亚麻核心种质进行群体结构分析。设定K值为1～10，每个K值运行3次，根据似然值最大的原则，选择合适的K值。

1.2.5 SSR分子标记与亚麻出麻率关联分析

运用TASSEL软件的GLM程序，以得到群体Q值矩阵作为协方差，在显著性水平P＜0.01下，将分子数据和数量性状数据进行Q+GLM线性模型的逻辑回归率检验，运行后得到各位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R²。

2结果与分析

2.1分子标记多态性

利用350对SSR引物对124份亚麻核心种质进行遗传多样性分析，扩增出378个SSR标记位点，共检测出1526个条带，大小在80-569bp之间，各个位点分别检测到2-18个等位基因，平均4.05个，每个SSR标记位点的的基因多样性介入0.005～0.901之间，平均为0.3401，杂合度介入0-1之间，平均为0.2443，多态信息量(PIC)介于0.005～0.893之间，平均为0.2997。

350对SSR引物的变性聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳条带图的部分结果见图1。

2.2核心种质株高基本统计分析

本发明检测的两年亚麻的株高基本统计分析结果如表3所示，2011年株高的最大值为3449.0，最小值为901.0，平均为1681.5769；2012年株高株高的最大值为3449.0，最小值为901.0，平均为1681.5769。

表3株高基本统计分析

2.3亚麻SSR位点间的连锁不平衡分析

利用TASSEL软件对378个多态性位点进行群体连锁不平衡分析，如图2所示，得到基因组内连锁不平衡的分布情况。试验得到总共378个标记的71064(即378个标记的任意组合数)个组合，当P<0.01时，仅1893个位点处于LD，占总位点组合数的2.66％。本发明所使用的124个材料连锁不平衡水平很低，适合于全基因组关联分析策略进行初定位。

2.4群体结构分析

群体结构会增加群体的连锁不平衡率，使原本不相关的性状与基因呈现连锁状态，出现假阳性。因此需要对样本的群体结构进行校正。

将350对多态性引物的分子标记数据运用STRUCTURE软件进行群体结构检验，将群体划分为1到10(K＝1，2，3，…，10)的亚群进行3次重复的测试，确认类群数目。将亚群测试过程中运行得出的对数似然值LnP(D)的平均数，绘制成与亚群数K相关的折线图，如图3所示。由图3可知，随着亚群数目K的增加，后验概率对数随之增大，不能确定K的取值。所以采用△K的方法确定K值，采用Evanno等(2005)提出的方法求得△K，绘制△K与K的相关关系图，来确定最佳亚群数，如图4所示。

2.5 SSR位点与亚麻株高的关联分析

利用TASSEL软件的GLM程序，以得到的群体Q值以作为协方差，在显著性水平P＜0.01下，将分子数据分别与亚麻2年的株高数据进行Q+GLM的逻辑回归率检验，输出各位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R²，如表4所示部分结果，寻找与性状相关联的分子标记。2年共有3个标记检测与株高有显著性关联，3个标记分别为GD201、GD264和GD282，在两年均被检测到与株高显著关联，可以认为是控制株高的主效QTL，标记的引物信息见表1。其中，标记GD201在株高较高的亚麻品种和株高较矮的亚麻品种中，对应的特征条带分别是154bp和134bp(图5)；标记GD264在株高较高的亚麻品种和株高较矮的亚麻品种中，对应的特征条带分别是173bp和192bp(图6)；标记GD282在株高较高的亚麻品种和株高较矮的亚麻品种中，对应的特征条带分别是193bp和187bp(图7)。

表4与株高性状显著相关的分子标记(P<0.05)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

1.Mackay I.,Powell W.Methods for linkage disequilibrium mapping incrops.Trends in Plant Science.2007,12(2):57-63.

2.Thornsberry J.M.,Goodman M.M.,Doebley J.,Kresovich S.,Nielsen D.,Buckler E.S.Dwarf8polymorphisms associate with variation in floweringtime.Nature genetics.2001,28(3):286-289.

3.杨学,关凤芝,李柱刚,等.亚麻品系9801-1抗白粉病基因的RAPD标记[J].植物病理学报,2011,41(02):215-218.

4.王玉富，粟建光，亚麻种质资源描述规范和数据标准.中国农业出版社.2006.

5.Pritchard J.,Wen X.,Falush D.Structure,version 2.2.Softwaredocumentation.Department of Human Genetics,University of Chicago,Illinois,USA.2007.

6.Evanno G.,Regnaut S.,Goudet J.Detecting the number of clusters ofindividuals using the software STRUCTURE:a simulation study.Molecularecology.2005,14(8):2611-2620.

序列表

<110> 中国农业科学院麻类研究所

<120> 与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记及其应用

<130> KHP171116366.2

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagctcttgc tcgttcttcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcattcctt tccattccga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catataccca ttcatcccgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaacccctta ctctccgtcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccacaatcta acccttgcgt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttgttcaat gtggtagcat ga 22

Claims

1.与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记单独或组合使用在亚麻株高的早期预测和筛选中的应用；

其中，所述与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记选自GD264、GD282和GD201中的至少一个；各分子标记的信息如表1所示：

表1

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测亚麻的基因组DNA；

2)以提取的DNA为模板，利用扩增权利要求1所述SSR分子标记的引物进行PCR反应；

3)分析PCR扩增产物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2)PCR扩增体系为：2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，含10mM Mg²⁺的10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTP各0.2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，40ng/μL DNA模板0.5μL，ddH₂O补足10μL；

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，步骤3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

5.与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记单独或组合使用在亚麻分子标记辅助育种中的应用；

其中，所述与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记采用权利要求1中所述的SSR分子标记。

6.与控制亚麻株高主效QTL共分离的SSR分子标记单独或组合使用在株高较高的亚麻品种选育中的应用；

7.用于控制亚麻株高的主效QTL，其特征在于，共包括3个主效QTL，分别为QTL1、QTL2和QTL3，用于扩增各主效QTL的引物分别如下：

QTL1：F:5'-CAGCTCTTGCTCGTTCTTCC-3'

R:5'-CTCATTCCTTTCCATTCCGA-3'

QTL2：F:5'-CATATACCCATTCATCCCGC-3'

R:5'-GAACCCCTTACTCTCCGTCC-3'

QTL3：F:5'-CCACAATCTAACCCTTGCGT-3'

R:5'-TTTGTTCAATGTGGTAGCATGA-3'。