CN107619873A

CN107619873A - 基于关联分析和KASP开发waxy1基因内分子标记

Info

Publication number: CN107619873A
Application number: CN201710769206.4A
Authority: CN
Inventors: 王文琴; 李长生; 巫永睿
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2018-01-23
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107619873B

Abstract

本发明公开了基于关联分析及KASP开发waxy1基因内分子标记；主要是通过全基因组关联分析和候选基因关联分析技术，找到位于waxy1基因内与直连淀粉含量极显著相关的一个indel和两个snp标记。所检测到的indel标记为中国糯玉米的主要突变类型，本发明基于该indel开发的标记可通过琼脂糖胶对糯玉米材料进行鉴定，相比以往的聚丙烯酰胺胶鉴定更加方便快捷；同时通过对59份玉米自交系材料的waxy1基因序列区域进行配对连锁不平衡检验，验证了该indel标记与两个snp标记紧密连锁，并开发了基于KASP技术的两个snp的引物，可实现对糯玉米材料快速高效准确的鉴定，对糯玉米分子育种具有促进作用。

Description

基于关联分析和KASP开发waxy1基因内分子标记

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于全基因组关联分析和KASP技术开发waxy1 基因内分子标记。

背景技术

玉米是很多国家广泛种植的主要农作物之一，且是重要的粮食、经济和饲料作物。现代玉米是野生玉米经历近万年的历史进化而来，在其过程中形成了遍布全球的独特地理品系及突变品系。这些品系与野生玉米之间以及品系内部之间特定性状的差异实质上是基因组上的某些位点受到长期的人工定向选择下变异积累而导致的。这些位点通常控制着重要的农艺性状，是育种中需要筛选的重要基因位点。因此，如何高效地鉴定、利用和聚合这些位点是当前育种行业面临的问题和挑战。起源于中国西南地区的糯玉米就是这些优异的突变品系之一(Weatherwax P,Randolph L,Sprague G.History and origin of corn incorn and corn improvement.Academic Press,New York,USA,1955. 黄玉碧,荣廷昭.我国糯玉米种质资源的遗传多样性和起源进化.作物杂志,1998, 1(998):27-80.)，其籽粒中的营养成分十分丰富，糖分、蛋白质、赖氨酸等多种氨基酸含量均高于普通玉米，并含有多种维生素和矿质元素，其淀粉分子量比普通玉米小10 多倍，适口性好且更易消化吸收，深受中国及东南亚国家人民的喜爱，同时也是加工支链淀粉的重要原料。

种质资源是培育一切优良品种的基础，因此如何高效的筛选和培育糯玉米自交系是目前研究的热点之一。常规的糯玉米自交系选育基本采用自交系选育方法、二环系选育法和回交转育法(刘纪麟.玉米育种学.北京:中国农业出版社,2002.)。这些方法为了保证隐性waxy1基因不丢失,通常需要育种家观察籽粒表型或通过碘染检法查配子体基因型，但这种方式育种周期长且选择效率低,已经无法完全满足当前玉米生产的需要，同时玉米的大部分农艺性状诸如产量、品质等均为数量性状，而数量性状的表型与基因型之间受环境、亲缘关系及群体结构等多种因素的影响(Yu J,Pressoir G,Briggs W H,et al.A unifiedmixed-model method for association mapping that accounts for multiple levelsof relatedness[J].Nature genetics,2006,38(2):203-208.)，仅依赖于表型选择的常规育种手段并不准确。

针对以上问题，近年来分子标记在糯玉米育种中的应用得到了广泛的发展，已经报道的有RAPD标记即随机扩增多态性DNA，缺点是它的稳定性和重复性不高；还有SSR 标记，它的数量丰富，并覆盖整个基因组，但密度不够，在选育过程中往往易受重组、选择、环境等变化的影响导致基因组中LD衰退(李春艳,***.分子标记技术在我国糯玉米育种中的应用.广东农业科学,2011,38(15):113-115.)。糯玉米主要是因为第9号染色体waxy1基因发生隐性突变导致胚乳中直链淀粉降低甚至缺失而产生的 (Demerec M.A case ofpollen dimorphism in maize.American Journal of Botany, 1924:461-464.)，在对waxy1基因编码区的多态性位点进行研究中发现，糯玉米第7 个外显子和内含子上有30bp的缺失，或是第外10显个子有15bp缺失，同时发现waxy1 基因位点的遗传多样性很低(田孟良,黄玉碧,谭功燮等.西南糯玉米地方品种waxy 基因序列多态性分析.作物学报,2008,34(5):729-736.Fan L,Quan L,Leng X,et al.Molecular evidence for post-domestication selection in the Waxy gene of Chinese waxy maize.Molecularbreeding,2008,22(3):329.)。在以往对糯玉米地方品种waxy1基因序列多态性分析报道中，主要关注了waxy1基因的第9到14外显子，未从全局上进行连锁分析；同时他们开发的标记均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，虽然可以区分小分子，但丙烯酰胺胶具有毒性，且制胶及染色相对复杂，高通量筛选效率低下。

发明内容

本发明的目的在针对上述现有技术存在的操作复杂、选择效率低、不利于高通量筛选等缺点，提供一种基于关联分析和KASP技术开发waxy1基因内分子标记。本发明利用高通量测序技术和含有糯玉米材料的自然群体，通过全基因组关联分析挖掘潜在的与直链淀粉表型紧密连锁的SNP，以应用于今后的育种，同时通过候选基因关联分析技术我们拟从waxy1基因序列挖掘出更多的多态性位点，为设计更灵活高效经济的SNP检测方法(KASP法)打下基础，从而为糯玉米基础材料的创制提供更多高效准确的鉴定手段。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种基于关联分析及KASP技术开发waxy1基因内分子标记的方法，通过碘染法测定了多份玉米自交系的直链淀粉含量并结合其对应的重测序基因型数据，以waxy1作为候选基因进行关联分析，获得waxy1基因内与直链淀粉含量显著相关的一个indel和两个snp分子标记，并通过配对连锁不平衡检验验证了indel标记与两个snp标记紧密连锁，并利用KASP技术设计了两个snp的引物可实现对糯质玉米的鉴定。

优选的，所述关联分析具体为：结合表型数据通过全基因组关联分析筛选一些可能存在相互关系的基因作为候选基因，按表型数据分布再选择一个子群体对候选基因进行测序，分析候选基因序列的多态性进行关联分析；或者利用GWAS或QTL mapping分析所获得的候选区间，对该区间的所有基因再与表型进行关联分析。

优选的，所述KASP技术开发SNP引物具体为：对子群体的候选基因的基因型数据进行配对连锁不平衡检验，获得与indel标记紧密连锁的两个SNP位点，并设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)引物，对SNP进行基因分型，鉴定糯质玉米。

优选的，所述方法包括如下步骤：

S1、对若干已知直链淀粉含量的马铃薯直链淀粉标样进行淀粉含量测定，获得光密度读数与直链淀粉含量的标准曲线；

S2、对待测玉米自交系群体进行同步骤S1的淀粉含量测定，获得光密度度数，并根据标准曲线计算直链淀粉含量；

S3、将群体自交系的表型数据与相应的SNP数据，通过使用GAPIT软件(版本：2.22)中的压缩混合线性模型(PCA群体结构+Kinship亲缘关系)来进行全基因组关联分析，获得显著的SNP区间内的候选基因waxy1进行后续分析；

S4、克隆多份(59份)子群体waxy1基因gDNA全长，并进行多重序列比对，获得Phylip alignment格式的基因型数据，导入Tassel 5使用GLM进行基于候选基因的关联分析，获得在waxy1基因内与直连淀粉显著相关的多态性位点；

S5、使用Tassel 5对子群体的基因型数据进行配对连锁不平衡检验，分析显著性位点间的连锁不平衡程度，获得与中国糯质玉米主要突变类型(indel标记)显著相关的两个SNP，针对SNP的侧翼序列信息进行KASP引物的设计和合成(将SNP的侧翼序列信息提交LGC公司(Laboratory of the Government Chemist，Hoddeston，UK)进行 KASP引物的设计和合成)，使用糯质玉米和非糯质玉米对两个SNP引物适用性进行鉴定。

第二方面，本发明涉及一种玉米糯质的Indel分子标记，是位于waxy1基因第7个外显子末端的30～33bp缺失的Indel。

优选的，所述Indel与糯质表型呈现紧密连锁

第三方面，本发明还涉及一种本发明所述的玉米糯质的Indel分子标记的引物，可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，wxl2引物效果最佳，其正向引物序列如SEQ ID NO.1 所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示：

wxl2_fwd：TCGTGCTACCTCAAGAGCAACTA SEQ ID NO.1，

wxl2_rev：GAGCATGGAGAACGAAGACGG SEQ ID NO.2。

第四方面，本发明涉及一种本发明所述的Indel分子标记在检测玉米基因型、筛选糯质玉米或分子标记辅助选择育种中的用途。

优选的，在利用Indel分子标记筛选糯质玉米中，针对waxy1基因内的Indel缺失，在两端保守区域设计引物获取扩增片段，直接通过高浓度的琼脂糖凝胶电泳对糯玉米材料进行鉴定。

优选的，设计的引物为如SEQ ID NO.1和2所示序列的wxl2引物。

优选的，利用wxl2引物在低直链玉米材料中可扩增出长度为70bp的含标记Indel的特征条带，在正常玉米材料中可扩增出长度为100～103bp的特征条带。

第五方面，本发明还涉及一种玉米糯质的SNP分子标记，包括位于waxy1基因第14个外显子的SNP1和位于3’UTR区的SNP2。

优选的，所述SNP1和SNP2与糯质表型呈现紧密连锁。

优选的，所述SNP1和SNP2与Indel缺失紧密连锁。(r²>0.9)。

第六方面，本发明涉及一种本发明所述的玉米糯质的SNP分子标记的KASP引物，分子标记SNP1对应的WXT引物包括：如SEQ ID NO.3所示的引物1、如SEQ ID NO.4 所示的引物2、如SEQ ID NO.5所示的引物3；分子标记SNP2对应的WXT2引物包括：如SEQ ID NO.6所示的引物4、如SEQ ID NO.7所示的引物5、如SEQ ID NO.8所示的引物6：

SEQ ID NO.3：CAGCCTCGGGGTCGCC，

SEQ ID NO.4：CTCAGCCTCGGGGTCGCT，

SEQ ID NO.5：CGGCGCGATCTCCTCGCCTT，

SEQ ID NO.6：CCACTGGCCACCACTACACTAT，

SEQ ID NO.7：CACTGGCCACCACTACACTAC，

SEQ ID NO.8：TTATGTGATATGGACAAGTRTGTGTA。

第七方面，本发明涉及一种如本发明所述的玉米糯质的SNP分子标记在检测玉米基因型、筛选糯质玉米或分子标记辅助选择育种中的用途。

优选的，在利用SNP分子标记筛选糯质玉米中，利用KASP引物进行PCR扩增，WET 引物的SNP T在低直链玉米材料中激发HEX荧光，SNP C在非低直链玉米材料中激发FAM 荧光；WET2引物的SNP A在低直链玉米材料中激发FAM荧光，SNP G在非低直链玉米材料中激发HEX荧光。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、建立了基于全基因组关联分析技术并迅速挖掘与表型紧密连锁的分子标记方法；

2、设计了基于第7个外显子末端的30～33bp缺失的分子标记，可以通过3％的琼脂糖凝胶电泳直接识别，适用于低通量的筛选；

3、分别设计了位于waxy1第14个外显子及3’UTR区的两个SNP(WXT及WXT2) 的KASP分子标记，通过荧光定量PCR仪对玉米快速分型，适用于高通量的筛选。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为直链淀粉含量全基因组关联分析示意图；其中，A为是基于混合线性模型(MLM) 全基因组关联分析Quantile–quantile plot图；B为直链淀粉全基因组关联分析Manhattan Plot图，x轴代表玉米10条染色体的物理位置，单位为bp；y轴代表相应 SNP的Pvalue的log10的负对数，虚线代表P value＝5×10-8，虚线以上代表该位点 SNP与表型极显著相关；C为Manhattan Plot在最显著SNP位点左右各0.2MB区间内所含基因的示意图，并标注各基因的ID(MaizeGDB release 5b.60)；

图2为waxy1紧密连锁SNP标记T在低直链淀粉自交系中的分布示意图；其中，A 中左半部分的圆为500自交系中含有SNP T的玉米材料，共26份，右半部分的圆为500 自交系中直链淀粉含量低于22％的玉米材料，共27份，其中重叠的玉米材料为15份； B为500份自交系材料在最显著SNP位点的不同等位基因的直连淀粉含量的箱线图；

图3为直链淀粉含量在关联分析群体中的分布示意图；其中，A为503份玉米自交系直链淀粉含量的分布；B为503份玉米自交系直链淀粉含量的描述统计；

图4为基于候选基因waxy1的直链淀粉含量的关联分析及配对连锁不平衡分析示意图；其中，A为关联分析结果，虚线以上(P value<5×10-8)表示与直链淀粉含量紧密关联的多态性位点，其中三角代表indel，圆形代表snp，标注相应的ID以及距离ATG 的物理位置；B为配对连锁不平衡分析示意图，黑色实线突出显示了indel与两个snp 的连锁不平衡程度；

图5为waxy1基因gDNA全长的多重序列比对示意图；其中，最左侧显示的为多重序列比对所使用的24份玉米自交系，其中2-13号为糯玉米，14-25号为非糯玉米(以 B73为参考序列)。

图6为indel标记的设计及位置信息示意图；其中wxl1～wxl4为条带差异引物，wxl5为条带有无引物，其反向引物20bp中有10bp在缺失上，因此低直链淀粉材料将无法扩出目的序列；

图7为indel标记对糯玉米材料的鉴定结构示意图；其中，A上半部分为24份样品直链淀粉含量，下半部分为相应的4种条带差异引物的琼脂糖凝胶电泳结果；B为阴性对照wxl5扩增结果；C为wxl2在市售粘糯玉米杂交种中的验证；

图8为基于KASP技术的waxy1基因SNP引物的基因分型散点图；A为WXT引物的分型情况，其中横坐标为HEX荧光值，纵坐标为FAM荧光值；B为WXT2引物的分型情况，其中横坐标为FAM荧光值，纵坐标为HEX荧光值；

图9为PCR反应条件示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

本实施例涉及基于全基因组关联分析和KASP技术开发waxy1基因内分子标记；具体内容如下：

1.材料和方法：

1.1植物材料

本发明收集来源于中国农业大学的465份温带自交系，38份来自于云南省农业科学院的优质蛋白玉米自交系和5份购于亚马逊(由深圳市飞度时代网络有限公司销售)粘糯玉米杂交种(分别为紫粘玉米，彩粘玉米，白粘玉米，白糯玉米，金糯玉米)，其它所有玉米遗传材料来自本实验室。除5份糯玉米杂交种外其余全部遗传材料于2013年 11月海南三亚播种自交繁殖。

1.2玉米籽粒表观直链淀粉含量(AAC)测定

标准曲线的制作：称取37度烘箱过夜后的马铃薯直链淀粉标样(Sigma.公司，货号：A0512)100mg。分别加入编号的容量瓶中，然后各加1ml无水乙醇，使淀粉浸润，再各加9ml 1N NaOH，沸水浴10min，冷却后，定容至100ml，充分混匀，按下列表 1中的比例吸取至50ml离心管。

表1

离心管编号	0	1	2	3	4	5	6
								直链淀粉(ml)	0	0.1	0.4	0.5	0.75	1.0	1.25
水(ml)	2.5	2.4	2.1	2.0	1.75	1.5	1.25
								直链淀粉含量(％)	0	4	16	20	30	40	50
支链淀粉含量(％)	100	96	84	80	70	60	50

随后向各离心管加入25ml ddH₂0，0.5ml 1N HAc及0.5ml I-KI试剂(0.2％I-KI试剂配制方法：2g KI容于少量ddH₂0中，再加0.2g I²，待溶解后，用ddH₂0定容至100ml，混匀。)，并定容至50ml，充分混匀，放置l0min，测620nm光密度读数。同时，配置空白对照(无淀粉溶液其余一致)。

样品淀粉含量测定：玉米干种子，打样机打碎。过80目筛，37℃烘箱过夜。取25mg样品干粉(称取时要迅速)，由于玉米籽粒干粉中含有较多的醇溶蛋白会影响最终的显色，故加入80％的乙醇4ml，振荡混匀，80℃水浴20min(每隔5min振荡混匀一次)， 4000rpm离心10min，倒掉上清以去除大部分醇溶蛋白。随后加入300μl无水乙醇，振荡悬浮起沉淀并立即加入4.5ml 1N NaOH，振荡摇匀，沸水浴10min，取500μl 至50ml离心管，加水25ml，加1ml 1NHAc，加I-KI试剂1ml，定容至50ml，混匀，放置10min。配置空白对照(无淀粉溶液其余一致)，备用。分光光度计测620nm 光密度读数，并根据标准曲线拟合方程计算直链淀粉含量。

1.3DNA提取和纯化

样品DNA的提取采用经典的CTAB法，取玉米幼苗叶片于2ml离心管中，用液氮冷冻并加钢珠至于研磨仪中粉碎，随后加入预热的CTAB提取缓冲液，摇匀，放入65℃水浴锅中水浴60min-90min，其间每10-15min摇动或搅拌一次；离心管取出水浴锅后，置于室温条件5-10min(勿低于15℃，否则CTAB易出现沉淀)；加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)至离心管，密封后放入摇床轻摇15-20min；室温条件12,000rpm离心5min后，小心吸取上层清液至新1.5ml离心管中；加2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇至离心管中，缓慢摇动离心管；室温10,000rpm离心5min，倒掉上清。用1ml的75％酒精洗DNA沉淀两次，每次在室温条件下10,000rpm离心5min后，将乙醇液体小心倾倒出(不要倒出核酸沉淀)；在室温中轻微晾干DNA沉淀；加入0.2ml ddH2O溶解DNA沉淀。

1.4RNA提取和纯化

取50-100mg(约一到两个玉米胚乳)16天的玉米籽粒胚乳组织于2ml离心管用液氮冷冻,加入350μl去蛋白溶液和200μl氯仿，并加钢珠用研磨仪打碎。取上清，再加200μl氯仿重复一次。取200μl上清，加入1ml Trizol试剂，振荡混匀室温放置5min。加入200μl上清氯仿，混匀冰上5min。12,000rpm，4℃离心15min。取400μl上清液小心转移到新的1.5ml离心管中，加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，4℃下放置15min。再12,000rpm，4℃离心15min。小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。再用DEPC水配制70％乙醇洗涤1次，12,000rpm，4℃离心5min。尽可能彻底地吸走上清，将RNA放在室温，待乙醇完全挥发掉，最后沉淀用20μl DEPC 水溶解。

1.5cDNA合成

cDNA合成使用SuperScriptIII First-Stand synthesis试剂盒(Life Science公司)。在RNase-free的无菌离心管中将2μg RNA与1μl Oligo(dT)和1μl dNTP 混匀，用水补齐到10μL，置于65℃水浴5min。迅速取出，冰浴1min。加入以下组分并混匀：10×反应缓冲液2μL；25mM MgCl₂ 4μL；0.1M DTT 2μL；RNaseOUT 1μL和1μL SuperScriptIII RT。将离心管轻轻混匀，快离后放置于50℃水浴锅中 50min，最后置于85℃5min使反转录酶失活后备用。

1.6PCR引物设计和反应体系及条件

引物设计使用NCBI网站BLAST中的Primer-BLAST(可同时实现引物设计和引物的特异性检验)。PCR产物仅用于跑胶的使用LifeFeng公司的2xTaq PCR Master mix(货号：PT202-02)扩增，用于测序的使用TOYOBO公司的KOD FX Neo进行扩增；反应体系参照各试剂说明书，PCR反应条件如图9所示。

引物的标注使用SnapgGene(版本3.1.4)软件中的Features功能。多重序列比对使用Geneious(版本9.0.4)的Align/Assemble功能中Multiple Align的ClustalW比对算法以及SnapgGene(版本3.1.4)软件tools中的Align Multiple Sequence功能。

1.7关联分析

使用GAPIT软件(版本：2.22)中的压缩混合线性模型(PCA群体结构+Kinship亲缘关系)来进行GWAS的分析。Kinship矩阵通过软件emmax-kin(版本：beta-07Mar2010) 来计算，参数为-v-h-s-d 10。PCA的计算使用GCTA软件(版本：gcta64)，分为两步：第一，估计遗传关系矩阵，参数为--autosome-num 10--autosome--make-grm。第二，将遗传关系矩阵放到PCA计算模块，输出特征值和特征向量，参数为：--grm

-pca 20。特征值最大的3个特征向量用于GWAS的分析。分析结果通过shell脚本进行整理并用perl脚本绘制Manhattan Plot。

基于候选基因的关联分析首先设计6对引物克隆waxy1基因gDNA全长，然后测序结果使用Geneious(版本9.0.4)的Align/Assemble功能中的De Novo Assemble进行拼接，拼接后的序列比对使用Align/Assemble功能中的Multiple Align的MUSCLE算法，将比对结果两端裁齐(根据基因注释信息)存为Phylip alignment格式作为基因型数据，将基因型数据导入Tassel 5(版本5.2.28)，并通过Filter中的sites功能将基因型数据中的非差异性位点去除，随后导入表型数据，使用Data中的Intersect Jion将基因型数据和表型数据结合，结合后的文件使用Analysis中的GLM(一般线性模型)进行关联分析，Manhattan Plot使用result中的功能实现。

1.8基于KASP技术SNP引物的设计

使用Tassel 5对waxy1比对的gDNA序列进行Pairwise LD分析，找到两个与waxy1功能性缺失标记紧密关联的SNP(r2>0.9)，并将其侧翼序列信息提交LGC公司 (Laboratoryof the Government Chemist，Hoddeston，UK)进行KASP引物的设计和合成(表2)；PCR体系为10μL，其中5μL DNA(10ngμL–1)，KASP Master mix 5μL(LGC Genomics，Hoddeston，UK)(组分包括通用的FRET cassette荧光引物，分别含有FAM荧光基团和HEX荧光基团，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP 和MgCl₂。),0.14μL KASP Assay mix(含有3种特异性的引物，包括通用反向引物以及根据SNP设计的分别含有FAM荧光基团和HEX荧光基团的正向引物两个)。PCR程序为94℃热激活15min；94℃变性20s，61～55℃退火和延伸60s，10个循环(touch-down，每循环降低0.6℃)；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，26个循环。荧光信号检测在Bio-Rad公司的CFX Connect荧光定量PCR仪上完成。可再次在RT-PCR上进行热循环以提高分型效果，程序为95℃变性20s，57℃退火和延伸1min， 8个循环。结果数据导出csv格式，编写R脚本绘制基因分型散点图。

表2KASP引物的基本信息

2.实验结果：

2.1基于全基因组关联分析技术挖掘直链淀粉表型紧密连锁分子标记

近年来，植物全基因组关联分析(GWAS)及基于候选基因的关联分析技术在解析复杂数量性状方面已得到广泛的利用。本发明通过碘染法测定了503份玉米自交系的直链淀粉含量和其对应的重测序基因型数据进行全基因组关联分析，目的在于挖掘潜在的与直链淀粉表型紧密连锁的SNP及开发新型的分子标记对糯玉米材料进行选育。GWAS分析结果表明(见图1)，采用MLM对直链淀粉进行关联分析的模型合理有效(图1B)，多个 SNP位点与直链淀粉含量呈现显著关联(注：位于虚线以上，P value<5×10^-8)(图 1A)，在各SNP的LD(连锁不平衡)衰减距离内，发现了多个注释基因可能与直链淀粉的调控相关，其中在9号染色体的第23,283,117bp位置(物理位置基于B73RefGen_v2) 的SNP与直链淀粉含量最显著相关，在其LD衰减距离内存在编码颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1)的基因waxy1(图1C)，GBSS1已被证明是直链淀粉合成的关键酶，waxy1基因的突变将导致籽粒胚乳中支链淀粉含量几乎为100％，只含少量直链淀粉，籽粒呈糯性。

该位置SNP信息为C或T，其中SNP T与低直链表型呈极显著相关(p<0.01，卡方检验)，在直链淀粉含量低于11％的14份材料中，有13份材料含有SNP T，仅一份为SNP C，在所有含有SNP T的26材料中直链淀粉含量低于22％的有15个(图2A),同时在500份玉米自交系中，含有SNP T的材料直链淀粉含量普遍偏低，中位数在15％左右，而含有SNP C的中位数在26％左右。因此该SNP位点可以作为分子标记对低直链玉米进行选育。

2.2基于候选基因的关联分析技术开发基因内选择标记

玉米是雌雄异株作物,其在选育过程中易受重组、选择、环境等变化的影响导致基因组中LD衰退。因此在上述结果中所挖掘的SNP虽然与表型紧密关联，但在基因组中的位置不够理想。基于候选基因的关联分析技术是根据表型筛选一些可能存在相互关系的基因进行关联分析，或者利用GWAS或QTL mapping分析所获得的候选区间，对该区间的所有基因再与表型进行关联分析。该方法直接对候选基因进行测序，分析候选基因序列的多态性进行关联分析，因此可以挖掘基因内的功能性标记，使所开发的分子标记更具适用性。

本发明根据已测定的503份玉米自交系直链淀粉含量的分布情况(见图3)，挑选59份自交系样品(见表3)，以waxy1作为候选基因进行关联分析，挖掘基因内的分子标记，结果如图4所示，经分析发现，有三处多态性差异与直链淀粉含量呈极显著相关, 分别是位于ATG起始(位置参考B73基因组)第1,289～1,321位点一个33bp的缺失，命名为Indel，以及第3,044位点和3242位点的两个SNP，命名为SNP1和SNP2，其中 indel和SNP1的-log₁₀(P)值为13.25，对表型的贡献率高达64.52％；SNP2的-log₁₀(P) 值为7.79，对表型的贡献率为44.28％。

表3用于候选基因waxy1关联分析和多重序列比对的59份玉米自交系

根据多重序列比对数据(图5，其中显示了waxy1关联分析所得到的3个显著性位点的具体序列信息及和糯玉米和非糯玉米的对应情况)和直链淀粉含量(见表3)进一步分析发现，其中编号2-13的样品均为糯玉米自交系，14-25为正常玉米自交系，Indel 普遍存在于糯玉米材料中，缺失位置信息为7号外显子末端的4bp及其相连的7号内含子的29bp，但与有些材料相比为26bp，由于缺失发生在外显子末端，因此影响了mRNA正常剪接，经cDNA测序发现，根据糯玉米材料的不同，7号内含子被不同程度的保留；SNP1 位于第14号外显子中部，糯玉米材料中普遍为T，其它材料为C，但编码的氨基酸未发生改变(由GCC变为GCT，都编码的是Ala)；SNP2位于3’UTR区，糯玉米材料中主要为A，其它材料主要G。由配对连锁不平衡分析可知，SNP1和SNP2与Indel紧密连锁 (r²>0.9)。

综上所述，该30～33bp的Indel缺失以及SNP1和SNP2与糯质表型呈现紧密连锁，同时它们位于waxy1基因内部，在杂交组合中不会被交换掉，可以作为筛选糯质材料的功能性分子标记，相比其他类标记更具有适用性。

2.3基于waxy1基因的indel标记的开发及验证

在中国糯玉米wx基因种质资源遗传多样性的研究中，也报道了第7个外显子和其中30bp的缺失并开发了分子标记引物，他们将632bp的扩增条带进行测序与比对，鉴定基因型。通常建立于测序之上的方法比较费时费钱，本发明开发了既能准确又能快速鉴定基因型的分子标记。针对waxy1基因内的30～33bp indel缺失，在两端保守区域设计引物获取合适大小的扩增片段，可以直接通过高浓度的琼脂糖凝胶电泳对糯玉米材料进行鉴定，相比丙烯酰胺凝胶电泳和Sanger测序更加的快捷高效。本发明共设计了5 对引物对indel标记进行验证，5对引物位置如图6所示，序列信息见表4，其中wxl5 为阴性对照(图7B)。根据序列比对数据可知，5对引物基本处在序列保守区域，因此具有材料广泛适用性。

本发明使用了3种不同浓度的琼脂糖凝胶(2％、3％，4％)对Indel标记进行鉴定，比较分析发现，3％的琼脂糖凝胶在较易制备的同时能在较短时间(约20min)内区分条带差异，同时由图7A可知，4对引物的扩增条带在12份低直链玉米材料均比正常玉米材料的条带要小；引物之间相比，wxl1和wxl2的分离效果较好，wxl2的分离效果最好；从测序结果可知wxl2的扩增产物在低直链玉米材料中的长度为70bp，正常玉米材料中的长度为100～103bp。

本发明同时用wxl2引物在503份的关联分析群体中复查，结合图2可知，该群体低于17％的玉米材料有15份，wxl2共检测出13份玉米材料含有indel缺失且完全包含在15份低直链玉米材料中。

表4waxy1-indel引物列表

本发明也对wxl2在市售玉米中的兼容性进行了鉴定，图7C中的2、4、6，8和10 泳道为正常玉米自交系，3、5、7，9和11泳道为网购粘糯玉米杂交种，粘糯玉米通常含有较低的直链淀粉含量，由图可知，wxl2具有极好的筛选效果。

2.4基于KASP技术的waxy1基因SNP标记的开发及验证

连锁不平衡(linkage disequlhbrium，LD)是指不同基因座上等位基因间的非随机关联,其可以是两个标记间或两个基因/QTL间或一个基因/QTL与一个标记座位间的非随机关联。其用D表示，取值范围为0-1，但其度量一般用归一化的D’值和r2值来检验，当D’或r2等于0时,说明该基因座之间不存在连锁不平衡；当D’或r2等于1时,说明基因座之间完全连锁不平衡，观察一个基因座就可以获得另一个基因座的全部信息。在 r²和D’中,D’较多地反映了重组率的影响,而r2可同时考虑重组率和突变率的影响, 因此,更能客观地反映不同基因座基因间的连锁不平衡关系。本发明通过关联分析和 Pairwise LD分析检测到了两个SNP(SNP1和SNP2)不仅与糯质表型极显著相关，同时还与waxy1功能性缺失标记(Indel)紧密连锁(r2>0.8)(图4)，因此通过鉴定两个SNP也可以对糯玉米材料进行筛选。

KASP技术即竞争性等位基因特异性PCR技术，是基于引物末端碱基的特异匹配激发不同的荧光，仅通过RT-PCR检测荧光即可对SNP进行分型，因此通过设计KASP引物可以更高效地对SNP标记进行鉴定。使用鉴定Indel标记相同的24份玉米自交系，基于KASP技术基因分型情况如下：其中WXT引物(基于SNP1)的SNP T对应12份糯玉米材料，激发HEX 荧光，C对应12份非糯玉米材料，激发FAM荧光；WXT2引物(基于SNP2)的SNP A对应12 份糯玉米材料，激发FAM荧光，G对应12份非糯玉米材料，激发HEX荧光(表2)，从两个 SNP引物的荧光信号二维图(图8)中可知，两个SNP引物都能将糯玉米及非糯玉米很好的区分开，但相比WXT(图8A)，WXT2(图8B)的分型更加聚合，但WXT与waxy1功能性缺失标记的连锁程度更好(图4)。

综上所述，本发明通过全基因组关联分析及候选基因的关联分析技术开发了wx基因内的三个选择标记：30-33bp Indel和两个SNPs。本发明开发验证的wxl2引物扩增的PCR产物(～100bp)比已经报道的(～632bp)要短，可直接通过3％浓度的琼脂糖凝胶电泳就可以比较～30bp的差异，无需测序或聚丙烯酰胺凝胶即可达到快速分离糯玉米和非糯玉米的目的。该方法对实验设备及化学试剂要求低，常规的分子生物学实验室即可完成，但对于大数量样本的基因型鉴定还是费时费力。因此本发明进一步开发了更灵活经济的SNP检测方法，该方法对仪器试剂的要求高，需要荧光定量PCR仪和KASP引物，但是这种基于竞争性等位基因特异性PCR对SNP基因分型的方法既便宜又快速。本发明验证开发的WXT2引物分型效果最好，可以将糯玉米及非糯玉米很好的区分开，这种高通量的方法将在促进筛选玉米重要农艺性状糯性或低直链淀粉中发挥重要作用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 基于关联分析和KASP开发waxy1基因内分子标记

<130> DAG28641

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl2_fwd

<400> 1

tcgtgctacc tcaagagcaa cta 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl2_rev

<400> 2

gagcatggag aacgaagacg g 21

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WXT Primer_AlleleFAM

<400> 3

cagcctcggg gtcgcc 16

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WXT Primer_AlleleHEX

<400> 4

ctcagcctcg gggtcgct 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WXT Primer_Common

<400> 5

cggcgcgatc tcctcgcctt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WXT2 Primer_AlleleFAM

<400> 6

ccactggcca ccactacact at 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WXT2 Primer_AlleleHEX

<400> 7

cactggccac cactacacta c 21

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> WXT2 Primer_Common

<400> 8

ttatgtgata tggacaagtr tgtgta 26

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl1_fwd

<400> 9

tccatccata caaggggagg ac 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl1_rev

<400> 10

agcatggaga acgaagacgg 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl3_fwd

<400> 11

tacctcaaga gcaactacca gtc 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl3_rev

<400> 12

ggagatgttg tggatgcaga aag 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl4_fwd

<400> 13

tccatccata caaggggagg ac 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl4_rev

<400> 14

cctggtagga gatgttgtgg at 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl5_fwd

<400> 15

gcctcaacaa caacccatac ttc 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wxl5_rev

<400> 16

gaaggcaacc tttgcgtccc 20

Claims

1.一种基于关联分析及KASP技术开发waxy1基因内分子标记的方法，其特征在于，通过碘染法测定了多份玉米自交系的直链淀粉含量并结合其对应的重测序基因型数据，以waxy1作为候选基因进行关联分析，获得waxy1基因内与直链淀粉含量显著相关的一个indel和两个snp分子标记，并通过配对连锁不平衡检验验证了indel标记与两个snp标记紧密连锁，并利用KASP技术设计了两个snp的引物可实现对糯质玉米的鉴定。

2.根据权利要求1所述的基于关联分析及KASP技术开发waxy1基因内分子标记的方法，其特征在于，所述关联分析具体为：结合表型数据通过全基因组关联分析筛选一些可能存在相互关系的基因作为候选基因，按表型数据分布再选择一个子群体对候选基因进行测序，分析候选基因序列的多态性进行关联分析；或者利用GWAS或QTL mapping分析所获得的候选区间，对该区间的所有基因再与表型进行关联分析。

3.据权利要求1所述的基于关联分析及KASP技术开发waxy1基因内分子标记的方法，其特征在于，所述KASP技术开发SNP引物具体为：对子群体的候选基因的基因型数据进行配对连锁不平衡检验，获得与indel标记紧密连锁的两个SNP位点，并设计竞争性等位基因特异性PCR引物，对SNP进行基因分型，鉴定糯质玉米。

4.根据权利要求1所述的基于关联分析及KASP技术开发waxy1基因内分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S3、将群体自交系的表型数据与相应的SNP数据，通过使用GAPIT软件中的压缩混合线性模型来进行全基因组关联分析，获得显著的SNP区间内的候选基因waxy1进行后续分析；

S4、克隆多份子群体waxy1基因gDNA全长，并进行多重序列比对，获得Phylipalignment格式的基因型数据，导入Tassel 5使用GLM进行基于候选基因的关联分析，获得在waxy1基因内与直连淀粉显著相关的多态性位点；

S5、使用Tassel 5对子群体的基因型数据进行配对连锁不平衡检验，分析显著性位点间的连锁不平衡程度，获得与中国糯质玉米主要突变类型indel标记显著相关的两个SNP，针对SNP的侧翼序列信息进行KASP引物的设计和合成，使用糯质玉米和非糯质玉米对两个SNP引物适用性进行鉴定。

5.一种玉米糯质的Indel分子标记，其特征在于，是位于waxy1基因第7个外显子末端的30～33bp缺失的Indel。

6.一种如权利要求5所述的玉米糯质的Indel分子标记的引物，其特征在于，可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，所述引物包括wx12引物，其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种玉米糯质的SNP分子标记，其特征在于，包括位于waxy1基因第14个外显子的SNP1和位于3’UTR区的SNP2。

8.一种如权利要求7所述的玉米糯质的SNP分子标记的KASP引物，其特征在于，分子标记SNP1对应的WXT引物包括：如SEQ ID NO.3所示的引物1、如SEQ ID NO.4所示的引物2、如SEQ ID NO.5所示的引物3；分子标记SNP2对应的WXT2引物包括：如SEQ ID NO.6所示的引物4、如SEQ ID NO.7所示的引物5、如SEQ ID NO.8所示的引物6。

9.一种如权利要求5所述的玉米糯质的Indel分子标记或如权利要求7所述的玉米糯质的SNP分子标记在检测玉米基因型、筛选糯质玉米或分子标记辅助选择育种中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，在利用Indel分子标记筛选糯质玉米中，针对waxy1基因内的Indel缺失，在两端保守区域设计引物获取扩增片段，直接通过高浓度的琼脂糖凝胶电泳对糯玉米材料进行鉴定。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，在利用SNP分子标记筛选糯质玉米中，利用KASP引物进行PCR扩增，WXT引物的SNP T在低直链玉米材料中激发HEX荧光，SNP C在非低直链玉米材料中激发FAM荧光；WXT2引物的SNP A在低直链玉米材料中激发FAM荧光，SNP G在非低直链玉米材料中激发HEX荧光。