CN107929278A - 长管香茶菜甲素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 - Google Patents

长管香茶菜甲素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了长管香茶菜甲素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用。长管香茶菜甲素(LK‑A)是从三叶香茶菜属中提取出来的一种对映‑贝壳杉烷型二萜类化合物，主要通过在体内外诱导细胞凋亡来发挥对食管鳞癌细胞的杀伤作用。通过实验证明：LK‑A在体外可以抑制食管鳞癌细胞生长并诱导G2/M期阻滞。此外，LK‑A在体内裸鼠移植瘤模型中也非常有效。LK‑A通过提高ROS水平和激活JNK和p38MAPK通路从而引起食管鳞癌细胞凋亡，该化合物前体具有成为治疗食管鳞癌药物的潜力。

Description

长管香茶菜甲素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及长管香茶菜甲素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用。
背景技术
食管癌是我国最常见的癌症之一，其发病率和死亡率始终高居不下。其中食管鳞状细胞癌(ESCC)是我国食管癌的主要类型，约占总病例的90％以上，5年总体生存率约15-25％。食管鳞癌的主要治疗手段包括手术、化疗和放疗，但是治疗效果不尽如人意。因此，迫切需要开发新的可以用于治疗食管鳞癌的药物。许多抗癌药物源自植物、动物和海洋生物的小分子。自然界仍然是抗癌新药的重要来源之一，从20世纪40年代到2014年底的这段时间内，已批准的175个小分子药物中有131个实际上就是天然产物或直接来源于它们。
细胞凋亡在抗癌药物发挥作用的机制中起重要作用。活性氧(ROS)广泛参与各种生理过程，并可以诱导细胞凋亡。ROS是一柄双刃剑，因为过量的ROS增加可以通过不同的机制诱导细胞凋亡。许多信号通路可能受到ROS的影响，其中包括MAPK通路，其主要成分包括N末端激酶(JNK)、p38和细胞外信号调节激酶(ERK)。JNK和p38 MAPK通路都可以介导细胞外刺激引起的细胞凋亡，如使用化疗药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何抑制食管鳞癌细胞增殖。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了长管香茶菜甲素的新用途。
本发明提供了长管香茶菜甲素在如下A1)至A11)中至少一种中的应用：
A1)制备抑制食管鳞癌细胞的增殖和/或生长的产品；
A2)制备抑制食管鳞癌细胞的克隆形成的产品；
A3)制备诱导食管鳞癌细胞周期阻滞的产品；
A4)制备抑制食管鳞癌细胞的DNA修复的产品；
A5)制备诱导和/或促进食管鳞癌细胞凋亡的产品；
A6)制备上调促进细胞凋亡蛋白的表达量的产品；
A7)制备下调抵抗细胞凋亡蛋白的表达量的产品；
A8)制备诱导食管鳞癌细胞活性氧(ROS)增加的产品；
A9)制备诱导和/或激活食管鳞癌细胞JNK MAPK通路的产品；
A10)制备诱导和/或激活食管鳞癌细胞p38 MAPK通路的产品；
A11)制备抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长的产品。
长管香茶菜甲素在如下B1)至B11)中至少一种中的应用也属于本发明的保护范围。
B1)抑制食管鳞癌细胞的增殖和/或生长；
B2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；
B3)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；
B4)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；
B5)诱导和/或促进食管鳞癌细胞凋亡；
B6)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；
B7)下调抵抗细胞凋亡蛋白的表达量；
B8)诱导食管鳞癌细胞活性氧(ROS)增加；
B9)诱导和/或激活食管鳞癌细胞JNK MAPK通路；
B10)诱导和/或激活食管鳞癌细胞p38 MAPK通路；
B11)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长。
上述应用中，所述促进细胞凋亡蛋白具体可为Cleaved caspase-3、Cleavedcaspase-9、Cleaved PARP、γH2AX、Bax、Bcl-2和细胞色素c中至少一种；
所述抵抗细胞凋亡蛋白具体可为Bcl-2。
上述应用中，所述细胞周期具体可为G2/M期。
上述应用中，所述食管鳞癌细胞具体可为KYSE30细胞或KYSE450细胞。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，其活性成分为长管香茶菜甲素；
所述产品的功能为如下A1)至A11)中的至少一种：
A1)抑制食管鳞癌细胞的增殖和/或生长；
A2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；
A3)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；
A4)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；
A5)诱导和/或促进食管鳞癌细胞凋亡；
A6)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；
A7)下调抵抗细胞凋亡蛋白的表达量；
A8)诱导食管鳞癌细胞活性氧(ROS)增加；
A9)诱导和/或激活食管鳞癌细胞JNK MAPK通路；
A10)诱导和/或激活食管鳞癌细胞p38 MAPK通路；
A11)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长。
上述产品中，所述促进细胞凋亡蛋白具体可为Cleaved caspase-3、Cleavedcaspase-9、Cleaved PARP、γH2AX、Bax、Bcl-2和细胞色素c中至少一种；
所述抵抗细胞凋亡蛋白具体可为Bcl-2。
上述产品中，所述细胞周期具体可为G2/M期。
上述产品中，所述食管鳞癌细胞具体可为KYSE30细胞或KYSE450细胞。
所述产品具体可为药物。
上述应用或产品中，所述长管香茶菜甲素具体可为三叶香茶菜提取物，所述三叶香茶菜提取物具体可为三叶香茶菜酮提物，所述酮具体可为丙酮。
所述三叶香茶菜提取物的制备方法可包括如下步骤：以三叶香茶菜的叶子为原料，依次进行丙酮浸泡、乙酸乙酯萃取、硅胶色谱柱分析、薄层色谱法检测、MCI脱色、甲醇洗脱和重结晶。
在本发明的具体实施例中，所述三叶香茶菜提取物的具体制备方法如下：
1)将三叶香茶菜的叶子依次进行干燥和研磨，得到粉末状样品；
2)将所述粉末状样品在丙酮水溶液中浸泡，浸泡后过滤，收集滤液；
3)将所述滤液进行减压蒸馏，去除所述滤液中的丙酮，得到粗提取液；
4)向所述粗提取液中加入乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液；
5)使用硅胶色谱柱分离所述乙酸乙酯萃取液，得到乙酸乙酯提取物；
6)将所述乙酸乙酯提取物先用薄层色谱法检测，合并相同部分，得到5个馏分；然后将馏分二依次进行MCI脱色、甲醇水溶液洗脱和甲醇溶解重结晶，得到的固体物质即为长管香茶菜甲素。长管香茶菜甲素的结构如图1A所示。
上述方法中，所述丙酮水溶液具体可为体积分数为70％的丙酮水溶液。所述丙酮水溶液与所述粉末状样品的配比可为100L：10Kg。所述浸泡的时间具体可为3d。
所述硅胶色谱柱为填充有200-300目孔径硅胶的硅胶色谱柱；
所述甲醇水溶液具体可为体积分数为90％的甲醇水溶液。
在发明发现来自三叶香茶菜属的对映-贝壳杉烷型二萜类化合物长管香茶菜甲素(LK-A)在体外对食管鳞癌细胞增殖具有强烈的抑制作用，在体内也可以显著抑制裸鼠移植瘤的生长。LK-A可以导致细胞内ROS水平升高，促使食管鳞癌细胞发生凋亡和G2/M期阻滞，同时，LK-A在正常细胞中没有表现明显的细胞毒性作用，在体内裸鼠模型中也无明显脏器毒性，这表明该化合物具有抗食管鳞癌作用的同时具有一定的安全性。以上研究结果表明，LK-A可通过提高ROS水平，激活JNK和p38MAPK通路引起食管鳞癌细胞的凋亡，具有治疗食管鳞癌药物的潜力。
附图说明
图1为LK-A抑制KYSE30和KYSE450细胞增殖和克隆形成。A为LK-A的化学结构式。B为通过CCK-8法测定KYSE30、KYSE450、NIH3T3和HEK-293细胞增殖。C为不同剂量的LK-A对KYSE30和KYSE450细胞集落形成的影响。D为长管香茶菜甲素的质谱分析。E为长管香茶菜甲素的1H核磁共振波谱检测。F为长管香茶菜甲素的13C核磁共振波谱检测。G为长管香茶菜甲素的色谱分析。
图2为LK-A诱导KYSE30和KYSE450细胞G2/M期阻滞。A为LK-A在KYSE30和KYSE450细胞中诱导G2/M期阻滞。B为KYSE30和KYSE450细胞系在细胞周期不同阶段所占百分比。C为通过Western blot测定G2/M细胞周期检查点相关蛋白(cyclin B1和cdc2)的表达水平。
图3为LK-A诱导KYSE30和KYSE450细胞凋亡。A为用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定LK-A诱导的KYSE30和KYSE450细胞凋亡。B和C为不同浓度的LK-A处理KYSE30和KYSE450细胞24h后Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cleaved PARP、γH2AX、Bax、Bcl-2和细胞色素c的蛋白表达水平。D为LK-A通过caspase的活化诱导细胞凋亡。
图4为LK-A诱导KYSE30和KYSE450细胞凋亡需要ROS的增加。A为LK-A对ROS水平的影响。B为抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对LK-A诱导的细胞凋亡的影响。
图5为JNK和p38MAPK通路介导LK-A诱导的KYSE30和KYSE450细胞凋亡。A为LK-A对KYSE30和KYSE450细胞中JNK/p-JNK、p38/p-p38和Erk/p-Erk表达水平的影响。B为JNK通路抑制剂对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡的影响。C为p38通路抑制剂对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡的影响。D为NAC对LK-A引起的JNK和p38 MAPK激活的影响。
图6为LK-A抑制食管鳞癌小鼠异种移植物模型中的肿瘤生长。A为不同处理组别间的肿瘤大小比较。B、C和D为不同处理组别间的肿瘤体积、肿瘤重量和裸鼠体重。E为LK-A的治疗未引起明显的脏器毒性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，所有实验均重复三次之后取平均值，以均数±标准差的形式表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(与对照组相比)。
下述实施例中的CCK-8试剂是日本Dojindo公司的产品。细胞周期检测试剂盒和Annexiv-FITC细胞凋亡检测试剂盒是中国凯基生物的产品。结晶紫、NAC和过氧化物敏感型荧光探针DCFH-DA均是中国碧云天的产品。JNK抑制剂(SP600125)、p38 MAPK抑制剂(SB202190)及用于Western blot的所有抗体均为Cell Signaling Technologies Inc.(Danvers，MA，USA)的产品。
下述实施例中的KYSE30细胞、KYSE450细胞、NIH3T3细胞和HEK-293细胞均由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供。经过STR鉴定，KYSE30细胞和KYSE450细胞均符合日本细胞库(JCRB)提供的STR位点谱。KYSE30细胞、KYSE450细胞和NIH3T3细胞均使用添加胎牛血清(Gibco，New York，NY，USA)、青霉素和链霉素的RMPI 1640培养基(HyClone，Logan，UT，USA)进行培养，HEK-293细胞使用添加胎牛血清、青霉素和链霉素的MEM培养基(HyClone，Logan，UT，USA)进行培养，培养基中添加体积分数为10％的胎牛血清、工作浓度为1％的(100U/ml)青霉素和工作浓度为1％的(100μg/ml)链霉素。所有细胞在37℃，5％CO2的恒温培养箱(Thermo，USA)中培养。本发明使用的所有细胞系均通过短串联重复(STR)检测进行鉴定，并排除支原体的存在。
下述实施例中的雌性BALB/cA-nu无特定病原体级的裸鼠(SPF，4周龄)是北京华阜康生物科技股份有限公司的产品。每只裸鼠重量约为18g，饲养于中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心。
下述实施例中所有数据的统计分析均使用GraphPad Prism 6.0软件，将数据表示为平均值±标准差，并通过单因素方差分析或Student's t test检验比较各组实验数据。p<0.05被认为差异具有统计学意义的标准。
下述实施例中PBS(pH 7.4)的制备方法：称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶解于800mL蒸馏水，浓盐酸调节pH值至7.4，定容至1L。
实施例1、长管香茶菜甲素(LK-A)的制备及鉴定
一、长管香茶菜甲素(LK-A)的制备
1、将在中国广西金秀采集的三叶香茶菜的叶子依次进行干燥和研磨，得到粉末状样品；取10千克粉末状样品，将其在100升体积分数为70％丙酮水溶液中浸泡3天，然后过滤，收集滤液。
2、在低压条件下蒸发步骤1获得的滤液(减压蒸馏)，去除滤液中的丙酮，得到粗提取液。
3、向步骤2获得的粗提取液中加入乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，每次乙酸乙酯15升，得到乙酸乙酯萃取液。
4、使用填充有200-300目孔径硅胶的硅胶色谱柱分离步骤3获得的乙酸乙酯萃取液(938.5g)。流动相由氯仿(A)和丙酮(B)组成，用氯仿–丙酮(1:0，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，0:1)梯度洗脱，薄层色谱法(TLC)检测并合并相同部分，得到A、B、C、D、E共5个组分。
5、将组分B(618.5g)在MCI凝胶上脱色，然后用体积分数为90％的甲醇水溶液洗脱，得到组分B1-B4，再通过重复硅胶柱色谱法分离，洗脱体系(石油醚：丙酮为(20:1)-(2:1))，得到组分B1(116g)和B2(135g)，两个组分溶于甲醇中进行重结晶，即得到LK-A粉末(20g)。LK-A的化学结构式如图1A所示。LK-A的结构是一种对映-贝壳杉烷型二萜类化合物。
6、将步骤5获得的LK-A粉末溶于二甲基亚砜(DMSO)，得到LK-A溶液，LK-A溶液中LK-A浓度为50mM，将LK-A溶液在-20℃保存。下述实验研究中所使用LK-A溶液即为此处制备的LK-A溶液，使用时可用RMPI 1640培养基将LK-A溶液稀释至所需工作浓度。
二、长管香茶菜甲素的结构鉴定和纯化分析
1、将步骤一的5中获得的LK-A粉末分别进行质谱分析、1H核磁共振波谱检测和13C核磁共振波谱检测。检测步骤参考文献“Fujita,Tetsuro,Takeda,Yoshio,Shingu,Tetsuro,Longikaurin Aand B；new,biologically active diterpenoids from Rabdosialongituba,J From Journal of the Chemical Society,Chemical Communications(1980),(5),205-7.”中的方法。检测结果依次如图1D、图1E和图1F。
长管香茶菜甲素：白色粉末；C20H28O5，质谱m/z 371.1837([M+Na]+，calcd for371.1829)；
1H核磁共振(400MHz，CDCl3)：δH 6.54(1H，s，OH)，6.52(1H，s，OH)，6.18(1H，s，H-17a)，5.56(1H，s，H-17b)，4.82(1H，br s，H-14α)，4.11(1H，d，J＝9.9Hz，H-20a)，3.82(1H，d，J＝9.9Hz，H-20b)，3.77(1H，m，H-6α)，3.06(1H，br d，J＝9.4Hz，H-13)，1.10(3H，s，H-18)，1.09(3，H，H-19)。
13C核磁共振(100MHz，CDCl3)：δC 31.0(t，C-1)，18.5(t，C-2)，41.1(t，C-3)，33.6(s，C-4)，59.2(d，C-5)，72.6(d，C-6)，97.3(s，C-7)，62.0(s，C-8)，52.8(d，C-9)，36.3(s，C-10)，16.6(t，C-11)，29.5(t，C-12)，42.7(d，C-13)，74.1(d，C-14)，207.3(s，C-15)，151.2(s，C-16)，120.8(t，C-17)，33.3(q，C-18)，22.3(q，C-19)，66.8(t，C-20)。
2、在Agilent 1200液相色谱仪上对步骤一的5中获得的LK-A粉末进行纯化分析，使用Zorbax SB-C18(4.6毫米×250毫米)色谱柱(10-100％CH3CN：H2O，30分钟，238纳米，1毫升/分钟)。结果表明：LK-A粉末的纯度大于98％(图1G)。
上述结果表明，本发明制备的白色粉末状的固体物质为长管香茶菜甲素。
实施例2、LK-A在抑制食管鳞癌细胞增殖和克隆形成中的应用
一、LK-A抑制食管鳞癌细胞的增殖
为了研究LK-A对食管鳞癌细胞系(KYES30和KYSE450)的影响，进行了CCK-8实验。具体步骤如下：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(食管鳞癌细胞系KYSE30或KYSE450，小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取96孔细胞培养板，每孔加入100μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约3000个细胞)，12h左右，待细胞贴壁后换液为100μL LK-A溶液，得到细胞培养体系，使LK-A在细胞培养体系中的浓度分别为0μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、4μM、6μM和8μM，在5％CO2、37℃条件下培养24h或48h；然后每孔加入100μL含10％CCK8(10μL/1mL)的RPMI-1640培养基，并孵育2-4h。采用酶标仪检测在450nm处的吸光值。
在96孔细胞培养板中设置阴性对照孔，每个阴性对照孔加入100μL步骤1所得细胞悬浮液，即每孔约3000个细胞。阴性对照组待细胞贴壁后换液为100μL含0.1％DMSO(v/v)的RPMI-1640培养液(与LK-A溶液同一时间点换液)，在5％CO2、37℃培养24h或48h；然后每孔加入100μL含10％CCK8(10μL/mL)的RMPI 1640培养基，并孵育2-4h。采用酶标仪检测阴性对照孔在450nm处的吸光值。
以LK-A在孔中的浓度为横坐标，相对活性为纵坐标，比较LK-A处理后待测细胞的增殖程度。相对活性根据下述公式计算：相对活性(％)＝(LK-A溶液在450nm处的吸光值-阴性对照在450nm处的吸光值)/(阳性对照在450nm处的吸光值-阴性对照在450nm处的吸光值)×100％。阳性对照是指LK-A浓度为0μM的组。
所有实验均重复三次之后取平均值，以均数±标准差的形式表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实验结果表明：LK-A通过时间和剂量依赖的方式来抑制两种食管鳞癌细胞系(KYES-30和KYSE-450)的增殖(图1B)。LK-A对KYSE-30和KYSE-450细胞增殖抑制24h时，IC50值分别为1.259μM和1.370μM。为了验证LK-A的安全性，检测了LK-A对正常细胞系即小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)及人胚肾细胞HEK-293细胞的毒性作用。实验结果表明：在NIH3T3细胞系中LK-A的IC50值约为3.941μM，HEK-293细胞中LK-A的IC50值约为5.744μM，远高于两个食管鳞癌细胞系的相应IC50值(图1B)。说明LK-A是一种相对有效而安全的药物。
二、LK-A抑制食管鳞癌细胞的克隆形成
为了研究LK-A对食管鳞癌细胞系(KYES30和KYSE450)集落形成的影响，进行了如下实验：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养食管鳞癌细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约400个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后加入LK-A溶液，使LK-A浓度分别为0.1μM、0.2μM和0.3μM，在5％CO2、37℃条件培养48h。同时以含0.1％(v/v)DMSO的RPMI-1640培养基作为对照。
3、培养1周后，将肉眼可见克隆用多聚甲醛固定30分钟，然后用0.1％结晶紫染色，以进行可视化和计数。
实验结果表明：LK-A可以在低浓度时明显抑制食管鳞癌的克隆形成。使用LK-A处理48h，可以通过剂量依赖的方式显著抑制食管鳞癌细胞系(KYES30和KYSE450)中的克隆形成(图1C)。
实施例3、LK-A在诱导食管鳞癌细胞周期阻滞中的应用
一、LK-A对食管鳞癌细胞周期的影响
为了研究LK-A是否通过诱导细胞周期阻滞发挥其作用，研究了LK-A对KYSE30和KYSE450细胞系中细胞周期的影响。具体步骤如下：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件培养12h；然后加入LK-A溶液，使LK-A浓度为1μM、2μM和3μM，在5％CO2、37℃条件培养48h。同时以含0.1％(v/v)DMSO的RPMI-1640培养基作为对照。
3、用PBS洗涤LK-A处理后细胞及对照细胞，然后在4℃下用冷冻的70％乙醇固定过夜。
4、用PBS洗涤固定的细胞，用RNase A孵育30分钟去除RNA，再用碘化丙啶(PI)染色30分钟。
5、通过流式细胞仪分析检测记录激发波长488nm处红色荧光，使用分析软件计算并分析细胞周期不同阶段G2/M期细胞、S期细胞和G0/G1期细胞所占百分比。
实验结果表明：与对照相比，LK-A处理的G2/M期食管鳞癌细胞的百分比显著增加。说明LK-A可影响食管鳞癌细胞周期进程，诱导食管鳞癌细胞G2/M期阻滞(图2A和2B)。
二、LK-A对食管鳞癌细胞周期相关蛋白的表达水平的影响
为了研究LK-A对参与调控G2/M期检查点的特异性细胞周期相关蛋白的表达水平的影响。进行了如下实验：
1、提取上述步骤一的2中的LK-A处理后细胞的总蛋白。
2、采用DNADamage Antibody Sampler Kit对细胞总蛋白进行Western blot。采用Cdc2Antibody检测Cdc2，采用Cyclin B1Antibody检测Cyclin B1，采用GAPDH Antibody检测GAPDH。
实验结果表明：和对照细胞相比，LK-A处理后细胞中的cdc2和Cyclin B1的表达水平降低(图2C)。说明LK-A通过下调CylinB1和cdc2表达来诱导食管鳞癌细胞G2/M周期阻滞。
实施例4、LK-A在诱导食管鳞癌细胞凋亡中的应用
一、LK-A诱导食管鳞癌细胞凋亡
细胞凋亡是在20世纪70年代初被定义的。癌细胞的关键特征之一是可以抑制细胞的凋亡。凋亡通过两种主要途径发生，即外源性途径(死亡受体途径)和内源性途径(线粒体途径)，这些途径促进细胞凋亡的分子机制已被阐明。Bcl-2蛋白的两个主要组分是：促进凋亡的Bcl-2蛋白(即Bad、Bid和Bax)和抵抗凋亡的Bcl-2蛋白(即Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1)。Bcl-2家族包含几种促生存和促死亡的蛋白。为了研究LK-A诱导食管鳞癌细胞凋亡的能力及LK-A对食管鳞癌细胞系是否具有促凋亡作用，进行了AnnexinV/PI染色和流式细胞分析。具体步骤如下：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后加入LK-A溶液，使LK-A浓度为0μM、1μM、2μM和3μM，在5％CO2、37℃条件下培养24h或48h，然后收集细胞。以LK-A浓度为0μM的处理组作为对照组。
3、用PBS洗涤收集到的细胞，然后用Annexin V-FITC和PI染色，之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平(Becton Dickinson FACSCantoII，NJ，USA)，并使用凯基的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。
实验结果表明：和对照组相比，不同浓度的LK-A处理的食管鳞癌细胞(KYSE30细胞和KYSE450细胞)发生凋亡的比例显著增加，且LK-A浓度越高，则发生凋亡的比例越高。说明LK-A可以促进食管鳞癌细胞凋亡，并呈现剂量和时间依赖性(图3A)。
二、LK-A对细胞凋亡蛋白表达水平的影响
为了研究LK-A对细胞凋亡蛋白表达水平的影响，通过Western blot测定LK-A处理食管鳞癌细胞24h后的Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cleaved PARP、γH2AX、Bax、Bcl-2和细胞色素c的蛋白表达水平，同时以GAPDH为内参。
实验结果表明：随着LK-A剂量的增加，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达水平逐渐增加(图3B)。另外，在KYSE30和KYSE450细胞中，γH2AX的蛋白表达水平随着LK-A的剂量增加而升高，γH2AX(双链断裂的特异性标志物)是一种DNA损伤标志物，γH2AX的升高表明LK-A作用后造成了细胞DNA的损伤。Bax和细胞色素C蛋白表达水平也随着LK-A的剂量增加而升高。而Bcl-2蛋白表达水平随着LK-A的剂量增加而降低。Bcl-2/Bax比例的改变引起细胞色素C、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达的变化(图3C)。
三、LK-A通过caspase的活化诱导细胞凋亡
为了研究LK-A诱导的细胞凋亡是否需要caspase的活化，进行了如下实验：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；分别向各孔细胞中加入一种可渗透细胞的caspase的抑制剂合成肽Z-VAD(OMe)-FMK(CST，60322S)，使其在细胞培养体系中的浓度为10μM；在5％CO2、37℃条件下预处理2h。同时以不加Z-VAD(OMe)-FMK为对照。
3、然后向各孔细胞中再加入LK-A溶液，使LK-A浓度为3μM，在5％CO2、37℃条件下培养24h，然后收集细胞。同时以不加LK-A为对照。
4、用PBS洗涤收集到的细胞，然后用Annexin V-FITC和PI染色，之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平(Becton Dickinson FACSCantoII，NJ，USA)，并使用凯基的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。
实验结果表明：使用Z-VAD(OMe)-FMK可以部分逆转LK-A诱导的细胞凋亡。说明LK-A通过caspase的活化诱导细胞凋亡。
实施例5、ROS在LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡中发挥的作用
一、LK-A对食管鳞癌细胞中ROS的影响
研究表明细胞内过量的ROS产生可以诱导多种类型的癌细胞凋亡。为了研究LK-A对食管鳞癌细胞中ROS的影响，进行了如下实验：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后加入LK-A溶液，使LK-A浓度分别为1μM、2μM和3μM，在5％CO2、37℃条件下培养12h。同时以含0.1％DMSO(v/v)的RPMI-1640培养液处理作为对照组。
3、LK-A处理后，取6孔板，向各孔中加入荧光探针DCFH-DA(Beyotime，China)，使其在细胞培养体系中的浓度为10μM，37℃孵育20分钟，收集细胞。
4、用PBS洗涤细胞两次，将其重新悬浮在PBS中，通过流式细胞仪测定平均DCF荧光值来检测ROS水平变化。
实验结果表明：LK-A处理引起食管鳞癌细胞中ROS的升高，并呈剂量依赖性(图4A)。说明ROS升高可能是导致食管鳞癌细胞凋亡的原因。
二、ROS介导LK-A诱导食管鳞癌细胞凋亡
为了验证抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)是否可以逆转LK-A诱导的细胞凋亡，进行了如下实验：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后向各孔中加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)，使抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)浓度为10mM，在5％CO2、37℃条件下预处理1h。同时以不加NAC处理作为对照组。
3、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理后，向各孔中加入LK-A溶液，使LK-A浓度为3μM，在5％CO2、37℃条件下培养12h后收集细胞。同时以不加LK-A处理作为对照。
4、用PBS洗涤收集到的细胞，然后用Annexin V-FITC和PI染色，之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平(Becton Dickinson FACSCantoII，NJ，USA)，并使用凯基的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。
实验结果表明：NAC可以显著逆转LK-A诱导的细胞凋亡(图4B)。
以上结果表明：LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡可能由ROS介导，同时可被抗氧化剂NAC逆转。
实施例6、LK-A通过激活JNK/p38通路诱导食管鳞癌细胞凋亡
一、LK-A对MAPK激酶活性的影响
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的主要成分包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶或应激活化蛋白激酶(JNK或SAPK)和p38，它在抗肿瘤药物作用中发挥重要作用。研究表明，JNK和p38MAPK的激活在各种抗癌剂诱导的癌细胞凋亡中起关键作用。为了研究LK-A对MAPK激酶活性的影响，检测了LK-A对KYSE30和KYSE450细胞中JNK/p-JNK，p38/p-p38和Erk/p-Erk表达水平的影响。具体步骤如下：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后加入LK-A溶液，使LK-A浓度为1μM、2μM和3μM，在5％CO2、37℃条件下培养24h。同时以含0.1％DMSO(v/v)的RPMI-1640培养液处理作为对照组。
3、提取上述步骤2中的LK-A处理后细胞的总蛋白，通过Western blot检测LK-A处理后细胞中JNK/p-JNK，p38/p-p38和Erk/p-Erk的表达水平。
实验结果表明：LK-A处理24h后JNK和p38磷酸化水平均升高，而Erk/p-Erk的表达水平无显著性改变(图5A)。
二、JNK和p38通路抑制剂对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡的影响
为了研究JNK和p38通路对于LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡是否至关重要，进行了如下实验：
1、JNK通路抑制剂对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡的影响
(1)用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
(2)取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后加入JNK抑制剂SP600125，使SP600125在细胞培养体系中的浓度为5μM，在5％CO2、37℃条件下培养1h。同时以不加JNK抑制剂SP600125处理作为对照组。
(3)SP600125处理后，取6孔板，向各孔中加入LK-A溶液，使LK-A浓度为3μM，在5％CO2、37℃条件下培养24h，收集细胞。同时以不加LK-A处理作为对照组。
(4)用PBS洗涤收集到的细胞，然后用Annexin V-FITC和PI染色，之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平(Becton Dickinson FACSCantoII，NJ，USA)，并使用凯基的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。
2、p38通路抑制剂对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡的影响
按照步骤1中的方法，将JNK抑制剂SP600125替换为p38通路抑制剂SB202190，且保持其他步骤不变，检测p38通路抑制剂对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡的影响。
实验结果表明：LA-K处理前2h用JNK抑制剂SP600125或p38MAPK抑制剂SB202190预处理可以减弱LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡(图5B和图5C)。
三、NAC对LK-A引起的JNK和p38MAPK激活的影响
MAPK通路可通过ROS激活，为了研究NAC对LK-A引起的JNK和p38 MAPK激活的影响，进行了如下实验：
1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100U/mL)青霉素和1％(100μg/mL)链霉素的RPMI-1640培养基培养细胞(KYSE30细胞或KYSE450细胞)至对数增殖期，然后消化重悬，得到细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1950μL RPMI-1640培养基和50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约1.2×105个细胞)，在5％CO2、37℃条件下培养12h；然后向各孔中加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)，使抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)在细胞培养体系中的浓度为10mM，在5％CO2、37℃条件下预处理1h。同时以不加NAC处理作为对照组。
3、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理后，向各孔中加入LK-A溶液，使LK-A浓度为3μM，在5％CO2、37℃条件下培养12h后收集细胞。同时以不加LK-A处理作为对照。
4、提取上述步骤3中的LK-A处理后细胞的总蛋白，通过Western blot检测LK-A处理后细胞中JNK/p-JNK和p38/p-p38的表达水平。
实验结果表明：NAC处理后降低了JNK和p38磷酸化水平，说明ROS引起了LK-A诱导的p-JNK和p-p38的变化(图5D)。综上所述，JNK和p38 MAPK磷酸化和ROS的产生可能对LK-A诱导的食管鳞癌细胞凋亡发挥协同作用。
实施例7、LK-A抑制食管鳞癌小鼠异种移植物模型中的肿瘤生长
为了研究LK-A的体内抗肿瘤活性，进行了如下实验：
1、将雌性BALB/cA-nu无特定病原体级的裸鼠(SPF，4周龄)随机分成如下四组(每组5只)：LK-A(6mg/kg)组、LK-A(12mg/kg)组、顺铂(DDP)组和对照组，分别进行如下处理：
LK-A(6mg/kg)组：将KYSE30细胞皮下注射到裸鼠右侧背部(细胞注射量为1.2×106个)，移植后每三天腹腔注射LK-A，持续3周后取出肿瘤。注射剂量均为6mg LK-A/kg裸鼠。
LK-A(12mg/kg)组：将KYSE30细胞皮下注射到裸鼠右侧背部(细胞注射量为1.2×106个)，移植后每三天腹腔注射LK-A，持续3周后取出肿瘤。注射剂量均为12mg LK-A/kg裸鼠。
顺铂(DDP)组：将KYSE30细胞皮下注射到裸鼠右侧背部(细胞注射量为1.2×106个)，移植后每三天腹腔注射LK-A，持续3周后取出肿瘤。注射剂量均为2mg LK-A/kg裸鼠。
对照组：将KYSE30细胞皮下注射到裸鼠右侧背部(细胞注射量为1.2×106个)，移植后每三天腹腔注射0.1％DMSO，持续3周后取出肿瘤。注射剂量均为200μL。
2、测量各组小鼠的肿瘤体积并按组取平均值；称量各小鼠的肿瘤重量并按组取平均值；每3天测量肿瘤体积和裸鼠体重一次，持续3周。并以注射时间为横坐标，平均肿瘤体积或肿瘤重量为纵坐标，绘制肿瘤生长曲线。
实验结果表明：与对照组相比，LK-A组和DDP组明显抑制了移植瘤的生长，并显著降低了移植瘤的重量和体积(图6A、图6B和图6C)，说明LK-A和顺铂均可有效抑制肿瘤生长，具有明显肿瘤抑制活性。
3、为了进一步确定LK-A在体内的安全性，测量不同组别间裸鼠体重并按组取平均值，检测不同组别间裸鼠体重的变化。
实验结果表明：不同组别间裸鼠体重的无显著差异(图6D)，同时LK-A的治疗对裸鼠的一般状况也无明显不良影响。说明LK-A对裸鼠无明显副作用。
4、实验后处死裸鼠，分别取各组小鼠的肝组织和肾组织，并将其固定在***中，然后进行石蜡包埋处理并进行HE染色。
实验结果表明：各组小鼠的肝组织和肾组织均无明显损伤。说明LK-A的治疗未引起明显的脏器毒性(图6E)。

Claims (10)

1.长管香茶菜甲素在如下A1)至A11)中至少一种中的应用：
A1)制备抑制食管鳞癌细胞的增殖和/或生长的产品；
A2)制备抑制食管鳞癌细胞的克隆形成的产品；
A3)制备诱导食管鳞癌细胞周期阻滞的产品；
A4)制备抑制食管鳞癌细胞的DNA修复的产品；
A5)制备诱导和/或促进食管鳞癌细胞凋亡的产品；
A6)制备上调促进细胞凋亡蛋白的表达量的产品；
A7)制备下调抵抗细胞凋亡蛋白的表达量的产品；
A8)制备诱导食管鳞癌细胞活性氧(ROS)增加的产品；
A9)制备诱导和/或激活食管鳞癌细胞JNK MAPK通路的产品；
A10)制备诱导和/或激活食管鳞癌细胞p38MAPK通路的产品；
A11)制备抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长的产品。
2.长管香茶菜甲素在如下B1)至B11)中至少一种中的应用：
B1)抑制食管鳞癌细胞的增殖和/或生长；
B2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；
B3)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；
B4)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；
B5)诱导和/或促进食管鳞癌细胞凋亡；
B6)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；
B7)下调抵抗细胞凋亡蛋白的表达量；
B8)诱导食管鳞癌细胞活性氧(ROS)增加；
B9)诱导和/或激活食管鳞癌细胞JNK MAPK通路；
B10)诱导和/或激活食管鳞癌细胞p38MAPK通路；
B11)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述促进细胞凋亡蛋白为Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cleaved PARP、γH2AX、Bax、Bcl-2和细胞色素c中至少一种；
所述抵抗细胞凋亡蛋白为Bcl-2。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述细胞周期为G2/M期。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述食管鳞癌细胞为KYSE30细胞或KYSE450细胞。
6.一种产品，其活性成分为长管香茶菜甲素；
所述产品的功能为如下B1)至B11)中的至少一种：
B1)抑制食管鳞癌细胞的增殖和/或生长；
B2)抑制食管鳞癌细胞的克隆形成；
B3)诱导食管鳞癌细胞周期阻滞；
B4)抑制食管鳞癌细胞的DNA修复；
B5)诱导和/或促进食管鳞癌细胞凋亡；
B6)上调促进细胞凋亡蛋白的表达量；
B7)下调抵抗细胞凋亡蛋白的表达量；
B8)诱导食管鳞癌细胞活性氧(ROS)增加；
B9)诱导和/或激活食管鳞癌细胞JNK MAPK通路；
B10)诱导和/或激活食管鳞癌细胞p38MAPK通路；
B11)抑制食管鳞癌细胞引起的肿瘤的生长。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：
所述促进细胞凋亡蛋白为Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cleaved PARP、γH2AX、Bax、Bcl-2和细胞色素c中至少一种；
所述抵抗细胞凋亡蛋白为Bcl-2。
8.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于：
所述细胞周期为G2/M期。
9.根据权利要求6-8中任一所述的产品，其特征在于：
所述食管鳞癌细胞为KYSE30细胞或KYSE450细胞。
10.根据权利要求6-9中任一所述的产品，其特征在于：
所述产品为药物。
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