CN107904202B - 一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用，本发明所述方法包括以下步骤：1)在含有细胞生长因子M‑CSF的培养基中培养单核细胞，所述M‑CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；2)在步骤1)之后，在含有M‑CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M‑CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml和30～100μg/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞。与传统的干细胞诱导方式相比，本发明所述方法具有操作简单、诱导效率高以及性价比高的优点。

Description

一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用
技术领域
本发明涉及干细胞修复领域，具体而言，涉及一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用。
背景技术
干细胞是处于分化阶段前的未分化细胞，按照分化能力的不同，大致可以分为全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells)和单能干细胞(Monopotent Sterm Cells)。其中，全能干细胞是指受精卵到卵裂期32细胞前的所有细胞，其具有形成完整个体分化潜能；而多能干细胞具有分化成多种细胞的能力，可以形成各种细胞和器官，但无法形成完整个体；而单能干细胞，又名专能干细胞或偏能干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。
全能干细胞是由能够发育成人的胚胎产生，容易引发伦理问题。单能干细胞的分化能力有限。而多能干细胞较少涉及伦理问题且具有多种分化潜能，因此成为当前干细胞研究的热点和焦点。多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在疾病治疗、组织和器官修复和再生方面具有极大的应用价值。
目前，国内刘光慧等利用基因编辑技术改造抗逆相关基因，获得抗逆特异性高的基因增强型间充质干细胞，用于抵抗细胞衰老以及组织修复。美国哥伦比亚大学和爱荷华大学的科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术诱导病患多能干细胞分化的方式实现眼疾色素性视网膜炎相关缺陷基因的修复。最近，国内研究人员将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞后，利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组的方式修复突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞，移植到病人体内，治疗人类的镰刀形贫血症。
尽管已经在各方面取得可喜进展，但现有的多能干细胞技术仍然存在诸多风险和不足，妨碍多能干细胞技术的应用，其中包括：
(1)迄今为止，本领域仍难以以合理费用获得大量满足临床治疗要求的多能干细胞：
1)、干细胞来源受限制：目前，多能干细主要从骨髓、外周血、肝脏和胎盘等组织器官中分离，而干细胞在骨髓中的数量仅为1/10000，在外周血中的占比仅为1/250000，在肝脏中占比为1/100000，要获取临床治疗需要的干细胞量对供者机体有压力；胎盘来源的干细胞数量虽然优于骨髓、外周血和肝脏，但受到伦理和致瘤性的限制；
2)、诱导型多能干细胞(iPS)需要在体细胞中转入Oct4、sox2、c-Myc、KLF4等基因，操作方式复杂，成本高且存在细胞癌变风险高的缺陷；
3)、利用M-CSF、IL-3、IL-6、IL-2和抗CD-13抗体等的组合，诱导形成多能干细胞，制备过程中需要使用多种细胞因子或抗体的组合，成本高，且成体细胞去分化形成多能干细胞的效率低。
(2)就治疗效果而言，多能干细胞对损伤或坏死组织的修复，尤其是炎症部位的损伤或坏死组织的修复能力差，治疗效果不理想。
因此，本领域有必要对现有多能干细胞制备方法和治疗方式进行改进，以期简化操作、降低成本、提高多能干细胞的制备效率以及治疗效率。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，所述方法通过M-CSF、以及M-CSF和麦冬高异黄酮的组合，可以有效地诱导单核细胞形成多能干细胞样细胞，与传统的干细胞诱导方式相比，具有操作简单、诱导效率高以及性价比高的优点。
本发明的第二目的在于提供一种同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的方法，所述方法通过M-CSF、以及M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的组合，可以同时获得多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，无需分别诱导，操作方法简单、快捷。
本发明的第三目的在于提供一种组合物，所述组合物包括根据前述方法制成的多能干细胞样细胞，或多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，能够有效地对损伤或坏死细胞、组织或器官进行修复。
本发明的第四目的在于提供前述组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
本发明的第五目的在于提供前述组合物在制备治疗缺血性病变的药物中的应用。
本发明的第六目的在于提供前述组合物在制备治疗神经***退行性病变的药物中的应用。
本发明的第七目的在于提供前述组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
本发明的第八目的在于提供前述的组合物在制备治疗肝硬化或慢性肝炎的药物中的应用。
本发明的第九目的在于提供前述的组合物在制备治疗慢性肾功能不全或肾小球肾炎的药物中的应用。
本发明的第十目的在于提供前述的组合物在制备治疗糖尿病、糖尿病并发症以及严重型代谢综合征后群的药物中的应用。
本发明的第十一目的在于提供前述的组合物在制备治疗疾病消耗症候群的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；
2)在步骤1)之后，在含有M-CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml和30～100μg/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞。
黄酮(flavone)是指两个具有酚羟基的苯环，通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。现有的一些研究结果表明，黄酮类化合物对干细胞的增殖、凋亡和分化起到调控作用，但目前尚未见关于黄酮类化合物与单核细胞去分化形成干细胞样细胞的相关报道。
为探究黄酮与单核细胞去分化之间的关系，以及为筛选获得能够诱导单核细胞形成干细胞样细胞的药物，本发明使用多种不同类型的黄酮对单核细胞进行刺激。结果令人吃惊地发现，麦冬总黄酮(即，麦冬高异黄酮)与M-CSF配合，能够有效地抑制单核细胞标志物CD14的表达，促进干细胞标志物CD90的表达；同时，细胞的形态也相应发生变化，细胞体积变大，细胞边缘出现伪足，表现出干细胞的形态特征。后续的诱导分化试验也进一步证实，根据本发明所述方法制备的干细胞能够在不同条件下诱导形成类肝细胞、类神经细胞和类心肌细胞，展现出分化成多种特化细胞的“多能干细胞”特性。而其他类型的黄酮，例如大豆总黄酮、淫羊藿总黄酮等并不能抑制CD14的表达、促进CD90的表达，也无法刺激单核细胞表现出干细胞样细胞形态。
与常规转基因诱导形成诱导型多能干细胞(iPS)的方法相比，本发明所述诱导方法不需要在单核细胞中导入Oct4、sox2、c-Myc、KLF4等基因，通过简单的刺激即可获得多能干细胞，具有操作简单、癌变风险低等优点。另外，与细胞因子组合相比，本发明所述方法在诱导过程中只需要使用单个细胞因子M-CSF，降低使用细胞因子组合诱导的成本。
本发明还涉及：一种同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10～50ng/ml，所述培养的时间为3～5天；
2)在步骤1)之后，在含有M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜在所述培养基中的工作浓度分别为10～30ng/ml、30～100μg/ml和100～1000ng/ml，所述培养时间为4～8天，即得多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。
本发明所述方法通过M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的组合方式刺激单核细胞，能够同时获得多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。而其他备选药物不能够在M-CSF和麦冬高异黄酮诱导形成多能干细胞样细胞的同时诱导形成M2型巨噬细胞，其中某些备选药物，如香菇多糖或枸杞多糖，不但不能诱导形成M2型巨噬细胞，反而对多能干细胞样细胞的形成具有抑制作用。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括：3)收获步骤2)所述多能干细胞样细胞，或多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，制成含多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的细胞悬液。
在一些具体的实施方式中，步骤3)所述多能干细胞样细胞，或多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，通过机械方式或者酶解方式从其附着的固相载体上剥离。
在一些具体的实施方式中，所述方法进一步包括将步骤3)所述细胞悬液冻存或配制成药物组合物。
在一些具体的实施方式中，所述多能干细胞表达多能性标记CD90。
在一些具体的实施方式中，所述M2型巨噬细胞表达CD68、CD163、CD14和CD16中的一种或多种，优选地，所述M2型巨噬细胞表达CD68和CD163。
在一些具体的实施方式中，所述麦冬高异黄酮选自6-醛基异麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、甲基麦冬黄烷酮A、6-醛基异麦冬黄酮A和6-醛基异麦冬黄酮B中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述灵芝三萜选自灵芝酸、丹芝酸甲酯、灵芝酸、灵芝醇，灵芝草酸、灵芝烯酸、丹芝醇、灵芝醇、灵芝醛、环氧灵芝醇、灵芝甾酮、灵芝萜二醇、灵芝萜三醇、灵芝萜酮二醇、灵芝萜酮三醇、灵芝孢子酸、赤芝酸、赤芝萜酮、赤芝醇、赤芝萜醇、赤芝孢子内酯、灵芝内酯中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，步骤1)中所述M-CSF的工作浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml；优选地，所述M-CSF的工作浓度为30ng/ml。
在一些具体的实施方式中，步骤2)中所述M-CSF的工作浓度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/ml；优选地，所述M-CSF的工作浓度为20ng/ml。
在一些具体的实施方式中，步骤2)中，所述麦冬高异黄酮的工作浓度为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/ml；优选地，所述麦冬高异黄酮的浓度为60μg/ml。
在一些具体的实施方式中，步骤2)中，所述灵芝三萜在培养基中的工作浓度为100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900ng/ml；优选地，所述灵芝三萜在培养基中的工作浓度为800ng/ml。
在一些具体的实施方式中，步骤1)中，所述培养时间为3、4或5天，优选地，所述培养时间为3天。
在一些具体的实施方式中，步骤2)中所述培养时间为4、5、6、7或8天；优选地，所述培养时间为4天。
本发明前述方法还对麦冬高异黄酮的具体种类、用量以及灵芝三萜的用量等参数进行进行优化，优化后的方法无论是在诱导形成多能干细胞样细胞，还是在同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞发明，诱导效率均提高。
在一些具体的实施方式中，步骤1)和步骤2)所述培养基均选自RPMI培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、MEM培养基、F12培养基、MCDB131培养基和PCM培养基中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述单核细胞分离自外周血、脐带血、淋巴液和骨髓中的一种或多种，优选地，所述单核细胞分离自外周血。
本发明还涉及一种组合物，所述组合物包括根据前述方法制成的多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。
本发明所述组合物包括干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。其中，所述干细胞样细胞能够在具体的生态微环境下分化成特定的细胞类型，而M2型巨噬细胞对炎性反应具有强效抑制作用，清除坏死组织和发挥抗氧化作用，引导再生修复过程的启动和延展，为干细胞样细胞的分化提供良好的生理环境，促使所述干细胞样细胞开始细胞和组织的修复。综上所述，本发明所述组合物中的干细胞样细胞和M2型巨噬细胞相互配合，具有协同增效的作用。
在一些具体的实施方式中，所述组合物中还包括药物，所述药物包括选自抗炎药、抗氧化剂以及治疗细胞、组织或器官功能障碍、损伤或坏死的药物。
在一些具体的实施方式中，所述抗炎药选自甾体类抗炎药或非甾体类抗炎药，优选地，所述甾体类抗炎药选自氢化可的松、***或***中的一种或多种，所述非甾体类抗炎药选自阿司匹林、双氯芬酸或布洛芬中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述抗氧化剂选自硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶酸、番茄红素、β-胡萝卜素、辅酶Q-10、EPA和DHA中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述治疗细胞、组织或器官功能障碍、损伤或坏死的药物选自胰岛素、胰岛素样因子、肠促胰素、二甲双胍、透明质酸、辛伐他汀、表皮生长因子、白介素-11、盐霉素和阿霉素中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述组合物中还包括药学上可接受的载体，所述载体选自血浆、血清、白蛋白、凝胶和生理盐水中的一种或多种。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗缺血性病变的药物中的应用，优选地，所述缺血性病变选自末端动脉粥样缺血性损害、缺血性心血管疾病、缺血性脑血管疾病或外周动脉硬化缺血性病变；更优选地，所述缺血性心血管疾病为心梗，所述缺血性脑血管疾病为脑梗。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗神经***退行性病变的药物中的应用，优选地，所述神经***退行性病变选自ALS、MS、MSA、帕金森氏病、小脑萎缩、血管性老年痴呆或部分运动神经元功能障碍中的一种或多种。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，所述自身免疫性疾病选自类风湿、克隆氏肠炎、红斑狼疮或移植器官排斥中的一种或多种。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗肝硬化或慢性肝炎的药物中的应用。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗慢性肾功能不全或肾小球肾炎的药物中的应用。
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗糖尿病、糖尿病并发症以及严重型代谢综合征后群的药物中的应用
本发明还涉及前述的组合物在制备治疗疾病消耗症候群的药物中的应用，优选地，所述疾病消耗症候群为癌症晚期恶液质。
为了更容易地理解本发明，首先对以下术语进行定义：
术语“干细胞样细胞”是指具有自我更新能力和形成至少一种或多种特化细胞类型的能力的细胞；
术语“多能性”是指干细胞具有能够形成多种特化细胞类型的能力；
术语“M2型巨噬细胞”是指替代性活化的巨噬细胞(alternatively activatedmacrophage)；
术语“M-CSF”是指巨噬细胞-集落刺激因子(macrophage colony-stimulatingfactor)；
术语“CD90”，是指“Cluster of Differentiation 90”，又称为Thy-1，属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族成员，为干细胞表面标志物；
术语“CD14”，是指“Cluster of Differention 14”，为LPS受体，属于一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原；
术语“CD16”是指“Cluster of Differentiation 16”，为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity，ADCC)所需的FcγRIII Fc受体；
术语“CD68”是指“Cluster of Differentiation 68”，是在M2型巨噬细胞中特异性表达的细胞表面抗原；
术语“CD163”是指“Cluster of Differentiation 163”，是在M2型巨噬细胞中特异性表达的细胞表面抗原；
术语“ALS”，是指“amyotrophic lateral sclerosis”，即，肌萎缩侧索硬化症；
术语“MS”是指“multiple sclerosis，MS”，即，多发性硬化症；
术语“MSA”是指“multiple system atrophy，MSA”，即，多***萎缩症；
术语“EPA”是指“Eicosapentaenoic Acid”，即，二十碳五烯酸，属于Ω-3系列多不饱和脂肪酸；
术语“DHA”是指“Docose Hexaenoie Acid”，即，二十二碳六烯酸，属于Ω-3系列多不饱和脂肪酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明出人意料地发现，M-CSF和麦冬高异黄酮的组合能够有效刺激单核细胞去分化形成干细胞样细胞，所述干细胞样细胞具有分化成多种特化细胞的潜能；
(2)与常规诱导形成多能干细胞的方法不同，本发明所述方法无需通过基因工程的方法导入Oct4、sox2、c-Myc、KLF4等基因，操作简单、癌变风险低；同时，本发明所述方法在诱导过程中只需要使用单个细胞因子M-CSF，且使用量低，诱导时间短，显著降低诱导成本；
(3)本发明通过大量筛选发现，在M-CSF和麦冬高异黄酮的基础上加入灵芝三萜，能够在诱导形成干细胞样细胞的同时，形成M2型巨噬细胞，本发明所述方法通过一次诱导即可获得干细胞细胞和M2型巨噬细胞，无需分开诱导，操作简单；
(4)本发明所述组合物包括干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，其中M2型巨噬细胞对炎性反应具有强效抑制作用，清除坏死组织和发挥抗氧化作用，引导再生修复过程的启动和延展，为干细胞样细胞的分化提供良好的生理环境，促使所述干细胞样细胞开始细胞和组织的修复，所述干细胞样细胞和M2型巨噬细胞在修复过程中，起到协同增效的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同类型总黄酮刺激下的细胞形态图(40×)，其中：
图1A为阴性对照；
图1B为麦冬总黄酮；
图1C为大豆总黄酮；
图1D为淫羊藿总黄酮；
图1E为蔓荆子总黄酮；
图1F为苦荞麦总黄酮；
图1G为葛根总黄酮；
图1H为山楂总黄酮；
图1I为金银花总黄酮；
图1J为银杏叶总黄酮；
图1K为杜仲总黄酮；
图1L为益母草总黄酮；
图2为60μg/ml甲基麦冬黄烷酮A刺激下的细胞形态图(40×)，其中：
图2A为阴性对照；图2B为6-醛基异麦冬黄酮A；
图3为60μg/ml甲基麦冬黄烷酮A刺激下，CD14和CD90的流式检测结果，其中：
图3A为阴性对照；图3B为60μg/ml甲基麦冬黄烷酮A；
图4为800ng/ml灵芝三萜刺激下，CD 14、CD90、CD16、CD68和CD163的流式检测结果，其中：
图4A为对照；图4B为800ng/ml灵芝三萜。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
按以下方式制备外周血来源的单核细胞：
1)采集外周血血液标本。取4个无菌50ml离心管，将标本小心倒入离心管中，每管放50ml血液标本。900g，离心10min，慢升慢降。
2)取上层黄色血浆至新的50ml离心管中(最多取至血清层的3/4处，以免损失细胞得率)，56℃灭活15min。3500rpm离心10min。
3)转移上层血浆至新的50ml离心管，置于4℃冰箱待用。
4)将剩余血样用PBS重悬至原体积，准备若干个无菌50ml离心管，每管加入人单核细胞分离液20ml，切勿将淋巴细胞分离液溅到离心管壁(按单核细胞分离液：血液＝1:1，例如80ml全血，分4管进行淋巴细胞分离)。
5)900g，离心20min，慢升慢降。
6)准备若干个新的50ml离心管。密度梯度离心完毕后，用10ml移液管将上层上清轻柔吸取至离白膜层0.5cm处并废弃。
7)再小心吸取中间白膜层细胞至新的50ml离心管中。
8)白膜层的细胞悬液吹匀，每10ml的细胞悬液分装到50ml离心管中。
9)加PBS到细胞悬液中混匀，至50ml刻度处。
10)1600rpm，离心10min，弃上清。加PBS至45ml重悬，1200rpm，离心10min，弃上清。
11)加PBS至45ml重悬，取100ul样品计数，根据计数结果取适量细胞悬液进行流式检测，补足PBS至45ml，1200rpm，离心10min，弃上清。
实施例2
按照以下方式筛选诱导单核细胞去分化形成多能干细胞样细胞的药物：
1)Day 0：将实施例1制备的单核细胞重悬，将单核细胞的密度为1×106/ml，接种到24孔板中，在37℃、5％CO2的条件下贴壁培养3h；之后，吸弃悬浮细胞，在每孔中添加0.5ml RPMI1640培养基，并按10％补充自体血清，在37℃、5％CO2的条件下继续培养，所述培养基中添加M-CSF和自体血清，所述M-CSF在培养基中的终浓度为30ng/ml；
2)Day 1，Day 2和Day3：每天在显微镜下观察细胞形态。
Day3：每孔吸弃1/2体积的培养基，补充1/2体积的新鲜培养基，所述新鲜培养基中含有M-CSF(不添加待筛选药物，作为对照)，或M-CSF和待筛选药物，并按10％补充自体血清，其中，所述M-CSF的工作浓度为20ng/ml，所述待筛选药物的浓度为50μg/ml。
3)Day 4，Day5和Day6：在显微镜下观察细胞形态。
4)Day 7：在显微镜下观察细胞的形态，具体细胞形态结果参见图1。收获细胞，提取mRNA，反转录为cDNA，通过定量PCR的方式检测细胞中单核细胞标志物CD14和干细胞标记物CD90的表达水平，所述CD14、CD90的表达量均经过看家基因GAPDH均一化，具体检测结果如表1所示。
其中具体的待筛选药物如下所示：
大豆总黄酮、淫羊藿总黄酮、蔓荆子总黄酮、苦荞麦总黄酮、葛根总黄酮、麦冬总黄酮、山楂总黄酮、金银花总黄酮、银杏叶总黄酮、杜仲总黄酮、益母草总黄酮。
根据表1所示数据可知，大豆总黄酮、淫羊藿总黄酮、蔓荆子总黄酮、苦荞麦总黄酮、葛根总黄酮、山楂总黄酮、金银花总黄酮、银杏叶总黄酮、杜仲总黄酮、益母草总黄酮并不能刺激干细胞标记物的表达，而麦冬总黄酮能够刺激干细胞标记物CD90的表达，同时抑制单核细胞标志物CD14的表达，表明麦冬总黄酮可能是能够刺激单核细胞形成干细胞的诱导物。
同时，根据图1所示细胞形态可知，与阴性对照相比，在麦冬总黄酮的刺激下，细胞明显呈现出体积增大，细胞表面出现伪足的形态特征，表现出类干细胞形态特征，而其他物质不能刺激细胞出现类似的类干细胞形态特征。
表1不同药物刺激下CD14和CD90的表达情况
CD14 CD90
对照 1.0±0.05 1.0±0.07
大豆总黄酮 1.1±0.06 1.2±0.09
淫羊藿总黄酮 0.9±0.07 1.1±0.05
蔓荆子总黄酮 0.9±0.05 1.5±0.12
苦荞麦总黄酮 1.4±0.11 0.9±0.04
葛根总黄酮 1.5±0.10 0.7±0.05
麦冬总黄酮 0.3±0.04 5.4±0.27
山楂总黄酮 0.7±0.07 1.8±0.11
金银花总黄酮 2.1±0.15 0.9±0.06
银杏叶总黄酮 2.2±0.12 1.0±0.04
杜仲总黄酮 1.2±0.11 1.4±0.09
益母草总黄酮 0.9±0.09 1.1±0.06
实施例3
检测不同类型的麦冬黄酮诱导单核细胞形成干细胞样细胞的能力：
具体方法参照实施例2，区别仅在于，待测药物分别为6-醛基异麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、甲基麦冬黄烷酮A、6-醛基异麦冬黄酮A和6-醛基异麦冬黄酮B，具体检测结果参见表2。根据表2所示数据可知，上述五种麦冬黄酮均能够抑制CD14基因的表达和上调CD90基因的表达，具有诱导单核细胞形成干细胞样细胞的能力，其中，6-醛基异麦冬黄酮A的诱导能力最强。
表2不同麦冬黄酮诱导单核细胞形成干细胞样细胞的能力
CD14 CD90
对照 1.0±0.05 1.0±0.07
6-醛基异麦冬黄烷酮A 0.35±0.06 4.31±0.21
甲基麦冬黄烷酮B 0.41±0.04 4.93±0.25
甲基麦冬黄烷酮A 0.25±0.02 5.84±0.44
6-醛基异麦冬黄酮A 0.50±0.07 5.19±0.37
6-醛基异麦冬黄酮B 0.33±0.04 4.75±0.35
实施例4
检测不同浓度下，6-醛基异麦冬黄酮A诱导单核细胞形成干细胞样细胞的能力：
具体检测方法参见实施例2，区别仅在于，待测药物为6-醛基异麦冬黄酮A，所述6-醛基异麦冬黄酮A的浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/ml，具体检测结果参见表3。根据表3的检测结果可知，当浓度为60μg/ml时，6-醛基异麦冬黄酮A的诱导效果最强。
表3不同诱导物浓度下，CD14和CD90的表达水平
6-醛基异麦冬黄酮A CD14 CD90
0μg/ml 1.0±0.07 1.0±0.09
10μg/ml 0.50±0.09 4.31±0.15
20μg/ml 0.43±0.07 4.79±0.21
30μg/ml 0.37±0.05 4.97±0.25
40μg/ml 0.33±0.06 5.11±0.29
50μg/ml 0.25±0.03 5.67±0.37
60μg/ml 0.22±0.02 6.13±0.42
70μg/ml 0.31±0.05 5.36±0.34
80μg/ml 0.36±0.06 5.11±0.27
90μg/ml 0.41±0.09 5.40±0.18
100μg/ml 0.43±0.10 5.67±0.29
实施例5
使用浓度为60μg/ml的甲基麦冬黄烷酮A，参照实施例2所述方法诱导单核细胞形成干细胞样细胞，在第6天，观察细胞形态，并收获细胞，通过流式细胞术检测单核细胞标志物CD14、干细胞标记物CD90表达。其中，细胞形态具体检测结果参见图2A-图2B，流式细胞术检测结果参见图3A-图3B。
根据图2A-图2B所示细胞形态可知，与阴性对照相比，经过60μg/ml的甲基麦冬黄烷酮A刺激后，细胞形态发生明显转变，体积明显增大，并出现伪足，表现出类干细胞的细胞形态。同时，图3A-3B所示流式结果也表明，单核细胞表面标志CD14的表达量下降，而干细胞表面标志物CD90的表达量上升。综合前述检测结果，本发明从细胞形态、标志物的mRNA表达水平和蛋白表达水平等不同方面，证实6-醛基异麦冬黄酮A等能够诱导单核细胞形成类干细胞样细胞。
实施例6多能干细胞样细胞诱导分化试验(诱导形成类肝细胞)
1、使用60μg/ml的甲基麦冬黄烷酮A诱导单核细胞形成多能干细胞样细胞(具体诱导方法参照实施例5)。
2、在特定的条件下，诱导前述多能干细胞分化为类肝细胞，其中，诱导形成类肝细胞的方法如下：
将所述多能干细胞样细胞接种到预先铺有纤维连接素(50μg/cm2)、含有诱导培养基的50ml塑料培养瓶中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中进行诱导培养，每3天换液1次，共诱导28天。其中，所述培养基为加入有FGF4和HGF的DMEM高糖培养基，其中FGF4在培养基中的工作浓度为40ng/ml，HGF在培养基中的工作浓度为70ng/ml。
3、检测是否成功诱导形成类肝细胞，具体检测方法如下：
(1)观察诱导前、诱导第14天和诱导第28天后的细胞形态；
(2)在诱导前、诱导第14天和诱导第28天，提取细胞总RNA，通过PCR的方式检测所述细胞关于AFP、FGFR2和白蛋白的mRNA表达水平(均为经看家基因GAPDH均一化后的结果)，具体检测结果参见表4。
根据表4所述实验结果可知，本发明所述多能干细胞样细胞在诱导过程中逐渐呈现出上皮细胞样特征，同时，肝细胞特异性的分子标记AFP、FGFR2、白蛋白、氨甲酰磷酸合成酶I在mRNA水平上的表达量显著上升，表明本发明所述多能性干细胞样细胞具有分化成为肝细胞的能力。
表4多能干细胞样细胞诱导前后细胞形态和基因表达水平变化
实施例7多能干细胞样细胞诱导分化试验(诱导形成类神经细胞)
1、使用60μg/ml的甲基麦冬黄烷酮A诱导单核细胞形成多能干细胞样细胞(具体诱导方法参照实施例5)。
2、在特定的条件下，诱导前述多能干细胞分化为类神经细胞，其中，诱导形成类神经细胞的方法如下：
将前述多能干细胞样细胞接种于6孔板中(孔中预先放置无菌盖玻片)，待细胞生长达到80％融合状态时，弃去培养液，加入预诱导培养液(含20％FBS、1mmol/Lβ-ME的DMEM/F12完全培养液)培养24h以后，去除预诱导培养液，PBS洗涤3次，再加入诱导液(1mmol/Lβ-ME、2％DMSO、200μmol/L BHA的无血清DMEM/F12)诱导24h。
3、检测是否成功诱导形成类神经细胞，具体检测方法如下，具体检测结果参见表2：
(1)在显微镜下观察诱导前、诱导24h后，细胞的生长形态；
(2)取生长有细胞的盖玻片，采用SABC法进行免疫细胞化学染色，检测细胞表达NSE的情况，其中，复片5次，每片计阳性细胞数和总细胞数，按下列公式计算阳性细胞百分率：阳性细胞百分率＝阳性细胞数/细胞总数×100％。
根据表5所述实验结果可知，本发明所述干细胞样细胞在经过诱导后表现出类神经细胞样形态，表明本发明所述干细胞样细胞具有诱导分化成神经细胞的能力。
表5多能干细胞样细胞诱导前后细胞形态和NSE表达水平变化
实施例8多能干细胞样细胞诱导分化试验(诱导形成类心肌细胞)
1、使用60μg/ml的甲基麦冬黄烷酮A诱导单核细胞形成多能干细胞样细胞(具体诱导方法参照实施例5)。
2、在特定的条件下，诱导前述多能干细胞分化为类神经细胞，其中，诱导形成类神经细胞的方法如下：
将前述多能干细胞样细胞接种于6孔板中，待细胞生长达到60～70％融合状态时，弃去培养液，加入诱导剂诱导，所述诱导剂为DMSO，具体诱导方法为：用8mL/L DMSO诱导液诱导24h，吸去DMSO诱导液，换为含100mL/L FBS的DMEM培养基继续培养21d。
4、检测是否成功诱导形成类心肌细胞，具体检测方法如下，具体检测结果参见表6：
(1)在显微镜下观察诱导前、诱导21天后，细胞的生长形态；
(2)提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR检测心肌细胞标志物Desmin、Nkx2.5和Tropnin I的表达。
根据表6所述实验结果可知，本发明所述干细胞样细胞在经过诱导后表现出类心肌细胞样形态，且心肌细胞的标志物Desmin、Nkx2.5和Tropnin I的表达量显著上升，表明本发明所述干细胞样细胞具有诱导分化成心肌细胞的能力。
表6多能干细胞样细胞诱导前后细胞形态和基因表达水平
实施例9筛选同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的药物
按照以下方式筛选诱导能够同时诱导产生干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的药物：
1)Day 0：将实施例1制备的单核细胞重悬，将单核细胞以1×106/ml的密度，接种到24孔板中，在37℃、5％CO2的条件下贴壁培养3h；之后，吸弃悬浮细胞，在每孔中添加0.5ml RPMI1640培养基，并按10％补充自体血清，在37℃、5％CO2的条件下继续培养，所述培养基中添加M-CSF和自体血清，所述M-CSF在培养基中的终浓度为30ng/ml；
2)Day 1，Day 2和Day3：每天在显微镜下观察细胞形态。
3)Day3：每孔吸弃1/2体积的培养基，补充1/2体积的新鲜培养基，所述新鲜培养基中含有M-CSF(不添加待筛选药物和6-醛基异麦冬黄烷酮A，作为对照1)，或M-CSF和6-醛基异麦冬黄烷酮A(不添加待筛选药物，作为对照2)，或M-CSF、6-醛基异麦冬黄烷酮A和待筛选药物，并按10％补充自体血清，其中，所述M-CSF的工作浓度为20ng/ml，所述6-醛基异麦冬黄烷酮A的浓度为60μg/ml，所述待筛选药物的浓度为0.5μg/ml，所述待筛选药物具体如下所示：
香菇多糖、灵芝多糖、黄芪多糖、枸杞多糖、人参总皂苷、三七总皂苷、蒺藜总皂苷、海参总皂苷、甘草甜素、齐墩果烷型三萜皂苷和灵芝三萜。
4)Day 4，Day5和Day6：在显微镜下观察细胞形态。
5)Day 7：收获细胞，提取mRNA，反转录为cDNA，通过定量PCR检测细胞中单核细胞标志物CD14、干细胞标记物CD90的表达水平，M1型巨噬细胞标志物CD16和M2型巨噬细胞标志物CD68的表达水平，上述基因的表达量均为经过看家基因GAPDH均一化后的结果。
具体检测结果如表7所示。根据表7所示结果可知，灵芝三萜与M-CSF、6-醛基异麦冬黄烷酮A组合使用，能够使单核细胞在形成干细胞样细胞的同时，诱导形成巨噬细胞，且所述巨噬细胞为M2型巨噬细胞，而非M1型巨噬细胞，而多糖或其他的萜类化合物并不能同时诱导M2型巨噬细胞的形成，甚至某些多糖在一定程度上还会阻碍干细胞样细胞的形成。
表7多糖和萜类对单核细胞的诱导效果
实施例10不同浓度下灵芝三萜诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的能力
1、检测不同浓度下，灵芝三萜诱导单核细胞形成干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的能力，具体检测方法参见实施例7，区别仅在于，待测药物为灵芝三萜，所述灵芝三萜的浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000ng/ml，具体检测结果参见表5。根据表5的检测结果可知，当浓度为800ng/ml时，灵芝三萜的诱导效果最强。
表8不同浓度下，灵芝三萜对单核细胞的诱导能力
2、使用浓度为800ng/ml的灵芝三萜，参照实施例7所述方法诱导单核细胞形成干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，在第6天收获细胞，通过流式细胞术检测单核细胞标志物CD14、干细胞标记物CD90、M1型巨噬细胞标记物CD16、M2型巨噬细胞标记物CD68和CD163的表达，具体检测结果参见图4。图4的检测结果从蛋白水平上证明，加入灵芝三萜后，单核细胞能够同时被诱导形成干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的组合物。
实施例11细胞组合物治疗类风湿性关节炎的效果
1、参照实施例5所述方法制备含干细胞样细胞的组合物；参照实施例7所述方法，使用浓度为800ng/ml的灵芝三萜诱导单核细胞形成含干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的组合物；使用100μg/L IL-4刺激48h，诱导人外周血单核细胞形成M2型巨噬细胞。
2、召集12名患者，其中男性患者6名，女性患者6名，平均年龄为59岁，所述患者按照2009年美国风湿学会(ACR)和欧洲风湿病联盟(EULAR)诊断标准，分值均在6分以上，确诊为类风湿病患者。
3、将患者随机分为3组，其中第1组患者只采用含干细胞样细胞的组合物治疗，第2组患者只采用含M2型巨噬细胞的组合物治疗，第3组患者采用含干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的组合物进行治疗。治疗过程中，第1组中，所述干细胞样细胞的剂量为1×106个细胞/Kg；第2组中，所述M2型巨噬细胞的剂量为1×106个细胞/Kg；第3组中，所述干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的剂量为1×106个细胞/Kg。治疗时间为5个月，在疗程的第1、2、3、4个月分4次输入干细胞样细胞、M2型巨噬细胞或者干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。
4、在疗程开始前、疗程结束后，对患者进行28个关节的疾病活动度评分(DAS28)，具体检测结果参见表9。根据表9所示结果可知，与单独使用干细胞样细胞或M2型巨噬细胞相比，干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的联用，可以显著增强干细胞样细胞对类风湿关节炎的修复作用。
表9治疗前后DAS值变化
组别 n x±s P
第1组治疗前 4 4.36±0.56
第1组治疗后 4 3.95±0.49 P＜0.05
第2组治疗前 4 4.47±0.67
第2组治疗后 4 4.21±0.34 P＜0.05
第3组治疗前 4 4.60±0.37
第3组治疗后 4 3.17±0.23 P＜0.05
注，与治疗前相比，P＜0.05，差异有统计学意义。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (32)

1.一种诱导形成多能干细胞样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10~50ng/ml，所述培养的时间为3~5天；
2）在步骤1）之后，在含有M-CSF和麦冬高异黄酮的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF和麦冬高异黄酮在所述培养基中的工作浓度分别为10~30ng/ml和30~100μg/ml，所述培养时间为4~8天，即得多能干细胞样细胞。
2.一种同时诱导形成多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）在含有细胞生长因子M-CSF的培养基中培养单核细胞，所述M-CSF在培养基中的工作浓度为10~50ng/ml，所述培养的时间为3~5天；
2）在步骤1）之后，在含有M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜的培养基中培养所述单核细胞，其中，所述M-CSF、麦冬高异黄酮和灵芝三萜在所述培养基中的工作浓度分别为10~30ng/ml、30~100μg/ml和100~1000ng/ml，所述培养时间为4~8天，即得多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：3）收获步骤2）所述多能干细胞样细胞，或多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞，制成细胞悬液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3）所述多能干细胞样细胞，或者所述多能干细胞和M2型巨噬细胞，通过机械方式或者酶解方式从其附着的固相载体上剥离。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将步骤3）所述细胞悬液冻存或配制成药物组合物。
6.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞表达多能性标记CD90。
7.根据权利要求2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，所述M2型巨噬细胞表达CD68、CD163、CD14和CD16中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述M2型巨噬细胞表达CD68和CD163。
9.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，所述麦冬高异黄酮选自6-醛基异麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、甲基麦冬黄烷酮A、6-醛基异麦冬黄酮A和6-醛基异麦冬黄酮B中的一种或多种。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述灵芝三萜选自灵芝酸、丹芝酸甲酯、灵芝醇，灵芝草酸、灵芝烯酸、丹芝醇、灵芝醇、灵芝醛、环氧灵芝醇、灵芝甾酮、灵芝萜二醇、灵芝萜三醇、灵芝萜酮二醇、灵芝萜酮三醇、灵芝孢子酸、赤芝酸、赤芝萜酮、赤芝醇、赤芝萜醇、赤芝孢子内酯、灵芝内酯中的一种或多种。
11.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述M-CSF的工作浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述M-CSF的工作浓度为30ng/ml。
13.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述M-CSF的工作浓度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/ml。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述M-CSF的工作浓度为20ng/ml。
15.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述麦冬高异黄酮的工作浓度为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/ml。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述麦冬高异黄酮的浓度为60μg/ml。
17.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述灵芝三萜在培养基中的工作浓度为100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、650、700、750、800、850或900 ng/ml。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述灵芝三萜在培养基中的工作浓度为800ng/ml。
19.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述培养时间为3、4或5天。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述培养时间为3天。
21.根据权利要求1~2、4~5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述培养时间为4、5、6、7或8天。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述培养时间为4天。
23.根据权利要求1~2、4~5任一项所述方法，其特征在于，所述单核细胞分离自外周血、脐带血、淋巴液和骨髓中的一种或多种。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述单核细胞分离自外周血。
25.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括根据权利要求2~24任一项所述方法制成的多能干细胞样细胞和M2型巨噬细胞。
26.根据权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包括药物，所述药物选自抗炎药、抗氧化剂以及治疗细胞、组织或器官功能障碍、损伤或坏死的药物中的一种或多种。
27.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述抗炎药选自甾体类抗炎药或非甾体类抗炎药。
28.根据权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述甾体类抗炎药选自氢化可的松、***或***中的一种或多种，所述非甾体类抗炎药选自阿司匹林、双氯芬酸或布洛芬中的一种或多种。
29.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述抗氧化剂选自硒、抗坏血酸、维生素E、儿茶酸、番茄红素、β-胡萝卜素、辅酶Q-10、EPA和DHA中的一种或多种。
30.根据权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述治疗细胞、组织或器官功能障碍、损伤或坏死的药物选自胰岛素、胰岛素样因子、肠促胰素、二甲双胍、透明质酸、辛伐他汀、表皮生长因子、白介素-11、盐霉素和阿霉素中的一种或多种。
31.根据权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包括药学上可接受的载体，所述载体选自血浆、血清、白蛋白、凝胶和生理盐水中的一种或多种。
32.权利要求25所述的组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
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