CN107893126A - 用于鉴定黄精属种质资源的ssr分子标记及应用 - Google Patents
用于鉴定黄精属种质资源的ssr分子标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于鉴定黄精属种质资源的SSR分子标记及应用，属于植物分子标记辅助种质资源鉴别技术领域。本发明的SSR分子标记为以下7个中任一或多个SSR分子标记，7个SSR分子标记分别由如SEQ ID NO.1‑14所示的引物扩增得到。本发明提供的SSR分子标记可将黄精属内不同种质区分开来，操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服用表型鉴定方法难以准确区分不同黄精属种质的缺点，在黄***质资源鉴别及分子标记辅助育种中具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子标记辅助种质资源鉴别技术领域，特别是涉及用于鉴定黄精属种质资源的SSR分子标记及其应用。
背景技术
黄精属(Polygonatum Mill.)为百合科(Liliaceae)多年生草本植物，根茎横走，圆柱状，结节膨大，常以干燥根茎入药。该属植物全球大约有40余种，我国约有31种。其中，黄精、多花黄精和滇黄精是《中华人民共和国药典》收录了三种黄精的“原生药”。现代药理学研究表明黄精具有抗衰老的作用、降血糖和免疫调节作用、提高学习和记忆能力、抗动脉硬化和对心血管***的作用、抗肿瘤作用、抗炎、抗病原微生物等作用，是一种生理活性显著，极具开发利用价值的药用植物资源。近几年,黄精制品纷纷开发成功，黄精配方颗粒、黄精茶、黄精花粉茶、黄精口服液、黄精酸奶、黄精糯米酒等一系列产品不断涌现到市场上，随着黄精药用价值及经济价值的提高，市面上出现了一些伪黄精以及以次充好的现象，甚至一些误食中毒的现象也有发生。黄精属植物不同种之间分布区存在重叠现象，并且有些种变异幅度大，存在较多的中间类型，所以仅从形态学上的角度难以区分。
目前，RAPD、RFLP、ISSR、SCoT、SSR分子标记技术已应用到黄***鉴定、遗传多样性分析和种质资源保护研究中。微卫星标记(microsatellite)又被称为短串联重复序列(short tandem repeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸，甚至更多核苷酸为基本单位组成的串联重复序列片段，其长度大多在200bp以内，普遍存在于真核生物和原核生物基因组中，分布于编码区和非编码区。由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，具有扩增稳定，特异性高，共显性，开发成本相对低等优点，因此微卫星标记的应用非常广泛。由于SSR标记具有共显性、高度重复性、多态性好、稳定可靠、经济方便等优点，SSR标记完全符合作物品种鉴别的4个基本准则，即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异和实验结果的可靠性，其已成为作物种质资源鉴定的一种理想分子标记，该标记可通过比较材料之间的扩增条带，就可以较好地将同一物种的不同品种的亲缘关系进行有效鉴定评价，鉴定结果客观公正、可靠性高。
目前黄精SSR分子标记的开发缓慢，已公布的黄精属SSR分子标记数97个，其中仅有40个黄精SSR分子标记具有较高的多态性，能够利用的黄精微卫星分子标记数量非常有限，且既往对黄精遗传多样性的研究材料或SSR引物太少，使得筛选的引物缺乏代表性，因此，急需开发能够区分鉴定黄精属不同种植物的SSR分子标记。
SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术是基于简化代表库测序(RRLs)及高通量双端测序的一种有效的测序方法，具有高通量、测序错误率低、低成本等特点，近年来广泛地应用于植物的分子标记的开发中，但目前此方法还没有运用到黄精属SSR标记开发中。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用SLAF-seq技术开发得到的可快速、准确鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质资源的SSR分子标记。
本发明的第二个目的是提供上述分子标记在鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：申请人收集了不同地理来源、有代表性的24份黄精属种质资源，包括多花黄精、黄精、滇黄精作为本研究的研究对象。将研究对象的DNA样本送往北京百迈客生物科技有限公司，利用SLAF-seq技术对样品进行重测序，申请人进一步利用测序序列挖掘寻找特异的SSR位点，并设计黄精属SSR引物。然后在诸多SSR引物中寻找能区分黄精属种质资源不同种的特异性引物对，最终筛选得到鉴定效果最佳的7对SSR引物。
基于上述技术方案，本发明提供了用于鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质资源的SSR分子标记，其为以下任一或多个SSR分子标记组合，
(1)HC10F：TGCTTGTAGACACTTGTGCCA
R：GCAAACATAAACCCGAACAAA；
(2)HC33F：GCCAACGATGGAGATGAGAT
R：TGCAAGAGGTTCAGGAGGAG；
(3)HPT62F：AGTGGCGATTTTCTCTTGGA
R：CCCCTACTTGATCTCCACCA；
(4)HPT64F：CCTCAAATCTATCCTTGGGC
R：TCGGTGGTATTACGTGCAAA；
(5)HPT97F：ACATGTAACCCTGTTGGAATG
R：CGTCGAAACATAGGCTCTGA；
(6)HPS40F：CTGCCATTATTCACACGAGG
R：TGCCATGTTGAGAACTGGTC；
(7)HPL18F：AACCCTCGAATCAAGCTCAA
R：AACTCCGAAGTGAAGGACGA。
进一步地，本发明听了用于鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质资源的特异性引物对，其为以下任一或多对特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2、或SEQ ID NO.3-4、或SEQ ID NO.5-6、或SEQ ID NO.7-8、或SEQ ID NO.9-10、或SEQ ID NO.11-12、或SEQ IDNO.13-14所示。
本发明提供了上述SSR分子标记或扩增其的特异性引物对在黄精属(PolygonatumMill.)种质鉴定中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或扩增其的特异性引物对在黄精属(PolygonatumMill.)种质分子育种中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或扩增其的特异性引物对在黄精属(PolygonatumMill.)种质资源遗传多样性分析中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记或扩增其的特异性引物对在鉴别多花黄精、黄精和滇黄精中的应用。
本发明提供含有上述特异性引物对的试剂盒。
本发明提供了一种鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质的方法，包括以下步骤：
(1)提取待鉴定黄***质的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，利用本发明提供的任一个SSR分子标记或用于扩增任一或多个SSR分子标记的特异性引物对进行PCR扩增反应；
(3)扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，统计显色结果，根据统计结果判断黄精属种质。
步骤(2)中PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
步骤(3)中，扩增产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及快速银染法检测。根据统计的显色结果，计算各引物的等位基因数、基因多样性和多态信息量；基于UPGMA方法进行聚类分析。
本发明的有益效果在于：本发现利用SLAF-seq技术获得了7个新的具有高多态性的黄精属SSR分子标记，这7个分子标记在24份黄精属种质资源中表现出较好的多态性扩增，并且能很好地将黄精、多花黄精和滇黄精区分开，操作简单、重现性好、准确度高，可有效克服用表型鉴定方法难以区分黄精属种质的缺点，在不同品种黄精鉴别与分子辅助育种中发挥重要作用。本发明中所用材料来源广泛，涉及了全国11个省中的21个地区，覆盖了我国黄精属资源分布的大部分区域，并且能在黄精、多花黄精和滇黄精能够稳定地扩增。由此可见，本发明的这7个SSR标记组合可用于黄精属种质资源的遗传多样、种质的鉴定及亲缘关系的分析，是一批具有很好的重复性，高多态性，可靠的有效的分子标记。本发明的SSR分子标记还能够作为遗传标记，用于不同品种黄***质的育种或选育，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为引物HC10对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图。图中泳道1-24分别与表1中相同编号的黄精品种对应，以下各图泳道均为此。
图2为引物HC33对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图。
图3为引物HPT62对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图
图4为引物HPT64对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图。
图5为引物HPT97对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图。
图6为引物HPS40对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图。
图7为引物HPL18对24份黄***质材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带图。
图8为7对黄精属SSR引物对24份黄***质材料的聚类图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，下述实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径得到；实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1用于鉴定黄精属种质的SSR分子标记的获得及其在鉴定黄精属不同品种中的应用
本发明的用于鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质的SSR分子标记是通过以下方法获得的：
1、选取来自于全国11个省中的21个地区的24份黄精品种，包括多花黄精、黄精、滇黄精，见表1。提取它们的DNA样本送往北京百迈客生物科技有限公司，利用SLAF-seq技术对样品进行重测序。本发明利用测序序列挖掘寻找特异的SSR位点，设计48对黄精属SSR引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物。
表1 24份黄精属种质材料及其分子ID
2、SSR分子标记的引物的获得过程及其在区别黄精属不同品种中的应用。
(1)PCR反应体系：Eppendorf PCR管中反应总体积为10μL，
具体反应体系如下:
(2)PCR扩增条件
94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。最后保温在4℃。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳
对SSR引物扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，统计显色结果。
(4)数据分析：
根据扩增片段的大小(图1-图7)，对应的分子量从大到小从***数字的1开始记录,依次为2、3、4……,N统计数据。0表示零等位基因(即该泳道由于基因片段丢失而无带)，-1表示该种质的数据由于实验操作造成缺失，-2表示该泳道出现杂合带型。采用分析资源特征的软件(ID Analysis 3.0，软件登记号：2007SR11870)建立各种质的分子ID。
筛选出的7对引物的电泳图，根据SSR扩增谱带在相同迁移率位置上有带记为1、无带记为0，组成原始矩阵。利用powermaker软件计算各引物的等位基因数、基因多样性和多态信息含量(PIC)；使用NTSYS-PC V2.10软件基于UPGMA方法进行聚类分析。
利用ID Analysis 3.0软件对前期筛选的48对SSR引物进行分析，以多黄黄精、黄精、滇黄***质基因组DNA为模板，进行引物初步筛选，筛选出扩增条带清晰的SSR引物，淘汰缺失位点过多和引物之间相似系数过高的引物后，然后用筛选出的SSR引物对表1中的24份黄***质进行PCR扩增，从中寻找能区分黄精属种质不同品种的特异性引物对，最终获得7对具有高多态性且鉴定效果最佳的引物，效果数据见表2，以及各种质材料的分析ID(表1)。
7对SSR引物分别为：
HC10F：TGCTTGTAGACACTTGTGCCA(SEQ ID NO.1)
R：GCAAACATAAACCCGAACAAA(SEQ ID NO.2)；
HC33F：GCCAACGATGGAGATGAGAT(SEQ ID NO.3)
R：TGCAAGAGGTTCAGGAGGAG(SEQ ID NO.4)；
HPT62F：AGTGGCGATTTTCTCTTGGA(SEQ ID NO.5)
R：CCCCTACTTGATCTCCACCA(SEQ ID NO.6)；
HPT64F：CCTCAAATCTATCCTTGGGC(SEQ ID NO.7)
R：TCGGTGGTATTACGTGCAAA(SEQ ID NO.8)；
HPT97F：ACATGTAACCCTGTTGGAATG(SEQ ID NO.9)
R：CGTCGAAACATAGGCTCTGA(SEQ ID NO.10)；
HPS40F：CTGCCATTATTCACACGAGG(SEQ ID NO.11)
R：TGCCATGTTGAGAACTGGTC(SEQ ID NO.12)；
HPL18F：AACCCTCGAATCAAGCTCAA(SEQ ID NO.13)
R：AACTCCGAAGTGAAGGACGA(SEQ ID NO.14)。
利用7对SSR引物对24份黄精属种质进行遗传多样性分析，扩增出193个SSR标记位点，各个标记分别检测到4～10个等位基因，平均6.4286个，每个SSR标记的基因多样性介入0.52788～0.8620之间，平均为0.6421，杂合度介入0.2500～0.6667之间，平均为0.3988，多态信息量(PIC)介于0.5026～0.8470之间，平均为0.6127。从表2中可以发现，本发明的7个SSR位点全部为高度多态位点。由此可见，本发明的7对黄精属SSR位点在试供的24份黄精属种质材料中表现出较好的多态性扩增。
表2 7对SSR引物对24份黄精属种质资源的遗传多样性
使用NTSYS-PC V2.10软件基于UPGMA方法进行聚类分析。图8中的聚类分析结果显示：24份黄精属种质材料在遗传距离阈值为0.246处能被分成三大类，第一大类中所有的多花黄精聚在了一起，黄精聚为了第二大类，滇黄精聚聚为了第三大类。聚类的结果表明，黄精、多花黄精、滇黄精中之间具有较高的亲缘关系，遗传相似系数较高，并且本发明中开发的7个SSR位点能将这三种黄精区分开来，成为黄***之间鉴定的方法之一。
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 用于鉴定黄精属种质资源的SSR分子标记及应用
<130> KHP171117332.6
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcttgtaga cacttgtgcc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaaacataa acccgaacaa a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccaacgatg gagatgagat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcaagaggt tcaggaggag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtggcgatt ttctcttgga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccctacttg atctccacca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctcaaatct atccttgggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcggtggtat tacgtgcaaa 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acatgtaacc ctgttggaat g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtcgaaaca taggctctga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgccattat tcacacgagg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgccatgttg agaactggtc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaccctcgaa tcaagctcaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aactccgaag tgaaggacga 20
Claims (10)
1.用于鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质资源的SSR分子标记，其特征在于，其为以下任一或多个SSR分子标记组合，
(1)HC10F：TGCTTGTAGACACTTGTGCCA
R：GCAAACATAAACCCGAACAAA；
(2)HC33F：GCCAACGATGGAGATGAGAT
R：TGCAAGAGGTTCAGGAGGAG；
(3)HPT62F：AGTGGCGATTTTCTCTTGGA
R：CCCCTACTTGATCTCCACCA；
(4)HPT64F：CCTCAAATCTATCCTTGGGC
R：TCGGTGGTATTACGTGCAAA；
(5)HPT97F：ACATGTAACCCTGTTGGAATG
R：CGTCGAAACATAGGCTCTGA；
(6)HPS40F：CTGCCATTATTCACACGAGG
R：TGCCATGTTGAGAACTGGTC；
(7)HPL18F：AACCCTCGAATCAAGCTCAA
R：AACTCCGAAGTGAAGGACGA。
2.用于鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质资源的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2、或SEQ ID NO.3-4、或SEQ ID NO.5-6、或SEQ ID NO.7-8、或SEQID NO.9-10、或SEQ ID NO.11-12、或SEQ ID NO.13-14所示。
3.权利要求1所述的SSR分子标记或权利要求2所述的特异性引物对在黄精属(Polygonatum Mill.)种质鉴定中的应用。
4.权利要求1所述的SSR分子标记或权利要求2所述的特异性引物对在黄精属(Polygonatum Mill.)种质分子育种中的应用。
5.权利要求1所述的SSR分子标记或权利要求2所述的特异性引物对在黄精属(Polygonatum Mill.)种质资源遗传多样性分析中的应用。
6.权利要求1所述的SSR分子标记或权利要求2所述的特异性引物对在鉴别多花黄精、黄精和滇黄精中的应用。
7.含有权利要求2所述特异性引物对的试剂盒。
8.一种鉴定黄精属(Polygonatum Mill.)种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待鉴定黄***质的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物对进行PCR扩增反应；
(3)扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，统计显色结果，根据统计结果判断黄精属种质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
10.如权利要求8-9任一所述的方法，其特征在于，计算各引物的等位基因数、基因多样性和多态信息量；基于UPGMA方法进行聚类分析。
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Application publication date: 20180410 Assignee: Foshan Furun Inspection and Testing Co.,Ltd. Assignor: INSTITUTE OF BAST FIBER CROPS, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980032382 Denomination of invention: SSR Molecular Markers for Identification of Polygonatum Germplasm Resources and Their Application Granted publication date: 20190423 License type: Common License Record date: 20230222 |
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