CN107893051A - 一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法 - Google Patents

一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法，该方法包括以下步骤：1)血清预处理；2)制备免疫磁珠；3)将步骤1)所得血清预处理产物与2)中获得的免疫磁珠孵育，得到抗体‑磁珠复合物吸附外泌体。本发明的优点：操作简单，所得到的产物纯度高，需要的设备较为简单，且可对血清中含有特定标志物的外泌体进行分离。

Description

一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地，涉及一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法。
背景技术
外泌体(exosome)是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm，在生物进程以及细胞间信号传递都发挥着作用。外泌体膜表面含有CD9、CD63和CD81等标志蛋白，膜内含有核酸如microRNA等生物大分子。目前，血清外泌体分离主要有基于超速离心的分离技术，基于分子大小的分离技术(色谱法)、PEG沉淀法、基于免疫吸附的分离技术等。离心法获得的外泌体得率较高，但其耗时耗力，不适合大量样本操作。色谱法提取的外泌体纯度较高，但其分离易受杂蛋白干扰，操作稳定性差，且通常对样本会产生稀释作用，得到的外泌体浓度偏低，难以进行后续检测。PEG沉淀法获得的外泌体耗时短，但所得外泌体纯度较低。更重要的是，上述离心法、色谱法及PEG沉淀法分离纯化血清中总外泌体,而无法分离提取含有特定标志物的外泌体(如CD9+/CD63+外泌体)。
外泌体膜上存在大量的蛋白质和受体，这些蛋白质(抗原抗体)之间的免疫亲和作用以及受体和配体之间的特异反应，为有效特异的分离外泌体提供了新方法。免疫磁珠分离技术以其靶向特异性强、操作方便、分离高效的优点，在广泛应用于生化、分子、遗传学、病理、生理、药理、微生物等各个领域。目前，美国SBI公司，日本MBL公司已开发基于磁珠的免疫亲和捕获技术用于外泌体的分离纯化，可用于提取分离血清中表达特定标志物的外泌体。
发明内容
本发明目的是提供一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法，该方法包括以下步骤：
1)预处理，(室温)取新鲜血清，经超速离心分离，初步去除杂质，取上清；
进一步地，步骤1)包括：取新鲜血清，室温3000g离心30分钟，弃细胞碎片沉淀；取离心上清液，加入29倍体积的PBS进行稀释，4℃100000g，离心2小时，收取沉淀，重悬。
2)取磁珠悬液用适量分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，用适量所述分离缓冲液悬浮；然后向所得悬浮液中加入适量CD5L单克隆抗体孵育；孵育完成后用适量(例如100倍体积)所述分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠(至少清洗三遍)，再用适量(例如100倍体积)分离缓冲液悬浮；
进一步地，步骤2)中采用链霉亲和素修饰的磁珠，例如链霉亲和素修饰磁珠。
进一步地，步骤2)中分离缓冲液的用量为磁珠悬液体积的50-500倍，例如100倍。
进一步地，步骤2)中所述CD5L单克隆抗体的加入体积与所述磁珠悬液的体积比为1-1.5:50-100。
进一步地，步骤2)中所述孵育时间至少12小时。
3)向步骤2)最终得到的磁珠悬浮液中加入2-10倍体积步骤1)预处理得到的上清，孵育；
进一步地，步骤3)中所述孵育时间至少24小时。
4)将步骤3)孵育完成后的体系用适量(例如100倍体积)磷酸缓冲盐溶液清洗，磁力架分离磁珠，即得到吸附有外泌体的复合物，即磁珠-抗体-外泌体复合物。
进一步地，所述分离缓冲液为含0.1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。
进一步地，所述分离缓冲液事先以0.22微米滤膜过滤除菌。
如无特殊指明，本发明所述孵育条件为：温度37℃，孵育器参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒。
具体地，本发明所述使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法，包括以下各步骤：
1)预处理，室温下以新鲜血清，经超速离心分离，初步去除杂质，取上清；
2)取1倍体积磁珠悬液用100倍体积分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，100倍体积分离缓冲液悬浮；将上述悬浮液加入1/10倍体积CD5L单克隆抗体孵育12小时；孵育完成后用100倍体积分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍，100倍体积分离缓冲液悬浮；
3)将步骤2)最终得到的磁珠悬浮液中加入2-10倍体积步骤1)处理得到的预处理上清，孵育24小时；4)将步骤3)孵育完成后用100倍体积磷酸缓冲盐溶液清洗，磁力架分离磁珠，即得到含有的外泌体复合物(即磁珠-抗体-外泌体复合物)。
本发明的技术特点在于：
本发明的基本思想是使用免疫磁珠分离血清中外泌体。
本发明针对现有技术的缺陷，用免疫磁珠的方法将血清中外泌体进行富集，操作简单，所得到的产物纯度高，不需要特定设备，能够针对性地分离表达特定蛋白质的外泌体。
附图说明
图1为免疫磁珠分离血清中CD5L+外泌体的Dot-blot。
图2为免疫磁珠分离血清中CD5L+外泌体的Western-blot。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
下述实施例中使用的主要仪器及试剂：M-280Tosylactivated(Ancell公司,美国)；兔抗人CD5L多克隆抗体(Abcam公司,美国)；HRP标记二抗(JacksonImmuno Research)；超速离心机(Beckman coulter,美国)；磁力架(NewEnglandBiolabs)；半干转膜仪，电泳槽购于Bio-rad。
实施例1免疫磁珠分离血清中CD5L+外泌体
1、实验步骤：
1)收集新鲜血清，置于离心机中，室温3000g离心30分钟，弃细胞碎片沉淀，取离心上清液，以1:29(血清:PBS)的体积比例进行稀释，采用超速离心机进行超速离心(100000g，2小时，4℃)，收取沉淀，重悬。
2)漩涡震荡链霉亲和素修饰磁珠，待磁珠悬浮液均一后，取165微升磁珠悬液加入到1ml分离缓冲液中，悬浮清洗,磁力架分离磁珠，重复清洗三遍。清洗完成后，250升分离缓冲液悬浮磁珠。
取6微升兔抗人CD5L多克隆抗体加入到上述所得的磁珠悬液中，颠倒混合均匀，置于孵育器上孵育12小时(参数为颠倒旋转90°，37℃)；孵育完成，孵育液置于磁力架上2分钟,弃清液，磁珠用1ml分离缓冲液悬浮，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍。清洗完成后，250微升分离缓冲液悬浮磁珠。
3)取150微克步骤1)所得的沉淀重悬液加入到步骤2)所得的磁珠悬液中，颠倒混合均匀，置孵育器上孵育24小时(参数为颠倒旋转90°，4℃)；
4)孵育完成，孵育液置于磁力架上，弃清液，磁珠用1ml分离缓冲液悬浮，悬浮清洗,磁力架分离磁珠，清洗三遍；清洗完成后，即得到吸附有CD5L+外泌体的复合物即磁珠-抗体-CD5L+外泌体复合物。
2、实验结果：
如图1示，是根据上述方法所分离得到的有CD5L+外泌体的复合物即磁珠-抗体-CD5L+外泌体复合物经过洗脱后所得到的Dot-blot。所示结果显示外泌体得到高度富集。exo为外泌体。
如图2示，是根据上述方法所分离得到的有CD5L+外泌体的复合物即磁珠-抗体-CD5L+外泌体复合物经过洗脱后所得到的Western-blot。所示结果显示外泌体得到高度富集。TSG101为外泌体特异性marker，常作为外泌体鉴定的特异性蛋白。

Claims (9)

1.一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)预处理：取新鲜血清，经超速离心分离，初步去除杂质，取上清；
2)取磁珠悬液用适量分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，用适量所述分离缓冲液悬浮；然后向所得悬浮液中加入适量CD5L单克隆抗体孵育；孵育完成后用适量所述分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，再用适量分离缓冲液悬浮；
3)向步骤2)最终得到的磁珠悬浮液中加入2-10倍体积步骤1)预处理得到的上清，孵育；
4)将步骤3)孵育完成后的体系用适量磷酸缓冲盐溶液清洗，磁力架分离磁珠，即得到吸附有外泌体的复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离缓冲液为含0.1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液；优选地，所述分离缓冲液事先以0.22微米滤膜过滤除菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：取新鲜血清，室温3000g离心30分钟，弃细胞碎片沉淀；取离心上清液，加入29倍体积的PBS进行稀释，4℃100000g，离心2小时，收取沉淀，重悬。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)采用链霉亲和素修饰的磁珠；优选链霉亲和素修饰磁珠。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中分离缓冲液的用量为磁珠悬液体积的50-500倍。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述CD5L单克隆抗体的加入体积与所述磁珠悬液的体积比为1-1.5:50-100。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述孵育时间至少12小时；和/或，
步骤3)中所述孵育时间至少24小时。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述孵育条件为：温度37℃，孵育器参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，包括以下各步骤：
1)预处理，室温下以新鲜血清，经超速离心分离，初步去除杂质，取上清；
2)取1倍体积磁珠悬液用100倍体积分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，100倍体积分离缓冲液悬浮；将上述悬浮液加入1/10倍体积CD5L单克隆抗体孵育12小时；孵育完成后用100倍体积分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍，100倍体积分离缓冲液悬浮；
3)将步骤2)最终得到的磁珠悬浮液中加入2-10倍体积步骤1)处理得到的预处理上清，孵育24小时；
4)将步骤3)孵育完成后用100倍体积磷酸缓冲盐溶液清洗，磁力架分离磁珠，即得到含有的外泌体复合物。
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