CN107849559A - 鉴定并验证亲和试剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明特征在于鉴定并验证亲和试剂如抗体的方法。本发明的方法主要涉及通过例如细菌（例如大肠杆菌（E.coli））上的噬菌体展示来筛选抗体文库，从而鉴定能够结合期望靶多肽的特定抗体克隆。以此方式鉴定的克隆可随后利用酵母双杂交进行验证。在一些情况下，通过它们结合半抗原的能力鉴定的抗体可通过它们结合全长抗原的能力进行验证。验证过的克隆可通过另外几轮噬菌体展示和/或酵母双杂交进一步进行筛选。在每轮之间，可产生并筛选特定抗体克隆的另外的变体以鉴定表现出对所关注的靶具有更高结合亲和力的变体。

Description

鉴定并验证亲和试剂的方法
序列表
本专利申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且据此全文以引用方式并入。创建于2016年2月12日的所述ASCII拷贝名称为50881_011WO2_Sequence_Listing_2_12_16_ST25.txt，并且大小为5150字节。
技术领域
本发明涉及鉴定并验证能够结合靶多肽的亲和试剂。
发明背景
用于产生抗体的最常用的方法是通过动物免疫产生。然而，这种方法一般来讲是低通量的、昂贵的、耗时的，并且产生的抗体不总是可再生的。此外，无中间验证步骤以确保针对半抗原分离的此类抗体将有效地结合全长抗原。替代方法是产生重组抗体（rAb），该方法目前通过以下几种方法完成：（i）小鼠杂交瘤和（ii）重组展示技术。小鼠杂交瘤方法昂贵并且可能导致亲和试剂的异质集合。此外，基于杂交瘤的方法可能常常耗费几个月来产生rAb，并且无进一步操作的情况下得不到DNA序列信息。不涉及动物的重组展示技术可为自动的并且能够仅在几周内产生可用的rAb。通过展示技术产生的rAb通过在合适异源宿主中的过表达是可再生的，并且易于以DNA形式储存和传递。然而，当前的展示技术成本高且通量低。因此，本领域需要开发高效的、成本可接受的、并且可广泛应用的方法以产生可再生的亲和试剂，例如重组抗体。
发明内容
本发明特征在于鉴定并验证亲和试剂如抗体（例如IgG、scFv、Fab、和本领域已知的其它抗体类型）的方法。本发明的方法主要涉及通过例如细菌（例如大肠杆菌（E. coli））上的噬菌体展示筛选抗体文库，从而鉴定能够结合期望靶多肽的特定抗体克隆。以此方式鉴定的克隆可随后利用双杂交***（例如酵母双杂交）进行验证。在一些情况下，抗体可通过它们结合半抗原（半Ag）的能力进行鉴定。在某些情况下，通过它们结合半抗原的能力鉴定的抗体可通过它们结合全长抗原（FL-Ag）的能力进行验证。验证过的克隆可通过另外几轮噬菌体展示和/或酵母双杂交进一步进行筛选。在每轮之间，可进一步修饰特定克隆的变体，例如通过本文所述的AXM克隆方法进行修饰，用于产生另外的克隆变体，可筛选它们以鉴定对所关注靶显示更高的结合亲和力的变体。
在第一方面，本发明特征在于鉴定并验证能够结合靶多肽的结合部分的方法。该方法涉及：
(a)提供多种病毒，每种病毒包括：
编码结合部分的核酸，其中结合部分展示在病毒表面；
(b)与靶多肽或其肽片段一起温育多种病毒；
(c)检查病毒展示的结合部分是否结合靶多肽或其肽片段；
(d)对于每个鉴定为能够结合靶多肽的结合部分，在细胞中表达：
（i）第一融合蛋白，其包括鉴定为能够结合靶多肽的特定结合部分和第一报告部分，以及
（ii）第二融合蛋白，其包括靶多肽或其肽片段，以及第二报告部分，
其中特定结合部分与靶多肽或其肽片段的结合导致细胞中可检测基因的表达，其中该可检测基因的表达处于第一报告部分和第二报告部分的控制之下；并且
(e)测定是否每个细胞表达可检测基因，从而验证鉴定为能够结合靶多肽的结合部分能够与靶多肽结合。
在第一方面的一些实施方案中，该方法还涉及在检查步骤之后并在表达步骤之前，给编码每个鉴定为结合靶多肽或其肽片段的结合部分的核酸测序。给此类核酸测序的方法可包括例如本领域已知的任何测序方法（例如深度测序和桑格（Sanger）测序）。
在第一方面的一些实施方案中，在检查步骤和测序步骤中将多个结合部分鉴定为能够结合靶多肽，并且该方法还包括根据步骤（d），在不同细胞中表达每个鉴定的结合部分，以及根据步骤（e）测定是否每个不同细胞表达所述可检测基因。在某些实施方案中，该方法还包括产生至少一个验证过的结合部分的多个变体，并且使用多个变体作为步骤（a）的结合部分重复步骤（a）-（e）。在特定实施方案中，重复步骤（a）-（e）至少两次（例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10次）。在一个实施方案中，重复步骤（a）-（e）一次。
在第二方面，本发明特征在于验证在结合部分和靶多肽之间的结合相互作用的方法。该方法涉及：
在细胞中表达：
(a)第一融合蛋白，其包括结合部分和第一报告部分，以及
(b)第二融合蛋白，其包括靶多肽或其肽片段，以及第二报告部分；
通过以下步骤已经将结合部分鉴定为能够结合靶多肽：
（i）在病毒上表达编码结合部分的核酸，其中结合部分展示在病毒表面，
（ii）与靶多肽或其肽片段一起温育病毒，并且
（iii）检查病毒展示的结合部分是否结合靶多肽或其肽片段；
其中细胞中结合部分与靶多肽或其肽片段的结合导致细胞表达可检测基因，其中该可检测基因的表达处于第一报告部分和第二报告部分的控制之下；并且
测定是否细胞表达可检测基因，从而验证结合部分能够结合靶多肽。
在第二方面的一些实施方案中，该方法还包括用一个或多个另外的结合部分重复表达步骤和测定步骤，已经根据步骤（i）-（iii）将所述一个或多个另外的结合部分鉴定为能够结合靶多肽。
在上文任一方面的一些实施方案中，结合部分是抗体或抗体片段。在某些实施方案中，结合部分是单链可变片段（scFv）。在特定实施方案中，scFv包括抗体框架，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90% 的序列同一性（例如90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% 的序列同一性）的氨基酸序列。
在上文任一方面的一些实施方案中，温育步骤包括与靶多肽的肽片段一起温育病毒。在某些实施方案中，靶多肽的肽片段长度少于约40个氨基酸（例如长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、或40个氨基酸）。在其它实施方案中，靶多肽的肽片段长度多于约40个氨基酸（例如长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、或40个氨基酸）。在其它实施方案中，靶多肽的肽片段长度为约30-100个氨基酸（例如长度为约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100个氨基酸）。在一个实施方案中，肽片段是合成的。
在上文任一方面的一些实施方案中，第二融合蛋白包括靶多肽的全长氨基酸序列。
在上文任一方面的一些实施方案中，靶多肽经翻译后修饰。在某些实施方案中，靶多肽经磷酸化。在特定实施方案中，靶多肽通过在细胞中共表达修饰酶（例如激酶）进行磷酸化。在其它实施方案中，靶多肽利用抑制细胞（例如抑制酵母或细菌细胞）进行位点特异性修饰。在一个实施方案中，靶多肽进行体内翻译后修饰，例如利用pSer***在大肠杆菌（E. coli）中进行，或者通过在双杂交***（例如酵母双杂交***或细菌双杂交***）中掺入碘代酪氨酸进行。
在上文任一方面的一些实施方案中，结合部分进行翻译后修饰（例如磷酸化）。在某些实施方案中，使用能够位点特异性修饰结合部分的抑制宿主细胞。
在上文任一方面的一些实施方案中，靶多肽是可溶性蛋白。在某些实施方案中，靶多肽是细胞内蛋白（例如细胞质蛋白、核蛋白、线粒体蛋白、溶酶体蛋白、或叶绿体蛋白）。在一个实施方案中，靶多肽是细胞质蛋白。在备选的实施方案中，靶多肽是分泌蛋白。在各种实施方案中，靶多肽是前体蛋白（例如分泌蛋白的前体）。
在上文任一方面的一些实施方案中，靶多肽是蛋白的可溶性结构域。在某些实施方案中，靶多肽是膜结合蛋白的可溶性结构域（例如细胞内结构域或细胞外结构域）。
在上文任一方面的一些实施方案中，第一报告部分是转录因子激活结构域并且第二报告部分是DNA结合结构域。在备选的实施方案中，第一报告部分是DNA结合结构域并且第二报告部分是转录因子激活结构域。在特定实施方案中，转录因子激活结构域是B42激活结构域。在具体实施方案中，DNA结合结构域是GAL4 DNA结合结构域。在一个实施方案中，转录因子激活结构域是B42激活结构域并且DNA结合结构域是GAL4 DNA结合结构域。
在上文任一方面的一些实施方案中，细胞是酵母细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、或植物细胞。在一些实施方案中，细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）。在一个实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。在备选的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞（例如人或小鼠细胞）。在其它实施方案中，细胞是细菌细胞（例如大肠杆菌（E. coli）细胞）。
在上文任一方面的一些实施方案中，病毒是噬菌体M13。
在上文任一方面的一些实施方案中，检查步骤包括进行酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫沉淀、蛋白质印迹（Western blot）、流式细胞术、或质谱。
在上文任一方面的一些实施方案中，每种病毒起源于双功能载体，其包括编码特定结合部分的基因，其中：如果双功能载体存在于第一细胞中，该双功能载体用作模板，用于第一细胞表达包括特定结合部分和病毒蛋白的第一融合蛋白；并且如果双功能载体存在于第二细胞中，该双功能载体用作模板，用于第二细胞表达包括特定结合部分和报告部分的第二融合蛋白。
在某些实施方案中，第一细胞是细菌细胞。在各种实施方案中，第二细胞是酵母细胞并且报告部分是转录因子激活结构域或DNA结合结构域。在特定实施方案中，转录因子激活结构域是B42激活结构域。在具体实施方案中，DNA结合结构域是GAL4 DNA结合结构域。在一个实施方案中，转录因子激活结构域是B42激活结构域并且DNA结合结构域是GAL4 DNA结合结构域。
在某些实施方案中，双功能载体包括抑制性终止密码子，其位于病毒蛋白和结合部分之间。在特定实施方案中，抑制性终止密码子是琥珀终止密码子。
在某些实施方案中，病毒蛋白是gp3蛋白。在一个实施方案中，双功能载体是pCH103载体（例如本文所述的pCH103载体或其变体）。
在上文任一方面的一些实施方案中，表达步骤和测定步骤在液体培养基中进行。
在上文任一方面的一些实施方案中，细胞在表达步骤之前缺少选择性标记物，并且表达步骤还包括在细胞中表达选择性标记物。在一个实施方案中，选择性标记物是URA3。
在上文任一方面的一些实施方案中，在多种病毒中编码结合部分的核酸通过以下步骤产生：
(i)提供包括结合部分序列的模板DNA分子，
(ii)提供一对寡核苷酸，其中寡核苷酸杂交到结合部分序列的相反链上，其中寡核苷酸之一受到保护，另一寡核苷酸不受保护，并且寡核苷酸侧接于结合部分序列；
(iii)使用寡核苷酸对模板DNA分子进行扩增反应，从而产生结合部分序列的dsDNA变体群；
(iv)与能够相较dsDNA变体的受保护链选择性降解未受保护的链的酶一起温育该dsDNA变体群，从而制备结合部分序列的ssDNA变体群；
(v)杂交该ssDNA变体群与ssDNA中间体，其中ssDNA中间体包括基本上与结合部分序列或其片段相同的序列，产生异源双链DNA；并且
(vi)将异源双链DNA转化到宿主细胞中，从而产生结合部分序列的多个变体。
在某些实施方案中，模板DNA分子还包括病毒核酸序列。在各种实施方案中，该方法还包括将结合部分序列的变体克隆到病毒载体中。在特定实施方案中，结合部分序列的未重组拷贝包括预先确定的限制性位点，并且结合部分序列的重组拷贝不包括预先确定的限制性位点。在具体实施方案中，宿主细胞表达限制性酶（例如Eco29kI），其识别并裂解预先确定的限制性位点。在一个实施方案中，转化步骤还包括在其中限制性酶能够裂解具有预先确定的限制性位点的核酸的条件下温育宿主细胞。在任一上文实施方案中，宿主细胞可为细菌，例如大肠杆菌（E. coli）（例如AXE688大肠杆菌（E. coli））。
在某些实施方案中，模板DNA分子是病毒载体。
在某些实施方案中，模板DNA分子是双功能载体，其中：如果双功能载体存在于第一细胞中，该双功能载体用作模板，用于第一细胞表达包括结合部分序列和病毒蛋白的第一融合蛋白；并且如果双功能载体存在于第二细胞中，该双功能载体用作模板，用于第二细胞表达包括结合部分序列和报告部分的第二融合蛋白。
在一个实施方案中，双功能载体是pCH103载体（例如如本文所述的pCH103载体或其变体）。
在某些实施方案中，能够相较dsDNA变体的受保护链选择性降解未受保护的链的酶是T7核酸外切酶。
在上文任一方面的一些实施方案中，该方法还包括在测定步骤后免疫沉淀来自瞬时转染细胞的靶多肽。在某些实施方案中，使待免疫沉淀的靶多肽带有表位标签。在特定实施方案中，表位标签是FLAG、HA、Myc、His、V5、GFP、YFP、GST、或MBP。在具体实施方案中，瞬时转染细胞是哺乳动物细胞（例如人细胞或小鼠细胞）。
在第三方面，本发明特征在于抗体框架，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90% 的序列同一性（例如90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% 的序列同一性）的氨基酸序列。本发明特征还在于编码抗体框架的核酸，该抗体框架包括与SEQ ID NO:1具有至少90% 的序列同一性（例如90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% 的序列同一性）的氨基酸序列。
定义
如本文所用，“半抗原”或“半Ag”是指用作抗原的全长蛋白的任何多肽片段，例如用于根据本发明的方法制备抗体。“半抗原”或“代抗原(proxy antigen)”可指例如以下任何物质：合成肽、蛋白片段、或不包括全长抗原的重组融合蛋白。
“全长抗原”或“FL-Ag”是指受关注抗原的全长多肽，例如多肽（例如蛋白）。例如，受关注蛋白的全长多肽可为包含受关注蛋白的完整氨基酸序列的多肽，其由编码该蛋白的天然存在形式的mRNA编码。受关注抗原可包括例如可溶性蛋白（例如细胞质蛋白或分泌蛋白）、膜结合蛋白（例如细胞表面蛋白或细胞器膜结合蛋白）、错误折叠蛋白（例如朊病毒）、或本领域已知的任何其它多肽。在一些情况下，全长抗原可与另一个多肽融合，例如选择性标记物或表位标签。在本文所述的方法中，全长抗原的片段可用作半抗原。
如本文所用，术语“靶多肽”是指受关注的任何多肽，其包含一个或多个表位，结合部分例如抗体或抗体片段可与其结合。靶多肽可为例如全长抗原或半抗原。
“结合部分”或“亲和试剂”是指能够结合另一个分子（例如靶多肽）的任何分子。本发明的结合部分可包括例如抗体、抗体片段、和抗体衍生物，例如在本领域中熟知的那些。示例性的抗体和抗体片段包括IgG、单链可变片段（scFv）、和Fab。
术语“可检测基因”或“选择性标记物”是指任何基因指示物，其能够出现或由核酸编码，并且允许选择、筛选、或检测。例如，可检测基因可编码允许细胞在特定培养基中生长的蛋白（例如URA3），或者赋予可检测特性如荧光（例如GFP、YFP、CFP、dsRed、mCherry、或本领域已知的任何其它荧光蛋白）或产生特定化合物或颜色（例如LacZ）的蛋白，或者能够利用结合部分（例如抗体）检测到的肽。在一些情况下，可检测基因可包括例如表位，其能够由抗体结合，用于利用多种技术进行检测，所述技术例如免疫荧光、荧光激活细胞分选（FACS）、流式细胞术、蛋白印迹分析（Western analysis）、和/或免疫组织化学。可检测基因可仅在某些条件下在细胞中选择性表达，例如如果特定启动子被激活（例如通过转录因子和/或通过与激活结构域和DNA结合结构域的缔合）。
如本文所用，“双功能载体”是指包含基因和允许基因在至少两种不同细胞中表达的元件的核酸载体。例如，双功能载体可用于在酵母（例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））和细菌（例如大肠杆菌（E. coli））中表达受关注的基因。在一些情况下，根据其中存在双功能载体的细胞，基因可以不同形式表达。在某些情况下，基因的蛋白产物可在一种细胞类型中与第二蛋白融合，并且可备选地在另一细胞类型中与第三蛋白融合。例如，受关注的基因当在大肠杆菌（E. coli）中表达时可与病毒蛋白gp3融合，但是当在酵母中表达时可与例如转录激活结构域或DNA结合结构域融合。因此，在一些情况下，相同的双功能载体可用于噬菌体展示筛选中的细菌表达和酵母双杂交测定中的酵母表达。载体（例如双功能载体）或其部分可用作基因表达的“模板”，因为该基因的核酸序列存在于载体上，使得RNA聚合酶可将该基因的核酸序列转录成mRNA，其可随后翻译成蛋白。备选地，基因可表达成非编码RNA、siRNA、shRNA、miRNA、piRNA、tRNA、或本领域已知的任何其它功能基因。
“dsDNA”是指双链DNA分子，例如包含彼此杂交的两条链的DNA分子。dsDNA分子的两条链可完全互补，使得每条链上的每个碱基与相反链上的碱基结合。备选地，dsDNA分子的两条链可包括非互补的核苷酸。“ssDNA”是单链DNA分子，例如目前不与另一条DNA链杂交的单个DNA链。ssDNA分子能够与另一个ssDNA分子杂交以形成dsDNA。
术语“抗体”本文以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、和抗体片段（例如scFv和Fab片段），只要它们表现出期望的生物活性即可。
如本文所用，“单链可变片段”或“scFv”是指包括抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。Fv多肽还可包括在VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够使scFv形成用于抗原结合的期望结构。参见例如Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269- 315页（1994）。
附图说明
图1是示出在发现筛选期间结合有Y2H测定的高通量流水线的流程图。显示为绿色的加到流水线中的Y2H可置于例如通过ɸD的第二轮和第三轮亲和选择之间，作为鉴定抗全长蛋白的亲和试剂的一种方法。第一ɸD发现轮可用于富集文库中低亲和力的结合物。Y2H测定随后可用于富集抗全长折叠蛋白抗原的结合物。可在AXM诱变后进行第二轮ɸD以亲和力成熟任何可能的亲和克隆。
图2是示出示例性克隆载体***pCH103载体***的图。已经构建pCH103载体***，其具有在Y2H和基于大肠杆菌（E. coli）的ɸD方法中行使功能的能力。在大肠杆菌（E. coli）中，表达的蛋白将取决于大肠杆菌（E. coli）基因型。（A）由于将琥珀终止密码子***到scFv和gp3之间，在非抑制大肠杆菌（E. coli）中表达的蛋白将为scFv本身。在大肠杆菌（E. coli）的抑制菌株中，scFv将与gp3蛋白融合。在酵母中，scFv可与酵母激活结构域融合，或者在使用不同载体***的备选情况下，与DNA-结合结构域融合。（B）pCH103载体***的特征包括：（i）用于表达克隆到pYESTrp2中的基因的GAL1启动子；表达在L40中是组成型的并且在EGY48/pSH 18-34中是诱导型的，（ii）允许利用抗-V5抗体检测融合蛋白的V5表位，（iii）SV40大T抗原核定位序列（NLS），其将融合体定位到核，用于与LexA融合体的潜在相互作用，（iv）B42激活结构域（AD），它是一种转录激活结构域，允许报告基因当通过两个相互作用蛋白靠近LexA DNA结合结构域（DBD）时进行表达，（v）CYC1转录终止信号，其允许有效终止并稳定mRNA，（vi）TRP1基因，其允许在Trp-酵母宿主（例如L40或EGY48/pSH 18-34）中的质粒的营养缺陷型选择，（vii）用于在酵母中维持和高拷贝复制的2-微米起点，（viii）用于通过M13K07辅助噬菌体的单链DNA拯救的f1起点，（ix）编码的大肠杆菌（E. coli）lac启动子（P E.coli ，用于M13 gp3融合构建体的受控表达），（x）M13 gp3基因，用于M13的gp3蛋白的ɸD融合体，以及（xi）用于将蛋白克隆到pCH103载体的多个克隆位点中的蛋白融合位点。
图3是一系列示出pCH103载体***特征的图像。（A）在大肠杆菌中的琥珀抑制测 试：构建一种pCH103载体形式，其在AD和Zeo基因之间缺失终止密码子。这种构建体与其中琥珀终止密码子位于AD和Zeo基因之间的相似载体进行比较。包含supE44的大肠杆菌（E. coli）菌株显示抑制终止密码子，允许在包含博来霉素（zeocin）的平板上生长。（B）在酵母 中的抑制测试：在酵母中测试如图3A所示的相同载体***。如预料的那样，如果存在AD基因3’的终止密码子，酵母不能在包含Zeo的平板上生长。（C）通过翻译重编码的大肠杆菌（E. coli）启动子肽在Y2H中进行的蛋白-蛋白相互作用测试：将抗cMet的scFv***载体并对于cMet和2个其它不相关的诱饵(bait)蛋白进行测试，一式两份。测试3个启动子的重编码启动子肽不干扰cMet scFv与cmer诱饵蛋白的相互作用的能力。tac和tacO启动子显示不干扰Y2H筛选。然而，发现phoA启动子肽干扰诱饵蛋白与猎物(prey)融合蛋白的相互作用。（D）F1 ori 测试：将M13KO7辅助噬菌体感染进入包含pJaneway的大肠杆菌（E. coli）中以形成包装的pJaneway质粒DNA的转导溶解物。这些溶解物经无菌过滤并随后用于在+Zeo平板上将大肠杆菌（E. coli）菌株CJ236的菌苔转导成Zeor。
图4是一系列示出针对蛋白片段产生的scFv能够识别全长（FL）蛋白的图像。（A）将用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签标记的纯化ZNF384片段（氨基酸1-100）和用全长ZNF384（DNASU）的表达构建体瞬时转染的HEK293细胞的溶解物在丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝酸纤维素膜上并用抗ZNF384片段产生的带FLAG-标签的scFv探测，随后用抗-FLAG-HRP二Ab探测以检测scFv。（B）溶解用全长ZNF622和ZNF384瞬时转染的HEK293细胞以制备溶解物（L）和染色质（C）级分。溶解物和染色质级分与固定在FLAG珠上的scFv（抗ZNF384的氨基酸1-100或ZNF622的氨基酸37-139产生）一起温育。洗涤珠，并用包含2% SDS的缓冲液洗脱复合物。洗脱过的复合物随后通过利用抗-V5-HRP抗体的蛋白质印迹（Western Blot）分析，以检测洗脱液中是否存在全长转录因子（用V5标签标记）。（C）这一页示出如图4B进行的实验，但是按照ChIP方案使用***交联的细胞。
图5是示出基于AXM克隆的scFv-to-IgG重构方案的图。在这一方案中，来自富集scFv的可变重链和轻链基因将使用在5’末端包含硫代磷酸键的反向引物进行扩增。所得双链DNA用T7核酸外切酶处理以选择性降解dsDNA分子的未经修饰的链。所得单链DNA或“大引物（megaprimer）”将随后退火成环状单链DNA，其包含CMV启动子、IL2信号序列、内部核糖体进入位点（IRES）、和带有在CDR区域中的Eco29kI限制性位点的轻链与重链可变以及恒定结构域。退火的大引物可用于引导通过DNA聚合酶的体外DNA合成。所得的连接的异源双链产物随后转化到大肠杆菌（E. coli）AXE688细胞中，其表达Eco29kI限制性内切核酸酶。因此，在这些细胞中存在Eco29kI有利于新合成的重组链的存在，该链掺入大引物。
图6是示出用载体转化的交配酵母菌株结果的一系列图像，所述载体编码与结合结构域融合的scFv（或对照）、或与激活结构域融合的至少一部分靶蛋白（Myb、EZH2、或对照）。（A）在阳性对照反应（表1的反应1）中；pGBKT7-p53与pGADT7-T交配），在所有最低限度培养基上观察到生长，指示强相互作用。（B）在阴性对照反应（表1的反应2；pGBKT7-Lam与pGADT7-T交配）中，如预期的那样，未观察到生长。（C）在表1的反应8（pGBKT7-AXM1387与pGADT7-Myb20交配）中，仅在TDO上观察到生长，指示弱相互作用。（D）在表1的反应15（pGBKT7-AXM1389与pGADT7-Myb100交配）中，在所有最低限度培养基上观察到生长，指示强相互作用。（E）在表1的反应17（pGBKT7-AXM2274与pGADT7-EZH2100交配）中，仅在TDO上观察到生长，指示弱相互作用。
图7是示出用载体转化的交配酵母菌株结果的一系列图像，所述载体编码与激活结构域融合的结合部分（scFv，已知的结合伴侣，或者其它对照），或者与结合结构域融合的至少一部分靶蛋白（GRAP2、XIAP、LNMA、或对照）。结果显示GRAP2在酵母双杂交***中与它的已知结合伴侣LCP2（阳性对照）相互作用，但是不与CASP9（阴性对照）相互作用。此外，GRAP2显示与scFv1相互作用，其针对如表3所示的GRAP2_2肽进行选择。此外，测试的scFv之一即AXM1389显示与全长GRAP2的相互作用。
发明详细描述
本发明提供用于抗全长（FL）人细胞质和核蛋白的重组抗体（rAb）的高通量（HT）验证的方法，其中rAb抗抗原的部分片段（半Ag）或者甚至合成肽而产生。例如，此类方法可涉及使用全长抗原（FL-Ag）进行酵母双杂交（Y2H）测定，以验证通过例如噬菌体展示（ɸD）产生的rAb。本发明的方法可并入任何高通量抗体生产流水线，并且可消除对于冗长、消耗劳动力并且低通量的单个亲和试剂表征的需要。本发明特征还在于能够进行Y2H和ɸD的载体***，其不需要进行任何亚克隆（例如pCH103载体***）。本发明特征还在于rAb框架（例如B2A框架），其能够在ɸD（例如当与噬菌体M13 gp3蛋白融合时）和Y2H（例如当与酵母DNA结合结构域或激活结构域如B42激活结构域融合时）中行使功能。这些方法允许快速、有效、并且低成本地生产和验证高度特异性的抗体，其具有对所关注靶多肽的强结合亲和力。
抗体筛选方法
本发明提供筛选能够结合期望靶多肽的亲和试剂（例如抗体）的方法，所述亲和试剂来自此类亲和试剂的文库。在一些情况下，使用噬菌体展示（ɸD）进行筛选，其中每个抗体在病毒（例如M13噬菌体）表面表达并且随后暴露于表示靶多肽的抗原（例如全长抗原或半抗原）。结合的病毒随后可与未结合的病毒分离，从而选择表达能够结合抗原的抗体的病毒。ɸD方法是本领域熟知的，并且可包括全液体ɸD方法。
在一些情况下，可通过本发明的方法，利用半抗原选择抗体。此类抗体可以例如最小的期望亲和力有利地结合全长靶多肽。使用半抗原可对使用作为靶的正确折叠的全长多肽进行补充。例如，可期望亲和试剂针对翻译后修饰的分子（例如磷酸化的靶）。许多此类靶位点位于靶多肽的非结构化区域内，使得半抗原是良好的表位模型。在一些情况下，特定全长蛋白可能难以纯化。也可期望区分靶蛋白家族的成员。在此类情况下，选择优选地集中于其中家族成员不同的序列区域，并且减法可能不总是成功的。因此，靶可由合成肽（例如少于40个氨基酸的合成肽）或蛋白片段（例如蛋白表位特征标签或PrEST，它们具有例如大于40个氨基酸的长度）组成，对于它们折叠可能是部分的，但是仍可能包含全长蛋白的若干个表位。对于此类蛋白片段，基因序列可与例如溶解度/折叠伴侣融合。这种方法能够在制备可溶性融合产物过程中产生高成功率（例如>90%），所述融合产物随后可进行纯化。所得纯化融合产物可用于产生抗融合体的半抗原部分的重组抗体（rAb），并且这些rAb在识别全长抗原时可具有高成功率。
本发明特征还在于筛选并验证抗全长翻译后修饰蛋白的rAb。在一些情况下，全长蛋白可进行翻译后修饰，例如通过在Y2H验证期间在酵母中共表达激酶或本领域已知的其它修饰酶。在某些情况下，可进行抗原的位点特异性修饰，例如使用抑制宿主。例如，可在大肠杆菌（E. coli）中使用pSer***（例如在细菌双杂交***中），或者可将碘代酪氨酸掺入双杂交***（例如酵母双杂交或细菌双杂交）。在酵母或细菌中用于抑制的任何其它方法也可用于这一目的。
在一个实施方案中，大肠杆菌（E. coli）的酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）经修饰以识别磷酸酪氨酸并使其掺入琥珀终止密码子，该琥珀终止密码子位于基因序列内的特定位置。在备选的实例中，可将磷酸丝氨酸（pSer）掺入全长蛋白[Dieter Soll，耶鲁大学（YaleUniversity），也参见M. Weiner，另外的支持文献]。pSer***可用于产生位点特异性磷酸丝氨酸全长蛋白，其可例如在pSer-抑制大肠杆菌（E. coli）宿主细胞中的细菌双杂交（B2H）***中进行测试（Battesti等人，Methods 58（4）:325-34，2012；Dove等人，MethodsMol Biol.261:231-46，2004；Velasco-García等人，58（11）:1241-57，2012）。
在一些情况下，根据上述方法测定为能够结合靶多肽的亲和试剂可通过分离编码亲和试剂的核酸（例如如本文所述的那些载体）并对分离的核酸测序来鉴定。测序方法是本领域熟知的，包括深度测序方法和下一代（NextGeneration）测序方法。测序可包括例如桑格（Sanger）测序或下一代测序技术。示例性的下一代测序技术无限制地包括Hyseq2500、Ion Torrent测序、Illumina测序、454测序、SOLiD测序、和纳米孔测序。另外的测序方法也是本领域已知的。
验证筛选
酵母双杂交验证
本发明特征在于使用酵母双杂交（Y2H）作为抗体的验证反向筛选，所述抗体鉴定为能够结合所关注的靶多肽（例如如本文所述使用噬菌体展示）。因此可通过Y2H反向筛选此类鉴定的抗体的合并物，富集具有对靶多肽最高的结合亲和力的抗体。出于几个原因，Y2H***对于此目的是理想的，所述原因包括（i）它的易用性；（ii）它的自动化能力（例如在96-孔微量滴定板中；参见例如[Buckholz，Slentz-Kesler]）；以及（iii）它对于例如本文所述的那些的基因构建体的适用性。
作为一种用于鉴定和/或表征细胞内发生的蛋白-蛋白相互作用的技术，Y2H是本领域熟知的。简而言之，Y2H涉及融合所关注的一个多肽与转录因子的激活结构域（“猎物”），和融合所关注的第二多肽与转录因子的DNA结合结构域（“诱饵”）。在一些情况下，激活结构域是B42激活结构域，和/或DNA结合结构域是GAL4 DNA结合结构域。两种融合蛋白随后可一起在酵母细胞中表达。例如，一种融合蛋白可在酵母交配型a中表达，并且另一种融合蛋白可在酵母交配型α中使用。两种单倍体酵母菌株可随后进行交配以产生表达两种融合蛋白的二倍体酵母。一般来讲，诱饵将结合控制可检测基因表达的DNA启动子或增强子元件，但是将不能单独激活可检测基因的表达。如果两个融合蛋白不结合，则DNA结合结构域和激活结构域将保持分离并且可检测基因的表达将不发生。然而，如果两个融合蛋白彼此结合，则激活结构域和DNA结合结构域彼此足够接近，使得激活结构域将能够引发可检测基因的表达。因此，在所关注的两个多肽间的结合可基于可检测基因的表达进行测定。
用于本发明的验证方法的可检测基因是本领域熟知的。示例性的可检测基因包括例如使细胞能够在特定培养基中生长的基因（例如URA3）、编码荧光蛋白（例如GFP、YFP、CFP、dsRed、mCherry、或本领域已知的任何其它荧光蛋白）或能够产生比色读数的酶（例如LacZ）的基因、或者编码本领域已知的任何其它多肽标记物或标签的基因。在一些情况下，可检测基因可为能够检测到其表达水平的任何基因。例如，基因的mRNA表达可使用例如定量实时PCR、RNA印迹分析（Northern analysis）、或RNA Seq技术进行测定。此类可检测基因的表达可根据本领域熟知的方法进行检测。
除细胞质蛋白之外，Y2H还已经用于表征膜结合蛋白的细胞质结构域（Brückner等人，Int J Mol Sci.10（6）:2763-88，2009）。为了快速说明通过大规模测序行为鉴定的多种基因的功能，已经开发出用于HT克隆、基因分型、和酵母双杂交分析的***[（HT-Y2H），（Buckholz等人，J Mol Microbiol Biotechnol.1（1）:135-40，1999；Chen等人，GenomeRes.10（4）:549-57，2000；Taylor等人Biotechniques 30（3）:661-6，2001；Uetz等人，Nature 403（6770）:623-7，2000；Uetz等人，Curr Opin Microbiol.3（3）:303-8，2000；Walhout等人，Yeast 17（2）:88-94，2000）。这些***使得基因组和蛋白质组的大规模平行分析成为可能。Y2H可用于例如鉴定在未表征蛋白和已知途径之间的关联，这可用于例如分析细胞中运行的分子网络。
预期来自早期噬菌体展示（ɸD）选择轮的低亲和力rAb能够根据本发明方法在酵母中进行验证，这出于多个原因是期望的。首先，如本领域所熟知的，Y2H是极其敏感的并且能够检测具有基本上大于300nM[Rid]的KD的伴侣之间的相互作用。其次，如本领域所熟知的，甚至具有彼此非常弱的亲和力的小量表达蛋白可足以引发阳性Y2H应答（Golemis等人，Curr Issues Mol Biol.1（1-2）:31-45，1999；Estojak等人，Mol Cell Biol.15（10）:5820-9，1995；Rid等人，Assay Drug Dev Technol.11（4）:269-75，2013；Rajagopala等人，Methods Mol Biol.781:1-29，2011）。第三，本文所述的rAb HT-流水线是强力的并且能够针对肽和蛋白片段分离亲和试剂。使用蛋白质数据库（Protein Data Bank）中的蛋白复合物（Berman等人，Nucleic Acids Res.，28:235–242，2000）和结构域-结构域相互作用（Stein等人，Nucleic Acids Res.39（数据库期号）:D718–D723，2011）可利用的三维共晶结构，已表明Y2H二元相互作用反映了直接的生物物理接触。Y2H敏感性也可与残基-残基接触的数目相关联，并且因此与相互作用亲和力相关联。
Y2H***也可用于发现亲和试剂。然而，酵母相对低效的转化效率可能限制酵母文库的大小（一般<108个抗体）。因此，在例如ɸD或核糖体展示富集筛选后，酵母更适于验证轮。也设想细菌双杂交和哺乳动物双杂交***用作抗体发现和/或已鉴定抗体的验证的备选方法。
免疫沉淀验证
作为在rAb产生后的附加质量控制检查，亲和力成熟的前导候选rAb分子可利用免疫沉淀（IP）进行进一步验证，例如使用在例如瞬时转染的哺乳动物细胞中表达的带FLAGTM-标签的全长蛋白。用于这一验证的免疫沉淀方法是本领域熟知的。
抗体库
本发明特征在于用于从抗体文库中鉴定能够结合所关注的靶多肽的特定抗体并从而验证鉴定的抗体的方法。此类抗体文库可根据本领域熟知的方法进行构建。用于本发明方法的一种示例性恒定框架抗体文库可例如涉及在六个互补决定区（CDR）内的18个不同位置处编码三联密码子诱变。在一些情况下，这可涉及在六个抗体CDR内的18个位置中的NNK密码子。用于本发明方法的示例性抗体包括scFv、IgG、Fab片段、和本领域已知的任何其它抗体或抗体片段。在一些情况下，抗体可包括基于B2A框架的scFv。在某些情况下，B2A框架包括核酸序列，其具有与以下序列至少80%的序列同一性（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性）：
DYKDDDDKLSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDSKRPSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSTDSSGNYRVFGGGTKLTVLGEGKSSGSGSESKASEVQLVQSGADVKKPGASLTISCQASGYTFTDYWISWVRQKPGKGLEWMGRIDPSDSYTNYGPSFQGHVTISADRSTATAYLQWRSLEASDTAMYYCVRSSMVTSGGTIPEYYQHWGPGTLVTVSS
（SEQ ID NO:1）
在一种情况下，B2A框架包括与SEQ ID NO:1相同的核酸序列。
在一些情况下，抗体文库包括特定抗体的变体。此类抗体变体文库可例如使用分子进化方法来产生，所述分子进化方法例如描述于PCT专利申请PCT/US2014/068595和PCT公开WO 2014/134166（它们全文以引用方式并入本文中）中的那些。鉴定为能够结合所关注的靶多肽的抗体（例如根据本发明的方法）可进一步优化以加强与靶多肽的结合，所述优化通过例如进行附加轮的分子进化，随后筛选并验证所得变体改善的与靶多肽的结合亲和力。可重复这一过程，例如直至鉴定并验证了具有与靶多肽期望的结合亲和力的抗体变体（参见例如图1）。
抗体文库的每个单个抗体可包含在例如载体中，诸如双功能载体，其能够在多个细胞类型中表达抗体。例如，抗体可存在于双功能载体中，该载体允许在细菌（例如大肠杆菌（E. coli））和真核细胞（例如酵母或哺乳动物细胞）中表达抗体。此外，双功能载体可允许抗体与特定多肽结构域融合，这取决于其中表达该抗体的细胞类型（或者甚至特定菌株）。例如，本文所述的pCH103载体允许在大肠杆菌（E. coli）中表达融合蛋白，其包括抗体和gp3，从而能够在噬菌体展示中利用抗体。在酵母中，pCH103载体允许表达包括抗体和B42激活结构域的融合蛋白，从而能够在酵母双杂交中利用抗体。此外，pCH103载体包括在抗体和gp3基因之间的琥珀终止密码子，使得融合蛋白仅在能够抑制琥珀终止密码子的大肠杆菌（E. coli）菌株（例如表达supE44的大肠杆菌菌株）中表达。用于本发明的载体还可包括例如另外的基因（例如选择性标记物）、启动子和增强子元件、以及与所关注抗体融合的其它多肽结构域如表位标签）。
抗原
本发明特征在于制备、筛选、并验证针对特定靶多肽或抗原的抗体。在抗体和靶抗原之间的结合发生在一个或多个表位处，其可通过例如在靶抗原的特定区域中的氨基酸残基的位置和极性进行限定。在一些情况下，可将此类表位保持在靶抗原的肽片段（例如半抗原）中，其与全长抗原上的类似表位具有足够的相似度，使得能够与肽片段中存在的表位结合的抗体也可与全长抗原上的类似表位结合。因此，预期本发明的抗体可针对半抗原或全长抗原进行筛选。同样地，可针对半抗原或全长抗原验证抗体。例如，可针对半抗原筛选抗体并针对全长抗原进行验证。
用于本发明方法的抗原可根据本领域熟知的方法进行制备。例如，通过用编码抗原的核酸转化细胞，并且诱导细胞将该核酸转录并翻译成抗原的氨基酸序列，可在细胞中表达抗原。备选地，可使用本领域熟知的肽合成方法合成抗原（尤其是半抗原，例如包含40个或更少的氨基酸的半抗原）。抗原可与结合部分缔合，允许多个抗原容易地从混合物中分离出来。例如，抗原可与生物素结合或融合，使得该抗原可利用链霉抗生物素蛋白或NeutAvidin分离，例如连接到表面（例如孔、管、条、或珠）上。
以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1.材料和方法
细菌菌株和载体
大肠杆菌（E. coli）菌株TG1[F'（traD36，proAB+ lacIq，lacZΔM15），supE，thi-1，Δ（lac-proAB），Δ（mcrB-hsdSM）5，（rK-mK-）]购自Lucigen（Middleton，WI）用于通过用编码Eco29kI RM操纵子的pAX1492质粒转化TG1来开发大肠杆菌（E. coli）菌株AXE688。大肠杆菌（E. coli）菌株CJ236（FΔ（HinDIII）::cat（Tra+，Pil+，CamR）/ ung-1，relA1，dut-1，thi- 1，spoT1，mcrA）购自New England BioLabs（NEB；Waverly，MA）。电感受态和化学感受态菌株将按照NEB方案进行制备。用于AXM诱变的模板质粒为噬粒pCH103的衍生物，并且相同的scFv模板与噬菌体M13的外壳蛋白gp3遗传融合。这一模板scFv的六个CDR中的每个将经修饰以包含opal（TGA）终止密码子和Eco29kI限制性内切核酸酶识别位点。在这一模板中，非重组克隆对于scFv展示是不具备功能的。opal终止密码子和Eco29kI限制性内切核酸酶位点将在完全重组rAb中缺失。
全液体ɸD
将使用的噬菌体文库包括大约1 x 1010个合成多样化的Ab，它们全部基于单个VH和Vk结构域。噬菌体展示scFv将通过培养来自每个文库的细菌等分试样，随后用辅助噬菌体KM13二重感染来制备（Kristensen等人，Nucleic Acids Res.15（14）:5507-16，1987）。多孔板将涂覆有NeutrAvidin（Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL）。在用PBS洗涤后，孔将用2%的脱脂奶粉PBS（MPBS）溶液封闭。为了在NeutrAvidin-涂敷的孔上捕集生物素化的肽，洗涤孔并与肽一起在室温下温育。来自文库的噬菌体（大约1 x 1013个转导单位）被加到孔中并在室温下温育。结合的噬菌体通过加入胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）进行洗脱。洗脱液将用于感染在液体中指数生长的大肠杆菌（E. coli）TG1，并且培养过夜。等分试样用于噬菌体拯救；向剩余物中加入甘油并在-80℃下储存悬浮液。对噬菌体进行滴定。如上进行第二和第三轮以选择高亲和力和特异性的克隆。我们使用多孔板并在几个孔中筛选半Ag。各孔保持独立。酶联免疫吸附测定（ELISA）用于鉴定结合噬菌体克隆，并且DNA测序用于鉴定独有的克隆。
使用酵母a-和α-交配型菌株的全液体Y2H并在ɸD中测试scFv
我们使用全液体Y2H测定，其由Weiner团队发明（Buckholz等人，同上）。我们掺入基因URA3（乳清酸核苷-5′ -磷酸脱羧酶）作为反向选择性标记物。内源性URA3基因被失活，并且引入报告基因盒，其中URA3的表达取决于诱饵/猎物相互作用的存在。如果表达URA3，则尿嘧啶生物合成途径具有功能，并且加入培养基的5-氟乳清酸（5-FOA）被代谢成必需胸苷酸合成酶的***底物。
免疫沉淀（IP）
免疫沉淀通过在瞬时转染后首先在选择的细胞系（例如CHO、293T、或HeLa）中建立带FLAG-标签的蛋白生产来进行。为了分离细胞质蛋白和核蛋白，取决于表达水平，将106-107个细胞重悬在RIPA缓冲液（25mM Tris-HCl（pH7.6），150mM NaCl，1% NP-40，1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS）中20分钟，并且将离心得到的澄清上清液转移到洁净管中。对于核定位蛋白，将107个细胞轻柔重悬在冰冷的低渗缓冲液中并在冰上温育。细胞被匀化，并且在离心后将核组分重悬在RIPA缓冲液中。对于IP，牛血清白蛋白（BSA）-封闭的抗-FLAG珠将与根据描述制备的细胞溶解物混合，并且在轻柔搅拌下温育。将期望的scFv加到浆液中、温育，随后进行洗涤。在最终洗涤后，将珠煮沸、离心，并且将澄清的溶解物加载到聚丙烯酰胺凝胶上进行随后的蛋白印迹分析（Western analysis）。我们当前瞬时转染的蛋白具有V5标签。溶解物通常与scFv ON混合，并且次日加入FLAG珠，持续2小时。FLAG珠捕集scFv（它带FLAG-标签）和与其结合的蛋白（如果有的话）。随后充分洗涤珠，并且使用抗-V5-HRP抗体，通过WB分析洗脱液以检测是否存在全长抗原。
在pCH103中构建scFv文库
我们以前已经使用我们的用于体内限制非重组DNA的新方法构建了几个重组scFv文库，它们具有>1010的多样性（参见例如Holland等人，J. Immunol.Methods，刊印中）。我们已经成功地使用这些文库对>100个不同的FL-蛋白、蛋白片段和短肽鉴定了scFv。我们的典型scFv文库使用恒定-框架，其带有限于CDR的氨基酸改变。scFv以外壳蛋白gp3的基因融合体形式展示在噬菌体M13表面上。我们使用我们的新文库构建方法来构建pCH103文库。
通过AlphaScreen进行的亲和力测定
恒定浓度的纯化scFv与恒定浓度的生物素化Ag和链霉抗生物素供体以及FLAG受体AlphaScreen珠（Perkin Elmer）一起温育。加入提高浓度的非生物素化的抗原，并且预测竞争物浓度（在该浓度下产生最大信号的一半（IC50））为KD。
蛋白表达和纯化
在补充有氨苄青霉素（100μg/ml）的低磷酸培养基中的大肠杆菌（E. coli）Mach1细胞（Life Technologies）中表达scFv。带有导流板的***最大20%的烧瓶体积用于确保透气良好。培养沉淀物将冻存在-80℃下。将细胞沉淀物重悬在补充有Benzonase（EMDChemicals，Gibbstown，NJ）、苯甲磺酰氟（PMSF）、和蛋白酶抑制剂混合物的BugBuster（EMDChemicals，Gibbstown，NJ）中。将重悬的沉淀物通过离心澄清，并且将scFv从澄清溶解物，在HisPurTM Cobalt树脂（Thermo Scientific，Rockford，IL）上纯化。在结合可溶性scFv蛋白后，洗涤柱并通过加入咪唑洗脱蛋白，并且通过SDS-PARTIAL-AGE进行分析。HiPrep 26/10脱盐柱（GE Healthcare，Piscataway，NJ）用于与PBS的缓冲液交换。
IgG抗体制备
利用Freestyle MAX试剂（Life Technologies），以30-ml的批次将自由型（Freestyle）CHO或293F细胞（Life Technologies）用IgG构建体瞬时转染。这种培养规模已经显示足以获得100μg的可溶性IgG抗体产量，这是足以进行初步表征的材料。rAb IgG使用蛋白A亲和树脂以高通量进行纯化。在单步骤纯化中，我们通常回收>80%的可溶性IgG，其具有>90%的纯度。在我们的纯化IgG中的内毒素水平预期为少于50内毒素单位（EU）/毫克，这基于标准鲎变形细胞溶解物（LAL）测试（Sharma，Biotechnol Appl Biochem.8（1）:5-22，1986；Tuomela等人，Gene Ther.12 Suppl 1:S131-8，2005；Vanhaecke等人，J Clin PharmTher.12（4）:223-35，1987）。我们进行时间进程以确定收获蛋白的最佳转染后时间。
实施例2.抗体框架和文库设计概述
我们已经鉴定了基于恒定框架scFv的Ab文库，其编码NNK密码子（参见例如Benhar，Expert Opin Biol Ther.7（5）:763-79，2007；Chan等人，Int Immunol.26（12）:649-657，2014；Miersch等人，Methods.57（4）:486-98，2012；Mondon等人，Front Biosci.13:1117-29，2008；Tohidkia等人，J Drug Target.20（3）:195-208，2012），编码位置在六个互补决定区（CDR）内的18个不同位置处（Mandrup等人，PLoS One.8（10）:e76834，2013）。在这些实验中鉴定并使用的文库的B2A框架基于它在噬菌体展示（ɸD）（当与M13 gp3蛋白融合时）和酵母双杂交（Y2H）（当与激活结构域融合时）中行使功能的能力进行选择。值得注意的是，虽然本发明产生rAb的平台当前用于单链可变片段（scFv），但是该平台可容易地应用于其它用途，例如Fab、IgG、和酵母展示文库。例如，scFv向全长IgG的高通量转化可整合到流水线中。
在噬菌体展示和酵母细胞质中工作的Ab框架的鉴定
为了鉴定用于我们的Y2H和ɸD文库的合适框架，我们从未经实验的cDNA文库中筛选了几百个scFv框架，并且鉴定了一个框架，标记为B2A，其在ɸD和酵母细胞质内工作异常良好。B2A框架可容易地在大肠杆菌（E. coli）中表达并从中纯化，并且因此选择其作为框架，由其构建我们初始的基于NNK的恒定框架ɸD文库。B2A框架的这些有用特性是值得注意的，因为大部分scFv不具有细胞内抗体的功能，这是由于在细胞质的还原环境中二硫键的不正确折叠。
为了进一步验证B2A框架，我们测试了大规模纯化并且能够证实纯化5-10mgscFv/升大肠杆菌（E. coli）培养物的能力，纯度>90%。这意味着0.3升的大肠杆菌（E. coli）培养物应足以产生足够的纯化材料用于rAb评估。对于下游加工，我们将B2A转化成IgG分子，并且显示所得IgG在CHO细胞中强表达并在随后从细胞中分离时具有功能。
使用AXE688菌株的文库设计、构建和多样性
对于抗体文库构建，我们已经利用了一种使用体内Eco29kI限制性内切核酸酶消化以消除非重组体的方法，如我们已描述于例如PCT专利申请PCT/US2014/068595和PCT公开WO2014/134166（它们每个全文以引用方式并入本文）。预测使用这种方法产生的文库的多样性>1010。实际上，这比使用称为“>1010”文库的标准噬菌体展示方法的文库的多样性好2-10x，因为传统的噬菌体展示方法产生<40%重组体的文库。相比之下，使用我们的方法构建的文库为>99%的重组体。发生这种高重组体百分比是因为：（i）电感受态细胞能够摄取超过一个质粒分子/个转化事件，（ii）我们使用10x饱和量的质粒DNA转化我们的细胞，并且（iii）我们的AXE688菌株对非重组体自选择，因为非重组体在一个或多个CDR中保留至少一个Eco29kI位点。当对我们的文库进行质量控制分析时，我们通常发现>99%的scFv测序样品编码全长scFv。
实施例3.pCH103克隆载体***能够消除对用于在ɸD、酵母双杂交、和大肠杆菌（E.coli）蛋白表达中测试的亚克隆蛋白的需要
可改变用于Y2H和ɸD的技术以开发选择性的且规模化的***，用于以极高通量和成本可取的方式获取、鉴定并亲和成熟抗体。已经构建了双功能载体***（pCH103），其具有在Y2H和基于大肠杆菌（E. coli）的ɸD方法中行使功能的能力（图2）。在大肠杆菌（E. coli）中，蛋白表达取决于大肠杆菌（E. coli）基因型。下文描述了pCH103载体***的主要特征及其有益效果。
pCH103载体设计
如图2A所示，将琥珀终止密码子***到所关注蛋白（在这种情况下为scFv）和gp3之间。因此，在非抑制大肠杆菌（E. coli）中，表达的蛋白将为scFv本身。在大肠杆菌（E. coli）的抑制菌株中，scFv将相反地与gp3蛋白融合。在酵母中，scFv将相反地与酵母激活结构域融合（或者备选地与DNA-结合结构域融合）。如图2B所示，pCH103载体***包括以下特征：
(i) GAL1启动子，用于表达克隆到pYESTrp2中的基因。表达在L40中是组成型的，并且在EGY48/pSH 18-34中是诱导型的。
(ii) V5表位，其允许利用抗-V5 Ab检测融合蛋白
(iii) SV40大T Ag核定位序列（NLS），其将融合体定位到核，用于与LexA融合体的潜在相互作用
(iv) B42激活结构域（AD），它是一种转录激活结构域，允许报告基因当通过两个相互作用蛋白靠近LexA DNA结合结构域（DBD）时进行表达
(v) CYC1转录终止信号，其允许有效终止并稳定mRNA
(vi) TRP1基因，其允许在Trp-酵母宿主（例如L40或EGY48/pSH 18-34）中的质粒的营养缺陷型选择
(vii) 用于在酵母中维持和高拷贝复制的2-微米起点
(viii) 用于通过M13K07辅助噬菌体的单链DNA拯救的f1起点
(ix)编码的大肠杆菌（E. coli）lac启动子（P E.coli ，用于M13 gp3融合构建体的受控表达）
(x) M13 gp3基因，用于M13的gp3蛋白的ɸD融合体
(xi) 蛋白融合位点（其中将蛋白克隆到pCH103载体的多克隆位点中的位点）
在大肠杆菌（E. coli）中的琥珀抑制测试
为了测试位于scFv和gp3基因之间的琥珀终止密码子（图3A），将博来霉素抗性（zeoR）基因克隆到pCH103的衍生物中，取代gp3基因。制备这种修饰载体的构建体，其在B42 AD和ZeoR基因之间不具有终止密码子。这种构建体与其中琥珀终止密码子位于两个基因之间的相似载体进行比较。包含supE44的大肠杆菌（E. coli）菌株显示抑制终止密码子，允许在包含博来霉素（zeocin）的平板上生长。不能抑制琥珀终止密码子的大肠杆菌（E. coli）菌株无法在包含博来霉素抗生素的平板上生长。
位于B42 AD 和ZeoR-基因之间的琥珀终止密码子在酵母中的琥珀抑制测试
在酵母中测试与上文相同的载体***，其中克隆zeoR取代gp3（图3B）。酵母细胞不能抑制琥珀终止密码子。因此，如预料的那样，如果存在位于AD基因3’的琥珀终止密码子，则酵母细胞不能在包含Zeo的平板上生长。与之相反，如果缺失琥珀终止密码子，酵母能够在包含博来霉素的平板上生长。
展示：位于Y2H B42 AD和scFv之间的对应于大肠杆菌（E. coli）启动子元件的功 能启动子接头肽序列；以及在酵母中工作的B2A框架
将抗人蛋白cMet的scFv***到pCH103载体中，并针对cMet-DBD融合体以及2个其它不相关的诱饵蛋白进行测试。三个大肠杆菌（E. coli）启动子（phoA、tac和tacO）与酵母AD基因的3’末端融合，使得大肠杆菌（E. coli）启动子加倍成为开放阅读框接头肽，其***到酵母AD的羧基末端和抗-cMet scFv的氨基末端之间。phoA、tac和tacO启动子各自分别测试相应的启动子接头肽不干扰抗-cMet scFv与FL-cMet诱饵的相互作用的能力（图3C）。tac和tacO启动子显示不干扰Y2H筛选。然而，发现phoA启动子肽干扰诱饵与猎物融合体之间的相互作用。
F1 ori 测试
M13K07辅助噬菌体用于感染包含pCH103-衍生物质粒（pJW302s）的大肠杆菌（E. coli）细胞，并且产生包装的ssDNA pCH103质粒DNA的转导溶解物。这些溶解物经无菌过滤，并随后用于将在包含博来霉素的琼脂平板上的大肠杆菌（E. coli）菌株转导成zeoR（图3D）。
实施例4.可成功利用肽和蛋白片段产生IP-级scFv
表达并纯化足量的全长蛋白常常是重组抗体产生中的一个障碍。就转录因子（TF）而言，在结构域（即，DNA结合结构域）和相同蛋白家族成员之间的高同源性也可能损害抗体特异性。为了通过ɸD***地分离抗-TF抗体，我们利用TF片段（30-100个氨基酸）。设计片段使其具有最大的免疫原性和与人蛋白质组中的其它序列的最少重叠。我们已经示出，针对纯化TF片段分离的scFv能够在蛋白质印迹（WB）、IP和从***固定的染色质级分的IP中鉴定全长蛋白（图4）。后一种特性使我们的scFv可能用作ChIP研究的工具。
从图4A中可见，将用带麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的纯化ZNF384片段（氨基酸1-100）和用全长ZNF384（DNASU）的表达构建体瞬时转染的HEK293细胞的溶解物在丙烯酰胺凝胶上分离、转移到硝酸纤维素膜上并用抗ZNF384片段产生的scFv探测，随后用抗-FLAG-HRP二Ab探测以检测scFv（带FLAG标签的）。溶解用全长ZNF622和ZNF384瞬时转染的HEK293细胞以制备溶解物（L）和染色质（C）级分（图4B）。溶解物和染色质级分与固定在FLAG珠上的scFv（抗ZNF384的氨基酸1-100和ZNF622的氨基酸37-139产生）一起温育。洗涤珠并且用包含2%SDS的缓冲液洗脱复合物，并且通过蛋白质印迹（Western Blot）用抗-V5-HRP Ab分析，从而检测在洗脱液中是否存在全长TF（带有V5标签）。图4C示出如上所述对于图4B进行的实验，不同的是按照染色质免疫沉淀（ChIP）方案，使用***交联的细胞。
实施例5.试剂组合
在此我们描述试剂组合，包括构建双功能文库；从SGC和相互作用组数据组（Interactome Data Set）中选择靶；建模***；在Y2H中克隆诱饵（对应于肽和全长蛋白），并且如果认为需要，克隆M2H载体；以及构建能够在酵母中有功能的阳性选择***并掺入酵母载体中。
假设和验证
我们可利用例如我们已知产生亲和试剂的肽开发模型***，所述亲和试剂具有抗全长（FL）抗原（Ag）的功能。我们可将这种成功归纳为多达100-200个半Ag的实验组，所述半Ag选自一组25-50个新全长抗原（FL-Ag），它们来自包括转录因子（TF）、激酶、和磷酸酶的组。我们可将酵母阳性选择性标记物掺入我们的pCH103-***中以减少或消除不结合FL-Ag的scFv克隆相互作用子(interactor)。
实验设计和预期结果
（a）在pCH103中构建scFv文库。例如，如果需要新文库，可使用三联密码子构建方法，利用对CDR内特定位点的三联密码子诱变在pCH103中构建>1010的多样性的文库（Mandrup等人，同上）。
（b）全长抗原（FL-Ag）蛋白。将使用两个数据组作为初始组靶FL-抗原的指导：
（b1）结构基因组协会（Structural Genome Consortium ，SGC）数据组。SGC已经生成了多种激酶和磷酸酶的细菌表达构建体，并且已经对它们中的一大批进行了构建体优化。从预选的蛋白质组中将产生合适Ag和半Ag的列表。
（b2）相互作用组数据组（Interactome Data Set）。来自我们的合作者之一（M. Vidal）（包括Space II并报告于2014年[Rolland]）的对应相互作用组数据组是已见报告的最大的实验测定的二元相互作用图谱，在4303个不同蛋白之间的13944例相互作用。我们可使用验证过的Y2H蛋白的这一数据组作为抗原选择的起始点。全长克隆将购自DNASU（ArizonaState University）。
（c）肽靶设计。选择肽和蛋白片段抗原的标准可包括例如：（i）表面暴露的亲水性转角，（ii）结构信息（如果知道的话），（iii）人蛋白质组的独特性，（iv）缺少半胱氨酸残基，（v）缺少已知的或预测的翻译后修饰，（vi）移除了信号肽，（vii）已知的或预测的拼接和多态性变化，以及（viii）氨基-和羧基-末端。
（d）克隆到酵母中。同源重组是用于在酵母中亚克隆的广为接受的方法，并且可用于我们的实验。
（e）在酵母中的阳性选择。假阳性已经成为常规Y2H的一个常见问题。一类假阳性由诱饵或猎物的与它们的相互作用无关的对报告基因转录的诱导引起。例如，猎物可能具有固有的DNA结合活性并且因此使其融合的转录激活结构域结合报告基因的启动子。这种类型的假阳性在我们的***中是相当少见的，这是由于测试的猎物蛋白少于0.01%。这可能是由于例如我们使用三个报告基因（两个选择性原养型标记物加上β-Gal报告基因）。可使用两个选择性标记物并加入25mM氨基***控制提高的相互作用严格性。我们也可使用URA3基因（乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶）作为反向选择性标记物。可失活内源性URA3基因，并且引入报告基因盒，其中URA3的表达取决于诱饵/猎物相互作用的存在。如果表达URA3，尿嘧啶生物合成途径将具有功能。如果将5-氟乳清酸（5-FOA）加到培养基中，则5-FOA代谢成必需胸苷酸合成酶的***底物。URA3/5-FOA***是本领域熟知的，并且已经成功地用于酵母相互作用陷阱***以针对诱饵/猎物相互作用进行体内反向选择（Vidal等人，PNAS 93（19）:10315-20，1996）。这种反向选择的严格性可通过改变URA3基因的表达来测量；较高的URA3表达水平提高细胞对5-FOA的敏感性。
备选选项
在ɸD和/或Y2H中的混杂相互作用子在下文实施例6中处理。初始将不选择表现出自动激活或者显示不易位至核的诱饵，利用提议的Y2H验证方法进行进一步分析。初始将不选择通过缺少结合V5表位的抗-V5 Ab证明在酵母中不表达的诱饵进行进一步分析。在一些情况下，例如TF，可期望融合FL-Ag与AD而不是DBD。在此类情况下，我们能够构建pCH103-类似的载体，其中文库与DBD融合，而不是AD。或者备选地，我们可使用AXM克隆将产生的第一轮命中物（hit）转移到备选的载体***中。（5）与B42 AD的羧基-末端的融合可影响氨基-来源的融合。如果这种情况发生，我们可在反转与AD的融合顺序的载体***中单独测试这些rAb。
实施例6.在酵母中进行体内测定以针对FL-Ag验证抗-半-Ag
在这一部分中，我们描述在酵母中进行体内测定以针对全长抗原验证抗-半抗原。简而言之，测定涉及：筛选轮1（或2）富集第2（或3）轮Y2H筛选中的抗FL蛋白Ag的ɸD库。任选地，可在哺乳动物双杂交（M2H）***中进行确认（Slentz-Kesler等人，Genomics 69（1）:63-71，2000）。
假设和验证
Y2H可用作在多轮ɸD之间的反向筛选以富集能够结合FL-蛋白的亲和试剂。
实验设计和预期结果
在发现轮期间，将使用几种策略在ɸD和Y2H之间交替。在一个实施例中，方案结合了“乒乓”筛选，其涉及在初始轮的ɸD之间的交替，随后在一轮或多轮ɸD中使用针对半Ag的亲和选择（参见例如图1）：
（a）来自（a）轮1和/或轮2的ɸD富集的命中物将批量转化到酵母交配型a菌株中。
（b）对应于FL-蛋白和半Ag的FL-基因和半Ag基因片段（在具体目标（SpecificAim）1中列出）将被克隆到合适的诱饵载体中并转化到酵母交配型α中。
（c）来自步骤（b）的富集命中物将与来自步骤（c）的酵母α菌株中的诱饵交配。交配的酵母将铺板于合适的琼脂平板上进行选择。
（d）单个酵母克隆将在ELISA中针对以下进行测试：（i）FL-Ag蛋白（如果可用的话），（ii）初始半Ag，（iii）一种或多种无关FL-Ag蛋白，和/或（iv）一种或多种无关半Ag。
（e）任选地，我们可进行批量酵母筛选并且随后回收在Y2H中合并的针对FL-抗原的克隆，随后通过针对半Ag的ɸD轮再次筛选克隆。
备选选项
在ɸD中的混杂的相互作用子将通过在亲和选择步骤期间，在溶液中与不相关肽的竞争而被去除。在Y2H筛选期间的混杂的相互作用子可通过在酵母筛选期间保持多个孔分离、用FOA反向选择、并且在对包含酵母的孔进行的Y2H筛选中测试相同孔中的scFv合并物而被去除，所述酵母表达与以下融合的杂合体：（i）初始半Ag，（ii）FL-Ag蛋白，（iii）不相关的FL-Ag蛋白，和（iv）不相关的半Ag。来自在（iii）或（iv）中显示生长的孔的scFv可从进一步分析中排除。（2）提议的方法可能对膜结合蛋白和分泌蛋白无法同样地有效。我们已经开发了一种用于此类抗原的单独的筛选方法，该方法涉及基于乳液的筛选，如例如PCT专利申请PCT/US2013/076580（其全文以引用方式并入本文）所述。（3）可能需要合并和/或单克隆分析以分析来自非相互作用子和混杂相互作用子的命中物（也参见实施例7）。
实施例7.用于验证亲和试剂的体外测定
在此，我们进行几个体外测定以验证使用上述方法制备的亲和试剂，包括：免疫沉淀（IP）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹分析（Western analysis）、流式细胞术（FC）、质谱（MS）和命中物表征。
假设和验证
亲和试剂将在几种应用中进行测试，包括例如针对表达带FLAG-标签的FL-Ag的细胞系的细胞溶解物进行的ELISA和蛋白质印迹分析（Western analysis）。
实验设计和预期结果
（a）选择轮的优化。我们可将合并的噬菌体方法改成在Y2H选择前，利用B2A-框架主要发现文库的附加严格选择轮。
（b）亲和力测量。为了测量scFv和IgG的亲和力，我们可使用竞争性AlphaScreen测定快速评估从我们的文库中选择的命中物，该测定是我们基于来自PerkinElmer的珠开发出来的。我们的流水线通常产生具有在单数位纳摩尔范围内的亲和力的rAb，其对于大多数分子生物学和临床应用是足够的。如果需要的话，附加轮的亲和力成熟可用于进一步提高亲和力。
（c）免疫沉淀和质谱。IP已经在材料和方法中描述（参见例如实施例1）。在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后，大小对应于预期的FL-Ag蛋白的蛋白将从用考马斯蓝（CoomassieBlue）染色的聚丙烯酰胺凝胶中切出并进行MS分析。
备选选项
某些人蛋白可能表达不良或者不表达为它们的正确确认形式，这可能是由于在特定细胞系中存在或不存在翻译后修饰。这些抗原将优选地不用于细胞溶解物的IP。
实施例8.建立用于IgG重构的规模化方法
在此我们描述建立用于IgG重构的规模化方法。可使用的示例性验证测定包括：IP、Western、ELISA、FACS、和基于细胞的测定。
假设和验证
（a）虽然scFv或Fab***有利于重组Ab的选择过程，但是用于改变已经可用的亲和试剂基础结构的最终期望形式一般来讲是完整的免疫球蛋白（例如IgG）。来自细菌蛋白制造的脂多糖（LPS）污染能够干扰体外细胞测定和体内功能筛选。因此，本发明特征在于scFv抗体（例如根据本发明方法产生并选择期望结合特性的scFv）直接重构成IgG，其能够例如在哺乳动物细胞中表达。
（b）我们也正在开发特异性抗体应用，例如免疫荧光（IF）、ChIP、荧光激活细胞分选（FACS）、和免疫组织化学（IHC），它们可按需应用于一些靶。
实验设计和预期结果
（a）scFv重构成IgG。使用我们的AXM克隆方法的修改版本，在用于Ab生产的亲和力成熟后来自IP-阳性克隆的重链和轻链可变基因将被扩增并克隆到单个双重表达载体中，该载体包含小鼠IgG2a或人IgG1的恒定区（图5）。在加入T7聚合酶和T4连接酶以延伸引物并连接产物后，所得异源双链将被转化到大肠杆菌（E. coli）菌株AXE688中，其表达限制包含Eco29kI位点的DNA的Eco29kI内切核酸酶。这种方法将允许在单个步骤中同时克隆重链和轻链可变基因。因为模板scFv将在重链和轻链CDR中包含6个Eco29kI位点，所以仅已经去除了所有这6个限制性位点的重组克隆将在AXE688菌株中增殖。我们已经证明这种方法产生>95%的重组克隆（参见例如PCT专利申请PCT/US2014/068595，同上）。质粒DNA将从重构克隆中分离。
（b）抗体制备。抗体亚克隆和IgG的制备已经在材料和方法部分进行了描述（参见实施例1）。所得IgG将使用例如蛋白A亲和树脂以高通量进行纯化。
AXM克隆
我们已经使用AXM克隆方法生成几百个用于亲和力成熟的文库。相同的原理应用于这一提议，用于将scFv rAb转化成全长IgG。我们下述的载体和细胞系已经成功地在我们的实验室中使用，用于制备功能性IgG。如图5所示，存在于pCH103载体***中的scFv将在pAXM-IgG载体中重构成IgG基因。简而言之，来自富集scFv的可变重链和轻链基因将使用在5’末端包含硫代磷酸酯键的反向引物进行扩增。所得双链DNA将用T7核酸外切酶处理以选择性降解dsDNA分子的未经修饰的链。所得单链DNA或“大引物（megaprimer）”将随后退火成环状的单链DNA，其包含CMV启动子、IL2信号序列、内部核糖体进入位点（IRES）、和带有在CDR区域中的Eco29kI限制性位点的轻链与重链可变及恒定结构域。退火的大引物将用于引导通过DNA聚合酶的体外DNA合成。连接的异源双链产物随后转化到大肠杆菌（E. coli）AXE688细胞中，其表达Eco29kI限制性酶，并且因此有利于新合成的重组链的存在，该链掺入大引物。
实施例9.使用酵母双杂交验证抗肽产生的scFv结合全长蛋白的能力
本发明的方法可用于测定是否抗肽产生的抗体可对全长蛋白进行测试，优选地不需要实际上纯化全长（FL）蛋白。鉴定并验证抗FL蛋白的抗体常常受到正确折叠的纯免疫原可用性的妨碍。肽（例如FL靶蛋白的肽片段，诸如本文所述的靶多肽和/或抗原）常常是用于产生抗体（例如scFv）的容易获得的备选靶。在这个实施例中，描述了使用酵母双杂交（Y2H）技术快速验证抗肽产生的scFv。具体地，评估此类scFv结合在酵母细胞质中表达并产生的FL靶蛋白的能力。我们发现scFv可在酵母中进行细胞内表达，并且显示与它们的靶相互作用。
双杂交测定概述
可用于本发明的双杂交测定是本领域已知的。在一个实施例中，使用转录因子测定是否两个蛋白（本文称为诱饵蛋白和猎物蛋白）相互作用。转录因子基因可包括两个结构域，例如结合结构域和激活结构域（例如分别为LexA DNA结合结构域和B42激活结构域）。在一些情况下，激活结构域是报告基因转录必需的。报告基因可为例如营养缺陷型基因、比色基因、或抗性基因。在这一方法中，制备两种融合蛋白：LexA-诱饵蛋白和B42-猎物蛋白。任何单独一种融合蛋白不足以引发报告基因的转录。然而，当产生两种融合蛋白并且第一融合蛋白的诱饵部分与第二融合蛋白的猎物部分相互作用时，可发生报告基因的转录。
噬菌体展示概述
噬菌体展示是本领域熟知的实验室技术，用于研究例如蛋白-蛋白、蛋白-肽、和蛋白-DNA的相互作用。一种示例性的噬菌体展示测定使用噬菌体以关联蛋白与编码它们的遗传学信息。在这个实施例中，将编码所关注蛋白的基因***噬菌体外壳蛋白基因中，引起噬菌体在它的外侧展示蛋白，同时在它的内侧包含包含该蛋白的基因，从而关联基因型和表型。这些展示噬菌体可随后对靶分子（例如蛋白、肽、核酸、和所关注的任何其它分子）进行筛选以检测在展示蛋白和一个或多个靶分子之间的相互作用。以此方法，可筛选并扩增蛋白质大文库。可用于噬菌体展示的示例性噬菌体无限制地包括M13和fd丝状噬菌体。
使用Matchmaker Gold酵母双杂交***（例如Clontech #630489）
在第一系列实验中，针对来自一对靶蛋白（即，人Myb和人EZH2）的肽片段产生scFv。随后将编码scFv的基因克隆到编码DNA结合结构域（BD）的载体中，从而形成编码scFv-BD融合蛋白的载体。将编码靶蛋白的部分的基因克隆到编码激活结构域（AD）的载体中，从而形成编码靶蛋白-AD融合蛋白的载体。这些载体随后单独转化到酵母菌株中。表达scFv-BD融合蛋白的单倍体MATa酵母随后与表达靶蛋白-AD融合蛋白的单倍体MATα酵母交配以形成表达两种类型融合蛋白的二倍体酵母细胞。如果在此类细胞中scFv结合靶蛋白，则BD和AD将适当接近以允许转录因子活性和下游报告基因表达。
I. DNA构建
将编码以下scFv的多核苷酸克隆到pGBKT7 BD克隆载体的NdeI/SalI位点中，如表1所示：
表1：在pGBKT7载体中融合scFv与Gal 4 DNA结合结构域
scFv目录# 针对以下产生 全长靶转录因子 UniProt ID
AXM1387 Myb，aa 1-20，生物素化肽 人Myb P10242
AXM1388 Myb，aa 1-20，pSer11，生物素化肽 人Myb P10242
AXM1389 Myb，aa 455-544，SUMO融合体，生物素化的 人Myb P10242
AXM2274 EZH2，aa 342-441，MBP融合体，生物素化的 人EZH2 Q15910
将编码以下蛋白片段的多核苷酸克隆到pGADT7 AD克隆载体的NdeI/XhoI位点中：
1. Myb，aa 1-20（pGADT7Myb20）
2. Myb，aa 455-544（pGADT7Myb100）
3. EZH2，aa 342-441（pGADT7EZH2100）
确认所有构建体的序列，并且制备中量制备级DNA用于酵母转化。
II.酵母转化
Y2H Gold菌株（MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80Δ， LYS2 ::GAL1UAS–Gal1TATA–His3，GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3 ::MEL1UAS–Mel1TATA AUR1-C MEL1）酵母由Clontech***提供，用以下物质之一转化：（i）上述基于pGBKT7的构建体之一，（ii）空pGBKT7载体，或者（iii）对照载体pGBKT7-p53和pGBK-T7-Lam之一。转化体在SD/-Trp最低限度琼脂平板上生长。
Y187菌株（MATα，ura3-52，his3-200，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4Δ， gal80Δ，met-，URA3 ::GAL1UAS–Gal1TATA–LacZ，MEL1）酵母由Clontech***提供，用以下物质之一转化：（i）上述基于pGADT7的构建体之一，（ii）空pGADT7载体，或（iii）对照载体pGADT7-T（对照，预期显示与p53的相互作用，但是与Lam无相互作用）。转化体在SD/-Leu最低限度琼脂平板上生长。
III.酵母交配
来自每组pGBKT7和pGADT7转化体的一个菌落在0.5ml YPDA培养基中混合，并在30℃、200rpm振荡条件下温育过夜。0.1ml的过夜交配培养物的1:10稀释液在平板上铺展，该平板使用以下最低限度琼脂培养基之一制备：
● DDO – 双省却成分（SD/-Leu/-Trp）。预期所有二倍体将在交配后在这一培养基上生长
● TDO – 三省却成分（SD/-Leu/-Trp/-His）。预期如果两种蛋白相互作用，将发生生长。较低严格条件。将检测到弱结合
● QDO – 四省却成分（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）。预期如果两种蛋白相互作用，将发生生长。较高严格条件。将检测到强结合。
● DDO/X/A – 双省却成分（SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/短梗霉素（Aurerobasidin）A）。双省却成分培养基补充有检测α-Gal活性（响应GAL4激活来自MEL1基因的分泌的报告基因）的X-α-Gal和短梗霉素A（酵母抗生素，它对酵母有毒性，除非它们表达突变型AUR1基因）。最严格条件。如果两种蛋白相互作用，菌落应生长呈蓝色。
结果如下表2和图6所述。
表2：交配反应
反应 # MATa（Y2H Gold） MATα（Y187） 交配生效 预期相互作用 观察到相互作用 弱或强
1 pGBKT7-p53 pGADT7-T Y Y Y 强
2 pGBKT7-Lam pGADT7-T Y N N
3 pGBKT7空 pGADT7空 Y N N
4 pGBKT7空 pGADT7Myb20 Y N N
5 pGBKT7空 pGADT7Myb100 Y N N
6 pGBKT7空 pGADT7EZH2100 Y N N
7 pGBKT7-AXM1387 pGADT7空 Y N N
8 pGBKT7-AXM1387 pGADT7Myb20 Y Y Y 弱
9 pGBKT7-AXM1387 pGADT7Myb100 Y N N
10 pGBKT7-AXM1388 pGADT7空 Y N N
11 pGBKT7-AXM1388 pGADT7Myb20 Y N N
12 pGBKT7-AXM1388 pGADT7Myb100 Y N N
13 pGBKT7-AXM1389 pGADT7空 Y N N
14 pGBKT7-AXM1389 pGADT7Myb20 Y N N
15 pGBKT7-AXM1389 pGADT7Myb100 Y Y Y 强
16 pGBKT7-AXM2274 pGADT7空 Y N N
17 pGBKT7-AXM2274 pGADT7EZH2100 Y Y Y 弱
利用备选的酵母双杂交***
在第二系列实验中，针对来自一对靶蛋白（即，GRAP2、XIAP、和LNMA）的肽片段产生scFv。随后将编码scFv的基因克隆到编码激活结构域（AD）的载体中，从而形成编码scFv-AD融合蛋白的载体。将编码靶蛋白部分的基因克隆到编码DNA结合结构域（BD）的载体中，从而形成编码靶蛋白-BD融合蛋白的载体。这些载体随后单独转化到酵母菌株中。表达scFv-AD融合蛋白的单倍体MATa酵母随后与表达靶蛋白-BD融合蛋白的单倍体MATα酵母交配以形成表达两种类型融合蛋白的二倍体酵母细胞。如果在此类细胞中scFv结合靶蛋白，则BD和AD将适当接近以允许转录因子活性和下游报告基因表达。
I. 靶选择
选择来自Vidal实验室保藏中心的三种蛋白作为测试例：GRAP2、XIAP、和LNMA。这些蛋白已经显示在多种实验条件下与它们的结合伴侣（分别是LCP2、CASP9、和LMNB1）相互作用。如下表3所示，针对每种蛋白设计并定制三种肽，并且随后使用我们的噬菌体展示scFv文库进行筛选以鉴定结合物。
表3：用于三种蛋白靶的肽设计
肽名称 序列 氨基酸 SEQ ID NO:
LMNA_1 生物素-GELHDLRGQVAKLEAALGEA 160-179 2
LMNA_2 生物素-RIDSLSAQLSQLQKQLAAKE 298-317 3
LMNA_3 生物素-DEYQELLDIKLALDMEIHAYRK 357-378 4
XIAP_1 生物素-SGSPVSASTLARAGFLYTGE 38-57 5
XIAP_2 生物素-THADYLLRTGQVVDISDTIY 135-154 6
XIAP_3 生物素-AEAVDKCPMCYTVITFKQK 475-493 7
GRAP2_1 生物素-GFFIIRASQSSPGDFSISVR 78-97 8
GRAP2_2 生物素-SLNKLVDYYRTNSISRQKQI 124-143 9
GRAP2_3 生物素-TDPVQLQAAGRVRWARALYD 262-281 10
II. scFv选择
使用AxioMx标准噬菌体展示方法筛选如表3所示的肽以鉴定肽特异性的scFv。基于滴定ELISA数据，选择四种独有的抗GRAP2肽（GRAP2_2和GRAP2_3）产生的scFv以继续进行Y2H测试。
III.DNA构建
利用BP Clonase试剂盒（Life Technologies，11789-013）将抗-GRAP2 scFv 1-4克隆到pENTR23载体中，并且利用M13正向和反向引物确认序列。使用LR Clonase试剂盒（LifeTechnologies，11791-019）使scFv与在pDEST-AD载体中的AD结构域融合。
IV.酵母转化
Y8800菌株（MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80Δ，LYS2 ::GAL1–His3，GAL2–Ade2，Met2::Gal7-LacZ，cyh2 R ）酵母用以下之一转化：（i）编码与在pDEST-AD载体中的AD结构域融合的四种scFv之一的载体，（ii）pDEST-AD-LCP2（与GRAP2的阳性对照相互作用），或（iii）pDEST-AD CASP9（与GRAP2的阴性对照相互作用）。转化体在SD/-Trp最低限度琼脂平板上生长。
Y8039菌株（MATα，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80Δ， LYS2 ::GAL1–His3，GAL2–Ade2，Met2::Gal7-LacZ，cyh2 R ）酵母用pDEST-DB-GRAP2转化。转化体在SD/-Leu最低限度琼脂平板上生长。以下对照也使用：pGBKT7-P53/pGADT7-T和pGBKT7-AXM1389/pGADT7-Myb100。
V. 酵母交配
如上所述进行酵母交配。交配反应在SD/-Trp/-Leu平板上以及SD/-Trp/-Leu/-His+1mM 3AT平板上展开以检测相互作用子。针对GRAP2肽AXM1389选择的四种scFv之一显示与全长GRAP2的相互作用（图7）。
其它实施方案
在上文说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在本文中通过参考被引入，其引入程度如同指明每个单独的出版物、专利或专利申请通过参考全文被具体且单独地引入。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的方法、药物组合物和试剂盒的各种变型和修改将对本领域的技术人员显而易见。虽然已结合具体实施例描述了本发明，但应理解它能够进一步修改并且受权利要求书保护的本发明不应不当地受限于此类具体实施例。实际上，对本领域技术人员显而易见的用于执行本发明的所述方式的各种变型旨在落入本发明的范围内。本专利申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，一般来讲，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的原理并包括落入本发明所属的技术领域中的已知惯例实践范围内、并可应用于上文阐述过的必要特征的此类与本公开的偏离。

Claims (54)

1.一种鉴定并验证结合部分能够结合靶多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供多种病毒，每种病毒包括：
编码结合部分的核酸，其中所述结合部分展示在所述病毒表面；
(b)与所述靶多肽或其肽片段一起温育所述多种所述病毒；
(c)检查所述病毒展示的所述结合部分是否结合所述靶多肽或其所述肽片段；
(d)对于每个鉴定为能够结合所述靶多肽的所述结合部分，在细胞中表达：
（i）第一融合蛋白，其包括鉴定为能够结合所述靶多肽的特定结合部分和第一报告部分，以及
（ii）第二融合蛋白，其包括所述靶多肽或其肽片段，以及第二报告部分，
其中所述特定结合部分与所述靶多肽或其所述肽片段的结合导致所述细胞中可检测基因的表达，其中所述可检测基因的表达处于所述第一报告部分和所述第二报告部分的控制之下；并且
（e）测定是否每个所述细胞表达所述可检测基因，从而验证鉴定为能够结合所述靶多肽的所述结合部分能够与所述靶多肽结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述检查步骤和所述测序步骤中将多个结合部分鉴定为能够结合所述靶多肽，所述方法还包括根据步骤（d）在不同细胞中表达每个所述鉴定的结合部分，以及根据步骤（e）测定是否每个所述不同细胞表达所述可检测基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括产生至少一个所述验证过的结合部分的多个变体，并且使用所述多个变体作为步骤（a）的所述结合部分重复步骤（a）-（e）。
4.一种验证在结合部分和靶多肽之间的结合相互作用的方法，所述方法包括：
在细胞中表达：
(a)第一融合蛋白，其包括结合部分和第一报告部分，以及
(b)第二融合蛋白，其包括靶多肽或其肽片段，以及第二报告部分；
通过以下步骤已经将所述结合部分鉴定为能够结合所述靶多肽：
（i）在病毒上表达编码所述结合部分的核酸，其中所述结合部分展示在所述病毒表面，
（ii）与所述靶多肽或其所述肽片段一起温育所述病毒，并且
（iii）检查所述病毒展示的所述结合部分是否结合所述靶多肽或其所述肽片段；
其中所述细胞中所述结合部分与所述靶多肽或其所述肽片段的结合导致所述细胞表达可检测基因，其中所述可检测基因的表达处于所述第一报告部分和所述第二报告部分的控制之下；并且
测定是否所述细胞表达所述可检测基因，从而验证所述结合部分能够结合所述靶多肽。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括用一个或多个另外的结合部分重复所述表达步骤和所述测定步骤，已经根据步骤（i）-（iii）将所述一个或多个另外的结合部分鉴定为能够结合所述靶多肽。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述结合部分是抗体或抗体片段。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述结合部分是单链可变片段（scFv）。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述scFv包括抗体框架，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90% 的序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述温育步骤包括与所述靶多肽的肽片段一起温育所述病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶多肽的所述肽片段的长度少于约40个氨基酸。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶多肽的所述肽片段的长度多于约40个氨基酸。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶多肽的所述肽片段的长度为约30-100个氨基酸。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述肽片段是合成的。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第二融合蛋白包括所述靶多肽的全长氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述靶多肽经翻译后修饰。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶多肽是磷酸化的。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述靶多肽是可溶性蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶多肽是细胞内蛋白。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一报告部分是转录因子激活结构域，并且所述第二报告部分是DNA结合结构域。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一报告部分是DNA结合结构域，并且所述第二报告部分是转录因子激活结构域。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、或植物细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述病毒是噬菌体M13。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述检查步骤包括进行酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫沉淀、蛋白质印迹、流式细胞术、或质谱。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中每种所述病毒起源于包括编码特定结合部分的基因的双功能载体，其中：
如果所述双功能载体存在于第一细胞中，所述双功能载体用作模板，用于所述第一细胞表达包括所述特定结合部分和病毒蛋白的第一融合蛋白；并且
如果所述双功能载体存在于第二细胞中，所述双功能载体用作模板，用于所述第二细胞表达包括所述特定结合部分和报告部分的第二融合蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一细胞是细菌细胞。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述第二细胞是酵母细胞并且所述报告部分是转录因子激活结构域或DNA结合结构域。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述转录因子激活结构域是B42结构域。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述双功能载体包括抑制性终止密码子，其位于所述病毒蛋白和所述结合部分之间。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抑制性终止密码子是琥珀终止密码子。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述病毒蛋白是gp3蛋白。
32.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述双功能载体是pCH103载体。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述表达步骤和所述测定步骤在液体培养基中进行。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述细胞在所述表达步骤之前缺少选择性标记物，并且所述表达步骤还包括在所述细胞中表达所述选择性标记物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述选择性标记物是URA3。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中在所述多种病毒中编码所述结合部分的所述核酸通过以下步骤产生：
(i)提供包括结合部分序列的模板DNA分子，
(ii)提供一对寡核苷酸，其中所述寡核苷酸杂交到所述结合部分序列的相反链上，其中所述寡核苷酸之一受到保护，另一寡核苷酸不受保护，并且所述寡核苷酸侧接于所述结合部分序列；
(iii)使用所述寡核苷酸对所述模板DNA分子进行扩增反应，从而产生所述结合部分序列的dsDNA变体群；
(iv)与能够相较所述dsDNA变体的受保护链选择性降解未受保护的链的酶一起温育所述dsDNA变体群，从而制备所述结合部分序列的ssDNA变体群；
(v)杂交所述ssDNA变体群与ssDNA中间体，其中所述ssDNA中间体包括基本上与所述结合部分序列或其片段相同的序列，产生异源双链DNA；并且
(vi)将所述异源双链DNA转化到宿主细胞中，从而产生所述结合部分序列的多个变体。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述模板DNA分子还包括病毒核酸序列。
38.根据权利要求36或37所述的方法，还包括将所述结合部分序列的所述变体克隆到病毒载体中。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述结合部分序列的未重组拷贝包括预先确定的限制性位点，并且所述结合部分序列的重组拷贝不包括所述预先确定的限制性位点。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述宿主细胞表达识别并裂解所述预先确定的限制性位点的限制性酶。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述转化步骤还包括在其中所述限制性酶能够裂解具有所述预先确定的限制性位点的核酸的条件下温育所述宿主细胞。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述限制性酶是Eco29kI。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述宿主细胞是AXE688大肠杆菌（E. coli）。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述模板DNA分子是病毒载体。
46.根据权利要求36-45中任一项所述的方法，其中所述模板DNA分子是双功能载体，其中：
如果所述双功能载体存在于第一细胞中，所述双功能载体用作模板，用于所述第一细胞表达包括所述结合部分序列和病毒蛋白的第一融合蛋白；并且
如果所述双功能载体存在于第二细胞中，所述双功能载体用作模板，用于所述第二细胞表达包括所述结合部分序列和报告部分的第二融合蛋白。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述双功能载体是pCH103载体。
48.根据权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述能够相较所述dsDNA变体的受保护链选择性降解未受保护的链的酶是T7核酸外切酶。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，还包括在所述测定步骤后，从瞬时转染细胞中免疫沉淀所述靶多肽。
50.根据权利要求49所述的方法，其中使待免疫沉淀的所述靶多肽带有表位标签。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述表位标签是FLAG、HA、Myc、His、V5、GFP、YFP、GST、或MBP。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述瞬时转染细胞是哺乳动物细胞。
53.一种抗体框架，所述抗体框架包括与SEQ ID NO:1具有至少90% 的序列同一性的氨基酸序列。
54.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求53所述的抗体框架。
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