CN107849059A

CN107849059A - 7‑苯基乙基氨基‑4h‑嘧啶并[4,5‑d][1,3]噁嗪‑2‑酮化合物及其作为突变体idh1抑制剂的用途

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Publication number: CN107849059A
Application number: CN201680043259.1A
Authority: CN
Inventors: R.A.鲍尔; S.L.布莱; T.P.伯克霍尔德; S.卡瓦拉雷斯马丁; J.R.吉利; R.吉尔摩尔; W.卢梅拉斯/W.卢梅拉斯阿马多尔; Z.吴
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: EP3328866A1; JP2018525369A; EP3328866B1; JP6473270B2; CN107849059B; WO2017019429A1; US20180118759A1; ES2764523T3; US10253041B2; WO2017019429A8

Abstract

式I的苯基乙基氨基‑4H‑嘧啶并[4,5‑d][1,3]噁嗪‑2‑酮化合物、包含那些化合物的制剂以及它们作为异柠檬酸脱氢酶1酶抑制剂的用途。

Description

7-苯基乙基氨基-4H-嘧啶并[4,5-D][1,3]噁嗪-2-酮化合物及其作为突变体IDH1抑制剂的用途

在柠檬酸(三羧酸或Krebs)循环中，异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白是重要的酶。柠檬酸循环对于许多生化途径来说是非常重要的，并且是最早确定的细胞代谢的组成部分之一。

异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧成为α-酮戊二酸(即，2-氧代戊二酸)。这些酶属于两个不同的亚类，其中一类使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(+))作为电子受体，另一类使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP(+))。已经报道了五种异柠檬酸脱氢酶∶三种NAD(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶，它们定位于线粒体基质，两种NADP(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶，其中一种是线粒体型的，另一种主要是细胞溶质型的。每种NADP(+)依赖型同功酶都是二聚体。IDH1基因编码的蛋白是在细胞质和过氧化物酶体中发现的NADP(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶。所述细胞质酶在细胞质NADPH产生的过程中具有显著作用。IDH1在许多物种和缺乏完整柠檬酸循环的有机体中表达。

最近，已经在几种类型的癌症中发现IDH1中的突变，以及相关的异构型IDH2。突变被发现出现于沿着蛋白序列的特定氨基酸上，并且被杂合表达，与功能的获得一致。这些突变出现在功能保守的残基上，并且IDH1的突变形式的生化研究表明IDH1的正常功能的丧失，异柠檬酸向α-酮戊二酸的可逆转化。这些突变的结果是允许α-酮戊二酸(αKG)向2-羟基戊二酸(2HG)的新(或新生形)转化。结果，隐藏IDH1或IDH2的突变形式的癌细胞，形成总体上更高浓度的2HG。高水平的2HG导致阻碍细胞分化，这可以通过抑制突变体IDH1或IDH2来逆转。

还需要相对于野生型IDH2来选择性抑制突变体IDH1酶的化合物，用于治疗各种癌症。进一步需要相对于野生型IDH1来选择性抑制显示新生活性的突变体IDH1酶的化合物，用于治疗各种癌症。

本发明的一个方面提供了下式的突变体IDH1酶抑制剂化合物∶

其中

L是连接基，选自-N-氮杂环丁烷-3-CH₂-O-、-N-氮杂环丁烷-3-O-(CH₂)-、-N-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-6-(CH₂)-、-N-哌嗪-4-(CH₂)-、-N-哌嗪-、-N-氮杂环丁烷-3-(CH₂CH₂)-、-7-N-(2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷)-2-(CH₂)-、-N-氮杂环丁烷-3-(NMe)CH₂-、-N-哌啶-4-(NMe)CH₂-和-N-2,5-二氢吡咯-3-(CH₂)-O-；

Z选自H和F；

R选自C₁-C₄烷基、-CH(CH₃)CH₂-OH、-CH₂CH₂F和-CH₂CHF₂；

或其可药用盐。

本发明的进一步方面提供了式I的化合物，

其中: L是连接基，选自-N-哌嗪-4-(CH₂)-、-N-哌嗪-、-N-氮杂环丁烷-3-(NMe)CH₂-、-N-氮杂环丁烷-3-CH₂-O-、-N-氮杂环丁烷-3-O-(CH₂)-、-N-氮杂环丁烷-3-(CH₂CH₂)-和-N-哌啶-4-(NMe)CH₂-；

Z是H；

R是C₁-C₄烷基；或其可药用盐。

本发明的另一个方面提供了式I的化合物，

其中: L是连接基，选自-N-哌嗪-4-(CH₂)-、-N-哌嗪-、-N-氮杂环丁烷-3-O-(CH₂)-、-N-氮杂环丁烷-3-(CH₂CH₂)-、-N-氮杂环丁烷-3-(NMe)CH₂-和-N-哌啶-4-(NMe)CH₂-；

Z是H；

R选自-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂；或其可药用盐。

本发明的进一步方面是化合物1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐。

本发明的另一个方面是化合物1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐。

本发明的进一步方面是选自下列的化合物∶

1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐；

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐；

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(1-丙-2-烯酰基氮杂环丁烷-3-基)氧基甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐；

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[2-(1-丙-2-烯酰基氮杂环丁烷-3-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐；

1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-[(1-丙-2-烯酰基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基]-苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐；

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[[甲基-(1-丙-2-烯酰基氮杂环丁烷-3-基)氨基]甲基]-苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐。

本发明的另一个方面提供了药物组合物，其含有式I的突变体IDH1抑制剂化合物或其可药用盐，以及可药用载体。

本发明的进一步方面提供了治疗患者的表达突变体IDH1的癌症的方法，所述癌症是：神经胶质瘤、恶性胶质瘤、多形性恶性胶质瘤（glioblastoma multiforme）、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤（oligodendrogliomas）、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(AML)、黑素瘤、***癌、软骨肉瘤或胆管癌，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的式I的化合物，或其可药用盐。

本发明的另一个方面提供了治疗患者的表达突变体IDH1的癌症的方法，所述癌症是：纤维肉瘤、急性髓性白血病、神经胶质瘤或恶性胶质瘤，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的式I化合物，或其可药用盐。

本发明的进一步方面提供了用于治疗的式I化合物或其可药用盐。

本发明的另一个方面提供了用于治疗表达突变体IDH1的癌症的式I化合物，或其可药用盐，所述癌症是：神经胶质瘤、恶性胶质瘤、多形性恶性胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(AML)、黑素瘤、***癌、软骨肉瘤或胆管癌。

本发明的进一步方面提供了式I的化合物，或其可药用盐，用于治疗表达突变体IDH1的癌症，所述癌症是：纤维肉瘤、急性髓性白血病、神经胶质瘤或恶性胶质瘤。

本发明的另一个方面提供了式I化合物或其可药用盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗表达突变体IDH1的癌症，所述癌症是：神经胶质瘤、恶性胶质瘤、多形性恶性胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(AML)、黑素瘤、***癌、软骨肉瘤或胆管癌。

本发明的进一步的方面提供了式I的化合物或其可药用盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗表达突变体IDH1的癌症，所述癌症是：纤维肉瘤、急性髓性白血病、神经胶质瘤或恶性胶质瘤。

术语“患者”是指哺乳动物，“哺乳动物”包括但不局限于人。

“治疗有效量”或“有效量”是指式I化合物或其可药用盐的剂量，或含有所述化合物或其可药用盐的药物组合物的剂量，这种剂量为抑制癌症患者的突变体IDH1所必需，能够解除对于分化的阻碍，同时实现抑制肿瘤细胞生长，并且消除患者的癌症或减缓或抑制患者癌症的发展。式I化合物或其可药用盐的预期剂量在20 mg/患者/天至2000 mg/患者/天的范围内。优选剂量预期在30 mg/患者/天至1800 mg/患者/天的范围内。最优选剂量预期在40 mg/患者/天至1600 mg/患者/天的范围内。医师考虑疾病的阶段和严重程度，以及个体患者的具体需要和响应，确定治疗患者所需要的确切剂量以及治疗时间的长短。虽然以每天为基础来表示剂量，但为了给患者提供最佳治疗益处，并且控制或改善任何药物相关的毒性，可以调节给药剂量。除了日剂量之外，每天两次(B.I.D.)给药、每天三次(T.I.D.)给药、每隔一天给药(Q2D)、五天时间内每隔一天给药而后两天不用给药(T.I.W.)或每隔两天给药(Q3D)都是合适的给药方式。

术语“治疗”旨在包括全面介入患者患有的癌症，例如，给予患者活性化合物，以便减轻、减缓或逆转一或多种症状，并且即使不能实际上消除癌症，也要延迟癌症的发展。

短语“C₁-C₄烷基”包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

优选，使用可药用载体，将式I的化合物或其可药用盐配制为药物组合物，并且通过各种途径给药。优选，口服给予这种组合物。这种药物组合物和制备它们的方法在本领域是众所周知的。参见，例如，REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(A.Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)。在一个具体实施方案中，所述药物组合物含有1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮或其可药用盐，以及可药用载体，任选含有其它治疗组分，尤其是一般用于治疗癌症或特定癌症类型的组分。

式I的化合物或可药用盐，可以与一或多种其它治疗剂同时给予，或在给予一或多种其它治疗剂之前或之后给予。式I的化合物或可药用盐，当与一或多种其它治疗剂一起给予时，可以通过相同或不同的给药途径单独给予，或在与其它治疗剂相同的药物组合物中一起给予。如果给予一或多种其它治疗剂，则可以同时、分开或顺序给予每个治疗剂。

式I的化合物能够与许多无机和有机酸反应，形成可药用酸加成盐。这种可药用盐和制备它们的常规方法在本领域是众所周知的。参见，例如，P. Stahl et al., HANDBOOKOF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH,2002); S.M. Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977。

式I的化合物或其可药用盐，可以通过本领域已知的各种方法以及如下所述的方法来制备。为了制备式I的化合物或其可药用盐，可以将具体合成步骤用不同的顺序组合。

按照IUPAC命名式I的化合物，也可以按照CAS命名，其它名称可以用于清楚地鉴定式I的化合物或其可药用盐。

应该理解，可以将式I的化合物描述为单一立体异构体。在立构的苄基碳位置有一个手性中心，产生两个非对映异构体，并且可能更取决于取代基。本文使用的单一立体异构体旨在还包括立体异构体的混合物，其包括命名的或描述的式I化合物。本文中，(R)-和(S)-的Cahn-Ingold-Prelog符号可以用于指代具体立体异构体。可以使用光学纯或富集的起始原料，通过立体有择合成来制备具体立体异构体。起始原料、中间体或包括式I化合物的外消旋混合物的具体立体异构体，可以利用本领域众所周知的技术来拆分，例如，在Stereochemistry of Organic Compounds，E. I. Eliel 和S. H. Wilen(Wiley 1994)以及Enantiomers，Racemates and Resolutions，J.，Jacques，A. Collet 和 S. H. Wilen(Wiley 1991)中所得到的那些技术，包括手性固定相色谱、酶拆分，或为此目的所形成的非对映异构体（例如，非对映盐）的色谱或分级结晶。尽管含有式I化合物的非对映体的混合物包括在本发明范围内，但优选实施方案是式I所示的(S)构型。

在式I化合物的合成中，作为最初起始原料所使用的化合物是众所周知的化合物，不能商购时，可以通过本领域普通技术人员通常使用的标准方法或在一般参考文献中得到的方法，使用所提供的具体参考文献来容易地合成。

已知的工艺和方法的例子包括在一般参考文献中所描述的那些工艺和方法，例如，Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989;Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, WileyInterscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, andStructure, 5^th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience,2001; Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, Part B, Reactions andSynthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic/PlenumPublishers, 2000，等等，以及其中引用的参考文献。

为了清楚起见，下列反应路线中未指明某些立体化学中心，但并没有以任何方式限制反应路线的教导的意思。利用例如选择结晶技术或手性色谱的方法，在合成本发明化合物的过程中，在任何方便的点，本领域普通技术人员可以分离或拆分单一异构体、对映异构体和非对映异构体。

某些缩写定义如下∶“ACN”是指乙腈；“αKG”是指α-酮戊二酸或2-酮戊二酸；“alloc”是指烯丙氧基羰基；“ATCC”是指美国模式培养物保藏所；“BCA”是指二辛可宁酸；“BOC”是指叔丁氧基羰基；“BSA”是指牛血清白蛋白；“CDI”是指1,1'-羰二咪唑；“CPME”是指环戊基甲醚；“DCC”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“DCM”是指二氯甲烷； “DEAD”是指偶氮二甲酸二乙基酯；“DIAD”是指偶氮二甲酸二异丙基酯；“DIC”是指二异丙基碳二亚胺；“DIPEA”是指二异丙基乙胺或N-乙基-N-异丙基-丙-2-胺；“DMA”是指二甲基乙酰胺；“DMAP”是指二甲基氨基吡啶；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“DTT”是指二硫苏糖醇；“EDC”是指EDAC、EDCI或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“EGTA”是指乙二醇四乙酸；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“EtOH”是指乙醇；“Ex”是指实施例；“HATU”是指(二甲基氨基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲烷亚胺（methaniminium）六氟磷酸盐；“HBTU”是指2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐；“HEK”是指人的胚肾；“2HG”是指2-羟基戊二酸酯；“d₅-3HG”是指3-羟基-1,5-戊二酸-2,2,3,4,4-d₅酸；“HILIC”是指亲水相互作用液相色谱；“HOAt”是指1-羟基-7-偶氮苯并***；“HOBt”是指1-羟基苯并***水合物；“HPLC”是指高效液相色谱；“IC₅₀”是指产生对该药剂可能为最大抑制响应时的药剂的浓度；“mCPBA”是指间氯过苯甲酸；“Me”是指甲基或CH₃；“MeOH”是指甲醇；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“NADP⁺和NAHPH”分别是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化和还原形式；“NMP”是指N-甲基-2-吡咯烷酮；“PG”是指保护基；“Ph”是指苯基；“Prep”是指制备；“PyBOP”是指苯并***-1-基氧基三吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐；“PyBrop”是指溴-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐；“rpm”是指每分钟转数；“SCX”是指强阳离子交换；“S_NAr”是指亲核芳香取代；“TEA”是指三乙胺；“TFA”是指三氟乙酸；“THF”是指四氢呋喃；THP是指四氢吡喃基；“Tris”是指三（羟基甲基）氨基甲烷，“XRD”是指X射线粉末衍射。

本发明的化合物或其盐，可以用本领域已知的各种方法制备，下面的反应路线、制备例和实施例举例说明了其中的一些方法。所描述的每个途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或与不同反应路线的步骤结合，制备本发明的化合物或其盐。可以使用本领域众所周知的常规方法，回收下面反应路线中的每个步骤的产物，包括提取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。在下面的反应路线中，除非另作说明，否则，所有的取代基如以前所定义。对本领域普通技术人员来说，很容易得到所述试剂和起始原料。

在反应路线1中，经过一系列反应，得到1-取代的7-(甲磺酰基)-1,4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，步骤E的产物，其中R如先前所定义，或R=CH(CH₃)-CH₂-O-PG。“PG”是为氨基或氧基团开发的保护基，例如，氨基甲酸酯、酰胺或酯。例如，在步骤A中，在溶剂（例如，THF）中，使用氢氧化铵，使羧基保护的4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸酯的氯转化为胺，得到步骤A的取代的嘧啶胺产物。在步骤B中，在溶剂（例如，THF）中，在本领域众所周知的条件下，所述酯，例如，乙酯，可以被氢化物源(例如，氢化锂铝)还原为羟甲基，得到步骤B的羟甲基产物。在标准甲氨酰化条件下，使用三光气和有机碱，例如，DIPEA或TEA，在大约-30至-35℃的温度下，5-羟基甲基4-胺-嘧啶可以被环化为噁嗪-2-酮，得到步骤C的产物。或者，可以使用羰基二卤化物或羰基二-拟卤化物，例如，CDI、光气或双光气，代替三光气，完成甲氨酰化。在溶剂（例如，NMP）中，在无机碱（例如，K₂CO₃）的存在下，在大约50-65℃的温度下，可以使用合适的取代的烷基卤，例如，碘试剂，将噁嗪的胺烷基化，得到步骤D的产物。或者，可以使用合适的醇，例如，MeOH，进行Mitsunobu反应，使噁嗪的胺烷基化。Mitsunobu反应在本领域是众所周知的反应，在溶剂（例如，THF）中，使用三苯基膦和偶氮二甲酸酯，例如，DIAD或DEAD，可以使羟基转化为离去基团，该离去基团被多种亲核试剂（例如，氨基甲酸酯）取代得到步骤D的产物。在本领域众所周知的条件下，例如，mCPBA或过一硫酸钾，在大约10至25℃的温度下，在溶剂（例如，ACN或CH₂Cl₂）中，可以将所述硫化物氧化为砜，得到步骤E的产物。或者，在步骤A中，在一个3步骤的方法中，可以由取代的4-氯嘧啶制备烷氧基烷基胺取代的产物。例如，将(2R)-1-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基丙-2-胺和碱(例如，DIPEA)在溶剂(例如，DMF)中加热至大约65℃，而后用水淬灭，并用EtOAc提取，得到粗品中间体甲硅烷氧基烷基氨基嘧啶。用四丁基氟化铵处理该中间体，浓缩，而后用硅胶纯化，得到中间体羟烷基氨基嘧啶。可以使用对甲苯磺酸用3,4-二氢-2H-吡喃保护该中间体的羟基，纯化之后得到步骤A的羟基保护的产物。

在反应路线2的步骤J中，使用本领域众所周知的条件，例如，氢化锂铝，在溶剂（例如，THF）中，将4-乙胺保护的苯甲酸还原，得到4-乙胺-苄基-羟基化合物。在标准氯化反应条件下，使用氯化剂，例如，亚硫酰氯或POCl₃，在溶剂（例如，CH₂Cl₂）中，步骤J的苄基-羟基产物可以转化为卤化物（例如，氯化物），得到步骤K的产物。在步骤L的子步骤1中，使用保护基（例如，三氟乙酰基），可以保护步骤K的1-苯乙胺产物或步骤J的苄基-羟基产物。在两步法、一锅法中，可以用保护的连接基(L)的胺代替步骤L的产物的氯化物。并不总是需要保护1-苯乙胺，但如果选择保护，有利的是在1-苯乙胺上使用不同于连接基胺的保护基，以便在所期望的步骤中选择性地去保护一个或另一个PG。例如，在溶剂（例如，CH₂Cl₂）中，在大约0-5℃的温度下，使用有机碱，例如，TEA，可以使1-苯乙胺与三氟乙酸酐反应，得到步骤L的子步骤1的保护的胺产物。然后，在本领域技术人员众所周知的条件下，可以完成氯化物的取代。例如，当连接基具有胺时，在溶剂（例如，ACN）中，使用无机碱，例如，K₂CO₃，同时加热至大约60℃，可以用合适的连接基胺代替氯化物，得到步骤L的子步骤2的产物。或者，在溶剂（例如，DMSO）中，可以使用有机碱(例如，DIPEA)，使胺烷基化，得到步骤L的子步骤2的产物。当连接基通过醚键连接时，在溶剂（例如，DMF）中，使用碱（例如，氢化钠），醇前体可以替换卤化物，得到步骤L的子步骤2的产物。在步骤M的子步骤1中，在标准脱保护条件下，在溶剂（例如，EtOH）中，使用碱性条件，例如，氢氧化钠水溶液，可以将1-苯乙胺脱保护(如果先前保护的话)，得到步骤M的子步骤1的游离胺产物。或者，如果保护基是羧基苄基，氢解条件可用于除去保护基，例如，在溶剂（例如EtOH）中，在氢气氛围中，使用10% Pd/C，得到步骤M的子步骤1的脱保护产物。然后，在SNAr反应中，可以使1-苯乙胺与反应路线1的步骤E的产物反应，为了促进该反应，使用有机碱（例如，DIPEA、CsF），使用溶剂（例如，DMSO），温度为大约70-80℃，得到步骤M的子步骤2的产物。在步骤N的子步骤1中，使用酸，例如，二噁烷和MeOH中的HCl或CH₂Cl₂中的TFA，可以将叔丁氧基保护的连接基脱保护，而alloc保护的连接基，可以在钯源(例如，催化的四(三苯基膦)钯(0))的存在下，在溶剂（例如，THF）中，使用柔和的亲核试剂（例如，双甲酮），进行脱保护，得到步骤N的子步骤1的脱保护的连接基。在步骤N的子步骤2中，在大约50至75℃的温度下，在溶剂（例如，CH₂Cl₂）中，如果胺是酸式盐，使用有机碱，例如，TEA，可以用丙烯酰氯将连接基胺酰胺化，得到式I的化合物。或者，在溶剂（例如，DMF）中，使用偶合试剂(例如，EDC)和添加剂(例如，HOBt)，可以使用丙烯酸与合适的胺，进行酰胺偶合。本领域技术人员会认识到，羧酸和胺反应形成酰胺，存在着许多方法和试剂。例如，在偶合试剂的存在下，在存在或不存在有机碱(例如，DIPEA或TEA)的条件下，合适的胺和丙烯酸反应，可以提供式I的化合物。其它偶合试剂包括碳二亚胺（例如，DCC、DIC）或羰二咪唑（例如，CDI）。其它酰胺偶合添加剂，例如，HOAt，也可以用于促进该反应。另外，可以使用非亲核的阴离子的脲盐或鏻盐，例如，HBTU、HATU、PyBOP和PyBrOP，代替更常规的偶合试剂。为了促进所期望的酰胺化反应，可以使用添加剂，例如，DMAP。

或者，在反应路线3中，在原位没有连接基的1-苯乙胺与步骤E的产物反应，如反应路线2的步骤M所述，得到步骤O的产物。在ACN中，使用K₂CO₃和碘化钠，可以使步骤O的产物与保护的连接基反应，如反应路线2的步骤L的子步骤2所述，得到步骤P的产物。或者，如果X=Br，则在溶剂（例如，DMSO）中，使用无机碱（例如，碳酸钾、CuBr和羟脯氨酸），可以用胺代替溴化物，得到步骤P的产物。对于L包括炔的实施例，使用钯交叉偶合条件，例如，在Sonagashira反应中，可以使Br与合适的保护的炔反应。在溶剂（例如，THF）中，使合适的钯催化剂（例如，四(三苯基膦)钯(0)），铜催化剂（例如，CuI），以及有机碱（例如，TEA），与合适的炔和芳基溴混合，得到步骤P的产物。当X=-CH₂OH时，OH可以转化为氯化物，如反应路线2的步骤K所述，得到步骤Q的氯化产物。在溶剂（例如，THF）中，在氢气氛围中，使用催化剂，例如，10% Pd/CaCO₃，可以将步骤P的炔连接基氢化，得到还原的炔产物。然后，在步骤N中，将步骤P或步骤Q的产物脱保护，如反应路线2的步骤N的子步骤1所述，可以如反应路线2的步骤N的子步骤2所述，将连接基酰胺化，得到式I的化合物。

在反应路线4中，可以用保护基(例如，三氟乙酰基)或其它保护基(例如，羧基苄基)保护1-苯乙胺，如反应路线2的步骤L所述。例如，当羧基苄基是目标PG时，使用无机碱（例如，NaHCO₃），在溶剂的混合物（例如，THF和水）中，可以将氯甲酸苄基酯加入到1-(4-羟基苯基)乙胺中，得到羧基苄基保护的胺。当连接基L通过醚键与芳基环相连接时，可以在保护的1-(4-羟基苯基)乙胺上进行Mitsunobu反应。Mitsunobu反应在本领域是众所周知的反应，在溶剂（例如，THF）中，使用多种亲核试剂（例如，苯酚），使用三苯基膦和偶氮二甲酸酯（例如，DIAD或DEAD），可以使羟基转化为有效的离去基团，得到步骤R的芳基醚产物。然后，在1-苯乙胺官能团上，可以将步骤R的产物脱保护，如反应路线2的步骤M的子步骤1所述，而后，进行S_NAr烷基化，如反应路线2的步骤M的子步骤2所述，得到反应路线4的步骤M的产物。然后，可以由步骤N形成式I的产物，如反应路线2的步骤N的子步骤1和2所述。

在任选的步骤中，在合适的溶剂中，在标准条件下，合适的式I的游离碱与合适的可药用酸反应，可以形成式I化合物的可药用盐。另外，当氮保护基脱保护时，可以同时形成这种盐。这种盐的形成在本领域为大家所熟知和了解。参见，例如，Gould, P.L., “Saltselection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217(1986); Bastin, R.J.,等人， “Salt Selection and Optimization Procedures forPharmaceutical New Chemical Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435(2000); 以及Berge, S.M.,等人， “Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19,(1977)。本领域普通技术人员可以理解，式I的化合物容易转变为可药用盐和可以作为可药用盐进行分离。

制备例1

4-氨基-2-甲基硫烷基-嘧啶-5-甲酸乙酯

反应路线1，步骤A∶

在室温下，用1小时将氢氧化铵(8.4 L，17 wt%，6.86 mol)加入到4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(4 kg，10.74 mol)的THF(34.4 L)溶液中。搅拌4小时之后，加入水，并将该混合物用MTBE提取。用盐水洗涤有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。使粗品与石油醚(3 L)一起形成浆液，过滤，并真空干燥，提供标题化合物的白色固体(3.5 kg，纯度89%，产率95%)，其不用进一步纯化继续使用。MS(m/z): 214(M+H)。

制备例2

2-甲基硫烷基-4-[[(1R)-1-甲基-2-四氢吡喃-2-基氧基-乙基]氨基]-嘧啶-5-甲酸酯

反应路线1，步骤F∶

在室温下，将DIPEA(9.1 mL，52 mmol)和(2R)-1-(叔丁基甲硅烷基)氧基丙-2-胺(5.82g，30.7 mmol)加入到4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(6 g，25.8 mmol)的DMF(50 mL)溶液中。在室温下搅拌10分钟之后，将该混合物加热至65℃，保持1.5小时，冷却至室温，用水处理，并用EtOAc(2×)提取。用5% LiCl水溶液(3×)洗涤有机提取物，用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将粗品(8.64 g，22.4 mmol)溶于THF(100 mL)中，并用四丁基氟化铵(34 mL，34mmol，1M，在THF中)处理。在室温下搅拌30分钟之后，将该反应浓缩至干，并将粗品伯醇通过层析纯化(20-40%，EtOAc/己烷)，得到中间体醇的白色固体(4.94 g，81%)。将一部分该中间体醇(2.05 g，7.56 mmol)悬浮在CH₂Cl₂(40 mL)中，并用对甲苯磺酸一水合物(2.16 g，11.4mmol)和3,4-二氢-2H-吡喃(5.81 mL，60.5 mmol)处理。在室温下搅拌1小时之后，用饱和NaHCO₃水溶液淬灭该混合物，并用额外的CH₂Cl₂(2×)提取水相。用Na₂SO₄干燥合并的有机提取物，过滤，浓缩，用硅胶色谱纯化目标产物(0至15%，EtOAc/己烷)，得到无色油(2.60 g，该步骤的产率97%)。MS(m/z): 356(M+H)。

基本上利用制备方法2，制备下列化合物。

表1

制备例4

(4-氨基-2-甲基硫烷基-嘧啶-5-基)甲醇

反应路线1，步骤B∶

在-5℃，用1.5小时将LiAlH₄(13.9 L，14 mol，1M在THF中)加入到4-氨基-2-硫烷基-嘧啶-5-甲酸乙酯(3.5 kg，16.4 mol)的THF(45 L)溶液中。在-5至0℃下搅拌1小时之后，加入冰水(525 mL)和15% NaOH水溶液(525 mL)，而后加入额外的冰水(1.6 L)。在0℃下经过30分钟之后，将淬灭的反应混合物过滤，并用THF(1 L)洗涤滤饼。将合并的THF洗液干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩，并使所得到的粗品在石油醚/EtOAc的混合物(3:1，2 L)中形成浆液，过滤，再次干燥，提供标题化合物的黄色固体(2.1 kg，纯度82%，产率75%)，其不用进一步纯化，直接使用。MS(m/z): 172(M+H)。

基本上利用制备方法4，制备下列化合物。

表2

制备例7

7-甲基硫烷基-1,4-二氢嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线1，步骤C∶

在-30℃，用15分钟将三光气(859 g，2.9 mol)加入到(4-氨基-2-甲基硫烷基-嘧啶-5-基)甲醇(900 g，5.26 mol)的THF(22.5 L)溶液中。用1小时加入DIPEA(2.449 g，18.92mol)，同时保持反应温度在-35和-30℃之间。然后，将该反应混合物倾倒在冰水(30 L)中，并加入2-甲基四氢呋喃(10 L)。用水和盐水洗涤有机相。用Na₂SO₄干燥有机相，并浓缩至干。使粗品与石油醚/EtOAc(1:1)一起形成浆液，过滤，浓缩，得到黄色固体，其不用进一步纯化继续使用(890.5 g，1.62 mol，纯度83%，产率86%)。MS(m/z): 198(M+H)。

基本上利用制备方法7，制备下列化合物。

表3

制备例10

1-乙基-7-(甲硫基)-1,4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线1，步骤D∶

在室温下，向7-甲基硫烷基-1,4-二氢嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(280 g，1.42mol)的NMP(2.24 L)溶液中加入K₂CO₃(294.2 g，2.13 mol)和乙基碘(336.3 g，1.99 mol)。将该混合物在50℃下搅拌16小时，而后用CH₂Cl₂(3 L)和水(6 L)稀释。分离有机相，用水和盐水洗涤，并浓缩至干，得到粗品标题化合物(286 g，1.27 mol，纯度83%，产率91%)。MS(m/z): 226(M+H)。

基本上利用制备方法10，制备下列化合物。

表4

另一个制备例10

1-乙基-7-(甲硫基)-1,4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

在氮气氛围中，将7-甲基硫烷基-1,4-二氢嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(325 g，1648.0 mmol)和DMF(2.4 L)加在一起。然后，向该澄清溶液中加入碳酸铯(660 g，2025.61mmol)，并将该混合物搅拌30分钟。在20℃，用30分钟逐滴加入碘乙烷(170 mL，2120 mmol)。将该反应混合物在此温度下搅拌2.5小时。将该反应混合物慢慢地倾倒在冰冻水和盐水(1:1，12 L)中。将得到的浆液搅拌2小时。滤出固体，用水(2×2L)洗涤，在真空下用空气流干燥3天，得到所述化合物的黄色固体(318 g，纯度99%，87%)。MS(m/z): 226(M+H)。

制备例13

1-甲基-7-甲基硫烷基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线1，步骤D∶

在环境温度下，向三苯基膦(1.61 g，6.08 mmol)和7-甲基硫烷基-1,4-二氢嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(1.00 g，5.07 mmol)的THF(25 mL)溶液中加入MeOH(0.248 mL，6.08mmol)，而后逐滴加入DIAD(1.21 mL，6.08 mmol)。搅拌过夜之后，真空除去溶剂，并将得到的黄色油用硅胶色谱纯化(40-50%，EtOAc/己烷)，得到标题化合物的白色固体(1.08 g，5.11 mmol，定量)。MS(m/z): 212(M+H)。

基本上利用制备方法13，制备下列化合物。

表5

制备例15

1-乙基-7-(甲磺酰基)-1,4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线1，步骤E∶

用20分钟向1-乙基-7-(甲硫基)-1,4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(286g，1.24 mol)的ACN(2.8 L)和水(1.4 L)的搅拌溶液中加入固体过一硫酸钾(1526 g，2.48mol)，并将得到的混合物在10-20℃下搅拌16小时。过滤该反应混合物，并将所获得的滤饼用CH₂Cl₂洗涤。将合并的滤液和CH₂Cl₂用5% Na₂SO₃、水和盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机相，浓缩，提供标题化合物(133.8 g，纯度93%，产率41%)。MS(m/z): 258(M+H)。

基本上利用制备方法15，制备下列化合物。

表6

另一个制备例15

1-乙基-7-(甲磺酰基)-1,4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

将1-乙基-7-甲基硫烷基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(550 g，2.44 mol)与ACN(7 L)和水(3 L)混合。在12.5℃，用100分钟向此溶液中按10份加入过一硫酸钾(3070 g，4.9 mol)。在此温度下搅拌3小时之后，滤出固体，并用DCM(4 L)洗涤。分离各层，用5%Na₂SO₃(3 L)、水(2 L)、盐水(2 L)顺序洗涤有机层，并用Na₂SO₄干燥。过滤有机层，合并，并减压浓缩。将溶剂浓缩95%之后，滤出沉淀的固体，除去一些有色杂质。将滤出的固体用ACN(2×500 mL)洗涤两次，在真空下用空气流干燥，获得第一批340 g产物。将母液减压浓缩至干。然后，将残余物与最低量的ACN一起研磨，滤出固体，获得第二批34 g。合并的批次得到标题化合物(374 g，60%)的类白色固体。MS(m/z): 258(M+H)。

制备例17

7-甲磺酰基-1-[(1R)-1-甲基-2-四氢吡喃-2-基氧基-乙基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线1，步骤I∶

在室温下，将7-甲基硫烷基-1-[(1R)-1-甲基-2-四氢吡喃-2-基氧基-乙基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(700 mg，2.06 mmol)的CH₂Cl₂(10 mL)悬浮液用mCPBA(1.07 g，4.5 mmol，70-75%，试剂等级)处理。20分钟之后，滤出固体，并用额外的CH₂Cl₂洗涤。合并有机滤液，用饱和NaHCO₃水溶液(2×)和盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并浓缩至干。用硅胶色谱纯化该物质，得到标题化合物的无色油(589 mg，77%)。MS(m/z): 372(M+H)。

基本上利用制备方法17，制备下列化合物。

表7

制备例22

(S)-(4-(1-氨基乙基)苯基)甲醇

反应路线2，步骤J∶

用1小时向(S)-4-(1-氨基乙基)苯甲酸甲酯(100 g，558 mmol)的THF(2.2 L)搅拌溶液中加入LiAlH₄(560 mL，560 mmol，1M，在THF中)，同时保持反应温度低于30℃。将该反应混合物搅拌2小时，而后冷却至0℃。逐滴加入水(100 mL)，而后加入无水Na₂SO₄(1 kg)，并将得到的混合物搅拌过夜。用硅藻土过滤该混合物，并将得到的白色固体真空干燥，得到标题化合物(81.8 g,97%)。MS(m/z): 135(M-NH₂)。

制备例23

(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙胺盐酸盐

反应路线2，步骤K∶

用30分钟向(S)-(4-(1-氨基乙基)苯基)甲醇(81.8 g，541 mmol)的CH₂Cl₂(2.5 L)溶液中加入SOCl₂(80 mL，1.1 mmol)，同时保持反应温度低于25℃。在反应期间，形成的粘性沉淀溶解。搅拌4小时之后，浓缩该混合物，得到黄色固体。加入ACN(1 L)，将该混合物浓缩至500 mL，并滤出所得到的固体，得到类白色固体，将固体真空干燥。干燥之后，获得类白色固体产物，还可以浓缩母液，提供纯度较差的产物(～20 g)的黄色固体。将两个批次的产物合并，得到标题化合物(111 g，78%)。MS(m/z): 170(M+H)。

制备例24

4-[[4-[(1S)-1-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]乙基]苯基]-甲基]-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯

反应路线2，步骤L∶

在0℃，向(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙胺盐酸盐(10 g，48.5 mmol)的CH₂Cl₂(160 mL)溶液中加入三氟乙酸酐(8.2 mL，58 mmol)。加入TEA(15 mL，108 mmol)，同时保持加入温度低于5℃。在0℃下搅拌1小时之后，将该反应混合物浓缩至干，并加入ACN(120 mL)，而后加入哌嗪-1-基碳酸叔丁基酯(13.5 g，72.5 mmol)。加入K₂CO₃(20 g，144.7 mmol)，并将该混合物加热至60℃，搅拌17小时。真空除去溶剂，并加入EtOAc(1 L)。滤出固体，并用水和盐水洗涤EtOAc。将有机相用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩至干。将得到的粗品用硅胶色谱纯化(10至50%，丙酮/CH₂Cl₂)，得到题化合物的白色泡沫体(15.8 g，78%)。MS(m/z): 416(M+H)。

制备例25

4-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯

反应路线2，步骤M，子步骤1∶

在室温下，向4-[[4-[(1S)-1-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]乙基]苯基]-甲基]-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(203 g，0.489 mol)的EtOH(2.4 L)溶液中加入5M NaOH水溶液(480 mL，2.40mol)。在室温下搅拌3.5小时之后，浓缩该反应混合物，除去大部分EtOH。加入EtOAc(2 L)，使残余物溶解，并将该溶液用水和盐水洗涤。将合并的水相用EtOAc(2×)提取。将合并的有机提取物用Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩至干，得到粗品标题化合物的黄色粘性油(156 g，93%)，其不用进一步纯化。MS(m/z): 320(M+H)。

制备例26

4-[[4-[(1S)-1-[(1-异丙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯

反应路线2，步骤M，子步骤2∶

向4-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(46.7 g，136 mmol)和1-异丙基-7-甲磺酰基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(40.6 g，150 mmol)的DMSO(272mL)溶液中加入CsF(20.7 g，136 mmol)和DIPEA(23.7 mL，136 mmol)。将该混合物在75-80℃下搅拌17小时。然后，将该混合物冷却至室温，用水(1.2 L)稀释，用EtOAc(3×)提取，用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并浓缩至干。将得到的粗品用硅胶色谱纯化(30至60%，丙酮/CH₂Cl₂)，得到题化合物的白色泡沫体(54 g，78%)。MS(m/z): 511(M+H)。

制备例27

1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮盐酸盐

反应路线2，步骤N，子步骤1∶

向4-[[4-[(1S)-1-[(1-异丙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(54 g，106 mmol)的二噁烷(270 mL)溶液中加入HCl(264 mL，4M，在二噁烷中)，同时保持内部温度低于35℃。然后加入MeOH(100 mL)，促进搅拌。将该混合物在30℃下搅拌2小时，然后浓缩，得到白色固体，将白色固体真空干燥。干燥之后，获得标题产物的浅黄色固体(60 g，定量)，其不用进一步纯化。MS(m/z): 411(M+H)。

制备例28

4-[[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯

反应路线2，步骤N，子步骤1∶

向4-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(52 g，151.4 mmol)和1-乙基-7-甲磺酰基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(42.8 g，166 mmol)的DMSO(300mL)溶液中加入CsF(23 g，151.4 mmol)和DIPEA(26.5 mL，152 mmol)。将该混合物在75-80℃下搅拌4小时。将该混合物冷却至室温，用水(1.2 L)稀释，用EtOAc(3×)提取，用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并浓缩。用硅胶色谱纯化粗品(50至75%[10% EtOH/CH₂Cl₂]/己烷)，得到白色泡沫体(53.3 g，71%)。MS(m/z): 497(M+H)。

基本上利用制备方法28，制备下列化合物。

表8

另一个制备例28

将4-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(400 g，1252 mmol)和DMSO(2.2 L)加在一起。然后，向此溶液中顺序加入1-乙基-7-甲磺酰基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(325 g，1200.1 mmol)、CsF(200 g，1316.59 mmol)和DIPEA(240 mL，1380mmol)。然后，将该反应混合物在75℃下加热5小时，并升温至室温过夜，同时温和搅拌。将该反应混合物慢慢地倾倒在冰冻水/盐水(1:1)中。滤出沉淀的固体，用水(2×1.5L)洗涤，并在真空下用空气流干燥过夜。获得湿滤饼(800 g)，其不用进一步纯化。

制备例46

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮盐酸盐

反应路线2，步骤N，子步骤1∶

用20分钟向4-[[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(48.3 g，97.3 mmol)溶液(在二噁烷(140 mL)和MeOH(100 mL)的混合物中)中加入HCl(4M，在二噁烷中，243 mL)，同时保持内部温度低于30℃。将该混合物在30℃下搅拌1小时，然后浓缩至干，提供白色固体，真空干燥过夜，得到标题化合物(54 g，定量)。MS(m/z): 397(M+H)。

基本上利用制备方法46，制备下列化合物。

表9

另一个制备例46

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

将粗品湿润的4-[[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(800 g，理论数量1252 mmol)溶解在1,4-二噁烷(2l)中。用大约30分钟加入HCl(3.6 L，29.2 mol，水溶液，8 mol/L)，同时在15℃下冷却，而后加入DCM(1 L)。分离各层，并将酸溶液用DCM(2×500 mL)洗涤。在室温下，向水相中加入20% Na₂CO₃，达到pH9.5-10。加入DCM(1 L)，分离各层，并将水层用DCM(2×500 mL)提取。将合并的有机提取物用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，浓缩至干，得到黄色泡沫油，通过硅胶过滤来进行纯化，用己烷、DCM、EtOH(90:9:1至70:29:1)洗脱，得到标题化合物(219 g，53%，2步)的黄色泡沫状固体。MS(m/z): 397(M+H)。

制备例49

4-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸烯丙基酯二盐酸盐

反应路线2，步骤L，子步骤2∶

向压力容器中加入(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙胺盐酸盐(850 mg，4.12 mmol)、alloc-N-哌嗪(1.43 g，8.25 mmol)、K₂CO₃(1.71 g，12.4 mmol)和ACN(20.6 mL)。将得到的悬浮液封盖，并在60℃下加热24小时，而后浓缩。用硅胶色谱纯化粗品白色固体，使用0至10%的在MeOH/CH₂Cl₂中的7N NH₃-，提供目标产物和未反应的alloc-N-哌嗪的混合物。将该物质用反相色谱再次纯化(0至100%的ACN/10 mM NaHCO₃水溶液)，得到标题化合物的无色油(900 mg，71%)。MS(m/z): 171(M+H)。

基本上利用制备方法49，制备下列化合物。

表10

制备例52

1-异丁基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线2，步骤N，子步骤1：

将4-[[4-[(1S)-1-[(1-异丁基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]-苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸烯丙基酯(1.15 g，2.26 mmol)溶于THF(22.6 mL)中。顺序加入双甲酮(3.27 g，22.6 mmol)和Pd(PPh₃)₄₍131 mg，0.113 mmol，5 mol%)，并将该混合物在室温下搅拌30分钟。使该反应混合物通过用MeOH预洗的SCX柱。用MeOH洗脱不希望有的试剂，用2N NH₃/MeOH洗脱目标产物。将氨化的洗脱液浓缩，得到标题化合物的白色固体(980mg，定量)。

制备例53

3-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯基]甲氧基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯

反应路线2，步骤L，子步骤2∶

在室温下，将3-羟基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(4.19 g，23.7 mmol)溶于DMA(23.7mL)中，并加入NaH(1.4 g，35.6 mmol，60 wt%)。搅拌3分钟之后，加入(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙胺盐酸盐(2.44 g，11.9 mmol)(在最低量的DMA中)，并将该反应搅拌1小时。将该混合物用半饱和盐水稀释，并用EtOAc(3×)提取。合并有机提取物，干燥(MgSO₄)，过滤，浓缩，提供含有残余DMA的粗品黄色油。产物不用进一步纯化(假设100%产率)继续使用。MS(m/z):307(M+H)。

制备例54

7-[[(1S)-1-[4-(氮杂环丁烷-3-基氧基甲基)苯基]乙基]氨基]-1-乙基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线2，步骤N，子步骤1∶

将3-[[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲氧基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(1.85 g，3.83 mmol)溶于CH₂Cl₂(29 mL)中，在0℃，加入TFA(2.89 mL，38.3 mmol)，并搅拌6小时，同时终止冷浴，达到室温。真空除去溶剂和酸，得到标题化合物的浅黄色油(3.66 g，99%)。MS(m/z): 384(M+H)。

基本上利用制备方法54，制备下列化合物。

表11

制备例72

7-[[(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙基]氨基]-1-异丁基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线3，步骤Q∶

将SOCl₂(2.1 mL，4.2 mmol)用注射器加入到K₂CO₃(776 mg，5.61 mmol)和7-[[(1S)-1-[4-(羟甲基)苯基]乙基]氨基]-1-异丁基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(500 mg，1.40 mmol)的CH₂Cl₂(14 mL)悬浮液中。5小时之后，真空除去溶剂，提供粗品苄基氯与K₂CO₃的共同混合物(假设产率100%)。该混合物不用进一步纯化继续使用。MS(m/z): 375(M+H)。

基本上利用制备方法72，制备下列化合物。

表12

制备例75

6-[[4-[(1S)-1-[(1-异丁基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁基酯

反应路线3，步骤Q∶

将7-[[(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙基]氨基]-1-异丁基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(520 mg，1.4 mmol)、K₂CO₃(580 mg，4.2mmol)和2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁基酯草酸盐(550 mg，1.8 mmol)悬浮在ACN(7 mL)中，并加热至50℃，保持16小时，而后加热至70℃，保持2小时。加入碘化钠(210 mg，1.4 mmol)，并将该反应在70℃下加热2小时，而后回流3小时。将该混合物冷却至室温，并蒸发溶剂。将得到的残余物吸收在CH₂Cl₂中，并用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。用CH₂Cl₂(3×)提取水层。将合并的有机提取物用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩，提供粗品黄色固体。粗品不用进一步纯化，继续进入下一步(假设100%产率)。MS(m/z): 537(M+H)。

基本上利用制备方法75，制备下列化合物。

表13

制备例79

4-[4-[(1S)-1-[(1-异丙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯

反应路线3，步骤P∶

将7-[[(1S)-1-(4-溴苯基)乙基]氨基]-1-异丙基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(600 mg，1.53 mmol)、3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(400 mg，2.1 mmol)、CuBr(100 mg，0.70 mmol)、K₂CO₃(450 mg，3.2 mmol)和L-羟脯氨酸(500 mg，4 mmol)溶于DMSO(15 mL)中，并在80℃下加热过夜。将该反应混合物冷却至室温，倾倒在水中，提取到EtOAc中，并浓缩。色谱纯化粗品(50%的EtOAc/己烷)，得到标题化合物的褐色泡沫体(761 mg，46%)。MS(m/z): 497(M+H)。

基本上利用制备方法79，制备下列化合物。

表14

制备例81

3-乙炔基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯

将叠氮化钠(2.4 g，37 mmol)悬浮在ACN(14 mL)中，并用45秒钟加入甲磺酰氯(2.7mL，35 mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜，然后冷却至0℃，此时，用30秒钟加入(2-氧代丙基)膦酸二甲基酯(4.3 mL，31 mmol)，而后加入Cs₂CO₃(11 g，34 mmol)。将该混合物在0℃下搅拌30分钟，而后在室温下搅拌2.5小时。将该混合物再冷却至0℃，并加入MeOH(15.5 mL)。1小时之后，加入3-甲酰基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(3.0 g，16 mmol)，而后加入额外的Cs₂CO₃(9.1 g，28 mmol)，25分钟以后，除去冰-水浴，并将该反应搅拌过夜。真空除去溶剂，得到橙色油，用硅胶色谱纯化，使用50%的MTBE/己烷。获得标题化合物的浅黄色油(2.68 g，93%)。MS(m/z): 181(M+H)。

制备例82

3-[2-[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]乙炔基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯

反应路线3，步骤P∶

向7-[[(1S)-1-(4-溴苯基)乙基]氨基]-1-乙基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(1.8 g，4.77 mmol)和TEA(9.98 mL，71.6 mmol)的THF(24 mL)溶液中鼓入氮气5分钟。加入四(三苯基膦)钯(0)(455 mg，0.382 mmol，8 mol%)和CuI(18 mg，0.095 mmol，2 mol%)，并继续脱气5分钟。加入3-乙炔基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(1.26 g，6.68 mmol)，并重复脱气20秒钟。将该反应加热至60℃，搅拌～24小时，而后除去加热，并继续搅拌24小时。用水稀释该混合物，用CH₂Cl₂(3×)提取，干燥(MgSO₄)，过滤，浓缩，得到粗品，用硅胶色谱纯化，用25-85%的EtOAc/己烷洗脱，得到黄色泡沫体(1.14 g，50%)。MS(m/z): 478(M+H)。

制备例83

3-[2-[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]乙基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯

反应路线3，步骤P∶

在氢气氛围中，将3-[2-[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]乙炔基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(1.14 g，2.39 mmol)和Pd/CaCO₃(1.67 mg，10 wt% Pd，0.157 mmol)在THF(24 mL)中搅拌17小时。用硅藻土过滤该反应混合物，并将固体用热的EtOAc/MeOH洗涤。对粗品进行硅胶层析，用25-100%的EtOAc/己烷洗脱，得到标题产物的浅黄色泡沫体(890 mg，77%)。MS(m/z): 482(M+H)。

制备例84

N-[(1S)-1-(4-羟基苯基)乙基]氨基甲酸苄基酯

反应路线4∶

在0℃，将氯甲酸苄基酯(3.20 mL，20.6 mmol)逐滴加入到(S)-4-(1-氨基乙基)苯酚(2.75 g，19.6 mmol)和NaHCO₃(2.06 g，24.6 mmol)的混合物(在THF(20 mL)和水(20 mL)的混合物中)中。30分钟之后，除去冰水浴，并将该反应混合物在室温下搅拌72小时。用EtOAc稀释该混合物，并分离有机相，用0.1N HCl水溶液和盐水洗涤。干燥(Na₂SO₄)有机相，过滤，浓缩，并将得到的粗品用硅胶纯化(0至50%的EtOAc/己烷)，得到标题产物的白色固体(3.84 g，71%)。MS(m/z): 272(M+H)。

制备例85

3-[[4-[(1S)-1-(苄氧羰基氨基)乙基]苯氧基]-甲基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯

反应路线4，步骤R∶

在0℃，用15分钟将DIAD(980 mL，5 mmol)逐滴加入到3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(750 mg，4 mmol)、PPh₃(1.3 g，5 mmol)和N-[(1S)-1-(4-羟基苯基)乙基]氨基甲酸苄基酯(1.4 g，1.25 mmol)的THF(16 mL)溶液中。加入完成之后，除去冰-水浴，并将该反应在室温下搅拌4.5小时。然后，用EtOAc稀释该反应，用水、0.5N NaOH水溶液和盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并浓缩。用硅胶纯化产物，用0至50%的EtOAc/己烷洗脱，得到被24%起始苯酚污染的产物。对该混合物重复上述方案，得到目标产物的油(1.12 g，64%)。MS(m/z):341(M-BOC+H), 463(M+Na)。

制备例86

3-[[4-[(1S)-1-氨基乙基]苯氧基]甲基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯

反应路线4，步骤M，子步骤1∶

在氢气氛围(138 kPa)中，将3-[[4-[(1S)-1-(苄氧羰基氨基)乙基]苯氧基]-甲基]氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁基酯(1.12 g，2.54 mmol)和10% Pd/C(335 mg，0.315 mmol)在EtOH(60 mL)中搅拌45分钟。过滤该反应混合物，浓缩，提供油，其不用进一步纯化继续使用(假设产率100%)。MS(m/z): 290(M-NH₂)。

制备例87

3-[[4-[(1S)-1-[(1-乙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯氧基]甲基]-2,5-二氢吡咯-1-甲酸叔丁基酯

反应路线3，步骤P∶

在密封管中，将1-乙基-7-[[(1S)-1-(4-羟基苯基)乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(0.330 g，1.05 mmol)、3-(氯甲基)-2,5-二氢吡咯-1-甲酸叔丁基酯(200 mg，0.9 mmol)和K₂CO₃(400 mg，3 mmol)的丙酮(7 mL)溶液在60℃下加热16小时，而后在室温下搅拌72小时。将该溶液用水稀释，并用DCM提取两次。将合并的有机层干燥(Na₂SO₄)，过滤，并真空浓缩。用反相色谱纯化粗品(0至100%，CH₃CN/水)，得到标题化合物的橙色固体(250mg，0.504 mmol，48%)。MS(m/z): 496(M+H)。

制备例88

6-[[4-[(1S)-1-[(1-异丙基-2-氧代-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-7-基)氨基]乙基]苯基]甲基]-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁基酯

反应路线3，步骤P∶

将DIPEA(0.75 mL，4.3 mmol)加入到7-[[(1S)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙基]氨基]-1-异丙基-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(1 g，2.8 mmol)和2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁基酯(820 mg，4.1 mmol)的DMSO(14 mL)溶液中，并将得到的混合物在50℃下加热16小时，而后在室温下搅拌72小时。将该混合物倾倒在水中，用EtOAc提取，干燥(MgSO₄)，过滤，并浓缩。用硅胶纯化粗品(5-7%，MeOH/CH₂Cl₂中的7N NH₃)，得到标题化合物(978 mg，68%)。MS(m/z): 523(M+H)。

实施例1

1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线2，步骤N∶

在-75℃，用15分钟向1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮盐酸盐(59.6 g，113 mmol)和TEA(47.5 mL，341 mmol)的CH₂Cl₂(1.13 L)溶液中加入丙烯酰氯(11.1 mL，在80 mL CH₂Cl₂中，136 mmol)。在加入期间，使反应温度保持低于-70℃。30分钟之后，用饱和NaHCO₃水溶液(100 mL)淬灭该反应，并将该混合物升温至环境温度。加入水(200 mL)，并将该混合物用CH₂Cl₂(3×)提取，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩，得到黄色泡沫体。用硅胶色谱纯化粗品(6至10%[10% MeOH/CH₂Cl₂]/EtOAc)，得到标题产物的白色泡沫体(42.5 g，81%)。MS(m/z): 465(M+H)。

实施例2

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮

反应路线2，步骤N∶

在-75℃，用15分钟向1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮盐酸盐(53.6 g，124 mmol)和TEA(52 mL，373 mmol)的CH₂Cl₂(1.2 L)溶液中加入丙烯酰氯(12.1 mL，在80 mL CH₂Cl₂中，149 mmol)。在加入期间，使反应温度保持低于-70℃。1小时之后，用饱和NaHCO₃水溶液(100 mL)淬灭该反应，随后将该混合物升温至环境温度。加入水(200 mL)，并将该混合物用CH₂Cl₂(3×)提取，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并浓缩，得到黄色泡沫体。用硅胶色谱纯化粗品(6至10%[10% MeOH/CH₂Cl₂]/EtOAc)，得到标题产物的浅黄色泡沫体(30.2 g，54%)。MS(m/z): 451(M+H)。

基本上利用实施例2的方法，制备下列实施例。

表15

实施例23

1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮4-羟基苯甲酸盐

向1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(376 g，758.6 mmol)的DCM(6700 mL)溶液中加入TEA(116 mL，832 mmol)。将该混合物冷却至-70℃以下。在低于-68℃的温度下，用2小时加入丙烯酰氯(64.8 mL，796mmol)的DCM(750 mL)溶液。加入之后，将该反应在-68℃以下搅拌15分钟。加入水(1500ml)，并将该溶液升温至室温。分离各层。将有机层用水(2×1 L)、50%饱和NaHCO₃(1 L)和盐水(1L)洗涤，并用Na₂SO₄干燥。将此溶液加入到4-羟基苯甲酸(115 g，832.61 mmol)的CPME(1800mL)溶液中。将得到的浑浊混合物加热至35-40℃，得到黄色溶液，通过硅藻土过滤，并用DCM和CPME的混合物(1:1)洗涤。将滤液和洗液合并，并浓缩至¼体积。将得到的浆液与庚烷(2×1 L)共同蒸发，过滤，用庚烷洗涤，在氮气氛围中真空干燥过夜，得到标题化合物(382.7 g，81%)。MS(m/z): 451(M+H)。将粗品1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-鎓-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；4-羟基苯甲酸酯(624 g，1060 mmol)悬浮在丙酮(9.4 L)和庚烷(9.4 L)的预先混合的溶剂中，并将该浆液在室温下搅拌5小时。滤出固体，并用1:1的庚烷/丙酮(3×500 mL)洗涤。蒸发滤液和洗液。向残余物中加入庚烷(2 L)，过滤，并将收集的固体在50℃下真空干燥，得到标题化合物的浅黄色固体(357 g，55%)。

另一个制备实施例23

晶体1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮4-羟基苯甲酸盐

在60℃，在氮气氛围中，向1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(28.5 g，63.3 mmol)的CPME(430mL)溶液中加入溶于CPME(115 mL)中的4-羟基苯甲酸(8.74 g，63.3 mmol)。在300 rpm下、在60℃搅拌几分钟之后，将搅拌减速至50 rpm，并将样品搅拌2小时。此时，温度升至45℃，并将样品在200 rpm下搅拌4小时。然后，将样品调到室温。刮擦烧瓶壁，除掉固体，过滤收集固体，并空气干燥，得到第一批产物。将滤液在真空下减少至大约一半体积，在冰浴中冷却，同时搅拌，得到更多的固体。收集该固体，并加入到第一批固体中。将产物在70℃、在真空烘箱中干燥过夜，得到标题化合物(33.4 g，56.7 mmol，89.7%)。MS(m/z): 451(M+H)。

X射线粉末衍射(XRD)

在配备有CuKa源(λ= 1.54060 Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪(在35 kV和50 mA下操作)上获得结晶固体的XRD图。在4和40°(2θ)之间扫描样品，步长为0.009°(2θ)，扫描速率为0.5秒/步长，散射0.6 mm， 5.28固定的防散射，检测器狭缝为9.5 mm。将干粉填装到石英样品座上，并使用载玻片获得光滑表面。在环境温度和相对湿度下收集结晶形式的衍射图。结晶学领域众所周知的是，对于任何给定的结晶形式，衍射峰的相对强度可能由于例如晶体形态和特性等因素引起的优先取向而改变。如果存在优先取向的效果，峰强度改变，但多晶型物的特征峰位置没有变化。参见，例如， The United StatesPharmacopeia #23, National Formulary #18, 1843-1844页, 1995。此外，结晶学领域还众所周知的是，对于任何得到的结晶形态，有角度的峰位置可能轻微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度变化、样品替换、或存在或不存在内标，峰位置可能移动。在本发明的情况下，±0.2(2θ)的峰位置变化性将会考虑到这些可能的变化，不会妨碍明确鉴别所指明的结晶形式。基于特征峰(单位°2θ)的任何独特组合，典型地是更突出的峰，可以确定结晶形式。基于NIST 675标准峰(在8.853和26.774度2θ)，调节在环境温度和相对湿度下收集的结晶形式的衍射图。

制备的实施例23的样品的特征在于：使用CuKa辐射，XRD图具有下面表16所述的衍射峰(2θ（2-theta）值)，尤其是在16.8处具有峰，与一个或多个选自15.8、13.9和13.4的峰组合；衍射角的容许误差为0.2度。

表16∶晶体实施例23的XRD峰

实施例24

晶体1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮二(2,5-二羟基苯甲酸)盐

在1000 rpm搅拌下，在48℃，向1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(3.94 g，8.73 mmol)的EtOH(7mL)溶液中加入溶于EtOH(8 mL)中的2,5-二羟基苯甲酸(350 mg，17.8 mmol)，得到暗黄色溶液。将样品冷却至环境温度，将搅拌减至300 rpm。真空过滤分离，得到白色固体。将管瓶用EtOH(10 mL)冲洗，加入到滤饼中。在氮气吹扫下，将滤饼原位干燥10分钟，然后在环境温度下、在真空烘箱中干燥过夜(6.34 g，8.35 mmol，95.62%)。MS(m/z): 451(M+H)。

制备的实施例24的样品的特征在于：使用CuKa辐射，XRD图具有下面表17所述的衍射峰（2θ值），尤其是在24.7处具有峰，与一个或多个选自17.0、24.0和19.8的峰组合；衍射角的容许误差为0.2度。

表17∶实施例24的XRD峰

实施例25

晶体1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮二(糖精)盐

在1000 rpm下搅拌，在70℃，向1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮(955 mg，2.12 mmol)的EtOH(3mL)溶液中加入EtOH(7 mL)中的糖精(862 mg，4.66 mmol)，得到白色不透明浆液。形成白色胶质，进一步加入EtOH(10 mL)。将样品搅拌30分钟，使胶质转化为白色固体的浆液。将样品调到室温，并通过真空过滤，分离白色固体(1.61 g，1.97 mmol，93.0%)。

制备的实施例25的样品的特征在于：使用CuKa辐射，XRD图具有下面表18所述的衍射峰(2θ值)，尤其是在19.1处具有峰，与一个或多个选自22.0、16.8和23.7的峰组合；衍射角的容许误差为0.2度。

表18∶实施例25的XRD峰

癌症越来越多地被认为是疾病的异质性累积，它的起始和发展是由一或多种在细胞和组织微环境中调节DNA修复、基因稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵入和转移病变的基因的功能异常引起的。“癌症”基因的变异或异常的功能可以起因于天然存在的DNA多态性、基因组复制数的变化(通过扩增、消除、染色体丧失或复制)、基因和染色体结构的变化(通过染色体易位、反转或导致基因表达失调的其它重排)和点突变。癌性肿瘤可以由一种异常基因功能引起，并且被相同的异常基因功能所保持，或由其它异常基因功能保持和加剧发展。

除了上述遗传性染色体畸变以外，每种癌症还可以包括基因组的后天修饰，包括DNA甲基化、基因组印记和通过乙酰化、甲基化或磷酸化对组蛋白修饰。后天修饰可以在恶性肿瘤的诱导和/或保持中起一定作用。

已经汇编了人类癌症中的细胞遗传畸变的大量目录，并且在线保持和经常更新(参见The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the USNational Cancer Institute(NCI)Cancer Genome Anatomy Project(CGAP)Web site)。Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project保持了所有与肿瘤生成有关的人类基因的详细在线的“癌症基因统计（Cancer Gene Census）”，以及人类癌症中的体细胞突变的COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库。包含大量与各种癌症有关的细胞遗传变化的信息的其它渠道，是Atlas of Genetics and Cytogeneticsin Oncology and Haematology。

已知和通常使用活检、免疫(球蛋白)分型及其它试验来诊断癌性恶性肿瘤。除了高分辨染色体显带和先进的染色体成像技术之外，可以通过细胞遗传分析来确定所怀疑的癌症病例中的染色体畸变，例如，原位杂交荧光(FISH)、核型分析、光谱核型分析(SKY)、复合FISH(M-FISH)、对比基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性阵列(SNP Chips)及本领域技术人员已知和使用的其它诊断和分析试验。

已经在多种癌性肿瘤类型中鉴定了IDH1的突变，包括但不限于：神经胶质瘤、多形性恶性胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、副神经节瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(AML)，Dang等人，Trends Mol. Med.，2010，16∶387-397；Ward等人，Oncogene，2012，31(19)∶2491-2498；黑素瘤，Shibata等人，Am. J. Pathol.，2010，178(3)∶1395-1402；***，Flaherty等人，J. Clin. Oncol.，2014，32(suppl.4；Abstract 213)；Cairns等人，Cancer Discovery，2013，3∶730-741；软骨肉瘤和胆管细胞癌，Balss等人，Acta Neuropathol.，2012，124∶883-891；Cairns等人，Cancer Discovery，2013，3∶730-741；血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)，Cairns等人，Blood，2012. 119(8)∶1901-1903。在下列活性位点的具体残基上或附近已经发现突变：IDH1的G97D、R100、R132H、R132C、R132S、R132V、R132G、V71I、R132L和G123R，Dang等人，Trends Mol. Med.，2010，16∶387-397；Ward等人，2012和辅助表2。

已经表明，IDH1的突变形式具有使α-酮戊二酸还原为2-羟基戊二酸的新生活性(获得功能)。2-羟基戊二酸的内原性产生是对映体专一的，结果产生D-对映异构体(还称为(R)对映异构体)。通常，细胞具有低水平的2-羟基戊二酸，而证据表明，隐藏IDH1突变的细胞显著地升高2-羟基戊二酸的水平。在隐藏突变的肿瘤和带有突变体IDH1的患者的血浆中，检测到显著升高水平的2-羟基戊二酸。高水平的2-羟基戊二酸与过甲基化表型有关，导致分化受到阻碍，增加了肿瘤生成。

特定不可逆的共价抑制剂的活性是通过它与靶向(IDH1)的结合确定的，用K_I定义，且共价键形成的最大潜在速率，用K_inact定义。这两个因素不是分离的要素，而是合作产生共价键形成的预期效果。这可以由下列3点来说明。

首先，亲电试剂（例如，丙烯酰胺），相对于亲核试剂（例如，半胱氨酸），位置必须适当，在有机化学中是共价键形成的基本成分。亲核试剂接近亲电试剂时，必须具有精确的角度和距离，以便形成共价键。亲电试剂简单地接近亲核试剂，不足以形成共价键。

第二，当为了使抑制剂与酶的结合稳定而在包含氢键部分的核上结合反应性基团时，例如，定位核心（orienting core），技术人员必须考虑如何使定位核心与靶向结合，以及根据上述最佳角度和距离，相对于亲核试剂如何安置亲电试剂。此外，亲电试剂简单地接近亲核试剂，不足以形成共价键。定位核心的变化可以影响抑制剂化合物形成共价键的能力。

第三，当一起考虑上述两点时，在定位核心上仅仅存在亲电试剂部分不足以表明会形成共价键。

下列体外和体内研究证明了所试验的式I化合物针对各种具体癌细胞系列的突变体IDH1蛋白抑制活性和效果。这些试验是本领域技术人员通常公认的表明人类临床治疗活性的试验。在公开的研究中，认为抑制突变体IDH1新生蛋白能够有效抵御其它突变体IDH1新生蛋白。证明突变体IDH1抑制活性和效果的试验可以如下充分地进行，或通过得到类似数据的类似试验来进行。

下列试验的结果表明，举例说明和试验的化合物用作IDH1突变体抑制剂，并且可以用于治疗表达突变体IDH1的癌症。

IDH1和IDH2突变体酶的生化试验

IDH1-R132H、IDH1-R132C、IDH2-R172K和IDH2-R140Q突变体酶催化αKG转化为2HG。使用在线固相提取和质谱，分析2HG。利用与6460三重四极质谱仪(G6460A Agilent)连接的RapidFire®仪器，进行这种分析。

使包含N端His标签的IDH1突变体(R132H和R132C)和IDH2突变体(R140Q和R172K)蛋白在大肠杆菌(E. coli)中表达，并使用镍亲和色谱纯化。在包含100mM Tris-HCl缓冲剂、1mM DTT、0.005% TRITON^TMX-100、120mM NaCl的V底96孔聚丙烯板中，进行酶检测。对于IDH1 R132H，包括α-酮戊二酸、NADPH和MnCl₂，最后浓度分别为300µM、2.5µM和300µM。对于IDH1 R132C，包括α-酮戊二酸、NADPH和MnCl₂，最后浓度分别为100µM、10µM和100µM。对于IDH2 R172K，包括α-酮戊二酸、NADPH和MnCl₂，最后浓度分别为150µM、10µM和150µM。对于IDH2 R140Q，包括α-酮戊二酸、NADPH和MnCl₂，最后浓度分别为3000µM、10µM和100µM。最终pH值=7.0。将溶于DMSO储备溶液中的试验化合物在反应混合物中稀释，最终DMSO浓度为4%。以剂量-响应形式检验化合物。通过加入酶，使试验开始。使用下列最终浓度的酶∶IDH1R132H，2 nM；IDH1 R132C，0.5 nM；IDH2 R172K，1.2 nM；IDH2 R140Q，1.2 nM。90分钟之后，加入含有作为质谱分析和定量反应产物的内标的3-羟基-1,5-戊二酸-2,2,3,4,4-d₅酸(5d_5-3HG)的ACN(50:50)，淬灭该反应。使用强阴离子交换柱色谱(Phenomenex Strata-X-ASecurityGuard)，将淬灭的样品中的2-羟基戊二酸(2HG)分离，利用6460三重四极质谱仪(G6460A Agilent)，进行质谱分析。使用标准曲线(使用已知的2HG浓度形成)，将检测的2HG信号转变成分析物浓度。对于检验的每个化合物，使用DMSO对照样品作为0%抑制，没有酶的对照物作为100%抑制，计算%抑制。使用4参数方程，由各种化合物浓度的各个%抑制值获得IC₅₀值。使用Activity Base(IDBS)或Screener(Genedata)数据分析程序，进行这些计算。

该试验的结果表明，举例说明和检验的化合物，针对IHD1/R132H和IDH1/R132C，能够抑制突变体IDH1活性。

基本上如上所述，检验下列实施例，显示出针对突变体IDH1的活性，如下面表19所示，并且相对于突变体IDH2，对于突变体IDH1具有选择性。

表19

平均值+平均标准偏差。

野生型IDH1和IDH2酶的生化试验

IDH1和IDH2酶催化异柠檬酸转化为αKG。

使含有N端His标签的野生型IDH1(National Center for BiotechnologyInformation，Accession∶NP_001269316.1)和IDH2(National Center for BiotechnologyInformation，Accession∶EAX02082.1)蛋白在大肠杆菌(E. coli)中表达，并使用镍亲和色谱纯化。在包含100mM Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)、1mM DTT、0.005% TRITON^TM X-100、120mMNaCl的V形底96孔聚丙烯板中，进行酶测定。对于IDH1野生型试验，包括异柠檬酸、NADP⁺和MnCl₂，浓度分别为85µM、50µM和20µM。对于IDH2野生型试验，包括异柠檬酸、NADP⁺和MnCl₂，浓度分别为30µM、50µM和10µM。将溶于DMSO储备溶液中的抑制剂在反应混合物中稀释，最终DMSO浓度为4%。加入含有作为质谱分析内标的d6-2-酮基戊二酸(d6-αKG)的ACN(50:50)，停止(淬灭)酶试验。将十微升反应混合物与100µL水、50µL 1M的O-苄基羟胺(在吡啶缓冲剂中(8.6%吡啶，pH5))和50µL 1M的N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(在吡啶缓冲剂中)混合。在室温下衍生化一小时之后，用600µL的EtOAc提取样品。取出400µL上层，在加热下、在氮气氛围中干燥，并与100µL的MeOH/水(1:1)重构。将10µL衍生化的样品注入到由Shimadzu Prominence 20A HPLC***和The Thermo Quantum Ultra™三重四极质谱仪组成的LC-MS***上。在Waters XBridge™ C18柱(2.1 x 50 mm，3.5µm)上分离分析物，流速：0.6 mL/分钟。流动相A是0.1%甲酸/水，流动相B是MeOH。使用标准曲线(使用已知的αKG浓度形成)，将检测的αKG信号转变成分析物浓度。对于检验的每个化合物，使用DMSO对照样品作为0%抑制，没有酶的对照物作为100%抑制，计算%抑制。使用4参数方程，由各种化合物浓度的各个%抑制值获得IC₅₀值。使用Activity Base(IDBS)或Screener(Genedata)数据分析程序，进行这些计算。

该试验的结果表明，相比于IDH1 R132H或R132C突变体酶，举例说明和检验的化合物抑制IDH1野生型酶的活性较差。

基本上如上所述，检验下列表20中的实施例，相比于IDH1 R132H或R132C突变体酶，抑制IDH1野生型酶的活性较差。

IDH1野生型和IDH2野生型酶活性

表20

平均值+平均标准偏差。

IDH1(R132H)生化跳跃（Jump）稀释试验

用100% DMSO，将冷冻干燥的实施例化合物重构为10 mM或100 mM，并保持在室温，直到进行试验。利用本领域技术人员众所周知的和通常使用的方法，表达和纯化IDH1(R132H)-His蛋白。试验试剂包括下列试剂∶α-酮戊二酸(Sigma Cat# K1875)，MnCl₂-FisherScientific Cat# M87-100，NADPH-Sigma-Aldrich Cat# N7505，Tris-HCl(Invitrogen，Cat#15567-027)，NaCl(Sigma，S3014)，二硫苏糖醇(Sigma，D5545)和TritonX100(Peirce，28314)。NAD(P)H-Glo™试剂盒得自于Promega(G9061)。

自始至终所使用的试验缓冲剂包括：100 mM Tris-HCl(pH7.0)、120 mM NaCl、1mM DTT、0.005% Triton X-100和2% DMSO(从加入试验化合物开始)。在试验缓冲剂中，使用1.5 nM IDH1(R132H)、1 mM α-酮戊二酸、1mM MnCl₂和15µM NADPH，培养化合物的剂量响应(在Echo555上制备)，测定每个化合物的IC₅₀值。将该反应在室温下培养2小时，然后使用6-环丙基-5-(异喹啉-5-基)-2-[(3R)-4-(3-甲氧基丙酰基)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶-3-甲腈(10µM)，使反应停止。使用NAD(P)H-Glo™试剂盒，按照供应商的说明，测定NADPH浓度。在Envision(Perkin Elmer；0.1 sec/Luminescense Mirror/Lum700 WL400-700过滤器)上，读出荧光信号。在随后的跳跃稀释实验中，将相当于10×IC₅₀值的浓度的化合物预先用100nM IDH1(R132H)培养。化合物的浓度始终大于或等于酶浓度。在室温下2小时之后，将该混合物稀释(1:100)到含有α-酮戊二酸(10 mM)、MnCl₂(10 mM)和NADPH(15µM)的溶液中。这个最终的酶反应含有1 nM IDH1(R132H)和0.1×[IC₅₀]。在室温下培养2小时之后，按照上面的说明，使用6-环丙基-5-(异喹啉-5-基)-2-[(3R)-4-(3-甲氧基丙酰基)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶-3-甲腈和NAD(P)H-Glo™试剂盒，测定NADPH浓度。三个对照物包括∶1)在预培养和酶测定中，含有10×IC₅₀化合物的“10×对照物”，只不过在最后的测定酶活性的试验中，使用1mM α-酮戊二酸、1mM MnCl₂和15µM NADPH，2)在预培养和酶测定中，含有DMSO来代替化合物的“最大活性对照物”，3)在预培养中，含有DMSO来代替化合物的“0.1×对照物”，和在酶测定中，含有0.1×IC₅₀的化合物。包括缺少酶的“最小活性对照物”，但换句话说等于“最大活性对照物”。使用1 mM α-酮戊二酸、1mM MnCl₂和15µM NADPH，进行第二组最大和最小活性对照。一式三份地检验每个试验条件，对于最大活性对照(10 mM)和最小活性对照(10 mM)，进行32个平行测定，而对于最大活性对照(1 mM)和最小活性对照(1 mM)，进行16个平行测定。

相对于含有15µM的NADPH的最小活性对照，使用所观察到的信号的百分比降低，测定每个实验/对照产生的NADP(产物)的浓度。将最小活性对照(1 mM和10 mM)和最大活性对照(1 mM和10 mM)平均，分别计算标准偏差。将每个跳跃稀释物和0.1×对照的信号乘以15，然后除以最小活性对照(10 mM)孔的平均数。从15中减去这个数值，计算NADP(µM产物)。相同的计算用于10×对照，但使用最小活性对照(1 mM)。平均数乘以15，然后除以相应的最小活性对照(1 mM和10 mM)，由此计算最大活性对照(1 mM和10 mM)的产物的µmoles。每个孔的µM NADP除以平均最大活性对照(1 mM或10 mM)，然后乘以100，以确定化合物的跳跃稀释物、10×对照和0.1×对照的% IDH活性。对于10×对照，合格化合物必须显示<30%的活性，表明预先培养浓度足以用化合物使酶饱和。另外，对于0.1×对照，化合物必须显示>70-80%的活性，证明在0.1×/稀释的化合物浓度下，没有抑制。

基本上如上所述，检验实施例化合物，并且在该试验中，显示出IDH1/R132H的%恢复数据。与稀释之后2小时不抑制酶的、具有%恢复的化合物相反，举例说明和检验的本发明化合物在稀释之后2小时抑制酶。该试验的数据显示，检验的本发明化合物按照与共价抑制突变体IDH1一致的方式起作用，这是由于抑制剂的稀释不会引起酶活性的恢复。

IDH1突变体抑制剂的基于细胞的试验

为了检验IDH1突变体R132C的细胞抑制，使用纤维肉瘤细胞系HT1080(购买于ATCC)。为了检验R132H突变的基于细胞的抑制情况，用表达R132H突变体酶的DNA结构稳定地转染U87MG神经胶质瘤细胞系(ATCC)。

HT1080细胞试验∶

在用化合物处理之前18-24小时，将一万五千个细胞涂覆在聚D-lys涂渍的96孔板中(15,000个细胞/孔)。在化合物处理之前四个小时，除去正常培养基，并用不含谷氨酰胺的培养基代替，由此使细胞处于谷氨酰胺饥饿状态。饥饿之后，用各种浓度的试验化合物(20µM至1nM)处理细胞，所述试验化合物溶于不含谷氨酰胺、含有最后浓度为0.2%的DMSO的培养基中。将最初的化合物在37℃/5% CO₂条件下培养1小时。1小时之后，加入谷氨酰胺，最终浓度为2 mM，然后将处理的细胞在37℃/5% CO₂条件下进一步培养18小时。培养18小时之后，分析细胞溶解产物中的胞内2HG和αKG。除去培养基并向细胞中加入含有25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1 mM EGTA/1% Triton-X 100的缓冲剂之后，制备溶解产物。将等分的溶解产物加入到d₆-αKG和d₅-3HG的混合物中，作为内标，并在N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和吡啶的存在下，用O-苄基羟胺处理。然后，用EtOAc提取分析衍生物，干燥，而后用50% MeOH/水重构。使用反相色谱(C18柱)，将所述制备的样品注入到HPLC中，分离2HG和αKG衍生物(和相应的内标)。使用6460三重四极质谱仪(G6460AAgilent)，进行样品分析。使用标准曲线外推的αKG/d₆-αKG的比例和2HG/d₅-3HG的比例，将检测的2HG和αKG信号转变成分析物浓度。将计算的2HG或αKG浓度相对于最大和最小参比(在用化合物处理细胞期间，在存在谷氨酰胺和没有谷氨酰胺的情况下获得)归一化之后，获得每个单一样品的抑制百分数。使用S形的剂量-响应4参数方程，由各个%抑制获得IC₅₀值。使用Activity Base(IDBS)或Screener(Genedata)数据分析程序，自动进行这些计算。

该试验的结果表明，检验的表21中的实施例抑制2-羟基戊二酸的产生，这表示在该试验中，抑制细胞中的突变体IDH1 R132C。野生型IDH1产生的代谢物αKG，没有受到抑制剂的影响，这表明，在该试验中，在细胞中，相对于野生型IDH1，所述化合物对于突变体IDH1具有选择性。得到的下列实施例的IC₅₀值示于表21中。

表21

平均值+平均标准偏差。

U87MG/IDH1R132H细胞试验

在用化合物处理之前18-24小时，将细胞涂覆在聚D-lys涂渍的96孔板中(12,000个细胞/孔)。在化合物处理之前四个小时，除去正常培养基，并用不含谷氨酰胺的培养基代替，由此使细胞处于谷氨酰胺饥饿状态。饥饿之后，用各种浓度的试验化合物(20µM至1nM)处理细胞，所述试验化合物溶于不含谷氨酰胺、含有最后浓度为0.2%的DMSO的培养基中。将最初的化合物在37℃/5% CO₂条件下培养1小时。1小时之后，加入谷氨酰胺，最终浓度为2 mM，然后将处理的细胞在37℃/5% CO₂条件下进一步培养18小时。在除去培养基并用溶解缓冲剂(25mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1 mM EGTA/1% Triton-X 100)处理之后获得的细胞溶解产物中，分析胞内2HG。在-80℃下保存细胞溶解产物，直到处理为止。为了提取分析物，将等分的解冻的溶解产物转入深的96孔板中，并用冷的含有d₅-3HG的MeOH(作为内标)处理，而后用氯仿和水(1:4:3:2)处理。分离之后，收集上面的物相，注入到HPLC中，使用与MS/MS检测连接的亲水相互作用(HILIC)色谱，在6460三重四极质谱仪中，分离2HG(和内标)。将计算的2HG浓度相对于最大和最小参比(在用化合物处理细胞期间，在存在谷氨酰胺和没有谷氨酰胺的情况下获得)归一化之后，获得每个单一样品的抑制百分数。使用S形的剂量-响应4参数方程，由各个%抑制获得IC₅₀值。使用Activity Base(IDBS)或Screener(Genedata)数据分析程序，自动进行这些计算。

基本上如上所述，检验下列实施例，并且在该试验中，在U87MG细胞中，针对突变体IDH1/R132H显示出抑制活性，如下面表22所示。

表22

平均值+平均标准偏差。

体内2-羟基戊二酸试验

为了体内检验IDH1抑制剂，在植入HT1080细胞(携带R132C突变体IDH1的纤维肉瘤)或TB08细胞(携带R132H突变体IDH1的继发性恶性胶质瘤)之后，使皮下异种移植肿瘤生长在无胸腺的裸鼠(20-22g，Harlan Laboratories)中。使小鼠不限量地摄取食物和水，并且在植入细胞之前，适应新环境1周。将肿瘤细胞(HT1080)或肿瘤片段(TB08)植入到右后肋中。对于HT1080，植入5.0 x 10⁶个细胞，所述细胞在与基质胶的1:1混合物中，最终体积0.2ml。对于TB08，将外植肿瘤样品产生的肿瘤片段直接植入到后肋中。每周用卡钳测定肿瘤体积两次，并使用0.536×L×W²计算肿瘤体积，其中，L=长度，和W=宽度。当肿瘤体积达到150-400 mm³时，将动物随机放入各个组中(每个组：n=3-6个)，并给予IDH1抑制剂或赋形剂对照物。对于IDH1抑制剂，将化合物配制在含有1%羟乙基纤维素/0.25% Tween 80/0.05%消泡剂或10%***胶(含有1.1 mol当量的HCl)的赋形剂中。将化合物浴超声处理，获得悬浮液。以毫克每千克(mpk)为基础，通过口服填喂法给予化合物，最终体积为0.2ml。为了测定2HG的抑制，每天给予化合物两次(BID)，给予3天(剂量总数=6)。化合物处理之后，用异氟烷麻醉和颈部脱位方法，使小鼠安乐死。切除肿瘤，放进贴标签的管中，并立即在液氮中冷冻。将肿瘤保存在-80℃下，用于处理。

制备肿瘤溶解产物

在分子等级的水中，制备XY Lite缓冲剂，并且含有下列组分∶25mM Tris，pH7.5，150mMNaCl，1% Triton X-100，1mM EDTA，1 mM EGTA。向XY Lite(40 ml)中加入800µl的Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Halt^TM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，不含EDTA，ThermoScientific，Cat# 78441)。将样品旋转，而后在冰上冷却。将橙色盖的A溶解管贴上标签，并放到位于冰上的管架上。将陶钵和研棒放在干冰中，冷却。将2×2英寸正方形的铝箔放置在研钵的底部。将肿瘤样品转入预先冷却的研钵中的正方形箔片上。加入液氮(大约5 ml)，蒸发，使肿瘤超冷冻。将另一片箔片放置在肿瘤上，并用陶瓷研棒将肿瘤破碎成小块。将破碎的肿瘤快速转入溶解管中。将冰冷的XY Lite(500µL)加入到每个管中，并封盖。然后，在FastPrep-24MP Biomedicals上，旋转两次(35秒钟)，处理肿瘤，速度设定于5。然后，在Beckman Microfuge R中，在4℃，在14,000 rpm下，将样品离心30分钟。将上清液转入预先冷却的96孔深孔板中。弃置小粒。

蛋白试验

首先，将XY缓冲剂(145µl)加入到非无菌的96孔圆底Corning板中，形成蛋白试验稀释板。向其中加入肿瘤溶解产物(5µL)，并轻轻地混合。将板保持在冰上。BSA标准物(ThermoScientific cat. 23209，2 mg/mL)的系列稀释方案如下∶将五个0.5mL管放置在管架上，并将XY缓冲剂(60µL)加入到每个管中。将储备溶液BSA(60µl)加入到第一个管中，并旋转。从第一个管中取出60µl转入下一个管中，旋转，等等，直到稀释系列如下完成为止：管1=储备溶液BSA，管2-5是1:2系列稀释物，管6=单独的XY缓冲剂。按照生产商的说明书，将ThermoBCA蛋白试验试剂混合。将混合的BCA试剂(200µl)加入到每个样品中，并培养15分钟。在SOFTmax Pro板读数器上，读出蛋白试验结果。基于蛋白试验结果，将合适数量的XY缓冲剂加入到每个肿瘤溶解产物中，形成5mg/mL的最终蛋白浓度。将所有的样品贴标签，并在-80℃下保存。

肿瘤溶解产物的代谢物分析

通过肿瘤异种移植的液相色谱-质谱(LC-MS)分析，测定IDH1抑制对于全部2HG和αKG的浓度的体内影响。在LC-MS分析之前，该方法使用O-苄基羟胺衍生化。将十微升的各个肿瘤溶解产物放入深孔的96孔板中，并与含有10µM d₅-3HG和10µM d₆-αKG的内标溶液混合。将50µL的1M O-苄基羟胺(在吡啶缓冲剂中，8.6%吡啶，pH5)和50µL的1M N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(在吡啶缓冲剂中)加入到每个样品中。将衍生化反应在室温下进行一个小时。使用Beckman Biomek FX液体处理器，将600µL的EtOAc加入到每个样品中。将板密封，旋转5分钟，然后在4000 rpm下，在Eppendorf 5810R离心机上离心5分钟。将400µL上层转入新的96孔板中。将样品在加热下、在氮气氛围中、在50℃下干燥，并用100µL的MeOH/水(1:1)重构。将一微升的衍生化样品注入到由Shimadzu Prominence 20A HPLC***和Thermo Quantum Ultra™三重四极质谱仪组成的LC-MS***上。在Water XBridge™C18柱(2.1 x 50 mm，3.5µm)上分离分析物，流速：0.6 mL/分钟。流动相A是0.1%甲酸/水，流动相B是MeOH。梯度分布是∶0分钟，5% B；3分钟，100% B；4.00分钟，100% B；4.1分钟，5% B；5.50分钟，停止。质谱仪使用HESI-II探头，在阳离子选择的反应监控方式下运行。通过绘制出分析物浓度相对于分析物/内标峰面积比的图，建立标准曲线，并利用Xcalibur™软件，使用1/浓度重量，进行数据的二次拟合。由标准曲线来反演计算未知的分析物浓度。LCMS试验的代谢物数据用nmol/mg蛋白表示。赋形剂处理组中的平均2HG水平用于测定0%抑制对照物。然后，相对于赋形剂对照物，测定每个抑制剂处理的动物的%抑制。利用JMP软件分析数据，测定每个给药组的平均%抑制、标准偏差和标准误差。

证明示范化合物和测试化合物在IDH1突变体异种移植小鼠中体内抑制2-羟基戊二酸的数据示于下面表23中。

表23

Claims

1.下式的化合物∶

其中

L是连接基，选自-N-氮杂环丁烷-3-CH₂-O-、-N-氮杂环丁烷-3-O-(CH₂)-、-N-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-6-(CH₂)-、-N-哌嗪-4-(CH₂)-、-N-哌嗪-、-N-氮杂环丁烷-3-(CH₂CH₂)-、-7-N-(2,7-二氮杂螺[3.5]壬烷)-2-(CH₂)、-N-氮杂环丁烷-3-(NMe)CH₂-、-N-哌啶-4-(NMe)CH₂-、N-2,5-二氢吡咯-3-(CH₂)-O-；

Z选自H或F；

R选自C₁-C₄烷基、-CH(CH₃)CH₂-OH、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂；

或其可药用盐。

2.权利要求1的化合物，其中∶

L是连接基，选自-N-哌嗪-4-(CH₂)-、-N-哌嗪-、-N-氮杂环丁烷-3-(NMe)CH₂-、-N-氮杂环丁烷-3-CH₂-O-、-N-氮杂环丁烷-3-O-(CH₂)-、-N-氮杂环丁烷-3-(CH₂CH₂)-和-N-哌啶-4-(NMe)CH₂-；

Z是H；

R是C₁-C₄烷基；

或其可药用盐。

3.权利要求1或2的化合物，其中∶

L是连接基，选自-N-哌嗪-4-(CH₂)-、-N-哌嗪-、-N-氮杂环丁烷-3-(NMe)CH₂-、-N-氮杂环丁烷-3-O-(CH₂)-、-N-氮杂环丁烷-3-(CH₂CH₂)-和-N-哌啶-4-(NMe)CH₂-；

Z是H；

R选自CH₂CH₃、CH(CH₃)₂；

或其可药用盐。

4.权利要求1至3的任一项的化合物，其是1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐。

5.权利要求1至3的任一项的化合物，其是1-乙基-7-[[(1S)-1-[4-[(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐。

6.权利要求1至3的任一项的化合物，其是∶

1-异丙基-7-[[(1S)-1-[4-[(1-丙-2-烯酰基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基]-苯基]乙基]氨基]-4H-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮，或其可药用盐；或

7.包含按照权利要求1至6的任一项的化合物或其可药用盐和可药用载体的药物组合物。

8.治疗患者的表达突变体IDH1的癌症的方法，所述癌症是：神经胶质瘤、恶性胶质瘤、多形性恶性胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病、黑素瘤、***癌、软骨肉瘤或胆管癌，所述方法包括：给予需要其的患者治疗有效量的权利要求1至6的任一项的化合物，或其可药用盐。

9.权利要求8的方法，其中所述表达突变体IDH1的癌症是神经胶质瘤、恶性胶质瘤、急性髓性白血病或纤维肉瘤。

10.权利要求1至6的任一项的化合物或其可药用盐，用于治疗。

11.权利要求1至6的任一项的式I化合物，或其可药用盐，用于治疗表达突变体IDH1的癌症，所述癌症是：神经胶质瘤、恶性胶质瘤、多形性恶性胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病、黑素瘤、***癌、软骨肉瘤或胆管癌。

12.权利要求11的用途，其中所述表达突变体IDH1的癌症是神经胶质瘤、恶性胶质瘤、急性髓性白血病或纤维肉瘤。

13.权利要求1的化合物，或其可药用盐，用于制备药物的用途，所述药物用于治疗表达突变体IDH1的癌症，所述癌症是：神经胶质瘤、恶性胶质瘤、多形性恶性胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病、黑素瘤、***癌、软骨肉瘤或胆管癌。

14.权利要求13的用途，其中所述药物用于治疗表达突变体IDH1的癌症，所述癌症是神经胶质瘤、恶性胶质瘤、急性髓性白血病或纤维肉瘤。