CN107829145A - 一种构建小鼠TCRalphaCDR3区文库的方法 - Google Patents
一种构建小鼠TCRalphaCDR3区文库的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种构建小鼠TCR alpha CDR3区测序文库的方法,主要步骤包括:(1)提取鼠组织或全血总RNA。(2)逆转录RNA为cDNA,将接头序列连接到长链cDNA末端,通过通用C端引物和接头序列引物扩增包含CDR3区的TCR alpha。(3)通过Tn5转座酶打断TCR alpha并富集CDR3区序列。(4)通过illumina高通量测序平台进行测序。本方法适用于含有各类T细胞的组织,体液等样本的建库;采用5’RACE技术,可高效的无偏差的对小鼠TCR alpha进行扩增,克服了多重PCR扩增所引起的模板拷贝数和扩增效率难以控制,产物发生偏移等问题;利用Tn5酶能将DNA打断和接头连接同步完成的功能和使用特异性的引物可对TCR alpha的高度可变区(CDR3区)进行快速准确的富集建库,使测序更有针对性,方便数据分析,节约测序成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种高效无偏差构建小鼠TCR alpha 的CDR3区高通量测序文库的所需的引物和文库制备方法。
背景技术
淋巴细胞通过其表面抗体识别特异性抗原来发挥免疫功能。其对抗原识别的特异性体现在克隆水平,即同一克隆的淋巴细胞能识别具有相同的抗原受体,识别同一抗原表位。T细胞抗原受体(TCR)是T细胞特异识别和结合抗原肽-MHC 分子的结构,T细胞受体是异源二聚体,由两个不同的亚基所构成。95%的T细胞的受体由α亚基和β亚基构成,另外5%的受体由γ亚基和δ亚基构成,其比例会因为个体发育或疾病而变化。
TRA是编码TCR alpha的基因座,其包含可变段(V)、连接段(J)和恒定区(C)3个基因,而V,J,C又分为若干等位基因,T细胞发育过程中TRA基因座内发生基因重组,为TCRalpha的多样性提供了分子基础,另外通过在基因重组位点附近的碱基的随机***和缺失等机制,最终产生了多样性的TCR,以满足机体识别多种多样的抗原的需要。
TCR的C区靠近细胞膜,连接跨膜区和胞内的末端,而V区负责识别多肽/MHC 复合体。每个亚基的可变区都包含三个高度易变的互补决定区 (complementaritydetermining regions,CDR),最重要的CDR3负责直接与MHC所呈递的多肽结合,而且序列高度可变,故TCR的多样性主要由CDR3决定。随着高通量技术的发展,对整个T细胞群体TCR的CDR3区进行大规模平行测序已成为可能,通过对TCR alpha的CDR3区进行测序,可以评价免疫组库中TCR alpha的多样性等参数,进一步可以分析免疫***的应答发生机制及过程。
鉴于传统的扩增CDR3区需要多重PCR进行扩增,存在扩增过程中模板拷贝数和扩增效率难以控制,产物发生偏移,不能反应样本初始TCR分布等问题;同时,多种引物扩增会增加错配及相互干扰,导致扩增背景高,可重复性差等问题,最终导致测序结果不能真实反映样本情况。本发明采用5’RACE技术可较好避免建库过程中的扩增偏移,可无偏差的对小鼠TCR alpha库。利用Tn5酶能将DNA打断和接头连接同步完成的功能和使用特异性的引物可对TCR alpha的高度可变区 (CDR3区)进行快速富集建库,实现了对样本中T细胞受体库的准确检测,通过标签序列,可增加测序样本数,减少测序成本,可应用各类含T细胞的组织样本的T细胞受体库分析,对了解免疫机制和揭示疾病发生发展机制有重要意义。
发明内容
本发明的目的是建立一种高效无偏差的构建小鼠TCR alpha的CDR3区高通量测序文库的方法。
基于高通量测序的5’RACE结合Tn5转座酶技术构建鼠TCR alpha CDR3区文库的方法按如下步骤进行:
1)提取鼠组织或全血总RNA。
2)以步骤1)提取的RNA为模板,以SEQ ID NO.1为引物逆转录合成cDNA,在逆转录酶作用下将SEQ ID NO.4连接至cDNA的3’端。
3)采用半巢式PCR特异性扩增TCR alpha片段:使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5进行第一轮PCR;使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5进行第二轮PCR;其中SEQ ID NO.5作为通用引物,SEQ ID NO.3为在TCR alpha的C端序列,并带有测序接头。
4)使用磁珠纯化第二轮PCR产物;使用Tn5建库试剂盒进行DNA打断,使用SEQ IDNO.6与SEQ ID NO.7进行测序接头连接,建库,质控。
5)文库用于illumina高通量测序平台测序。
序列表
其中,上表SEQ ID NO.4的序列中rG代表单脱氧鸟嘌呤(riboguanosine),+G 代表锁核苷酸修饰的鸟嘌呤(LNA)。
有益效果:
本发明涉及一种基于高通量测序的5’RACE结合Tn5转座酶技术构建鼠 TCR alphaCDR3区文库的方法。本发明公布了通过5’RACE技术高效的,无偏差的扩增小鼠TCR alpha的全长序列,利用Tn5酶进行快速打断富集CDR3区的建库所需的引物和文库制备方法,实现了对样本中T细胞受体库的准确检测,可应用各类含T细胞的组织样本的T细胞受体库分析,对了解免疫机制和揭示疾病发生发展机制有重要意义。
附图说明:
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1 TCR alpha文库图;
图2 TCR alpha文库测序统计结果图。
具体实施方式
实施例
下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述:
基于高通量测序的5’RACE结合Tn5转座酶技术构建鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,包括以下步骤:
步骤1提取鼠组织中的总RNA
使用Trizol法(Roche,Tripure Isolation Reagent)提取鼠组织/全血中总RNA的提取方法,包括如下步骤:匀浆组织/全血加入Trizol后吹打,室温静置5min,直接提取RNA或放入-80℃冰箱冻存,加入200ul氯仿/ml Trizol,颠倒混匀30s,室温放置3min。4℃,12000g离心15min。尽可能吸取上层水相至另一EP管,注意不要吸到中间层。按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇,颠倒混匀,室温放置10min。4℃,12000g离心10min。按1ml75%乙醇/ml Trizol加入体积比为 75%的乙醇,温和震荡,悬浮沉淀。4℃,8000g离心5min。吸去上清。室温晾干5-10min。用合适体积的无RNase水溶解RNA。
将所提取的RNA利用nanodrop one超微量紫外分光光度计测定浓度,检测结果显示,OD260/280在1.8-2.0之间。将所提取的RNA利用琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性。检测结果显示,28S和18S条带明显,5S条带不明显,28S/18S 在2.0左右。
上述检测结果表明1所提取的RNA质量满足建库要求,能够用于后续建库。 2逆转录和模板转换:
将步骤1获得的总RNA样本使用SmartScribe Reverse Transcriptase进行逆转录逆,具体如下体系:总RNA 0.2-2ng,浓度为10uM的逆转录引物 C1(5’-CATGTCCAGCACAGTTTTGTCAGT-3’,(SEQ ID NO.1))1ul,加入无RNase 水至12ul,短暂离心,PCR仪中72度孵育3min,迅速冰上5min。再加入5X first strand buffer 4ul,dNTPs 2ul,DTT 0.5ul,RNA Inhibitor 0.5ul,SmartScribe Reverse Transcriptase 2ul,浓度为10uM的 TSO(5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCrGrG+G-3’,(SEQ ID NO.4))1ul,加水至20ul,短暂离心,PCR仪中42℃孵育90min,70℃10min,4℃保持。
3第一轮PCR反应:
利用步骤2所得到的的产物使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X;KAPABiosystems,KK2601)进行巢式PCR的第一轮PCR扩增,按如下体系准备1st PCR体系: 2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5ul,浓度为1uM的SP(5’ -ACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’,(SEQ ID NO.5))0.5ul,浓度为10uM的C2(5’ -GCACATTGATTTGGGAGTC-3’,(SEQ IDNO.2))0.5ul,cDNA 1ul,补水至25ul, PCR反应条件为:98℃预变性3mi n;98℃变性20s,67℃退火15s,72℃延伸6mi n,循环15次;72℃延伸5mi n。
4第二轮PCR反应:
利用步骤3所得到的的产物使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X;KAPABiosystems,KK2601)进行巢式PCR的第二轮PCR扩增,按如下体系准备2nd PCR体系:2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix 25ul,浓度为10uM的SP(5’- ACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’,(SEQ ID NO.5))2ul,浓度为10uM的C3(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTAACTGGTACACAGCAGGT-3’,(SEQ ID NO.3))2ul,第一轮PCR产物2ul,补水至50ul,PCR反应条件为:98℃预变性3min; 98℃变性20s,67℃退火15s,72℃延伸6min,循环20次;72℃延伸5min。
5 Tn5酶建库:
上述步骤4PCR反应结束后,使用AMPure XP magnetic beads进行DNA纯化,具体步骤如下:将磁珠从冰箱拿出,恢复至室温。配制新鲜的体积比为80%的乙醇。吸取50ulbeads加入到50ul 2nd PCR产物中,混合均匀,室温孵育5min。置于磁力架上至液体变澄清(约2min),用移液器吸除上清。将200ul新制备的 80%乙醇加入到样本中,磁力架上30s,吸除上清。重复上一步。磁力架上风干约10min,将EP管从磁力架上取下,加入30ul水洗脱磁珠上的DNA,室温2min。将EP管从磁力架上至液体变澄清(约2min),吸取上清至另一EP管即得纯化的PCR产物。
将纯化后的PCR产物使用TruePrep DNA Library PrepKit V2for Illumina的Tn5酶进行建库,使用Qubit 2.0荧光计对DNA进行定量,取1ng产物进行Tn5转座酶建库。具体操作按试剂盒说明书进行:室温解冻5×TTBL,上下颠倒混匀后备用;确认5×TS是否处于室温,并轻弹管壁确认有无沉淀;如有沉淀,37℃加热并涡旋振荡充分混匀,沉淀即可溶解。在PCR管中配制如下反应体系:5× TTBL 4ul,1ng DNA,TTE Mix V1 5ul,补水至20ul,轻轻吹打20次至充分混匀。放置在PCR仪中,55度10min;10度,保持。反应完成后立即向产物中加入5ul 5x TS,轻轻吹打充分,室温5min。在上述体系中加入以下成分:5×TAB10ul,PPM5ul,TAE 1ul,浓度为10uM的IP5
(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[ACGTCCTG]TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’,(SEQ ID NO.6))5ul,浓度为10uM的 IP7
(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[TCGCCTTA]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’,(SEQ ID NO.7))5ul,总体积50ul。反应条件为:105℃,热盖;72℃,3min;98℃,30s;98℃,15s,60℃,30s,72℃, 3min,10-15循环;72℃,5min;4℃,保持。
其中[ACGTCCTG]和[TCGCCTTA]为标签序列,包括但不局限于illumia的测序标签序列,[]内的序列可以为任意经验证的能区分不同样本的8bp的短序列。
上述PCR反应结束后,利用VAHTS DNA Clean Beads进行文库片段选择纯化,具体步骤如下:将VAHTS DNA Clean Beads平衡至室温并充分涡旋。配制新鲜的体积比为80%的乙醇。取30ul磁珠加入到50ulPCR产物中,充分混匀,室温静置5min。置于磁力架上至液体变澄清(约5min)。用移液器吸取上清至另一EP管,加入7.5ul磁珠并充分混匀,室温静置5min。置于磁力架上至液体变澄清(约5min),吸除上清。将200ul新制备的80%乙醇加入到样本中,磁力架上 30s,吸除上清。重复步骤5.6。磁力架上风干约10min,将EP管从磁力架上取下,加入20ul水洗脱磁珠上的DNA,室温2min。将EP管从磁力架上至液体变澄清(约 2min),吸取上清至另一EP管,-20度保存。
文库纯化结束后,利用安捷伦2100生物芯片分析***检测文库的纯度和大小,检测结果如图1所示:片段分布在300bp-550bp之间,平均长度400bp,***片段平均长度280bp。将所得的文库通过illumina Nextseq 500平台进行测序,通过生物信息学分析高通量测序结果。
以上是实施例仅用于说明本发明的描述而非限定,基于本发明思想的形式上和细节上做出的各种改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:
(1)提取小鼠组织或全血总RNA;
(2)以RNA为模板,SEQ ID NO.1为引物逆转录合成cDNA,在逆转录酶作用下将SEQ IDNO.4连接至cDNA的3’端;
(3)采用半巢式PCR特异性扩增TCR alpha片段:使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5进行第一轮PCR;使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5进行第二轮PCR;其中SEQ ID NO.5作为通用引物,SEQ ID NO.3为在TCR alpha的C端序列,并带有测序接头;
(4)使用磁珠纯化第二轮PCR产物;使用Tn5建库试剂盒进行DNA打断,使用SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7进行测序接头连接,建库;
(5)文库用于illumina高通量测序平台测序。
2.根据权利要求1所述一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:步骤(1)所述样本为含有T细胞的新鲜或冰冻组织和全血样本。
3.根据权利要求1所述一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:步骤(2)所使用的逆转录酶为SmartScribe Reverse Transcriptase,Maxima H Minus ReverseTranscriptase、Superscript IIreverse transcriptase或Superscript III reversetranscriptase的一种;SEQ ID NO.1为TCR alpha的C端特异性逆转录引物;SEQ ID NO.4为一种用于高效快速扩增cDNA 5’末端的锚定引物TSO,包括一段接头序列和5’末端的3个鸟嘌呤,其中前2个鸟嘌呤为单脱氧鸟嘌呤,第3个鸟嘌呤为锁核苷酸修饰鸟嘌呤,接头序列来源于illumina平台的序列片段,逆转录条件:42℃,90min;70℃,10min。
4.根据权利要求1所述一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:步骤(3)所使用的引物SEQ ID NO.2为在第一轮PCR产物3’端内部设计的引物,SEQ ID NO.5作为通用接头,序列与SEQ ID NO.4的接头序列一致。
5.根据权利要求1所述一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:步骤(4)所使用的磁珠为贝克曼Agencourt AMPure XP磁珠,产物与磁珠体积比例在0.8-1:1;使用体积比80%乙醇洗涤杂质。
6.根据权利要求1所述一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:步骤(4)中使用的Tn5酶建库试剂盒为诺唯赞TruePrep DNA Library PrepKit V2 forIllumina,其中DNA片段化时间为:105℃,热盖;55℃,10min;10℃,立刻取出终止反应。接头连接使用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物,反应条件为:105℃,热盖;72℃,3min;98℃,30s;98℃,15s,60℃,30s,72℃,3min,10-15循环;72℃,5min;4℃,保持;产物纯化使用VAHTS DNA Clean Beads,采用2次磁珠纯化,文库片段分布在300bp-550bp之间,平均长度400bp,覆盖TCR alpha的CDR3区。
7.根据权利要求1所述一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:所述测序接头是用于illumina测序平台的测序接头,标签序列为能区分不同样本的8个bp长度的短序列。
8.根据权利要求1所述构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法,其特征在于:步骤(5)中使用的illumina测序平台包括Hiseq4000,X-10,Nextseq500平台。
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