与猪达100公斤体重日龄相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域,特别是涉及与猪达100公斤体重日龄相关的分子标记,具体地,涉及与猪达100公斤体重日龄相关的SNP分子标记、其应用以及该分子标记在育种中的应用。
背景技术
我国是一个养猪大国,猪肉产量和质量的市场需求日益增加,提高猪肉产量、改善猪肉胴体质量,成为育种科学家长期以来不断探索的工作。早期的育种工作主要集中于猪的表型选择,随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发,分子选择正逐渐成为可靠而有效的选择方法。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记是第三代分子标记,是指在基因组DNA序列上有单个碱基的突变而产生的一种多态性,这种突变包括单碱基的颠换、转换、***和缺失。SNP具有量大、高频率、低突变率等优点,广泛应用于基因组分析、生物信息自动化检测、简单和复杂疾病的遗传研究、畜牧育种标记及全球种族遗传学等研究。分子标记辅助选择育种,是在分子水平上对目标性状进行选择,可以不受环境影响,通过遗传背景选择,减少连锁累赘,从而加速育种过程及精准度。
全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)是畜禽经济性状遗传改良和机理解析的重要方法。随着二代测序技术的发展,全基因组重测序和简化基因组测序技术成为高通量SNP分型的有力工具,GBS(Genotyping-by-sequencing)是简化基因组测序的经典代表,是一种高效的全基因组SNP分型方法,可以从群体中直接鉴定SNP并进行分型,能以较低的成本获得几万到几十万不等的SNP分型信息,已被广泛应用于动植物的分子标记开发、群体遗传分析、全基因组关联分析以及基因组选择育种等研究中(DeDonato et al.,2013;Elshire et al.,2011;He et al.,2014)。
猪达100kg体重日龄直接与猪的生长性能相关,因此,研究猪的达100kg体重日龄,在育种中具有重要的研究意义。利用优化的GBS技术对猪群体进行GWAS研究,有助于快速找到影响猪达100kg体重日龄的有意义的分子标记,为猪的标记辅助选择育种提供有利的理论依据。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供与猪达100公斤体重日龄相关的SNP分子标记。
本发明的第二个目的是提供该SNP分子标记的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
测定并记录3702头杜洛克猪的重要经济性状,利用优化的GBS技术对杜洛克猪体进行GWAS研究,得到了一个与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP分子标记,该SNP分子标记位于基因组版本Ensembl Sscrofa 10.2的chr1:177334696位点。统计该SNP位点在重测序的地方猪种(金华猪、五指山猪、陆川猪、梅山猪、巴马香猪、荣昌猪、莱芜猪、二花脸猪、河套猪和民猪)与商品猪种(杜洛克猪、约克夏猪和杜长大猪)中的SNP频率,发现其SNP频率分布在地方猪种和商品猪种中存在显著差异,商品猪中G为优势等位基因,地方猪中A为优势等位基因。
具体地,所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第101位碱基。
由此,得到了一种与猪达100公斤体重日龄相关的SNP标记,在生长速度慢的群体中,通过选择与商品猪种同等位基因G的个体,可以提高群体的生长速度。
进一步地,本发明提供了所述SNP分子标记在猪的标记辅助选择育种中的应用。
所述应用具体体现为一种利用所述SNP分子标记对猪进行辅助育种的方法,可包括以下步骤:
(1)检测样品猪在所述SNP分子标记的基因型;
(2)选择具有优势等位基因基因型的样品猪进行优势品系的选育。
作为优选,选择基因型为G/G的猪进行选育。
其中,所述优势品系主要表现为生长速度快。
进一步地,所述步骤(1)可采用直接测序,或先扩增含所述SNP位点的片段再检测的方式进行,例如,设计引物,从SEQ ID No.1所示的序列中扩增出含有所述SNP分子标记的片段,再检测该位点上的等位基因。
本发明还提供了所述SNP分子标记在鉴定生长速度快的猪种中的应用。
另一方面,用于扩增含有本发明所述SNP位点片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对的作用为:从SEQ ID No.1所示的序列中扩增出含有所述SNP位点的片段。
本发明的有益效果在于:通过优化的GBS技术对3702头具有重要经济性能记录的杜洛克猪群体进行GWAS研究,通过对GWAS结果的分析得到一个与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP(chr1:177334696)位点,对这个位点在中国地方猪种及商品猪种中进行SNP频率分析,发现其SNP频率分布在地方猪种和商品猪种中存在显著差异,商品猪中G为优势等位基因,地方猪中A为优势等位基因。商品猪生长速度要高于地方猪种,说明这个SNP位点可作为分子标记应用于优良猪种的选育。在生长速度慢的群体中,通过选择与商品猪种同等位基因G的个体,可以提高群体的生长速。本发明通过检测SNP分子标记能够早期、快速、低成本、有效的预测猪生长速度,在猪种改良方面具有广阔的应用前景,并能够取得优异的经济价值。
附图说明
图1为猪达100kg体重日龄GWAS结果的曼哈顿图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
实施例1猪经济性状全基因组关联分析
1.试验材料
以杜洛克猪纯种群体为研究对象,收集2007年8月至2016年1月出生的33,960头个体(12,987头公猪和20,973头母猪)的生产性能记录用于本研究。达100kg体重日龄(Age to100kg live weight,AGE)按照猪场内部规范进行。
2.试验方法
2.1 100kg体重日龄:当猪只体重达到30±5kg时,即空料准备始测(始测前一天下午清理料槽剩料至当天早上),空料12小时后用称重仪称取猪只的体重,记为体重;经过2-3个月的饲养,当猪只体重达到100±5kg时,开始进行终测;终测前一天下午开始停料,空料10小时后称取猪只的体重,记为终测体重;根据始测和终测时的体重和日龄,计算达100kg日龄。由于校正公式对终测体重有一定要求,因此后续数据处理时,将终测体重<75kg或>140kg的个体记录设定为缺失值。
2.2基于GBS技术的猪全基因组SNP分型方法
通过模拟酶切猪基因组,预测了36种常见的Ⅱ型限制性内切酶以及24种双酶切组合在猪基因组中的酶切效果;根据研究目的和群体特点,选择EcoRI-MspI双酶切组合用于猪的GBS建库,并对GBS实验和分析流程进行了优化,建立了基于GBS技术的猪全基因组SNP分型方法。通过对3757头杜洛克猪进行GBS测序,鉴定到的102,254个SNP覆盖了猪的整个基因组。
2.3全基因组关联分析
对杜洛克猪群体的达100kg体重日龄(AGE)进行了全基因组关联分析。
2.4 SNP质控
为了获得可靠的GWAS结果,采用以下条件进行质控:(1)MAF≥0.05;(2)HWE≥10E-6;(3)每个SNP的两种纯合子个体数均≥30。
2.5与经济性状显著相关的SNP位点
基因组水平显著位点的检测,采用独立标记数进行Bonferroni校正,独立标记数的计算使用PLINK indep-pairwise命令获得,得到Bonferroni基因组水平5%显著水平的p值为0.05/14,084=3.55×10-6,而潜在的关联的p值阈值为1.0/14,084=7.10×105。
根据该标准,得到一个与猪达100kg体重日龄达到Bonferroni校正的5%基因组水平显著的SNP位点(P<10-5.45)。
3.结果与分析
本发明以3702头杜洛克群***对象,利用优化的GBS测序获得的102,254个SNP对猪达100kg体重日龄进行了GWAS分析,确定了一个与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP(chr1:177334696)位点,如图1所示。
实施例2 SNP标记(chr1:177334696)在不同品种猪中的频率分布
1试验材料
地方猪种:6头莱芜猪,5头二花脸猪,6头河套猪,6头民猪,5头金华猪,6头五指山猪,6头陆川猪,14头梅山猪,9头荣昌猪和6头巴马香猪。商品猪种包括:16头杜洛克猪,8头约克夏猪和36头杜长大猪。
2试验方法
2.1基因组DNA的提取
采用QIAGEN公司的GIAamp DNA Mini试剂盒提取基因组DNA,具体操作步骤如下:
(1)向1.5ml的离心管中加入180μl的ATL缓冲液,再加入20μl蛋白酶K,混匀;
(2)取20mg左右的耳组织样品放入上述溶液中,55℃消化8h;
(3)向消化好的组织液中加入3μl的RNase A,37℃恒温水浴锅中放置30min,目的是降解组织溶液中的RNA;
(4)再向溶液中加入200μl AL溶液,旋涡振荡混匀后放入70℃水浴锅中消化10min;待离心管恢复至室温,加入200μl无水乙醇,再次涡旋震荡混匀;
(5)将上述溶液全部加入DNA吸附柱中,室温放置2min后,13000rpm离心1min;
(6)离心结束后,弃滤出液,并将吸附柱放进另一个新的2ml收集管中,加入500μlPW1溶液,13000rpm离心1min;
(7)离心结束后,再将吸附柱放进另一个新的2ml收集管中,加入500μl PW2溶液,13000rpm离心3min;
(8)倒掉收集管中的溶液,用纸巾擦净收集管管口的液体,再次将吸附柱放在收集管中,13000rpm离心2min;
(9)将DNA吸附柱的盖子打开,放入已编好号的1.5ml离心管中,室温放置2min,使管中残留的乙醇挥发完;
(10)向吸附柱的正中心加入120-150μl AE缓冲液,室温放置2min后,13000rpm离心1min,所得溶液即为基因组DNA。基因组DNA经过1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,用NanoDrop定量浓度;再将浓度统一稀释到50ng/μl,用于下一步实验。
2.2SNP(chr1:177334696)在各品种猪全基因组重测序数据中的频率分布
将各品种猪基因组DNA送测序,统计SNP(chr1:177334696)在以上地方猪种和商品猪种重测序数据中的频率分布。
3结果与分析
SNP(chr1:177334696)在不同地方猪种和商品猪种中的SNP频率分布结果如表1所示,在地方猪种和商品猪种中存在显著差异。商品猪中G为优势等位基因,地方猪中A为优势等位基因。
表1 SNP(chr1:177334696)在不同地方猪种和商品猪种中的SNP频率
由此,得到了一种与猪达100公斤体重日龄相关的SNP分子标记,在生长速度慢的群体中,通过选择基因组版本Ensembl Sscrofa 10.2的chr1:177334696等位基因G的个体进行育种,可以提高育种群体的生长速度。
虽然,上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做出一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 与猪达100公斤体重日龄相关的SNP分子标记及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgggaacct ccatatgccg caggtgcggc ccaaaaagga caaaaagaca gaaacaaaac 60
caaccaacaa aaaaacaatg cagtggacat ttgggtacat gaatctttgt taatatttat 120
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