CN107267627A - 与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪标记辅助选择(MAS)技术领域，公开了与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用。该分子标记选自(1)～(2)中的至少一种：(1)其DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示，在序列表SEQ ID NO：2所示序列的第11bp处有1个A11‑G11突变，导致HindII‑RFLP多态性；(2)其DNA序列如序列表SEQ ID NO：13所示，在序列表SEQ ID NO：13所示序列的第11bp处有1个(AC)n微卫星变异，n表示(AC)重复数。通过群体数据关联分析，启动子活性，以及基因表达分析，证实了两个分子标记与猪生产性状呈显著相关。本发明所建立的分子标记的制备方法和应用可用于猪相关生产性状的分子选育。

Description

与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用

技术领域

本发明属于猪标记辅助选择(MAS)技术领域，主要涉及到2种可用于猪生产性状标记辅助选择的分子标记的制备与应用。其中一个分子标记位于猪Six1基因第一内含子1595bp处的A/G变异位点上，而另外一个分子标记位于Six1基因启动子区(-1029bp—-1100区)的(AC)n微卫星变异位点上。

背景技术

我国是第一猪肉生产国，近年来猪肉产量每年保持在5.0千万吨以上，占整个肉类产量的63％左右，猪肉是我国人民肉类消费的主体。改革开放以来，我国本土产的猪肉远远不能满足国内市场的需求，为了解决猪肉消费市场供给不足的问题，我国引入了大量的西方瘦肉型猪种，并逐渐形成生产杜洛克×长白×大白三元杂交商品猪的生产模式。然而，随着西方猪种的大量引进，市场上频繁出现各种类型的劣质猪肉，主要表现在肉色发白、肉品发酸等。这些劣质肉的出现给消费市场带来巨大的经济损失，同时也严重影响食用时的口感。因此，利用遗传改良技术手段从源头对猪品种重要经济性状，特别是肉质性状进行遗传改良，从而生产出高品质的优质猪肉具有十分重要的意义。

过去的几十年来里，常规育种技术体系在中高遗传力性状的遗传改良上取得了长足的进展，如生长速度、饲料转化效率、胴体瘦肉率等，但对于低遗传力的肉质、繁殖等性状，利用常规育种技术体系进行遗传选育时，不仅成本高，所取得的遗传进展也非常缓慢。随着基因组学、分子生物学等领域的快速发展，分子育种技术体系的建立可为猪低遗传力性状的遗传改良提供新的有效途径。相对传统的常规育种技术，分子标记辅助选择具有许多明显的优势，它不受年龄，性别等的限制，可以进行早期选种，缩短世代间隔，提高选择的准确性，提高选择的强度，降低选育的成本，加快遗传改良的进度。目前，氟烷基因(RYR1)cDNA的1843位点，一磷酸腺苷激活蛋白激酶γ3亚基基因(PRKAG3)的第200个密码子位点均已成功应用于优质种猪的分子选育。尽管如此，目前可用于猪重要经济性状分子标记辅助选育的标记屈指可数，鉴定影响猪重要经济性状的主效基因，开发相应的分子标记应用于优质种猪的选育，对加快我国优质种猪的培育，提升我国种猪业在国际市场上的竞争力具有重要的促进作用。

Six1属于Six同源异型盒基因家族成员，是一个非常重要的发育调节因子，在肌肉生长发育，特别是肌纤维类型的转变中发挥着特别重要作用。骨骼肌组织是猪机体最主要的组成部分，可占猪胴体重的40％以上，其生长发育与猪生长速度有着紧密的联系。肌纤维作为肌肉组织的主要成分，其类型的差异是影响猪肌肉品质的重要因素之一，慢型纤维比例高的猪肉具有相对好的肉质特性。因此，Six1是一个影响猪生长与肉质性状的重要候选基因，其核苷酸序列中可能存在影响猪重要经济性状的有效分子标记。

发明内容

本发明的目的在于开发可应用于猪生产性状辅助选育的分子标记，简化生产性状遗传改良的过程，加速生产性状遗传改良进程。首先从猪骨骼肌发育关键基因Six1中鉴定出潜在的可影响猪生产性状的遗传变异位点，然后建立相应遗传变异位点的简便的分子标记检测方法，并对分子标记的应用效果在商业猪群中进行了验证，结果表明所开发的分子标记可应用于猪肉色、断奶重、胴体重与胸腰背膘厚中至少一种性状的分子标记辅助选育。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种与猪生产性状相关的分子标记，该分子标记选自(1)～(2)中的至少一种：

(1)其DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示，在序列表SEQ ID NO：2所示序列的第11bp处有1个A11-G11突变，导致HindII-RFLP多态性；

(2)其DNA序列如序列表SEQ ID NO：13所示，在序列表SEQ ID NO：13所示序列的第11bp处有1个(AC)n微卫星变异，n表示(AC)重复数。

上述的与猪生产性状相关的分子标记，其与所述分子标记(1)相关的猪生产性状为猪肉色；与所述分子标记(2)相关的猪生产性状为断奶重、胴体重与胸腰背膘厚性状。

本发明首先根据NCBI数据库中猪Six1基因全长mRNA序列(NM_001199718)翻译起始位点ATG位置，从GenBank数据库中从猪1号染色体核苷酸序列中下载Six1基因ATG前约2kb启动子序列SEQ ID NO：1。根据所下载的核苷酸序列设计10对目标区域扩增测序引物(F1/R1-F10/R10)(如表1)，进一步本发明利用所设计的10对引物通过二代测序技术对500头皮特兰×杜洛克×长白×大白(皮×杜×长×大)资源群，以及来源于7个不同猪种，包括大白、长白、二花脸、梅山、沙乌头、米猪与苏淮猪，共计144头个体中进行了目标区域测序。所获得的序列通过序列比对，最终在Six1基因核苷酸序列中共鉴定了12个遗传变异位点，分别位于第1内含子1595b处A/G变异与1648bp处A/G变异，其序列特征如SEQ ID NO：2，SEQID NO：3；+294bp处G/A变异，-136bp处C/T变异，-157bp处T/C变异，-379bp处A/G变异，-639bp处A/G变异，-1363bp处C/T变异，-1434bp处G/A变异，-1449bp处T/C变异，-1480bp处的AGA缺失变异，其序列特征如以SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12；以及-1030bp处的(AC)n微卫星变异，其序列特征如以SEQ ID NO：13。其中第1内含子1595b处A/G变异导致HindII-RFLP多态性，并对SEQ ID NO：1序列中Six1基因第1内含子1595b处A/G变异建立了利用限制性内切酶基因分型方法PCR-HindII-RFLP。根据测序及酶切所获得的遗传变异位点多态性基因分型结果，以及试验群体的相关性状记录，利用一般线性模型(GeneralLinear Model，GLM)对遗传变异位点多态性与猪重要经济性状进行关联分析，最终确定了2个可应用于猪生产性状选育的有效分子标记。依照本发明所发明的两种分子标记可以用于猪生产性状标记辅助选择中。

序列表SEQ ID NO：1是本发明从NCBI数据库中所下载的猪Six1基因基因组参考序列信息。

序列表SEQ ID NO：2是本发明鉴定的猪Six1基因第1内含子1595b处A/G变异上位点下游10bp序列特征(GAACAGGACA[A/G]TTGACTTGAT)。

序列表SEQ ID NO：3是本发明鉴定的猪Six1基因第1内含子1648bp处A/G变异位点上下游10bp序列特征(TCGTCCCCTG[A/G]TCATTTTCTT)。

序列表SEQ ID NO：4是本发明鉴定的猪Six1基因+294bp处G/A变异位点上下游10bp序列特征(CAGGCCCCA[G/A]CCATGTCGAT)。

序列表SEQ ID NO：5是本发明鉴定的猪Six1基因-136bp处C/T变异位点上下游10bp序列特征(GCTCCACAGC[C/T]TCGCCCTCCC)。

序列表SEQ ID NO：6是本发明鉴定的猪Six1基因-157bp处T/C变异位点上下游10bp序列特征(CACCACTCCC[T/C]ACCCGCCCCC)。

序列表SEQ ID NO：7是本发明鉴定的猪Six1基因-379bp处A/G变异位点上下游10bp序列特征(GACGGGGACA[A/G]GGGTACAGAG)。

序列表SEQ ID NO：8是本发明鉴定的猪Six1基因-639bp处A/G变异位点上下游10bp序列特征(TGAGAACATG[A/G]GAAGTACTCT)。

序列表SEQ ID NO：9是本发明鉴定的猪Six1基因-1363bp处C/T变异位点上下游10bp序列特征(TAATCAGAG[C/T]TAACTAGAGC)。

序列表SEQ ID NO：10是本发明鉴定的猪Six1基因-1434bp处G/A变异位点上下游10bp序列特征(CAGTCACTAA[G/A]AGGACACATT)。

序列表SEQ ID NO：11是本发明鉴定的猪Six1基因-1449bp处T/C变异位点上下游10bp序列特征(AGAGTTTGTT[T/C]CTCACAGTCA)。

序列表SEQ ID NO：12是本发明鉴定的猪Six1基因-1480bp处的AGA缺失变异位点上下游10bp序列特征(GCAGATTTAA[AGA/---]CAAGCAAGTT)。

序列表SEQ ID NO：13是本发明鉴定的猪Six1基因-1030bp处的(AC)n微卫星变异位点上下游10bp序列特征(ATTGCAATCT[ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC]TTCTTTATTT)。

表1目标区域测序引物及PCR-RFLP基因分型引物

用于检测上述的分子标记碱基突变的引物对，包括以下(1)～(3)中的至少一种：

(1)检测序列表SEQ ID NO：2中第11bp处A/G变异(即如SEQ ID NO：1所示的Six1基因第1内含子1595b处A/G变异)的正、反向扩增测序引物的DNA序列如下所示：

SEQ ID NO：2

正向引物(F10)：CTCTGGACACCACTTCCCATGAC(见表1)

反向引物(R10)：ACAAGCACGCATTTAGAAGTCACT(见表1)

(2)检测序列表SEQ ID NO：2序列中碱基突变的PCR-HindII-RFLP基因分型的正、反向引物的DNA测序序列如下所示：

SEQ ID NO：2

正向引物(F11)：CCGTCCGTCCTTTAAGTCAG(见表1)

反向引物(R11)：AGCACGCATTTAGAAGTCAC(见表1)

(3)检测序列表SEQ ID NO：13序列中(AC)n微卫星变异(即位于如SEQ ID NO：1所示的Six1基因启动子区(-1029bp—-1100区)的(AC)n微卫星变异)的正、反向扩增测序引物的DNA测序序列如下所示：

SEQ ID NO：13

正向引物(F3)：GGACATCTCTCATTCTCTGGCAGT(见表1)

反向引物(R3)：CCCTGGGAACTTCACACGAAAGG(见表1)

依照本发明，本发明所发明的SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：13序列中的2种分子标记可以用于猪标记辅助选择中。

一种与猪生产性状相关的分子标记的制备方法，为以下(Ⅰ)～(Ⅲ)中的至少一种：

(Ⅰ)采用所述的引物F10与R10PCR扩增包含SEQ ID NO：2序列的第11bp处有1个A11-G11突变的基因片段，然后采用测序技术进行基因分型；

(Ⅱ)采用所述的引物F11与R11PCR扩增包含SEQ ID NO：2序列的第11bp处有1个A11-G11突变的基因片段，然后利用HindII限制性内切酶在37℃条件下进行酶切基因分型；

(Ⅲ)采用所述的引物F3与R3PCR扩增包含SEQ ID NO：13序列(AC)n微卫星变异，然后采用测序技术进行基因分型。

上述的分子标记、引物对及制备方法在猪生产性状辅助选育中的应用。所述的猪生产性状为猪肉色、断奶重、胴体重与胸腰背膘厚中的只少一种性状。

本发明的有益效果是：

对于高遗传力的经济性状，传统的常规育种技术体系能够取得理想的选育效果，但对于低遗传力性状，特别是对于需要屠宰后测定的肉质性状，如肉色性状，利用常规育种技术体系进行选育时，存在成本高，遗传进展非常缓慢的缺点。本发明从猪Six1基因鉴定出了两个有效的分子标记位点，一个位于猪Six1基因第一内含子1595bp处的A/G变异位点上，另外一个分子标记位于Six1基因启动子区(-1029bp—-1100bp区)的(AC)n微卫星变异位点上，针对两个变异位点建立了3种方便可靠的多态性检测方法。目前，我们已对两个遗传变异位点的应用效果在500头规模的试验猪群中进行了验证，验证结果显示，本发明所鉴定的两个遗传变异位点及诊断方法可用于猪生产性状的早期、活体、快速的标记辅助选育。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是利用本发明中F3与R3引物扩增猪Six1基因第1内含子1595b处A/G变异DNA片段琼脂糖凝胶电泳检测图。图中：M：DNA分子量标准(DL500:500，400，300，200，150，100和50bp)；1与2泳道：329bp扩增产物。

图2：是本发明中猪Six1基因第1内含子1595b处A/G变异PCR-HindII-RFLP三种基因型电泳图谱。图中：M：DNA分子量标准(DL500:500，400，300，200，150，100和50bp)；1与2泳道：AG基因型；3与4泳道：GG基因型；5泳道：AA基因型。

图3：是本发明中在两种细胞系中对猪Six1基因启动子中(AC)n微卫星变异影响该基因启动子活性的双荧光素酶活性分析结果。图中：pGL3-Basic-(AC)₁₉与pGL3-Basic-(AC)₂₂分别代表启动序列中(AC)n微卫星长度分别为19与22个重复的情况，***表示P<0.001。

图4：是本发明中对猪Six1基因启动子中(AC)n不同基因个体的Six1基因表达水平检测结果。19/19，19/22与22/22分别代表启动序列中(AC)n微卫星长度分别为19个重复的纯合基因型个体、19与22个重复的杂合基因型个体，以及22个重复的纯合基因型个体，**表示P<0.01，ns表示差异不显著。

具体实施方式

实施例1:(制备实例)

1、猪Six1基因遗传变异位点鉴定

(1)参考序列下载与引物设计

从NCBI数据库中下载猪Six1基因组序列SEQ ID NO：1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，包括外显子、内含子，以及近端启动子序列，根据NCBI数据库中猪Six1基因全长mRNA序列(NM_001199718)确定转录与翻译起始位点，内含子外显子交接处，近端启动子起始位点等。根据所下载的核苷酸序列，利用引物设计软件设计10对扩增测序引物(如表1)。

(2)样本多重PCR反应

以来源于7个不同猪种，包括大白、长白、二花脸、梅山、沙乌头、米猪与苏淮猪，共计144头个体基因组DNA为模板，以优化后的多重PCR反应条件进行PCR扩增。

反应体系：反向体系为20uL，包括1×PCR buffer(Takara)，2mM Mg²⁺，0.2mM dNTP，0.1μM正反向引物/每对引物，1U HotStarTaq polymerase(Takara)，2μL DNA模板；

反应程序：95℃(2min)；94℃(20s)，63℃-0.5℃/per cycle(40s)，72℃(1min),11cycles；94℃(20s)，65℃(30s)，72℃(1min),24cycles；72℃(2min)。

(3)测序文库构建

将同一样本，不同片段PCR扩增产物进行等量混合，加上特异性标签序列完成文库构建(Illumina,San Diego,CA,USA)，然后利用Illumina Miseq测序仪的2×300bp测序模式对目的片段实现双向测序。

(4)遗传变异位点鉴定

对所获得测序数据采用GATK和Varscan软件进行遗传变异位点的检测，并对所鉴定的遗传变异位点进行注释，通过比对分析最终在Six1基因核苷酸序列中共鉴定了12个遗传变异位点。

2、猪Six1基因遗传变异位点遗传多样性分析

根据所鉴定的遗传变异位点信息，我们对所鉴定的12个单核苷酸遗传变异位点在7个不同猪种，包括大白、长白、二花脸、梅山、沙乌头、米猪与苏淮猪，共计144头个体中的遗传多样性进行了分析，如表2所示为12个单核苷酸遗传变异位点在7个不同猪种的基因型与等位基因频率分析结果。结果显示，位于猪Six1基因第一内含子1595bp处的A/G变异位点等位基因频率在中国地方猪种与国外瘦肉型猪种中存在明显的差异，国外瘦肉型猪种完全为C等位基因，等位基因频率为1，而中国地方猪种两种等位基因都存在，但T等位基因占绝对的优势，这也暗示着该遗传变异位点可能是影响中外猪种相关表型差异的重要位点，并具有潜在的分子标记应用的价值。

表2Six1基因单核苷酸遗传变异位点在不同猪种中的遗传多样性分析

对于Six1基因启动子区(-1029bp—-1100区)的(AC)n微卫星变异位点，在所检测的7个不同猪种中共检测到了9种等位基因，对应了15种基因型，其中国外瘦肉型猪种以(AC)₁₉与(AC)₂₂对应的(AC)_19/19，(AC)_19/22与(AC)_22/22三种基因开型为主，而中国地方猪种以(AC)₂₀与(AC)₂₂等位基因对应的(AC)_20/20，(AC)_20/22与(AC)_22/22三种基因开型为主(表3)。整体而言，基因型与等位基因频率在中国地方猪种与国外瘦肉型猪种中存在明显的差异，中国地方猪种的遗传多样性要比国外瘦肉型猪种丰富，这也暗示着该遗传变异位点可能是影响中外猪种相关表型差异的重要位点，并具有潜在的分子标记应用的价值。

表3猪Six1基因启动(CA)n微卫星位点在不同猪种中的遗传多样性分析

实施例2(应用实施例1)

1、分子标记诊断方法的建立

(1)SEQ ID NO：2序列变异位点PCR-RFLP诊断方法的建立

针对序列表SEQ ID NO：1中Six1基因第1内含子1595b处A/G变异(即序列表SEQ IDNO：2中第11bp处A/G变异)，我们利用限制性内切酶HindII建立了对针对该位点的简便高效的PCR-HindII-RFLP基因分型方法。首先将包含SEQ ID NO：2变异位点的PCR产物5μL，利用限制性内切酶HindII 0.3-0.5μL(3-5U)，加入1μL 10×Buffer，补充双蒸水至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置6-12h进行酶切，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用凝胶成像***拍照，并记录基因型。

用F11和R11扩增猪基因组DNA得到包括SEQ ID NO：1序列中Six1基因第1内含子1595b处A/G变异位点的329bp特异扩增片段(见图1)，扩增的PCR产物经HindII酶切产生三种基因型，当该位点为A时，不能被HindII酶切，酶切后只有一个片段，长度为329bp(A等位基因)；当该位点为G时，HindII酶可将PCR产物酶切成两个片段，长度分别为210bp和119bp(G等位基因)。猪Six1基因的HindII-RFLP酶切分型结果如图2所示。AA基因型只有一条329bp带；GG基因型有210bp和119bp二条带，AG基因型有329bp、210bp和119bp三条带。用2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别基因型(见图2)

(2)SEQ ID NO：13序列中(AC)n微卫星变异二代测序诊断方法的建立

用F3与R3扩增基因组DNA得到包括SEQ ID NO：13(AC)n微卫星变异位点的约250bp特异扩增片段，本发明采用二代测序方法对该位点进行了基因型检测。对于SEQ ID NO：13(AC)n微卫星变异位点，采用二代测序方法进行基因分型检测具有高通量、高准确性的特点。因此，申请人设计了一对引物F3与R3，用F3和R3这对引物所扩增包含SEQ ID NO：13(AC)n微卫星变异位点的片段。对所扩增的片段加上特异性标签序列构建文库，利用IlluminaMiseq测序仪的2×300bp测序模式对目的片段实现双向测序。

2、性状关联分析

利用所建立的SEQ ID NO：2序列变异位点PCR-RFLP诊断方法与SEQ ID NO：13序列中(AC)n微卫星变异二代测序诊断方法，我们对猪Six1基因第一内含子1595bp处的A/G变异位点与启动子区(-1029bp—-1100区)的(AC)n微卫星变异位点在皮×杜×长×大商业猪群中进行了基因分型，如表4与表5所示为该两个位点在皮×杜×长×大商业猪群中的基因型及等位基因频率分析结果。Six1基因第一内含子1595bp处的A/G变异位点在所检测的皮×杜×长×大商业猪群中成功分型了823个个体，检测结果显示，AA基因型为33头，AG基因型263为头，GG基因型527为头。而启动子区(-1029bp—-1100区)的(AC)n微卫星变异位点在所检测的皮×杜×长×大商业猪群中成功分型了509个个体，检测结果显示，(AC)n微卫星变异位点在皮×杜×长×大商业猪群中存在6种基因型，(AC)₁₉/(AC)₂₄(19/24)基因型3头，(AC)₂₀/(AC)₂₂(20/22)基因型13头，(AC)₁₉/(AC)₂₀(19/20)基因型34头，(AC)₁₉/(AC)₁₉(19/19)基因型50头，(AC)₂₂/(AC)₂₂(22/22)基因型131头，(AC)₁₉/(AC)₂₂(19/22)基因型278头。以上结果表明该两个变异位点在商业猪群中存在明显的多态性，具有分子标记开发的潜在价值。

表4Six1基因内含子1595处的A/G变异位点在皮杜长大中的多态性

表5Six1基因启动子STR在皮杜长大商品猪群中的多态性

在此基础上，我们在皮×杜×长×大商业猪群对两个遗传变异位点与猪生产性状进行了关联分析，用于关联分析的生产性状包括初生重、胴体重，板油重，肩部背膘厚、胸腰背膘厚、腰荐背膘厚、三点平均背膘厚、肌内脂肪含量、肉色值a*、肉色值L*、肉色值b*、失水率。申请人采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 8.0)GLM程序进行单标记方差分析，根据所采集的皮×杜×长×大F₂代资源群信息，针对不同的生产性状建立如下单标记关联模型：

模型1：Y_ijkl＝μ+Genotype_i+Sex_j+Sire_k+Dam_l+e_ijkl

模型2：Y_ijkl＝μ+Genotype_i+Sex_j+Sire_k+Dam_l+d_ijklA_ijkl+e_ijkl

模型3：Y_ijklm＝μ+Genotype_i+Sex_j+Sire_k+Dam_l+Batch_m+b_ijklmX_ijklm+e_ijklm

模型4：Y_ijklm＝μ+Genotype_i+Sex_j+Sire_k+Dam_l+Batch_m+c_ijklmZ_ijklm+e_ijklm

模型1适合于初生重；模型2适合于断奶重；模型3适合于肉质性状；模型4适合于胴体重；Y_ijkl或Y_ijklm为性状表型值；μ为群体均值；Genotype_i为基因型效应，Sex_j、Sire_k、Dam_l、Batch_m为固定效应，分别为性别、屠宰批次、公畜与母畜效应；d_ijkl为断奶日龄对断奶重的回归系数，A_ijkl为断奶日龄；b_ijklm为胴体重对肉质性状的回归系数，X_ijklm为胴体重；c_ijklm为屠宰日龄对胴体性状的回归系数，Z_ijklm为屠宰日龄；e_ijkl或e_ijklm为残差效应。

另外，针对单碱基变异位点，采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，加性效应分别用-1，0，1代表AA，AG与GG基因型，显性效应分别用1，-1，1代表AA，AG与GG基因型。

关联分析结果如表6所示，分析结果表明，第一内含子1595bp处的A/G变异位点多态性与肉色红度值a*值呈显著相关(P<0.05)，暗示着该位点可用于肉色性状的遗传改良。另外，分析结果显示，(AC)n微卫星变异位点多态性与断奶重与胴体重呈显著相关(P<0.05)，而与胸腰背膘厚呈极显著相关(P<0.01)(如表7)；除此之外，(AC)n微卫星变异位点多态性与平均背膘厚、肌内脂肪，以及失水率呈潜在的显著相关，暗示着该微卫星位点可用于猪相关生产性状的遗传改良。

表6猪Six1基因第一内含子1595bp处的A/G变异位点多态性与性状关联分析结果

注：数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著(P<0.01)，小写字母表示差异显著(P<0.05)；加性效应负值表示等位基因降低性状表型值，其上标*表示P<0.05,**表示P<0.01。

表7猪Six1基因启动(CA)n微卫星多态性与生产性状的关联分析结果

注：数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，大写字母表示差异极显著(P<0.01)，小写字母表示差异显著(P<0.05)。

实施例3：(应用实例2)

1、SEQ ID NO：13序列中Six1基因启动子(AC)n微卫星变异位点启动子活性分析载体构建

遗传变异位点检测结果显示，猪Six1基因启动子区(-1029bp—-1100区)的(AC)n微卫星变异位点在所检测的皮×杜×长×大商业猪群中共存在4种类型的等位基因，共组成6种基因型(如表5)，其中以(AC)₁₉/(AC)₁₉(19/19)，(AC)₂₂/(AC)₂₂(22/22)与(AC)₁₉/(AC)₂₂(19/22)基因型为主。为了进一步论证Six1基因启动子区(AC)n变异影响生产性状的调控机理，我们利用双荧光素酶报告***验证了(AC)n微卫星变异对启动子活性的影响。

(1)根据基因分型结果，我们以(AC)₁₉/(AC)₁₉(19/19)与(AC)₂₂/(AC)₂₂(22/22)基因型个体基因组DNA为模板，设计上游与下游引物进行PCR扩增(上游与下游引物分别为 GGTACCATTGTTCGGTGGTGCTGAG与 CTCGAGAAAGGCCGCTACTATTTGG，在每条上游引物5'端都引入KpnI酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以阴影区表示)；在下游引物的5'端添加XhoI酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以阴影区表示)。)；将PCR扩增片段经纯化回收后克隆至克隆载体pMD19-T(Takara公司)上，经克隆测序确定序列完全正确，不同基因型克隆载体分别命名为pMD19-T-(AC)₁₉与pMD19-T-(AC)₂₂。

(2)启动子活性分析目标载体构建

首先利用限制性内切酶KpnI与XhoI(Thermo Scientific公司)对克隆载体pMD19-T-(AC)₁₉与pMD19-T-(AC)₂₂进行双酶切，并将酶切后的PCR扩增产物片段进行纯化回收；同样利用限制性内切酶KpnI、XhoI对双荧光素酶报告空载体pGL3-Basic(Promega公司)进行双酶切，并将双酶后的pGL3-Basic空载体进行纯化回收；其次，将双酶切回收后的PCR扩增产物片段片段连入双酶切后的pGL3-Basic载体上，经克隆测序确定序列完全正确，所构建的载体分别命名为pGL3-Basic-(AC)₁₉与pGL3-Basic-(AC)₂₂。

2、SEQ ID NO：13序列中Six1基因启动子(AC)n微卫星变异对启动子活性影响

序列经测序确认正确后，对阳性克隆进行扩大培养，并抽提质粒。质粒提取用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取，质粒纯度与浓度纯度利用NanoDrop2000Spectrophotometer(美国NanoDrop公司)检测，所测的样品的OD260/OD280值在1.8-2.0才可用于后续的试验。

(1)细胞培养与接种

细胞培养采用10％的胎牛血清(Gibco)培养液进行常规的细胞培养，转染前将细胞消化后用生长培养基将细胞密度稀释成1-4×10⁵个/ml，并取500μl细胞悬液接种到24孔培养板中，每个样品进行至少3个重复实验。申请人在两种细胞系，包括猪肾细胞系(PK15)与小鼠成肌细胞(C2C12)中对启动活性进行了分析。

(2)细胞转染

a.转染质粒的准备，将目的质粒pGL3-Basic-(AC)₁₉与pGL3-Basic-(AC)₂₂质粒均稀释成0.2μg/μl，将内参质粒稀释成0.02μg/μl，然后取1μg目的质粒与0.05μg内参质粒混合(20：1的比例)，轻轻吹打均匀。同时分别取1μg pGL3-Basic和pGL3-Control与0.05μg内参质粒混合，分别用于阴性与阳性对照。

b.将(a)中混后的质粒用50μl的Opti-MEM无血清培养基(Gibco)稀释，轻轻混匀，室温放置5min。

c.取适量的Lipofectamine^TM 3000脂质体转染试剂(Invitrogen公司)，用50μl的Opti-MEM无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温放置5min。转染试剂量按所取质粒的量而定，本发明中转染试剂：质粒的比例为2.5：1。

d.将(b)中所稀释混合质粒与(c)中所稀释的脂质体转染试剂混合，并轻轻混匀，室温放置20min。

e.在静置转染复合物的时候，将前天晚上接种到24孔板中的细胞培养基去掉，换上新鲜的Opti-MEM无血清培养基。

f.取100μl(d)中准备的转染复合物轻轻加入24孔板中，轻轻晃动培养板使转染复合物均匀分布在细胞培养液中。

g.将细胞培养板置于5％CO₂培养箱中37℃培养中培养，4-6h后换上含血清的新鲜的培养基继续培养，24h后时行细胞的收集。

(3)启动子活性测定及统计分析

细胞裂解及样品前处理采用Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega公司)进行，具体操作参考试剂盒说明书。样品双荧光素酶活性测定在Glomax 20/20luminometer平台(Promega公司)上进行，相对启动子活性表示为：荧火虫荧光素酶活性(Firely luciferase activity)/海肾荧光素酶活性(Renilla luciferase activity)。显著性检验利用SPSS 20.0软件中自带的非配对样T检验方法(Unpaired-Samples T test)进行，P<0.05认为启动子活性差异达到显著水平，P<0.01认为是启动子活性差异达到了极显著。启动子活性检测结果显示，pGL3-Basic-(AC)₁₉启动性极显著低于pGL3-Basic-(AC)₂₂(图3)，在所采用的两种细胞模型中均获得了同样的结果，表明Six1基因启动子(AC)n微卫星变异能显著影响该基因的转录活性。

实施例4：(应用实例3)

1、(AC)n不同基因型个体基因表达水平差异分析

在明确了(AC)n变异可显著影响Six1基因启动子活性的基础之上，为了进一步确定(AC)n变异与Six1基因转录表达的关系，我们从皮×杜×长×大商业猪群根据(AC)n变异位点基因分型结果随机挑选出了(AC)₁₉/(AC)₁₉(19/19)，(AC)₂₂/(AC)₂₂(22/22)与(AC)₁₉/(AC)₂₂(19/22)三种基因型个体各约25头。利用TRIzol试剂进行总RNA的提取(Invitrogen公司产品)，利用Prime Script ^TM试剂进行cDNA第一链的合成(TaKaRa公司产品)，然后利用Real-time PCR进行基因表达水平检测。所以PCR反应执行3个重复，基因相对表达水平采用△△Ct方法进行计算，以HPRT基因作为内参基因进行基因相对表达水平校正。利用GraphPad Prism进行图表绘制，利用SPSS 20.0软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析，并采用最严谨的Bonferroni方法进行多重比较，P<0.01认为基因差异表达达到了极显著水平。基因表达水平检测结果表明，22/22基因型个体的表达水平要显著高于19/22基因个体(P<0.00003)，而极显著高于19/19基因型个体(P＝0.006)，而19/19与19/22基因型个体表达水平不存在显著差异(图4)。以上的研究结果再次证明了Six1基因启动子中(AC)n微卫星变异可显著影响Six1基因的表达，其遗传多态性可作为影响猪相关生产性状的分子标记应用于猪的分子标记辅助选育。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用

<130> 2017

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5845

<212> DNA

<213> 猪

<221> Six1基因

<400> 1

attttaaaac catataaata atataaggag aaacccacac attgcttctc ctcccactcc 60

cacttatgtc tcaatatgta aattgttcgg tggtgctgag ctcttgcaga tttaaagaca 120

agcaagttta aagaatctag agtttgtttc tcacagtcac taagaggaca catttaagtc 180

aaaagcattt ttgaaatgtg cttaaaattc tgttttgaac ttatctaatc agagctaact 240

agagccataa agtcactatc tttctatcct ttggctcccc ttatctcctt gcattgttct 300

tatctcttgc cagtctcagc tactgacaat agattatctt tgtttagaga tgctaattgt 360

tttcaaaatc tttttaataa ttgctttgga acaaggtgtg caaatgaggc ttaaaataat 420

tacagtttta ctaagcattc tctacacaaa cacaaaataa cggatgatgg gactgaaatt 480

gtaggacatc tctcattctc tggcagtaaa ataggccagc attgcaatct acacacacac 540

acacacacac acacacacac acacacactt ctttatttaa tcttcttgga gccactgtcc 600

tcctcccttt gagggcagtg tccctctcag aacagggcaa ggattatatt acaaccggag 660

ggctattgga gccggacaca gttttattta atttacactc catccagcgc ctttcgtgtg 720

aagttcccag ggcatttttg ctaatagcaa gtaaagcttc tcggcattcc tcagtagcag 780

aggtggcctc ggaaaatgca actgctcaga tgtggaaact gagcccagag gcctgccgac 840

ttaaagcata gaatattaag ataccgaatc acaaatgaac cctcagcaat tgctcagcca 900

ctatgctcta aacagctctt tgcgctgtcc caaatagtag cggccttttg agaacatgag 960

aagtactctg cagttgggag tattcaagtc ctttggaggg cggtgggggc aggagggaag 1020

agaggagaaa ttaggtttgg ctcctagagc tgaagccatt cttccagcgg ctgcagtccg 1080

gagcactgat ctgcttgctc ttgtattatt tatcgcgtac tctaagctat tcgtcaatcc 1140

attacttatt cattccaaca ttaaggtaat taaatatgag ctcaccggga aagggcgagt 1200

ctgcaaggga cggggacaag ggtacagagg aagagaaggg gaatatgaag gtctggagtc 1260

attgatttgt gcagagatga gagcggctgc ccttagatga cactgcagag ggggctcacg 1320

ttgcagggtc ctgacgtact cacccactcc caccgccccc ggtccccgcg aagcgcctct 1380

ccctcttccc tccccatctc gcttcccacc tctcgcggtc ccactcctcc caccactccc 1440

tacccgcccc cgctccacag cctcgccctc cccgcgcggg gcggcggggc ctcgcggccc 1500

ggccaggcgg cgagcaggct ggccagcccc ggataggcgc cgcccgcagc caatcagcgc 1560

gccggggaca ctgcgcgctt taaggcagct gcgggtagaa cagaaaccaa gttccccggc 1620

aacgagcagc atccacccgg cgggagaccg aagcctgaga ggcccgaaaa gctgcggagt 1680

gagccggccg ctccctgtcc agtgcgcgcc ctactcattt tcttctttgg ccggtcgtcc 1740

ccaagtcttg acttgtcttt ccgcctgcat aaagcctcgg gagggggtta ggagcagccg 1800

cgccccccct tcccagcggc tgccgccccc ggctttttcg gctctgctcc ctgccgcgtg 1860

cgctccggca gtgcgcttcg gcaggcccca gccatgtcga tgctgccatc gttcggcttc 1920

acacaggagc aagtggcttg cgtgtgcgag gttctgcaac aaggtgggaa cctggagcgc 1980

ctgggcaggt tcctgtggtc gctgccagcc tgcgaccacc tgcacaagaa cgaaagtgtg 2040

ctcaaggcca aggcggtggt cgccttccac cgcggcaact tccgcgagct ttacaagatc 2100

ctggagagcc accagttctc gcctcacaac caccccaagc tgcaacaact gtggctgaag 2160

gcgcactacg tggaggctga gaagttgcgc ggtcggcccc tgggcgcggt gggcaaatat 2220

cgggtgcgcc gaaaattccc gttgccgcgc actatctggg acggcgaaga gaccagctac 2280

tgcttcaagg agaagtcgcg gggcgtgttg cgggagtggt acgcccataa cccctacccc 2340

tcgccgcgtg agaagcggga gctggccgag gccaccggcc tcaccaccac ccaggtcagc 2400

aactggttca agaaccgaag gcaacgagac cgggccgccg aggccaagga aaggtacggg 2460

gtgtgattcc tgacaatcag gggacccggg gaagtcttcc ttcctctccc tctccgcctc 2520

ttcccgccca cccccctccc cgccccaggc accagccacc gcaacggtcc ctgctgcctg 2580

agccagtccg cggggcggcg cccgggcctc cgcggccctg cggcgaaagt tcatgaactc 2640

tgagatcgct tgctcgggat ggggggctcc tctgatttga gcatccgcgc gtgggtttcc 2700

tgggatgtga gtgtcgggaa atgttggcgc taggtttgtt tttcatgcct cccaggctgg 2760

cgggggccag gagtgacggg tggagaatgg gtttctagat aaattagaaa ggaaggtgtg 2820

atcttgagga aagggattca gtagggaggg aggatctcga gcctttttcc tcttgctccc 2880

cagaggagtg gagctggctg aaacttttgt tcggtctccc ctcccgcctc gtcctgcact 2940

cgctctctcc ttgtagtctt ttgggccaga ggtcgcttca tcccgcacta attgtacaaa 3000

agtaggaatc tttcaaaaga aatcaagagt ttggggcgag ttaccgttgc atgtactccc 3060

aggcgcctca agcccagaat ggatcgctcc tcgctggctt cctcgccggt ggccaggcgg 3120

cgggcgcagc aagtctgtcc gctgtcctcg ccgctgccgc cccaggcgag gcagggatgc 3180

ccagtttcat acttctctcg ccctggagct cagagggcaa tcttttcttt atctgtctct 3240

gcctctgccc tcctcgcgcc agcatcccgg ccacctggcc gggctccagc cgggtgttgt 3300

cgcttccgac cgaggctcga ggttcggagg agcgtggggg aggcggcggt ggggagagca 3360

ctccggggag ccgagcaggt tgcgcgaaac ctgagcgccg gggtcggccg ggtttctttt 3420

gttcgcctca gagcctgggg gccgaaggtg tcgccgccct gctcccctct gggcggaaaa 3480

gccaagtctg gataaattca actgaaatag gctttctggg agagagagag attgcgaccg 3540

gtggggaggg agtgggagag accgcaggcc cgggagtggg gaggaggccg agcgctctta 3600

aggtaaaagc ggcgagagcc cgagaaccct ggtttaccag cacccaacgc ccggactgac 3660

gcccggtgcg gcgcgccggc tcccgcagtt gcggggtggt ggagttcccc cgcccggaaa 3720

gggtgcgctg ctgtggatgt cctcagggag tttgggagag ggccgcgagg cacggaggac 3780

tgagccagta acacgggaac agggacagta caattccagt tagacgttag ttgcaaaacg 3840

gccgtccgtc ctttaagtca ggcccgaggg cccactccct gatgaaatcg gagagactgg 3900

ctgcgctccc tgtgtgttta ctcaggtcac tgggccgctc tggacaccac ttcccatgac 3960

ctgccctgtg tctctgaagc cacaacctcc gggcaggggc gggggaaaac ttgtcagtta 4020

attgtttcct cagatgggaa caggacaatt gacttgattc atgcccaaac atctgtgcac 4080

tgggcgctct tcgtcccctg atcattttct tcatcaccga caaccatttg ttggaagttg 4140

ttcacattta gtgacttcta aatgcgtgct tgttgatagg tatttaaaaa taactgcttg 4200

aacaaaaatt ttaaagtaat ttttgtgttg cacataagct ctgctgatct ggctttctaa 4260

aatctggaag aggtaaggac ccagctcccc tttagctccc cttctcaagt ctctgctgcc 4320

tcctcatctc cccagggccc ttggggatga gtgagagggc agagatcctc catttgggtc 4380

aatgactgat tgctcaatgg ccctttccta ctcctagttc tcctccctcc atctcacact 4440

ttttttaact tttttttttt tttttttttt aaccatatgg tgttgtcctc tatttcttag 4500

ggagaacacc gaaaacaata actcctcctc caacaagcag aatcaactct ctcctctgga 4560

agggggaaag ccgctcatgt ccagctcaga agaagaattc tcacctcccc aaagtccaga 4620

ccagaactcg gtccttctgc tgcagggcaa tatgggccac gccaggagct caaactattc 4680

cctcccgggt ttaacggcct cgcagcccac ccacggcctg caagcccacc agcatcagct 4740

ccaggactcc ctgctgggcc ccctcacctc cagtctggtg gacttagggt cctaagaggg 4800

gagggaatgg ggcctcaagc agcgactagg gacacttgta aatagaaatc aggaacattt 4860

ttttgcagct tgtttctggg gttctttgcg cataaaggaa tggtgaactt tcataaatat 4920

cttttaaaaa ctcaaaacca accacagtct caagcttagt gccctcttct ctccaactct 4980

ttccactttt gcatctcccc tcccagatca gggaaaagga agaagaagaa gaagacgaag 5040

aagaagaaac ccaaacaaac aaaaacatcc agtcacccag tcttggttct gggcaatcca 5100

cattgctgct tcagtagtct ctctttctct ctgtccctct cttttttgtt caatgaacag 5160

ggcttacaaa tcaactggat tttaattatt tccttttaat ttatttatgg taaaatgttt 5220

tgagaagagg aaaaggaaat gaaaatgaga gagaagagag agagaaagtc aaaatagtga 5280

aaagagcctc tatcctggga ggaacttgtg ttcttaaggt gaataggaaa aatatgatct 5340

tacaattttt tttgatgggg aaaattaagt ttacattttt catatttagt gttaaacaat 5400

tttatgtaga ttaaaatgaa agaacagtat tgggggaaaa aacaagtgcc taaatgtctt 5460

aatgctctct acataaggca gttagaaata gaagtgacca ttagtaatac aactattttt 5520

gtcaaattta gttggggggt ggttgttgtt tgtttccttg ggttttttct atggcaaact 5580

tttaaaatgt accaatgtga aaaaacactt tcctgaatgc cattacttct catgccctca 5640

aagctttcat atttgtagcc tactcctgtt aaaggtttct cctgttccta gtttctagct 5700

tgcaaaaata cgtaacaaat ctggcaacct ggtatttgtt actaaacagc atgtgttttc 5760

aggtttcttt tctattgtac ctaaaccagt ctaaattaaa acttagtaga accccaaaaa 5820

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 5845

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 2

gaacaggaca [a/g]ttgacttga t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 3

tcgtcccctg [a/g]tcattttct t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 4

caggcccca[g/a] ccatgtcgat 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 5

gctccacagc [c/t]tcgccctcc c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 6

caccactccc [t/c]acccgcccc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 7

gacggggaca [a/g]gggtacaga g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 8

tgagaacatg [a/g]gaagtactc t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 9

taatcagag[c/t] taactagagc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 10

cagtcactaa [g/a]aggacacat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 11

agagtttgtt [t/c]ctcacagtc a 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 12

gcagatttaa [aga/---]caagcaa gtt 23

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>

<400> 13

attgcaatct acacacacac acacacacac acacacacac acacacactt ctttattt 58

Claims (8)

1.一种与猪生产性状相关的分子标记，其特征在于：该分子标记选自(1)～(2)中的至少一种：

(1)其DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示，在序列表SEQ ID NO：2所示序列的第11bp处有1个A11-G11突变，导致HindII-RFLP多态性；

(2)其DNA序列如序列表SEQ ID NO：13所示，在序列表SEQ ID NO：13所示序列的第11bp处有1个(AC)n微卫星变异，n表示(AC)重复数。

2.根据权利要求1所述的与猪生产性状相关的分子标记，其特征在于：与所述分子标记(1)相关的猪生产性状为猪肉色；与所述分子标记(2)相关的猪生产性状为断奶重、胴体重与胸腰背膘厚性状。

3.检测权利要求1或2所述的分子标记碱基突变的引物对，其特征在于：包括(1)～(3)中的至少一种：

(1)检测序列表SEQ ID NO：2中第11bp处A/G变异的正、反向扩增测序引物的DNA序列如下所示：

正向引物(F10)：CTCTGGACACCACTTCCCATGAC

反向引物(R10)：ACAAGCACGCATTTAGAAGTCACT

(2)检测序列表SEQ ID NO：2序列中碱基突变的PCR-HindII-RFLP基因分型的正、反向引物的DNA测序序列如下所示：

正向引物(F11)：CCGTCCGTCCTTTAAGTCAG

反向引物(R11)：AGCACGCATTTAGAAGTCAC

(3)检测序列表SEQ ID NO：13序列中(AC)n微卫星变异的正、反向扩增测序引物的DNA测序序列如下所示：

正向引物(F3)：GGACATCTCTCATTCTCTGGCAGT

反向引物(R3)：CCCTGGGAACTTCACACGAAAGG。

4.一种与猪生产性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于：包括(Ⅰ)～(Ⅲ)中的至少一种：

(Ⅰ)采用权利要求3中所述的引物F10与R10PCR扩增包含SEQ ID NO：2序列的第11bp处有1个A11-G11突变的基因片段，然后采用测序技术进行基因分型；

(Ⅱ)采用权利要求3中所述的引物F11与R11PCR扩增包含SEQ ID NO：2序列的第11bp处有1个A11-G11突变的基因片段，然后利用HindII限制性内切酶在37℃条件下进行酶切基因分型；

(Ⅲ)采用权利要求3中所述的引物F3与R3PCR扩增包含SEQ ID NO：13序列(AC)n微卫星变异，然后采用测序技术进行基因分型。

5.权利要求1或2所述的分子标记在猪生产性状辅助选育中的应用。

6.权利要求3所述的引物对在猪生产性状辅助选育中的应用。

7.权利要求4所述的制备方法在猪生产性状辅助选育中的应用。

8.根据权利要求5～7中任一所述的应用，其特征在于：为在猪肉色、断奶重、胴体重与胸腰背膘厚中至少一种性状的分子标记辅助选育中的应用。