CN107828710B - 一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法，属于基因工程领域。本发明的是将谷氨酰胺酶基因在16S rDNA、nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr 7个位点整合表达，最终得到了多位点无抗性整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM7。本发明得到的BSM1和BSM7，摇瓶发酵24h后，酶活分别为40.5U/mL和85.6U/mL，突变酶活提高了111.4％。BSM7菌株分批补料发酵，在32h左右达到最高酶活，为375.6U/mL。通过遗传稳定性分析发现，BSM7的遗传稳定性远远大于改基因的质粒表达的稳定性。该发明提高了谷氨酰胺酶酶在食品工业的应用潜力。

Description

一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

谷氨酰胺酶(glutaminase,EC 3.5.1.2)能催化谷氨酰胺脱酰胺基水解形成谷氨酸和氨。近几年来，谷氨酰胺酶在食品和医学领域中应用研究发展迅速，有关这方面的报道也越来越多。通过研究如何减少癌细胞体内的谷氨酰胺酶含量或者活性，削弱癌细胞体内谷氨酰胺的代谢从而抑制肿瘤细胞的生长。谷氨酰胺酶在食品行业中的应用研究也很广泛，谷氨酰胺酶能够催化谷氨酰胺形成谷氨酸，谷氨酸在提高食品中的口感和风味方面具有很重要的作用。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，哺乳动物以及微生物中都发现含有谷氨酰胺酶。

发明内容

本发明首先提供了一种枯草芽孢杆菌偏好性的谷氨酰胺酶核苷酸序列是SEQ IDNO.1所示的序列。

本发明还提供了一种表达所述谷氨酰胺酶的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.1所示序列的基础上，将包括16SrDNA两端同源臂，lox71-zeo-lox66和Hpa II-Mglu的4个部分，通过重叠延伸的方法将4片段延伸成1个片段，得到整合片段，将整合片段转化到宿主菌中即得到B.subtilis基因工程菌，将含有CRE重组酶的质粒转化入该工程菌种，去除抗性标记，即得到无标记的16S rDNA位点整合表达谷氨酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是(序列如表1所示)：

(1)以B.subtilis 168基因组为模板，P3/P4和P9/P10为引物，PCR得到16S rDNA两段同源臂，以pMA5-Mglu和p7Z6所示核苷酸序列为模板，P5/P6和P7/P8为引物，PCR即得到Hpa II-Mglu和lox71-zeo-lox66；接着，用PrimeSTAR GXLDNA聚合酶将这4段片段进行融合PCR，得到整合片段。

(2)将上一步得到的整合片段转化入B.subtilis 168，获得有抗性的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，将含有CRE重组酶的质粒pDG148转化如该工程菌主，接着，51℃培养24h，获得无抗性整合表达谷氨酰胺酶菌株，命名为BSM1。

(3)以nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr基因作为整合表达位点，以P11-P18、P19-P26、P27-P34、P35-P42、P43-P50、P51-P58为引物，重复步骤(1)(2)，相继获得2、3、4、5、6、7位点整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM2-BSM7。

本发明在枯草芽孢杆菌偏好性修饰谷氨酰胺酶核酸序列的基础上，通过多位点整合表达谷氨酰胺酶，最终得到7位点整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM7，相对于BSM1，酶活提高了120％。BSM7相对于B.subtilis 168/pMA5-Mglu在无抗性条件下，酶活稳定性大大提高本。发明表明整合表达可以通过增加整合表达位点有效的提高谷氨酰胺酶酶活，并且提高了谷氨酰胺酶的稳定性，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于提高食品中的口感和风味方面的应用和抑制癌细胞生长。

具体实施方式

实施例1含谷氨酰胺酶的重组载体的构建

(1)谷氨酰胺酶基因的获得：来源于M.luteus K-3耐盐谷氨酰胺酶基因序列从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ019448.1)查询得到，由Sangon生物技术有限公司(上海，中国)对该序列进行枯草芽孢杆菌偏好性优化并合成，得到E.coli/pUC-Mglu。

(2)以P1/P2为引物，pUC-Mglu为模板，PCR获得谷氨酰胺酶基因序列(SEQ IDNO.1)，将基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-Mglu。测序工作由上海生工完成。

表1：引物序列一览表

实施例2质粒表达谷氨酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pMA5-Mglu化学法转化入B.subtilis 168感受态细胞，具体方法如下：

(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：

Sp-A：(NH₄)₂SO₄4，K₂HPO₄28，柠檬酸钠12Sp-B：MgSO₄·7H₂O 0.4

100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100Sp I培养基：Sp-A49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％Sp II培养基：Sp I培养基98％，50mmol/LCaCl₂1％，250mmol/L MgCl₂1％。115℃湿热灭菌。

(2)将B.Subtilis 168的单菌落接种至10mL LB培养基中(50mL离心管)，37℃、180r/min培养过夜；

(3)取200μL培养液至10mL Sp I培养基中，37℃、180r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约5～6h；

(4)取1mL培养液至10mL Sp II培养基中，37℃、180r/min培养90min，取出后加入120μL 10mmol/L EGTA，于37℃、180r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-Mglu，混匀，37℃、180r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pMA5-Mglu/B.subtilis 168。

实施例316S rDNA位点整合表达片段的构建

(1)以B.subtilis 168基因组为模板，P3/P4和P9/P10为引物，PCR得到16S rDNA两段同源臂(SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61)；以pMA5-Mglu和p7Z6所示核苷酸序列为模板，P3/P4和P5/P6为引物，PCR即得到Hpa II-Mglu(SEQ ID NO.63)和lox71-zeo-lox66(SEQ IDNO.62)。扩增条件为：98℃预变性，3min，一个循环；98℃预变性，10s，61℃退火，15s，72℃延伸，2min，28个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix4μL，5×PrimeSTAR HS Buffer 10μL，灭菌的双蒸水32μL，PrimeSTARHS DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。

(2)接着，将这4段片段等摩尔量为模板，不加引物条件下，其他体系如步骤(1)不变，进行PCR，初步得到整合片段。扩增条件为：98℃预变性，3min，一个循环；98℃预变性，8s，61℃退火，5s，72℃延伸，4min，13个循环；72℃终延伸20min。

(3)接着以步骤(2)初步得到的整合片段为模板，P3/P10为引物，PCR得到整合片段，采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。扩增条件为：98℃预变性，3min，一个循环；98℃预变性，10s，61℃退火，15s，72℃延伸，4min，28个循环；72℃终延伸20min。PCR扩增体系：模板2μL，上下游引物各1μL，dNTPMix4μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，灭菌的双蒸水31μL，PrimeSTAR GXLDNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。

实施例4多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株的构建

(1)B.subtilis 168感受态细胞制作方法如实施例2中所示

(2)加入25μL重组片段加B.subtilis 168感受态细胞，混匀，37℃、180r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到有抗性整合表达菌株。

(3)对步骤(2)中转化子制作感受态细胞，将含有CRE酶的pDG148质粒5μL转化入感受态细胞混匀，37℃、180r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。接着，51℃培养箱培养24h，即可得到无抗性基因的谷氨酰胺酶整合表达菌株，命名为BSM1。

(4)以P11-P18、P19-P26、P27-P34、P35-P42、P43-P50、P51-P58为引物，参照16SrDNA位点无标记整合表达菌株构建方法，依次构建nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr基因作为整合表达位点无标记整合表达菌株，分别命名为BSM2-BSM7。

nprB两端同源臂序列如SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65所示；Hpa II-Mglu如SEQ IDNO.63所示，lox71-zeo-lox66如SEQ ID NO.62所示；

nprE两端同源臂序列如SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67所示；Hpa II-Mglu如SEQ IDNO.63所示，lox71-zeo-lox66如SEQ ID NO.62所示；

aprE两端同源臂序列如SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69所示；Hpa II-Mglu如SEQ IDNO.76所示，lox71-zeo-lox66如SEQ ID NO.62所示；

spo0A两端同源臂序列如SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71所示；Hpa II-Mglu如SEQID NO.76所示，lox71-zeo-lox66如SEQ ID NO.62所示；

epr两端同源臂序列如SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73所示；Hpa II-Mglu如SEQ IDNO.76所示，lox71-zeo-lox66如SEQ ID NO.62所示；

bpr两端同源臂序列如SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75所示；Hpa II-Mglu如SEQ IDNO.76所示，lox71-zeo-lox66如SEQ ID NO.62所示。

实施例5重组菌BSM1-BSM7谷氨酰胺酶高效表达及酶活测定。

(1)将实施例4构建的重组菌BSM1～BSM7分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于枯草芽抱杆菌发酵培养基中，24℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。

(2)枯草芽抱杆菌发酵培养基：安琪酵母粉40g/L，葡萄糖25g/L，K₂HPO₄3H₂O1.875g/L，KH₂PO₄1.125g/L，CaCl₂2g/L。调节pH 6.8-7.0。

(3)酶活定义:在37℃反应条件下，每分钟内能催化谷氨酰胺转化为1μmol谷氨酸所需要的酶量为一个酶活单位。

(4)谷氨酰胺酶酶活测定方法：采用SBA生物传感分析仪直接测定酶产物中的谷氨酸含量。谷氨酰胺酶的酶活测定反应体系(总体系1mL)：880μL的50mmol L^-1Tris-HCl缓冲液和50mmol L^-1L-谷氨酰胺混合液，将其放置37℃水浴锅中预热5min，接着加入20μL的酶液，在37℃恒温水浴反应5min，迅速加入100μL的15％的三氯乙酸上下摇晃混匀，反应终止。将酶反应液放入离心机中，在10000r min^-1的条件下离心10min，去蛋白取上清，将反应液的产物浓度稀释到0.3-1.0g L^-1，取25μL反应液进行谷氨酸测定分析。

结果表明重组菌BSM7表达的谷氨酰胺酶的酶活为85.6U/mL，相对于菌株BSM1(40.5U/mL)L-天冬酰胺酶酶活提高111.4％。

实施例6重组菌的遗传稳定性分析

分别挑取BSM7、B.subtilis 168/pMA5-Mglu重组菌菌落接种至无抗性LB液体培养基中，37℃培养作为种子液。次日，按照4％的接种量转移至无抗性发酵培养基中，24℃培养12h后，分别取样测酶活，同时继续按4％的接种量转接至新鲜的无抗性发酵培养基中。依次类推，每24h转接一次并同时取样测酶活，共测定120h。结果表明，BSM7120h后测定酶活基本不变，而B.subtilis 168/pMA5-Mglu培养96h后基本就没有酶活，也就是说，BSM7重组菌的遗传稳定性要远远好于B.subtilis 168/pMA5-Mglu，为工业生产食品级谷氨酰胺酶提供了参考。实施例7分批补料发酵重组菌BSM7

将BSM7菌株在LB固体平板上划线，37℃生长12h。挑取单菌落于10mL LB液体培养基中，37℃培养12h。转接入100mL LB液体培养基中，37℃培养12h，作为种子液。将种子液转接入2L发酵培养基的5L发酵罐中。补料培养基(glucose 1000g/L；Angel yeast extract700g/L)流加入发酵罐中，保持葡萄糖浓度在10-20g/L。分批补料发酵在25℃，pH7.0，转速600rpm下进行。用50％的氨水和50％的硫酸调pH。结果显示BSM7菌株在32h左右达到最高酶活，为375.6U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列

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atgcgtcacc ctatcccaga ctacctggcc agcctggtaa ccgagctggg tgcagtaaac 60

cctggcgaaa ccgctcagta catcccggtg ctggcagagg cagatccaga ccgtttcggt 120

atcgctctgg ctaccccgac tggtcgtctg cattgcgcag gtgacgctga tgtggagttc 180

accattcagt ccgcgtccaa accgttcacc tacgcggctg cgctggtcga ccgtggtttc 240

gcagctgtgg accgtcaggt aggtctgaac ccgagcggtg aggctttcaa cgagctgagc 300

ctggaggcag aaagccaccg tccggacaac gcaatgatca acgcgggtgc actggctgta 360

caccagctgc tggtcggtcc ggaagcatct cgtaaggaac gtctggaccg tgcagtggaa 420

atcatgtccc tgctggccgg tcgtcgtctg tccgtggatt gggaaacgta cgaatccgaa 480

atggcggtca gcgaccgcaa cctgtccctg gcgcacatgc tgcgtagcta tggcgtgctg 540

caggactccg cagaagaaat cgtggccggc tacgtggcac agtgcgcagt cctggtcact 600

gtcaaagacc tggcggtgat gggcgcatgt ctggcaaccg gtggtatcca cccgatgacg 660

ggtgaacgta tgctgccgtc tatcgtggcg cgtcgtgtgg tgtctgttat gacctcctct 720

ggcatgtatg acgcggccgg ccagtggctg gctgatgtag gcatcccggc taaatctggt 780

gttgcgggcg gtgttctggg tgctctgccg ggtcgtgttg gtatcggtgt tttcagcccg 840

cgcctggatg aagttggcaa ctctgcgcgt ggcgttctgg cttgtcgtcg cctgtctgaa 900

gacttccgcc tgcatctgat ggacggcgac tctctgggtg gtaccgctgt tcgttttgtt 960

gaacgcgaag gcgaccgcgt ttttctgcac ctgcagggcg ttatccgctt tggcggcgcg 1020

gaagcggttc tggacgctct gaccgatctg cgtacgggtg ctgagaaacc gggtactggc 1080

tgggatgctg ctgtttatcc gcgctggcaa gaagccgccg ccgatcgtgc ggctctgtct 1140

gcggcgactg gcggcggtgc cgttcatgaa gcggcagccg ctgcggcgcg tgatgagaat 1200

gatggcccaa ttcgtactgt tgttctgaat ctggcccgtg ttgatcgtat tgatgacgta 1260

ggtcgccgcc tgattgccga aggcgttcgc cgtctgcaag cggatggcgt acgcgtagaa 1320

gtagaagatc cggaacgcat tctgccgctg gaagaagcgg gcgcgcacta a 1371

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gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagctt 49

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atttttattt tgtccgtttt gtctagctta tggaattcca ctctcctctt 50

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accttccgat acggctacct tgttacgact tcaccccaat catctgtccc a 51

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gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag 50

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cgtcgacctg caggcatgca agcttggcac cagacaaagc cgccttccgg 50

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ttgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc 50

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atttttattt tgtccgtttt gtctagctta ttcaggttct tcgcgtcaaa 50

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gatcaataca tttgacgcga agaacctgaa taagctagac aaaacggaca 50

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ctaatcctct agagtcgagc tcaagctagc accatgatta cgaattcgag 50

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ggatgttatt tctgaaaaag gcggaaaggt tcattggcaa gggtttaaag gtggagat 58

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cccgggtacc gagctcgaat tcgtaatcat ggtagccggc gaacgtggcg agaaagga 58

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tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctaccatga ttacgaattc gagctcgg 58

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cccgggtacc gagctcgaat tcgtaatcat ggtagccggc gaacgtggcg agaaagga 58

<210> 40

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctaccatga ttacgaattc gagctcgg 58

<210> 41

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ctacacggct tgcggttgtg ttaaattttt tggattctac cgttcgtata atgtatgc 58

<210> 42

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ttcgtatagc atacattata cgaacggtag aatccaaaaa atttaacaca accgcaag 58

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ggctgggtgc cttataaaga ttaatgtgca 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cggcaatttt cccggcgaca ggcattattt 30

<210> 45

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ctcaaaaaat caccaccttt aaacccttgc caattcctgt cagtcctgcc ttccaagc 58

<210> 46

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tgaaacaggc ttggaaggca ggactgacag gaattggcaa gggtttaaag gtggagat 58

<210> 47

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cccgggtacc gagctcgaat tcgtaatcat ggtagccggc gaacgtggcg agaaagga 58

<210> 48

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctaccatga ttacgaattc gagctcgg 58

<210> 49

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gggacgtttt ttctgaactt gcaggcagct tgcattctac cgttcgtata atgtatgc 58

<210> 50

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ttcgtatagc atacattata cgaacggtag aatgcaagct gcctgcaagt tcagaaaa 58

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gagcatgaga atagggggtt gtccaaggcg 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gaggaaaaaa acgaaaaaca gactcatcag 30

<210> 53

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ctcaaaaaat caccaccttt aaacccttgc caaaccccgg tatcaatgga cgcaacaa 58

<210> 54

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

tggcacggtt gttgcgtcca ttgataccgg ggtttggcaa gggtttaaag gtggagat 58

<210> 55

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cccgggtacc gagctcgaat tcgtaatcat ggtagccggc gaacgtggcg agaaagga 58

<210> 56

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctaccatga ttacgaattc gagctcgg 58

<210> 57

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

ttgttgagta tgatgcctgc atggaacgtg ccaattctac cgttcgtata atgtatgc 58

<210> 58

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

ttcgtatagc atacattata cgaacggtag aattggcacg ttccatgcag gcatcata 58

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

aattttctgt gttcatatta agttttccat 30

<210> 60

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagtg ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tcca 654

<210> 61

<211> 842

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg 60

gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt 120

agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca 180

gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 240

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 300

ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga 360

gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 420

aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc 480

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 540

gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat 600

cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat 660

cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 720

cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca 780

gccgccgaag gtgggacaga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag 840

gt 842

<210> 62

<211> 547

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagattct accgttcgta 60

tagcatacat tatacgaagt tatcttgata tggcttttta tatgtgttac tctacataca 120

gaaaggagga actaaatatg gccaagttga ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg 180

acgtcgccgg agcggtcgag ttctggaccg accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg 240

aggacgactt cgccggtgtg gtccgggacg acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg 300

accaggtggt gccggacaac accctggcct gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt 360

acgccgagtg gtcggaggtc gtgtccacga acttccggga cgcctccggg ccggccatga 420

ccgagatcgg cgagcagccg tgggggcggg agttcgccct gcgcgacccg gccggcaact 480

gcgtgcactt cgtggccgag gagcaggact gaataacttc gtatagcata cattatacga 540

gtagaat 547

<210> 63

<211> 1810

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

taagctagac aaaacggaca aaataaaaat tggcaagggt ttaaaggtgg agattttttg 60

agtgatcttc tcaaaaaata ctacctgtcc cttgctgatt tttaaacgag cacgagagca 120

aaacccccct ttgctgaggt ggcagagggc aggttttttt gtttcttttt tctcgtaaaa 180

aaaagaaagg tcttaaaggt tttatggttt tggtcggcac tgccgacagc ctcgcagagc 240

acacacttta tgaatataaa gtatagtgtg ttatacttta cttggaagtg gttgccggaa 300

agagcgaaaa tgcctcacat ttgtgccacc taaaaaggag cgatttacat atgagttatg 360

cagtttgtag aatgcaaaaa gtgaaatcag ggggaatgcg tcaccctatc ccagactacc 420

tggccagcct ggtaaccgag ctgggtgcag taaaccctgg cgaaaccgct cagtacatcc 480

cggtgctggc agaggcagat ccagaccgtt tcggtatcgc tctggctacc ccgactggtc 540

gtctgcattg cgcaggtgac gctgatgtgg agttcaccat tcagtccgcg tccaaaccgt 600

tcacctacgc ggctgcgctg gtcgaccgtg gtttcgcagc tgtggaccgt caggtaggtc 660

tgaacccgag cggtgaggct ttcaacgagc tgagcctgga ggcagaaagc caccgtccgg 720

acaacgcaat gatcaacgcg ggtgcactgg ctgtacacca gctgctggtc ggtccggaag 780

catctcgtaa ggaacgtctg gaccgtgcag tggaaatcat gtccctgctg gccggtcgtc 840

gtctgtccgt ggattgggaa acgtacgaat ccgaaatggc ggtcagcgac cgcaacctgt 900

ccctggcgca catgctgcgt agctatggcg tgctgcagga ctccgcagaa gaaatcgtgg 960

ccggctacgt ggcacagtgc gcagtcctgg tcactgtcaa agacctggcg gtgatgggcg 1020

catgtctggc aaccggtggt atccacccga tgacgggtga acgtatgctg ccgtctatcg 1080

tggcgcgtcg tgtggtgtct gttatgacct cctctggcat gtatgacgcg gccggccagt 1140

ggctggctga tgtaggcatc ccggctaaat ctggtgttgc gggcggtgtt ctgggtgctc 1200

tgccgggtcg tgttggtatc ggtgttttca gcccgcgcct ggatgaagtt ggcaactctg 1260

cgcgtggcgt tctggcttgt cgtcgcctgt ctgaagactt ccgcctgcat ctgatggacg 1320

gcgactctct gggtggtacc gctgttcgtt ttgttgaacg cgaaggcgac cgcgtttttc 1380

tgcacctgca gggcgttatc cgctttggcg gcgcggaagc ggttctggac gctctgaccg 1440

atctgcgtac gggtgctgag aaaccgggta ctggctggga tgctgctgtt tatccgcgct 1500

ggcaagaagc cgccgccgat cgtgcggctc tgtctgcggc gactggcggc ggtgccgttc 1560

atgaagcggc agccgctgcg gcgcgtgatg agaatgatgg cccaattcgt actgttgttc 1620

tgaatctggc ccgtgttgat cgtattgatg acgtaggtcg ccgcctgatt gccgaaggcg 1680

ttcgccgtct gcaagcggat ggcgtacgcg tagaagtaga agatccggaa cgcattctgc 1740

cgctggaaga agcgggcgcg caccaccacc accaccacca ctaatcctct agagtcgagc 1800

tcaagctagc 1810

<210> 64

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ttgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

gtttttgtaa cacatgcctc agctgaagaa agcatcgaat acgaccatac gtatcaaacc 120

ccttcataca tcatcgaaaa gtcaccgcag aagccggtac aaaacacaac ccagaaagaa 180

tcgctatttt cctatcttga caagcatcaa acgcagttta agctcaaagg gaatgcgaac 240

agccattttc gcgtttcgaa aaccataaag gatccaaaga caaaacaaac gttttttaaa 300

ttaacggagg tttacaaagg aattccgatt tacggctttg aacaagcggt cgcgatgaag 360

gaaaacaaac aagtgaaaag tttctttgga aaggtgcatc cgcaaatcaa ggacgtctcc 420

gtcacaccgt ctatttctga gaaaaaagca atacatacag caaggcgtga gctcgaggct 480

tccattggaa aaatcgaata tcttgatggg gaaccaaaag gcgaattata tatctatcca 540

cacgacggtg aatatgatct cgcctacctt gtgagactct cgacatctga acctgagcct 600

ggctattggc attatttcat cgatgccaaa aacggaaagg tcatcgagtc ctttaatgcc 660

attcatgaag cggcaggtac aggaatcggc gtgtcaggtg atgaaaaaag ctttgacgtc 720

acagaacaaa atgggcgctt ttatttggct gacgaaacaa ggggaaaagg gatcaataca 780

tttgacgcga agaacctgaa 800

<210> 65

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ccttgtttac gcttttgtct caactgatcg ggtatacggg caaagaaata gtcagcggca 60

cgtccgtatt taatgaacct gcggctgtag acgcacacgc aaatgcgcaa gccgtttacg 120

attattacag caagacattt ggccgtgatt cttttgatca aaacggagca aggattacgt 180

ctaccgtgca tgtcggcaaa caatggaaca atgctgcgtg gaacggtgtc cagatggtat 240

acggggatgg agacggttcg aaatttaagc cgctgtctgg atcgctcgac attgtcgcgc 300

atgaaatcac acacgcagtc acacagtatt ccgccggtct tttatatcaa ggagaacccg 360

gtgcattaaa tgagtccatt tctgacatta tgggcgcgat ggctgaccgt gatgattggg 420

agatcggcga agatgtctat actcctggta ttgcaggaga ttcattgcgg tcattggagg 480

acccatctaa gcagggaaat ccagatcatt actcgaaccg ctacacagga acagaggatt 540

atggcggagt ccatatcaat tcgtccattc acaataaagc agcttatctt cttgcagaag 600

gaggcgtgca ccacggtgta caggttgaag ggattgggcg tgaagcaagt gaacaaattt 660

actatcgggc tttaacatat tatgtaacgg catctacaga tttcagcatg atgaagcaag 720

cggcgattga agctgccaat gatttatacg gtgaaggctc gaagcaatca gcttcagtcg 780

aaaaggcgta tgaggctgtc ggcattctat gagcaaaca 819

<210> 66

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60

agcctgccag gtgttcaggc tgctgaaggt catcagctta aagagaatca aacaaatttc 120

ctctccaaaa acgcgattgc gcaatcagaa ctctctgcac caaatgacaa ggctgtcaag 180

cagtttttga aaaagaacag caacattttt aaaggtgacc cttccaaaag gctgaagctt 240

gttgaaagca cgactgatgc ccttggatac aagcactttc gatatgcgcc tgtcgttaac 300

ggagtgccaa ttaaagattc gcaagtgatc gttcacgtcg ataaatccga taatgtctat 360

gcggtcaatg gtgaattaca caatcaatct gctgcaaaaa cagataacag ccaaaaagtc 420

tcttctgaaa aagcgctggc actcgctttc aaagctatcg gcaaatcacc agacgctgtt 480

tctaacggag cggccaaaaa cagcaataaa gccgaattaa aagcgataga aacaaaagac 540

ggcagctatc gtcttgctta cgacgtgacg attcgctatg tcgagcctga acctgcaaac 600

tgggaagtct tagttgacgc cgaaacaggc agcattttaa aacagcaaaa taaagtagaa 660

catgccgccg ccactggaag cggaacaacg ctaaagggcg caactgttcc tttgaacatc 720

tcttatgaag gcggaaaata tgttctaaga gatctttcaa aaccaacagg cacccaaatc 780

atcacatatg atttgcaaaa 800

<210> 67

<211> 766

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

cagacaaagc cgccttccgg gcacgcttgt ctcaagcaca acgaaaacat ttacatcttc 60

atcacagcgg gcagccgttg acgcacacta taacctcggt aaagtgtacg attattttta 120

ttcaaacttt aaacgaaaca gctatgataa caaaggcagt aaaatcgttt cttccgttca 180

ctacggcact caatacaata acgctgcatg gacaggagac cagatgattt acggtgatgg 240

cgacggttca ttcttctctc cgctttccgg ctcattagat gtgacagcgc atgaaatgac 300

acatggcgtc acccaagaaa cagccaactt gatttatgaa aatcagccag gtgcattaaa 360

cgagtctttc tctgacgtat tcgggtattt taacgataca gaagactggg acatcggtga 420

agacattacg gtcagccagc ctgctcttcg cagcctgtcc aaccctacaa aatacaacca 480

gcctgacaat tacgccaatt accgaaacct tccaaacaca gatgaaggcg attatggcgg 540

tgtacacaca aacagcggaa ttccaaacaa agccgcttac aacaccatca caaaacttgg 600

tgtatctaaa tcacagcaaa tctattaccg tgcgttaaca acgtacctca cgccttcttc 660

cacgttcaaa gatgccaagg cagctctcat tcagtctgcc cgtgacctct acggctcaac 720

tgatgccgct aaagttgaag cagcctggaa tgctgttgga ttgtaa 766

<210> 68

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ccgatattgg ttaaacagcg gcgcaatggc ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat 60

gttcatctta tttcttcctc cctctcaata attttttcat tctatccctt ttctgtaaag 120

tttatttttc agaatacttt tatcatcatg ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt 180

gttctcacgg aagcacacgc aggtcatttg aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg 240

actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg acatttcagc ataatgaaca tttactcatg 300

tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag 360

agatgatata cctaaataga gataaaatca tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta 420

ttccatctat tacaataaat tcacagaata gtcttttaag taagtctact ctgaattttt 480

ttaaaaggag agggtaaaga gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt 540

taacgttaat ctttacgatg gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca 600

gtacagaaaa gaaatacatt gtcggattta aacagacaat gagtgccatg agttccgcca 660

agaaaaagga tgttatttct gaaaaaggcg gaaaggttca 700

<210> 69

<211> 683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

ctggaggcac ttacggcgct tataacggaa cgtccatggc gactcctcac gttgccggag 60

cagcagcgtt aattctttct aagcacccga cttggacaaa cgcgcaagtc cgtgatcgtt 120

tagaaagcac tgcaacatat cttggaaact ctttctacta tggaaaaggg ttaatcaacg 180

tacaagcagc tgcacaataa tagtaaaaag aagcaggttc ctccatacct gcttcttttt 240

atttgtcagc atcctgatgt tccggcgcat tctcttcttt ctccgcatgt tgaatccgtt 300

ccatgatcga cggatggctg cctctgaaaa tcttcacaag caccggagga tcaacctggc 360

tcagccccgt cacggccaaa tcctgaaacg ttttaacagc ggcttctctg ttctctgtca 420

actcgatccc atactggtca gccttattct cctgataacg cgagacagca ttagaaaaag 480

gcgtaaccgc aaagctcaaa acagaaaaca aaagcaataa cagcggaagt gccgcaagat 540

catgccgccc ttctaaatga aacatgctgc gggttaggcg aaccgtccgc ttgtaaagct 600

tatcaatgac ataaaatccg gcgagcgaca cgagcaaata gccagccaga ccgatgtaaa 660

cgtgcttcat gacataatgg ccc 683

<210> 70

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

gcgacaaaag gaatggtgtt gaaaattacc gatccaagac tgttgaaaga aacaggaggc 60

atcgtacagg ggatgagcgg aagcccgatc attcaaaatg gaaaagtgat cggtgctgtc 120

acccatgtat ttgtaaatga cccgacaagc ggctacggtg ttcatattga atggatgctg 180

tcagaagcag gaatcgatat ttatggaaaa gaaaaagcaa gctgactgcc ggagtttccg 240

gcagtttttt tattttgatc cctcttcact tctcagaata catacggtaa aatatacaaa 300

agaagatttt tcgacaaatt cacgtttcct tgtttgtcaa atttcatttt tagtcgaaaa 360

acagagaaaa acatagaata acaaagatat gccactaata ttggtgatta tgattttttt 420

agagggtata tagcggtttt gtcgaatgta aacatgtagc aagggtgaat cctgttaact 480

acatttgggg aggaagaaac gtggagaaaa ttaaagtttg tgttgctgat gataatcgag 540

agctggtaag cctgttaagt gaatatatag aaggacagga agacatggaa gtgatcggcg 600

ttgcttataa cggacaggaa tgcctgtcgc tgtttaaaga aaaagatccc gatgtgctcg 660

tattagatat tattatgccg catctagacg gacttgcggt 700

<210> 71

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ccaaaaaatt taacacaacc gcaagccgtg tagaaagagc gatccgccat gcaattgaag 60

tggcatggag cagaggaaac attgattcca tttcctcgtt gtttggttat actgtcagca 120

tgacaaaagc taaacctacc aacagtgaat tcattgcaat ggttgcggat aagctgaggt 180

tagagcataa ggcttcttaa acatgagctt attaagtggt cattaaatca aacgtctttt 240

atttattagt ttgcgctgat aaataggagg cgttttgttt tggggacatt tgtagtatgg 300

gagaagaata ttaagtatcc gcatatagta aaggataggt ttgaaaagta aggaaagcaa 360

atggcggtat tacctgcact cttggtccat tcatacatct tataggatca cgaagcatga 420

tcgaccctag atgtgtccgt tataaaatga aacctttctc ctgcaaaatc gtaagtaagg 480

cgtattcatg taaaaaggag acgtacgaat gaaaaagaaa aaagcaagaa agcgtgaggg 540

gtttttcctg gattttcttt tcgaagttgg tggggagctc tttcttttgc tgtttagatg 600

tgtacacaaa ctatttatat aaagggaaaa aagactgccg aatcgtttcg gcagtctttg 660

cacattaatc tttataaggc acccagcc 688

<210> 72

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

cggcaatttt cccggcgaca ggcattattt tttcctccat cacccgagtg aatgtgctca 60

tcttaaaaac ccccttttct cattgctttg tgaacaacct ccgcaatgtt ttctttatct 120

tattttgaaa acgcttacaa attcatttgg aaaatttcct cttcatgcgg aaaaaatctg 180

cattttgcta aacaaccctg cccatgaaaa attttttcct tcttactatt aatctctctt 240

tttttctccg atatatatat caaacatcat agaaaaagga gatgaatcat gaaaaacatg 300

tcttgcaaac ttgttgtatc agtcactctg tttttcagtt ttctcaccat aggccctctc 360

gctcatgcgc aaaacagcag cgagaaagag gttattgtgg tttataaaaa caaggccgga 420

aaggaaacca tcctggacag tgatgctgat gttgaacagc agtataagca tcttcccgcg 480

gtagcggtca cagcagacca ggagacagta aaagaattaa agcaggatcc tgatattttg 540

tatgtagaaa acaacgtatc atttaccgca gcagacagca cggatttcaa agtgctgtca 600

gacggcactg acacctctga caactttgag caatggaacc ttgagcccat tcaggtgaaa 660

caggcttgga aggcaggact gacaggaa 688

<210> 73

<211> 692

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gcaagctgcc tgcaagttca gaaaaaacgt ccctgcagaa acgccttaac aaagtgaaga 60

gcaccaattt gaagacggca cagcaatccg tatctgcggc tgaaaagaaa tcaactgatg 120

caaatgcggc aaaagcacaa tcagccgtca atcagcttca agcaggcaag gacaaaacgg 180

cattgcaaaa acggttagac aaagtgaaga aaaaggtggc ggcggctgaa gcaaaaaaag 240

tggaaactgc aaaggcaaaa gtgaagaaag cggaaaaaga caaaacaaag aaatcaaaga 300

catccgctca gtctgcagtg aatcaattaa aagcatccaa tgaaaaaaca aagctgcaaa 360

aacggctgaa cgccgtcaaa ccgaaaaagt aaccaaaaac ctttaagatt tgcattccaa 420

gtcttaaagg tttttttcat tctaagaaca ccacacacaa cctttttccc atccattgta 480

caggcttttc atactattgc tatacagcca tgaacagcat aaaatgaacg ttattacagt 540

tatcaccaca tatggcggga ttgtgactgg gcaggcaggc aagacccaat gatgcaaagg 600

gagtattaat gcctaaaaaa cagggcattt taactcttct tttcgtgttg ggctcataac 660

ggcgccttgg acaaccccct attctcatgc tc 692

<210> 74

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gaggaaaaaa acgaaaaaca gactcatcag ctctgtttta agtacagttg tcatcagttc 60

actgctgttt ccgggagcag ccggggcaag cagtaaagtc acctcacctt ctgttaaaaa 120

ggagcttcaa tctgcggaat ccattcaaaa caagatttcg agttcattaa agaaaagctt 180

taaaaagaaa gaaaaaacga cttttctgat taaatttaaa gatctggcta acccagaaaa 240

agcggcaaaa gcggctgtta aaaaagcgaa atcgaagaag ctgtctgccg ctaagacgga 300

atatcaaaag cgttctgctg ttgtgtcatc tttaaaagtc acagccgatg aatcccagca 360

agatgtccta aaatacttga acacccagaa agataaagga aatgcagacc aaattcattc 420

ttattatgtg gtgaacggga ttgctgttca tgcctcaaaa gaggttatgg aaaaagtggt 480

gcagtttccc gaagtggaaa aggtgcttcc taatgagaaa cggcagcttt ttaagtcatc 540

ctccccattt aatatgaaaa aagcacagaa agctattaaa gcaactgacg gtgtggaatg 600

gaatgtagac caaatcgatg ccccaaaagc ttgggcactt ggatatgatg gaactggcac 660

ggttgttgcg tccattgata ccggggt 687

<210> 75

<211> 695

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

tggcacgttc catgcaggca tcatactcaa caagggtgaa aatgagctga cggcaactgc 60

atcaactgac aacggaacaa cagatgcctc cagcccaatc acggtcacgc ttgatcaaga 120

aaagcctgaa ttaacactgg acaatccaaa ggatggcggg aaaacaaata aagaaacgct 180

gactgtcaaa ggggctgtat ccgatgacaa tctgaaagac gtcaaggtga atggcaaaaa 240

agcaacagta gctgatggtt catactcagc ccgtattctt ttggaaaatg gaagaaatga 300

aatcaaggta attgctacag acttggcagg caacaaaacg acgaaaaaga cagtcattga 360

tgtgaacttt gacaagcctg tcatttccgg cttaattccg ggagaggata aaaacttaaa 420

agccggtgaa tctgtgaaaa tcgctttctc aagcgctgag gatttagatg caacgtttac 480

cattcgtatg ccgctgacca atgcaagagc gagtgtgcaa aatgccaccg aactcccgtt 540

aagagaaatc tctccgggga gatatgaagg ctattggact gccacttctt ctattaaagc 600

aaaaggagca aaagtagaag tgatcgtccg agatgattat ggaaatgaaa caagaaaaac 660

tgcgaatgga aaacttaata tgaacacaga aaatt 695

<210> 76

<211> 2210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

ttggcaaggg tttaaaggtg gagatttttt gagtgatctt ctcaaaaaat actacctgtc 60

ccttgctgat ttttaaacga gcacgagagc aaaacccccc tttgctgagg tggcagaggg 120

caggtttttt tgtttctttt ttctcgtaaa aaaaagaaag gtcttaaagg ttttatggtt 180

ttggtcggca ctgccgacag cctcgcagag cacacacttt atgaatataa agtatagtgt 240

gttatacttt acttggaagt ggttgccgga aagagcgaaa atgcctcaca tttgtgccac 300

ctaaaaagga gcgatttaca tatgatgcgt caccctatcc cagactacct ggccagcctg 360

gtaaccgagc tgggtgcagt aaaccctggc gaaaccgctc agtacatccc ggtgctggca 420

gaggcagatc cagaccgttt cggtatcgct ctggctaccc cgactggtcg tctgcattgc 480

gcaggtgacg ctgatgtgga gttcaccatt cagtccgcgt ccaaaccgtt cacctacgcg 540

gctgcgctgg tcgaccgtgg tttcgcagct gtggaccgtc aggtaggtct gaacccgagc 600

ggtgaggctt tcaacgagct gagcctggag gcagaaagcc accgtccgga caacgcaatg 660

atcaacgcgg gtgcactggc tgtacaccag ctgctggtcg gtccggaagc atctcgtaag 720

gaacgtctgg accgtgcagt ggaaatcatg tccctgctgg ccggtcgtcg tctgtccgtg 780

gattgggaaa cgtacgaatc cgaaatggcg gtcagcgacc gcaacctgtc cctggcgcac 840

atgctgcgta gctatggcgt gctgcaggac tccgcagaag aaatcgtggc cggctacgtg 900

gcacagtgcg cagtcctggt cactgtcaaa gacctggcgg tgatgggcgc atgtctggca 960

accggtggta tccacccgat gacgggtgaa cgtatgctgc cgtctatcgt ggcgcgtcgt 1020

gtggtgtctg ttatgacctc ctctggcatg tatgacgcgg ccggccagtg gctggctgat 1080

gtaggcatcc cggctaaatc tggtgttgcg ggcggtgttc tgggtgctct gccgggtcgt 1140

gttggtatcg gtgttttcag cccgcgcctg gatgaagttg gcaactctgc gcgtggcgtt 1200

ctggcttgtc gtcgcctgtc tgaagacttc cgcctgcatc tgatggacgg cgactctctg 1260

ggtggtaccg ctgttcgttt tgttgaacgc gaaggcgacc gcgtttttct gcacctgcag 1320

ggcgttatcc gctttggcgg cgcggaagcg gttctggacg ctctgaccga tctgcgtacg 1380

ggtgctgaga aaccgggtac tggctgggat gctgctgttt atccgcgctg gcaagaagcc 1440

gccgccgatc gtgcggctct gtctgcggcg actggcggcg gtgccgttca tgaagcggca 1500

gccgctgcgg cgcgtgatga gaatgatggc ccaattcgta ctgttgttct gaatctggcc 1560

cgtgttgatc gtattgatga cgtaggtcgc cgcctgattg ccgaaggcgt tcgccgtctg 1620

caagcggatg gcgtacgcgt agaagtagaa gatccggaac gcattctgcc gctggaagaa 1680

gcgggcgcgc actaaggatc ctctagagtc gagctcaagc tagcttggta cgtaccagat 1740

ctgagatcac gcgttctaga ggtcgaaatt cacctcgaaa gcaagctgat aaaccgatac 1800

aattaaaggc tccttttgga gccttttttt ttggagattt tcaacgtgaa aaaattatta 1860

ttcgcaattc caagctaatt cacctcgaaa gcaagctgat aaaccgatac aattaaaggc 1920

tccttttgga gccttttttt ttggagattt tcaacgtgaa aaaattatta ttcgcaattc 1980

caagctctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 2040

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgcagatcac gcgccctgta gcggcgcatt 2100

aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc 2160

gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2210

Claims (5)

1.一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，对16S rDNA、nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr七个位点同时进行整合，整合表达如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

2.一种制备权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，

(1)16SrDNA位点整合表达片段的构建：将16S rDNA两端同源臂，lox71-zeo-lox66和HpaII-Mglu4个部分通过重叠延伸的方法延伸成1个片段，得到16SrDNA位点整合表达的整合片段，将整合片段转化到宿主菌中，并将含有CRE重组酶的质粒转化入该宿主菌中，去除抗性标记，即得到无标记的16SrDNA位点整合表达谷氨酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌BSM1；

(2)其他位点整合表达片段的构建：参照步骤(1)，选择nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr作为整合表达位点，分别构建整合表达片段；将整合片段转化到BSM1中，并将含有CRE重组酶的质粒转化入BSM1中，去除抗性标记，即得到B.subtilis168基因工程菌BSM7。

3.应用权利要求1所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，将菌株活化并制备种子液，将种子液转接入发酵培养基装液量40％的发酵罐中，在25℃、pH7.0、转速600rpm下分批补料发酵，保持葡萄糖浓度在10-20g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，补料培养基的组成为葡萄糖1000g/L、酵母浸膏700g/L。

5.权利要求1所述基因工程菌在提高食品口感和风味方面的应用。