CN107828706A - 一种eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株及其应用。所述的疫苗株以从猪肠道结肠段分离获得的屎肠球菌作为疫苗抗原传递活载体，其中含有eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体。由上述重组屎肠球菌疫苗株制备得到的抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的二价口服疫苗可达到一次免疫预防两种疾病的目的，且具有绿色环保、高效安全、益生性好等特点。

Description

一种eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组 屎肠球菌疫苗株及其应用
技术领域
本发明涉及一种疫苗株及其构建方法，特别涉及一种能够同时抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的屎肠球菌疫苗株及其构建方法，还涉及该疫苗株在制备抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二价口服疫苗中的应用。本发明属于兽药技术领域。
背景技术
猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)均为冠状病毒属病毒，猪只感染后引起以急性肠炎、腹泻和死亡为主要症状的猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)。TGE和PED爆发呈明显的季节性特征，冬春季节为多发期，发病时呈现群体爆发的情况，新生仔猪发病率和死亡率可达到100％，给养猪业带来巨大损失。抗生素和抗病毒类常规药物治疗本病的效果不明显，主要采用疫苗接种进行预防。目前，国内外市场使用的仔猪冠状病毒性腹泻疫苗主要2类：一类是灭活苗，不同国家研制灭活疫苗所使用的TGE毒株不同，例如美国使用TGE-Vac株、日本使用TO-163株、匈牙利使用CKP株，我国使用华毒株；另一类是弱毒疫苗，2004 年哈尔滨兽医研究所成功研制了TGEV和PEDV二联弱毒疫苗，现欧美国家使用的疫苗主要是弱毒疫苗，目前商品化弱毒疫苗主要有我国的CV777株、日本的P-5V株、韩国的KPED-9株及DR13株，2015年国内首创的TGEV、PEDV、PoRV(G 型)三联活疫苗正式投产上市。
从20世纪60年代末期，我国就有了关于TGE的报道，近年来疫区更为扩大,并与猪流行性腹泻、猪轮状病毒病混合感染,给养猪业造成了严重的经济损失。2013 年4月底，在美国猪群中爆发了PED，随后该病蔓延至美国20多个州。TGEV和 PEDV的致病机理相似，TGEV和PEDV主要经肠道黏膜感染动物发病，肠绒毛上皮细胞是TGEV和PEDV的靶细胞。大量研究结果表明，仔猪主要通过初乳获得母源sIgA抗体产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护。因此，黏膜免疫是使仔猪获得免疫保护的重要途径，通过母猪接种疫苗后机体产生乳源sIgA抗体进而对哺乳仔猪提供保护，或免疫仔猪使其自身产生黏膜免疫应答，才能为机体提供足够的抵抗病毒感染的保护。
传统的TGE和PED单价苗和多联灭活疫苗不能刺激动物机体产生足够量的 sIgA抗体，保护效果不佳，且制苗成本也比较昂贵。同时灭活疫苗在猪体内产生免疫力时间长达二周，需要提前接种，以保证预防效果。弱毒疫苗虽然可引起黏膜免疫，但由于存在着成本高、易返祖、有潜在毒力增强风险等缺陷，限制了其在生产中的应用。经后海穴接种疫苗，虽可引起黏膜免疫应答，是对常规免疫接种途径的突破，增强了免疫保护力，接种一次即可，但接种疫苗时，进针深度需随猪龄增大而加深，进针时保持与直肠平行或稍偏上接种，同时给妊娠母猪接种疫苗时要适当保定，否则易引起机械性流产。
TGE和PED传统疫苗在免疫保护和安全性方面存在缺陷，而基因工程疫苗因成本低、生产简单、存储方便而成为TGE和PED疫苗研究热点。TGEV和PEDV 的表面纤突蛋白S蛋白是介导病毒与宿主细胞结合的靶蛋白，可诱导机体产生中和抗体，是各类基因工程疫苗研究的首选免疫抗原。2013年Meng等使用真核融合表达的TGEV和PEDV蛋白通过肌肉注射途径免疫小鼠，诱导小鼠产生了抗TGEV和 PEDV的中和抗体。理论与实践研究表明，以口服接种方式接种疫苗可诱导机体产生针对黏膜感染最为直接的黏膜免疫抗体sIgA，使动物获得免疫保护。2016年Zhang 等以表达TGEV和PEDV S蛋白的重组鼠伤寒沙门氏菌口服免疫猪，虽然能够诱导实验猪产生中和抗体，但利用致病菌作为疫苗抗原传递载体存在生物安全隐患。通过利用食品级微生物作为疫苗抗原表达与传递载体研制TGE和PED口服疫苗将更安全。乳酸菌作为微生态制剂中的主要益生菌，广泛应用于食品、饲料加工业。
1990年Isabel等通过单克隆抗体实验证明并定位完成了TGEV S蛋白能够刺激机体产生中和抗体的区域，并将其划分为四个区域，定义为A、B、C、D抗原位点，其中A、B和D位点高度保守。2016年Jiang等以干酪乳杆菌(L.casei 393) 为免疫抗原传递载体构建了表达TGEV S蛋白D抗原位点的重组乳酸菌制剂，口服免疫猪产生了一定的免疫保护效力。但该重组乳酸菌***采用了氯霉素抗性基因作为选择标记，随着该乳酸菌制剂在实践中的应用，抗性因子的转移将带来严重的生物安全性后果，同时该重组乳酸菌***为诱导型，在缺乏诱导剂的环境中，重组乳酸菌将停止疫苗抗原的分泌，不利于规模化生产，进一步制约了该重组乳酸菌制剂的推广应用。
因此，本发明的目的是研制更加安全、有效、廉价、接种方便的可使机体产生保护性黏膜免疫反应的TGE和PED二价疫苗。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种eGFP标记的、能够同时抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株。
本发明的目的之二是提供一种由上述重组屎肠球菌疫苗株制备得到的抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的二价口服疫苗。
本发明的目的之三是提供所述的重组屎肠球菌疫苗株及其制备得到的二价口服疫苗在预防猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明依据TGEV与PEDV主要经肠道黏膜感染动物发病的特点，从黏膜免疫角度设计疫苗以同时预防TGEV和PEDV感染，对仔猪临床腹泻病毒病发生和控制具有重要意义，也是本发明主要解决的关键科学问题。为了研制益生性能好、安全高效的抗TGE和PED二价口服疫苗，本发明使用了一株从猪肠道结肠段分离获得的益生性优良的屎肠球菌作为疫苗抗原传递活载体，利用增强型绿荧光蛋白(eGFP) 作为选择标记以替代抗生素抗性选择标记，基于非诱导组成型表达载体pLXeno，构建了组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420的重组屎肠球菌疫苗株，实现一次免疫预防两种疾病的目的，由该疫苗株制备得到的口服疫苗绿色环保、高效安全、益生性好。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株，所述的疫苗株以从猪肠道结肠段分离获得的屎肠球菌作为疫苗抗原传递活载体，其中含有eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体。
其中，优选的，所述的屎肠球菌命名为屎肠球菌N-16(Enterococcus Faecium N-16)，分类命名为屎肠球菌N-16(Enterococcus Faecium N-16)，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国.武汉.武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2017516，保藏时间为2017年9月18日。
其中，优选的，所述的重组表达载体中含有依次以linker连接的六个编码所述的TGEV S蛋白D抗原的核苷酸序列，该重复序列命名为6Ds，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，优选的，所述的eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体通过电转化方法转入屎肠球菌的感受态细胞中。
其中，优选的，所述的eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体是通过以下方法制备得到：
(1)屎肠球菌组成型表达载体pLXeno的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与eno-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了屎肠球菌组成型表达质粒，命名为pLXeno，其中eno为乳酸菌烯醇酶的组成型启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PgsAanchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；MCS 为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)表达6Ds-ps420融合蛋白重组表达质粒的构建
将扩增得到的编码TGEV S蛋白D抗原位点、PEDV S蛋白中和表位区ps420 蛋白以及eGFP的核苷酸序列分别与质粒pMD19-T simple、pMD18-T和pMD19-T simple连接，得到的载体分别命名为pMD19-Ts-6Ds、pMD18-T-ps420以及 pMD19-Ts-eGFP；对重组质粒pMD19-Ts-6Ds及pMD18-T-ps420进行双酶切，将回收纯化的6Ds基因与pMD18-T-ps420载体片段连接，构建重组质粒 pMD18-T-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶分别对质粒pMD18-T-6Ds-ps420和屎肠球菌组成型表达载体pLXeno进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的6Ds-ps420基因片段与pLXeno片段连接，构建重组表达质粒 pLXeno-6Ds-ps420；
(3)eGFP标记表达6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
重组质粒pMD19-Ts-eGFP以及重组质粒pLXeno-6Ds-ps420经双酶切，将回收纯化的eGFP基因片段与pLXeno-6Ds-ps420目的载体片段连接，构建重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420；利用限制性核酸内切酶对重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420进行双酶切处理，以切除氯霉素抗性编码基因，经DNA 胶回收试剂盒纯化目的基因片段，利用DNA Blunting Kit试剂盒平末端化后进行连接，构建非抗性标记的重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组乳酸菌疫苗株的方法，包括以下步骤：
(1)屎肠球菌组成型表达载体pLXeno的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与eno-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了屎肠球菌组成型表达质粒，命名为pLXeno，其中eno为乳酸菌烯醇酶的组成型启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；MCS 为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)表达6Ds-ps420融合蛋白重组表达质粒的构建
将扩增得到的编码TGEV S蛋白D抗原位点、PEDV S蛋白中和表位区ps420 蛋白以及eGFP的核苷酸序列分别与质粒pMD19-T simple、pMD18-T和pMD19-T simple连接，得到的载体分别命名为pMD19-Ts-6Ds、pMD18-T-ps420以及 pMD19-Ts-eGFP；对重组质粒pMD19-Ts-6Ds及pMD18-T-ps420进行双酶切，将回收纯化的6Ds基因与pMD18-T-ps420载体片段连接，构建重组质粒 pMD18-T-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶分别对质粒pMD18-T-6Ds-ps420和屎肠球菌组成型表达载体pLXeno进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的6Ds-ps420基因片段与pLXeno片段连接，构建重组表达质粒 pLXeno-6Ds-ps420；
(3)eGFP标记表达6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
重组质粒pMD19-Ts-eGFP以及重组质粒pLXeno-6Ds-ps420经双酶切，将回收纯化的eGFP基因片段与pLXeno-6Ds-ps420目的载体片段连接，构建重组质粒 pLXeno-eGFP-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶对重组质粒 pLXeno-eGFP-6Ds-ps420进行双酶切处理，以切除氯霉素抗性编码基因，经DNA 胶回收试剂盒纯化目的基因片段，利用DNA BluntingKit试剂盒平末端化后进行连接，构建非抗性标记的重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420；
(4)电转化
将步骤(3)构建得到的重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420电转入屎肠球菌感受态细胞中，通过流式细胞术筛选带有eGFP荧光标记的重组菌，从而获得eGFP 标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌。
所述的方法中，优选的，所述的屎肠球菌命名为屎肠球菌N-16，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2017516。
所述的方法中，优选的，扩增得到的编码TGEV S蛋白D抗原位点的核苷酸序列中含有依次以linker连接的六个编码所述的TGEV S蛋白D抗原的核苷酸序列，该重复序列命名为6Ds，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码eGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
更进一步的，本发明还提出了所述的重组屎肠球菌疫苗株在制备预防和治疗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二价口服疫苗中的用途。
一种猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二价口服疫苗，其含有本发明所述的重组屎肠球菌疫苗株。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、与传统灭活疫苗和弱毒疫苗相比，本发明利用益生菌屎肠球菌作为传递疫苗抗原的活载体研制抗PEDV和TGEV二价口服疫苗，口服免疫能诱导机体产生针对黏膜感染最为直接的黏膜免疫应答，刺激机体产生足够量的sIgA抗体，为机体提供抵抗病毒感染的保护力，免疫途径省时省力。灭活疫苗在猪体内产生免疫力时间长达二周，本发明口服疫苗在免疫后3天即可在粪便中检测到特异性sIgA，且屎肠球菌具有在肠道定植的特点，可在肠道内不断的诱导产生特异性sIgA，及时对抗入侵病原，免疫效果好，同时能够避免使用弱毒苗的不安全隐患。
2、屎肠球菌作为微生态制剂中的主要益生菌,安全无毒，广泛应用于食品、饲料加工业，具有固有免疫佐剂效应、黏膜粘附特性、动物肠道良好的定殖能力以及增强机体非特异性免疫等生物学特性，作为食品级表达载体可高效的表达外源基因，比减毒致病菌和病毒作为疫苗抗原传递载体更为安全。
3、本发明发明人从猪肠道结肠段分离获得了一株屎肠球菌E.faecium N-16株，通过与干酪乳杆菌L.casei 393益生性能对比，证实该屎肠球菌E.faecium N-16株益生性更佳，可显著促进断乳仔猪的生长，提高饲料的利用率。本发明使用屎肠球菌 E.faecium N-16株作为疫苗抗原传递活载体，研制了抗TGEV和PEDV感染重组屎肠球菌二价口服疫苗，可实现一次免疫预防两种疾病的目的，具有绿色环保、高效安全、益生性好的特点。
4、本发明利用增强型绿色荧光蛋白eGFP作为筛选标记替代了抗生素抗性筛选标记，构建了非抗性标记重组屎肠球菌***，以防止抗生素抗性标记的使用带来的危害，使其制品更具安全性，绿色环保。
5、本发明使用组成型表达载体构建了表达PEDV S蛋白中和表位区ps420和 TGEVS蛋白D抗原位点的重组屎肠球菌口服制剂，疫苗抗原可随着菌株的自然繁殖而持续地分泌，进而有效地刺激机体免疫应答，应用前景可观。
附图说明
图1为断乳仔猪饲喂菌后的状态观察；
图2为屎肠球菌组成型表达载体pLXeno的载体图谱；
图3为重组质粒pLXeno-6Ds-ps420鉴定结果；
M：DNA marker；1：SacI酶切结果；2：ApaI酶切结果；3：SacI和ApaI双酶切结果；4：重组质粒；
图4为重组表达载体pLXeno-eGFP-6Ds-ps420鉴定结果；
M.DNA Marker 8000；2.pLXeno-eGFP-6Ds-ps420经SacI和ApaI双酶切结果
图5为菌落PCR扩增结果；
M.DNA Marker DL8000；1-21.目的基因PCR扩增结果.22：空白对照
图6为重组屎肠球菌去除氯霉素抗性基因的验证；
A：含氯霉素抗性MRS平板；B：无氯霉素抗性MRS平板；
1：重组屎肠球菌pLXeno-6Ds-ps420/E.faecium N-16；2：重组屎肠球菌pLXeno/E.faecium N-16；3：重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6D-ps420/E.faecium N-16
图7为目的蛋白表达的Western blot鉴定结果；
M：预染蛋白Marker；1：pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16；2：pLXeno/E.faecium N-16
图8为eGFP表达的荧光显微镜检测结果；
A：pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16；B：pLXeno/E.faecium N-16
图9为免疫鼠粪便中抗TGEV和PEDV特异性sIgA抗体水平检测结果；
图10为免疫鼠***洗液中抗TGEV和PEDV特异性sIgA抗体水平检测结果；
图11为免疫小鼠血清中特异性抗TGEV和PEDV IgG水平。
菌种保藏信息：
菌株名称： 屎肠球菌N-16
Enterococcus Faecium N-16
分类命名： 屎肠球菌N-16
Enterococcus Faecium N-16
保藏单位： 中国典型培养物保藏中心
地址： 中国.武汉.武汉大学
菌种保藏编号： CCTCC NO.M 2017516
保藏时间： 2017年9月18日
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1屎肠球菌E.faecium N-16株与干酪乳杆菌L.casei 393的益生性比较
本发明对从猪肠道中分离的屎肠球菌E.faecium N-16株(CCTCC NO:M 2017516)及构建基因工程乳酸菌常用菌株干酪乳杆菌L.casei 393的益生性进行了对比分析。具体方法如下：
实验猪分为3组，每组10头，实验I组饲喂添加屎肠球菌E.faecium N-16株的普通日粮，实验II组饲喂添加干酪乳杆菌L.casei 393的普通日粮，实验III组为普通日粮对照组，在饲喂21天后，观察仔猪的生长情况，可见饲喂屎肠球菌E.faecium N-16组的断乳仔猪较其他两组整体精神状态更好，被毛更光滑、光亮，皮肤也更加红润，更爱运动，警觉性高，实验结果表明日粮中添加屎肠球菌E.faecium N-16能够显著地促进仔猪的生长，其益生效果优于干酪乳杆菌L.casei 393，结果见图1。
同时，通过称量断乳仔猪的体重和饲喂的料重，计算每组实验猪的日增重和料重比，结果可见饲喂屎肠球菌E.faecium N-16组与饲喂干酪乳杆菌L.casei 393组和培养基对照组相比显著提高了断乳仔猪的平均日增重，并且显著降低了料重比(p ≤0.05)，结果见表1和表2所示。由此可见，饲喂屎肠球菌E.faecium N-16能够显著提高断乳仔猪的生长性能，提高饲料的利用率。
表1各组断乳仔猪日增重结果
注：不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)，不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。
表2各组断乳仔猪料重比结果
注：不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)，不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。
实施例2 eGFP标记的、融合表达TGEV 6Ds以及PEDV ps420重组屎肠球菌的构建
1、pMD18-T-6Ds质粒的构建
将编码TGEV TH98株D抗原位点(SCYTVSDSSFFSYGEIPFGVTDGPRYCY) 的核苷酸序列重复六次，每段之间***linker序列(GGCGGTGGCGGAGGCGGA)，共***5个linker，得到的重复序列命名为6Ds。6Ds基因序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将得到的基因序列与 pMD18-T连接，转化TG1，重组菌提取质粒经PCR、酶切和测序鉴定，重组质粒命名为pMD18-T-6Ds。
2、pMD18-T-ps420质粒的构建
PEDV毒株为本实验室分离培养的PEDV HLJ-2012毒株。利用RNAFastl000 试剂盒(上海飞捷试剂公司)提取病毒RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增PEDV中和抗原表位区基因ps420(Accession No.：JX512907)，扩增得到的ps420 基因序列如SEQ ID NO.2所示，与pMD18-T连接，转化TG1，重组菌提取质粒经PCR、酶切和测序鉴定，重组质粒命名为pMD18-T-ps420。
3、pMD19-Ts-eGFP质粒的构建
以本实验室保存的质粒pEGFP-N1(Accession No.：U55762.1)为模板扩增eGFP 基因，扩增得到的eGFP基因序列如SEQ ID NO.3所示，与pMD18-T连接，转化 TG1，重组菌提取质粒经PCR、酶切和测序鉴定，重组质粒命名为pMD18-T-eGFP。
4.编码TGEV D位点基因、PEDV ps420基因和eGFP基因的PCR扩增
利用引物Fs1(含SacI酶切位点)和Rs1(含MluI酶切位点)，以pMD18-T-6Ds 质粒为模板，扩增6Ds基因片段(594bp)；利用引物Fs2(含MluI酶切位点)和 Rs2(含ApaI酶切位点，并带有柔性Linker编码基因序列)，以pMD18-T-ps420质粒为模板，扩增PEDV ps420基因(420bp)；利用引物Fe(含SacI酶切位点)和 Re(含KpnI酶切位点，并带有柔性Linker编码基因序列)，以pMD18-T-eGFP质粒为模板，扩增增强型绿色荧光蛋白eGFP基因(717bp)。引物序列见表3。
表3引物序列
5.表达6Ds-ps420和eGFP-6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
5.1屎肠球菌组成型表达载体pLXeno的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与eno-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了屎肠球菌组成型表达质粒，命名为pLXeno，其中eno为乳酸菌烯醇酶的组成型启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；MCS 为多克隆酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；载体图谱如图2所示。
5.2表达6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
将上述扩增得到的基因6Ds、ps420和eGFP分别与质粒pMD19-T simple(简称pMD19-Ts)、pMD18-T和pMD19-T simple连接，对重组质粒pMD18-T-ps420 进行MluI与ApaI双酶切、MluI与SacI双酶切、ApaI与SacI双酶切、PCR及测序鉴定。利用SacI和ApaI双酶切重组质粒pMD19-Ts-6Ds及pMD18-T-ps420，经DNA 胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将回收纯化的6Ds基因与pMD18-T-ps420载体片段连接，构建重组质粒pMD18-T-6Ds-ps420。利用限制性核酸内切酶SacI和ApaI 分别对质粒pMD18-T-6Ds-ps420和屎肠球菌组成型表达载体pLXeno进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的6Ds-ps420基因片段与 pLXeno片段连接，构建重组表达质粒pLXeno-6Ds-ps420，重组质粒的酶切鉴定结果见图3。制备屎肠球菌E.faecium N-16(CCTCC NO:M 2017516)感受态细胞，经电转化将重组质粒pLXeno-6Ds-ps420转入E.faecium N-16，在含有氯霉素抗性的选择培养基中筛选阳性克隆，命名为pLXeno-6Ds-ps420/E.faecium N-16。
5.3eGFP标记表达6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
重组质粒pMD19-Ts-eGFP经SacI和KpnI双酶切，回收大小约为750bp目的基因eGFP；重组质粒pLXeno-6Ds-ps420经SacI和KpnI双酶切，回收大小约为6000bp 目的载体片段。将回收纯化的eGFP基因片段与pLXeno-6Ds-ps420目的载体片段连接，构建重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420，酶切鉴定结果见图4。利用限制性核酸内切酶StuI和NcoI对重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420进行双酶切处理，以切除氯霉素抗性编码基因，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，利用DNA Blunting Kit试剂盒平末端化后进行连接，构建非抗性标记的重组质粒 pLXeno-eGFP-6Ds-ps420。
制备屎肠球菌E.faecium N-16(CCTCC NO:M 2017516)感受态细胞，经电转化技术将重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420转入E.faecium N-16中，经FACS Calibur 流式细胞仪在波长488nm筛选带有绿色荧光信号的重组菌，并准备24孔板，将流式细胞术筛选出有荧光信号的细菌转接到24孔板中，每孔20个菌，然后涂布于无抗性的MRS琼脂平板上，37℃培养36h。挑取单菌落进行PCR鉴定，以Fs1和Re 为两侧引物，通过菌落PCR扩增目的基因eGFP，菌落PCR鉴定结果见图5，将鉴定阳性的重组屎肠球菌命名为pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16。
重组屎肠球菌去除氯霉素抗性验证：将过夜培养的非抗性标记(eGFP标记) 的重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16、重组屎肠球菌 pLXeno-6Ds-ps420/E.faecium N-16和重组屎肠球菌pLXeno/E.faecium N-16分别在含氯霉素抗性的MRS琼脂平板和无氯霉素抗性的MRS琼脂平板上划线培养，37℃静置培养36h。结果见图6所示，eGFP标记(非抗性标记)重组屎肠球菌 pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16在无抗MRS培养基上正常生长，在含有氯霉素抗性的MRS琼脂培养基上不生长，而对照重组屎肠球菌pLXeno-6Ds-ps420/E. faecium N-16和pLXeno/E.faecium N-16在无抗和含氯霉素MRS培养基中均正常生长。
6.目的蛋白的表达与鉴定
6.1Western blot鉴定
37℃静置培养重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16 16h，收集菌体并裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，以兔抗ps420蛋白高免血清为一抗进行Western blot检测，结果见图7所示，目的蛋白获得表达，蛋白大小与预期相符。
6.2荧光显微镜观察
挑取pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16单菌落接种于5mL MRS液体培养基中，37℃培养16h；取1mL菌液5000rpm离心5min，弃上清，用无菌PBS缓冲液洗菌体3次，菌体沉淀用PBS缓冲液悬起，取10μL涂片，经荧光显微镜观察 eGFP的表达情况。结果见图8所示，重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E. faecium N-16菌体可见明显的绿色荧光(A)，而对照组屎肠球菌pLXeno/E.faecium N-16的菌体未见绿色荧光。
实施例3重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16的免疫原性评价
本发明以BALB/c小鼠为动物模型***性评价了该重组屎肠球菌 pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16的免疫原性。8周龄BALB/c小鼠分为4组，每组10只，分别经口服途径接种重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16、pLXeno-6Ds-ps420/E.faecium N-16和pLXeno/E.faecium N-16，口服剂量为 200μL 2×109CFU/mL重组屎肠球菌，口服200μL PBS为对照。免疫程序为每2周免疫1次，共计免疫3次。采用ELISA方法检测BALB/c小鼠粪便、***粘液中sIgA 抗体水平以及血清中IgG抗体水平，抗体中和效价检测以及淋巴细胞增殖实验。具体结果如下。
1特异性sIgA抗体的测定
1.1免疫鼠粪便中特异性sIgA抗体检测结果
分别于免疫前及每次免疫后第1d、2d、7d采集小鼠粪便样品，采用ELISA方法检测抗TGEV和PEDV特异性sIgA抗体水平。检测结果见图9所示，口服免疫重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16和pLXeno-6Ds-ps420/E. faecium N-16后诱导小鼠机体产生了显著于对照组(PBS组和pLXeno/E.faecium N-16空载体组)的抗TGEV和PEDV特异性sIgA抗体水平，两个重组屎肠球菌免疫组间差异不显著。
1.2免疫鼠***洗液中特异性sIgA抗体测定
于免疫前及每次免疫后第7d收集小鼠***洗液样本，采用ELISA方法检测抗 TGEV和PEDV特异性黏膜抗体sIgA水平。检测结果见图10所示，口服免疫重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16和pLXeno-6Ds-ps420/E.faecium N-16后诱导小鼠机体产生了显著于对照组(PBS组和pLXeno/E.faecium N-16空载体组)的抗TGEV和PEDV特异性sIgA抗体水平，两个重组屎肠球菌免疫组间差异不显著。
2免疫小鼠血清中特异性抗体IgG测定
分别以TGEV和PEDV全病毒作为抗原包被96孔ELISA反应板，以采集的免疫重组屎肠球菌小鼠血清为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，检测免疫小鼠血清中抗TGEV和PEDV特异性抗体IgG水平。检测结果见图11所示，免疫重组屎肠球菌pLXeno-eGFP-6Ds-ps420/E.faecium N-16和pLXeno-6Ds-ps420/E.faecium N-16 后诱导小鼠机体产生了显著于对照组(PBS组和pLXeno/E.faecium N-16空载体组) 的抗TGEV和PEDV特异性血清IgG抗体水平，两个重组屎肠球菌免疫组间差异不显著。
3抗体中和效价检测
将TGEV和PEDV分别在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-3……，每孔病毒悬液量为100μL，每个稀释度作8孔，每孔加入100μL ST或Vero细胞悬液，培养板的最后一行设为细胞对照(细胞悬液的浓度以细胞在24h内长满单层为度)，置于5％CO2温箱37℃培养，逐日观察细胞病变。ST细胞接TGEV后第二天开始出现明显的病变，Vero细胞接PEDV后第三天开始出现明显的病变，按Reed 和Muench两氏法计算TGEV TCID50约为10-4.83，PEDVTCID50为10-3.83。
采用固定病毒稀释抗体的方法对口服重组屎肠球菌免疫小鼠所获得的血清抗体进行病毒中和效价的测定。每孔病毒浓度为100TCID50，血清抗体以2倍递进稀释，即1：10，1：20，1：40，1：80，1：160……，病毒与稀释后的抗体混匀后， 37℃孵育1h，然后接入ST或Vero细胞，将培养板置5％CO2、37℃恒温培养箱培养，逐日观察细胞病变并记录结果，进行统计分析。检测结果显示，免疫鼠血清抗体中和TGEV效价为1：100，中和PEDV效价为1：112.2。
4脾淋巴细胞增殖试验
4.1TGEV 6Ds蛋白抗原刺激脾淋巴细胞增殖
无菌取免疫鼠脾细胞体外培养，分别用终浓度为1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL 的TGEV 6Ds抗原刺激，结果显示(见表4)：5μg组对脾细胞的增殖作用最高， 25μg组对脾细胞的增殖作用高于1μg组(p<0.05)，但低于5μg组对脾细胞的增殖作用。
表4不同浓度6Ds刺激脾细胞的增殖作用
4.2PEDV ps420蛋白抗原刺激脾淋巴细胞增殖
无菌取免疫鼠脾细胞体外培养，分别用终浓度为1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL 的PEDV ps420抗原刺激，结果显示(见表5)：1μg组和5μg组对脾细胞的增殖作用高于25μg组(p<0.05)
表5不同浓度ps420刺激脾细胞的增殖作用
综上所述，本发明使用从猪肠道中分离的屎肠球菌E.faecium N-16株作为疫苗抗原传递载体研制的抗TGEV和PEDV重组屎肠球菌二价口服疫苗能够有效诱导动物机体产生显著黏膜免疫反应和***性免疫反应，显示了良好的免疫原性，并具有良好的益生性。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株及其应用
<130> klpi170707
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 594
<212> DNA
<213> 6Ds
<400> 1
tcttgttata ctgtttcaga ctcatcattt ttctcatatg gtgaaattcc atttggcgtt 60
actgatggtc cacggtattg ttatggcggt ggcggaggcg gatcttgtta tactgtttca 120
gactcatcat ttttctcata tggtgaaatt ccatttggcg ttactgatgg tccacggtat 180
tgttatggcg gtggcggagg cggatcttgt tatactgttt cagactcatc atttttctca 240
tatggtgaaa ttccatttgg cgttactgat ggtccacggt attgttatgg cggtggcgga 300
ggcggatctt gttatactgt ttcagactca tcatttttct catatggtga aattccattt 360
ggcgttactg atggtccacg gtattgttat ggcggtggcg gaggcggatc ttgttatact 420
gtttcagact catcattttt ctcatatggt gaaattccat ttggcgttac tgatggtcca 480
cggtattgtt atggcggtgg cggaggcgga tcttgttata ctgtttcaga ctcatcattt 540
ttctcatatg gtgaaattcc atttggcgtt actgatggtc cacggtattg ttat 594
<210> 2
<211> 420
<212> DNA
<213> ps420
<400> 2
gttactttgc catcatttaa tgatcattct tttgttaaca ttactgtctc tgcgtccttt 60
ggtggtcata gtggtgccaa ccttattgca tctgacacta ctatcaatgg gtttagttct 120
ttctgtgttg acactagaca atttaccatt tcactgtttt ataacgttac aaacagttat 180
ggttatgtgt ctaaatcaca ggacagtaat tgccctttca ccttgcaatc tgttaatgat 240
tacctgtctt ttagtaaatt ttgtgtttcc accagccttt tggctagtgc ctgtaccata 300
gatctttttg gttaccctga gtttggtagt ggtgttaagt ttacgtccct ttactttcaa 360
ttcacaaagg gtgagttgat tactggcacg cctaaaccac ttgaaggtgt cacggacgtt 420
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> eGFP
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 4
<211> 776
<212> DNA
<213> eno
<400> 4
gcatattaca aaaaagtcct ctgctcgcta acgcgggtgg agggcttatt tttttgaaac 60
taagaattca cttttcgtta ctgtgcaatt tgtgtgcaat ttggtccttt aataaccgct 120
acataagtgt ttcgtactcc cgggctgcgc agaaacccgg ttaaatggga aaaggtagga 180
cagcataacc ccgagtaatc ggggtttttg ttttgtttaa aattaaaaac attcaaaaca 240
ggatagaggc gtgacatgca tcatgctaaa acgccgataa gtgatagcct gagatccgaa 300
ttgcagcgac gatcttcacc gttcattgct cgggtgcttg atgagagatt cggcggctat 360
ttttgcaaac gctaacatta tgacttggaa actgctcatt atataacgaa cgggaataaa 420
accaaccctt gtcactactg aactaagaca caaactgaat cacttttccc agcatgaaaa 480
ttccattaga aacaacccga aacccgcttt caaaaaaagc cgccagacgg gatgatgttt 540
tagtaaaatc cgaataatct tcacaccaaa aaaatagatg ttctaagttt accgaatatg 600
tgattgtttt tggacgatta aggccgcaga cttgcgataa agcggaaccc ctgctacaat 660
tggtcttgtt ggtaaaggaa aacagcattt gttgggttcc taattttttt cagcttgctg 720
ggtcggcgaa cgactcggag ggacgtgaaa tgacccatta aagaaggacg tgcctt 776
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> T7g10
<400> 5
aataattttg tttaacttta ag 22
<210> 6
<211> 1143
<212> DNA
<213> PgsA anchor
<400> 6
atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60
aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120
atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt actctgacga cgtactctca 180
gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240
ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300
ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360
catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaatct cacggttctc 420
aacagcgcaa acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480
gaatttgcga agcaaaacct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540
aagaaaattt tgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg caacgcttgg ctttaccgat 600
gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct 660
gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg ctgacattgt tgttgtgcag 720
tcacactggg gacaagagta tgacaatgat ccaaatgacc gccagcgcca gcttgcaaga 780
gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc acccgcacat cttagaaccg 840
attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgatcaa 900
ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca 960
ggccgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcacc tgtgaaaaaa 1020
gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg 1080
aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140
taa 1143
<210> 7
<211> 404
<212> DNA
<213> rrnBT1T2
<400> 7
ttggcttatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 60
tgataaaaca gaatttgcct cccggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 120
actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 180
ccaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 240
atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 300
aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 360
catcaaagga atcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgc 404

Claims (10)

1.一种eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株以从猪肠道结肠段分离获得的屎肠球菌作为疫苗抗原传递活载体，其中含有eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体。
2.如权利要求1所述的重组屎肠球菌疫苗株，其特征在于，所述的屎肠球菌命名为屎肠球菌N-16，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCCNO.M 2017516。
3.如权利要求1所述的重组屎肠球菌疫苗株，其特征在于，所述的重组表达载体中含有依次以linker连接的六个编码所述的TGEV S蛋白D抗原的核苷酸序列，该重复序列命名为6Ds，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的重组屎肠球菌疫苗株，其特征在于，所述的eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体通过电转化方法转入屎肠球菌的感受态细胞中。
5.如权利要求1所述的重组屎肠球菌疫苗株，其特征在于，所述的eGFP标记的组成型表达TGEV S蛋白D抗原位点和PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体是通过以下方法制备得到：
(1)屎肠球菌组成型表达载体pLXeno的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与eno-T7g10-PgsAanchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了屎肠球菌组成型表达质粒，命名为pLXeno，其中eno为乳酸菌烯醇酶的组成型启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)表达6Ds-ps420融合蛋白重组表达质粒的构建
将扩增得到的编码TGEV S蛋白D抗原位点、PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白以及eGFP的核苷酸序列分别与质粒pMD19-T simple、pMD18-T和pMD19-T simple连接，得到的载体分别命名为pMD19-Ts-6Ds、pMD18-T-ps420以及pMD19-Ts-eGFP；对重组质粒pMD19-Ts-6Ds及pMD18-T-ps420进行双酶切，将回收纯化的6Ds基因与pMD18-T-ps420载体片段连接，构建重组质粒pMD18-T-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶分别对质粒pMD18-T-6Ds-ps420和屎肠球菌组成型表达载体pLXeno进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的6Ds-ps420基因片段与pLXeno片段连接，构建重组表达质粒pLXeno-6Ds-ps420；
(3)eGFP标记表达6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
重组质粒pMD19-Ts-eGFP以及重组质粒pLXeno-6Ds-ps420经双酶切，将回收纯化的eGFP基因片段与pLXeno-6Ds-ps420目的载体片段连接，构建重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶对重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420进行双酶切处理，以切除氯霉素抗性编码基因，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，利用DNA Blunting Kit试剂盒平末端化后进行连接，构建非抗性标记的重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420。
6.一种构建权利要求1-5任一项所述的重组乳酸菌疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)屎肠球菌组成型表达载体pLXeno的构建
在质粒pPG612的基础上进行改造，利用XbaI和XhoI对质粒pPG612进行双酶切，酶切后的载体片段与eno-T7g10-PgsA anchor-MCS-rrnBT1T2序列连接，构建了屎肠球菌组成型表达质粒，命名为pLXeno，其中eno为乳酸菌烯醇酶的组成型启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；T7g10为翻译增强子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PgsA anchor的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；MCS为多克隆酶切位点，至少包括Sac I和Apa I限制性内切酶酶切位点；rrnBT1T2为大肠杆菌转录终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)表达6Ds-ps420融合蛋白重组表达质粒的构建
将扩增得到的编码TGEV S蛋白D抗原位点、PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白以及eGFP的核苷酸序列分别与质粒pMD19-T simple、pMD18-T和pMD19-T simple连接，得到的载体分别命名为pMD19-Ts-6Ds、pMD18-T-ps420以及pMD19-Ts-eGFP；对重组质粒pMD19-Ts-6Ds及pMD18-T-ps420进行双酶切，将回收纯化的6Ds基因与pMD18-T-ps420载体片段连接，构建重组质粒pMD18-T-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶分别对质粒pMD18-T-6Ds-ps420和屎肠球菌组成型表达载体pLXeno进行双酶切处理，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的6Ds-ps420基因片段与pLXeno片段连接，构建重组表达质粒pLXeno-6Ds-ps420；
(3)eGFP标记表达6Ds-ps420融合蛋白重组屎肠球菌的构建
重组质粒pMD19-Ts-eGFP以及重组质粒pLXeno-6Ds-ps420经双酶切，将回收纯化的eGFP基因片段与pLXeno-6Ds-ps420目的载体片段连接，构建重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420，利用限制性核酸内切酶对重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420进行双酶切处理，以切除氯霉素抗性编码基因，经DNA胶回收试剂盒纯化目的基因片段，利用DNA Blunting Kit试剂盒平末端化后进行连接，构建非抗性标记的重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420；
(4)电转化
将步骤(3)构建得到的重组质粒pLXeno-eGFP-6Ds-ps420电转入屎肠球菌感受态细胞中，通过流式细胞术筛选带有eGFP荧光标记的重组菌，从而获得eGFP标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的屎肠球菌命名为屎肠球菌N-16，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO.M 2017516。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增得到的编码TGEV S蛋白D抗原位点的核苷酸序列中含有依次以linker连接的六个编码所述的TGEV S蛋白D抗原的核苷酸序列，该重复序列命名为6Ds，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码PEDV S蛋白中和表位区ps420蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码eGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.权利要求1-5任一项所述的重组屎肠球菌疫苗株在制备预防和治疗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二价口服疫苗中的用途。
10.一种猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二价口服疫苗，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的重组屎肠球菌疫苗株。
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