CN107810181B

CN107810181B - 突变的异柠檬酸脱氢酶idh1 r132h的抑制剂

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Publication number: CN107810181B
Application number: CN201680038633.9A
Authority: CN
Inventors: H.希尔默
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2036-07-22
Also published as: JP6804516B2; IL256024A; US20180222870A1; MX2018001205A; CU20180014A7; US10344004B2; DOP2018000027A; BR112018001534A2; TW201708193A; EA201890386A1; WO2017016992A1; SV2018005621A; KR20180030789A; CA2993473A1; CO2018000793A2; AU2016300980A1; PE20181038A1; AU2016300980B2; NI201800014A; ECSP18006465A

Abstract

本发明涉及加合物(2E)‑丁‑2‑烯二酸‑3‑(2‑{[4‑(三氟甲氧基)苯基]氨基}‑1‑[(1R,5R)‑3,3,5‑三甲基环己基]‑1H‑苯并咪唑‑‑基)丙酸(1:4)，制备该加合物的方法，包含该加合物的药物组合物以及该加合物用于制备治疗疾病的药物的用途。

Description

突变的异柠檬酸脱氢酶IDH1 R132H的抑制剂

本发明涉及加合物(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(1:4)，制备该加合物的方法，包含该加合物的药物组合物以及该加合物用于制备治疗疾病的药物的用途。

介绍

3-(2-苯氨基-1-环己基-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸作为突变的异柠檬酸脱氢酶IDH1 R132H的抑制剂公开于公布的说明书WO2015/121210(A1)中。

IDH1 R132H参与多种细胞过程，例如柠檬酸循环、脂质代谢、修复过程如组蛋白甲基化和DNA甲基化(Prensner, J.R., and Chinnaiyan, A.M.: Metabolism unhinged:IDH mutations in cancer, Nature Medicine 2011, 17, 291-293)。IDH1突变的抑制代表了***的有希望的疗法。

基于现有技术，目的在于提供突变的异柠檬酸脱氢酶IDH1 R132H的高度有效的抑制剂，其可用于治疗人体和/或动物体的疾病，特别是用于***。

本发明的描述

本发明涉及(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(1:4)，在下文中也称为加合物或根据本发明的加合物。

其采用包含一个富马酸分子比四个3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5- 三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸分子的加合物的形式。

各组分的结构式如下所示:

3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸

(2E)-丁-2-烯二酸(富马酸)

已经令人惊讶地发现，该加合物与游离的3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸相比具有更高的生物利用度。

与此同时，X-射线晶体学的研究已经能够表明该加合物是盐，即其由质子从富马酸转移到3-(2-苯氨基-1-环己基-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸而得到。

该加合物优选以结晶形式存在。

本发明还涉及(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(1:4)的结晶形式，其特征在于在以下2θ角的X射线衍射图中的最大值:5.4、6.8、10.2、10.3、10.8、11.1、16.8、21.6。

本发明还涉及(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(1:4)的结晶形式，其特征在于在以下波数的拉曼光谱中的最大值(值的单位为cm^-1):

3088、3047、2934、2910、2874、2771、2717、1658、1632、1615、1521、1463、1451、1420、1338、1306、1294、1277、1245、1198、1184、1167、1155、1127、1109、1077、1049、1018、979、961、943、922、908、877、866、839、817、789、767、714、700、685、646、631、613、568、517、503、450、438、416、388、358、339、330、102。

根据本发明的加合物可通过将3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸与过量(基于加合物组分的摩尔比)的(2E)-丁-2-烯二酸溶解于异丙醇中制备。优选相对于1份3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸0.3-0.8份(2E)-丁-2-烯二酸的摩尔比，特别优选相对于1份3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸使用0.5份(2E)-丁-2-烯二酸。

在蒸馏掉异丙醇时，加合物结晶出来并可以被分离。

本发明还提供了用于制备根据本发明的加合物的方法。

该方法包括以下步骤

- 将3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸和(2E)-丁-2-烯二酸引入异丙醇中，其中对于1 mol 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸，使用0.3-0.8 mol (2E)-丁-2-烯二酸，

- 在搅拌下加热混合物至沸点以获得澄清溶液，

- 使(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(1:4)结晶出来，优选通过浓缩该溶液。

3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸可以与WO2010/151441中公开的4-(1-环戊基-1H-苯并[d]咪唑-2-基氨基)-N-羟基苯甲酰胺的方法类似地制备。下面进一步描述另一种改进的方法。

富马酸是可商购的。

根据本发明的加合物可以以同位素变体的形式存在。因此，本发明包含根据本发明的加合物的一种或多种同位素变体，特别是含氘加合物。

术语“同位素变体”被定义为具有构成这样的物质的一种或多种同位素的非天然成分的物质。

表述“非天然成分”被理解为是指高于其自然频率的这样的同位素的成分。要在这个方面中使用的同位素的自然频率可以在"Isotopic Compositions of the Elements1997", Pure Appl. Chem., 70(1), 217-235, 1998中找到。

这样的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的稳定的且放射性的同位素，如²H (氘)、³H (氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³³P、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I和¹³¹I。

根据本发明的加合物显示药理学和药代动力学活性的不可预见的有用谱。

因此它适合用作治疗和/或预防人类和动物疾病的药物。

根据本发明的加合物作为IDH1 R132H抑制剂的药物效力可以通过3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸呈现的作用得到解释。

本发明还提供了根据本发明的加合物用于治疗和/或预防病症，特别是用于***的用途。

本发明还提供了用于治疗和/或预防肿瘤的方法中的根据本发明的加合物。

本发明还提供了根据本发明的加合物用于制备用于治疗和/或预防病症，特别是用于***的药物的用途。

本发明还提供了使用药物有效量的根据本发明的加合物治疗和/或预防病症，特别是用于***的方法。

可以根据本发明治疗的实体瘤是例如乳腺、呼吸道、脑、生殖器官、胃肠道、泌尿生殖道、眼、肝脏、皮肤、头和颈、甲状腺、甲状旁腺、骨和***的肿瘤以及这些肿瘤的转移灶。

可以治疗的血液肿瘤是，例如，

- 多发性骨髓瘤，

- 淋巴瘤或

- 白血病。

可治疗的乳腺肿瘤是，例如：

- 具有阳性激素受体状态的乳腺癌

- 具有阴性激素受体状态的乳腺癌

- Her-2阳性乳腺癌

- 激素受体和Her-2阴性乳腺癌

- BRCA相关乳腺癌

- 炎性乳腺癌。

可以治疗的呼吸道肿瘤是，例如，

- 非小细胞支气管癌，例如鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌和

- 小细胞支气管癌。

可以治疗的脑肿瘤是，例如，

- 神经胶质瘤，

- 胶质母细胞瘤，

- 星形细胞瘤，

- 脑膜瘤和

- 髓母细胞瘤。

可以治疗的***官的肿瘤是，例如:

- ***癌，

- 恶性附睾肿瘤

- 恶性睾丸肿瘤和

- ***癌。

可以治疗的女性生殖器官的肿瘤是，例如:

- 子宫内膜癌

- 子***

- 卵巢癌

- ***癌

- 外阴癌

可以治疗的胃肠道肿瘤是，例如:

- 结直肠癌

- ***癌

- 胃癌

- 胰腺癌

- 食道癌

- 胆囊癌

- 小肠癌

- 唾液腺癌

- 神经内分泌肿瘤

- 胃肠道间质瘤

可以治疗的泌尿生殖道肿瘤是，例如:

- 膀胱癌

- 肾细胞癌

- 肾盂和下尿道癌

可以治疗的眼肿瘤是，例如:

- 视网膜母细胞瘤

- 眼内黑素瘤

可以治疗的肝脏肿瘤是，例如:

- 肝细胞癌

- 胆管细胞癌

可以治疗的皮肤肿瘤是，例如:

- 恶性黑素瘤

- 基底细胞癌

- spinaliomas

- 卡波西肉瘤

- Merkel细胞癌

可以治疗的头和颈的肿瘤是，例如:

- 喉癌

- 咽和口腔癌

- 中线结构的癌症(例如NMC, C.A. French, Annu. Rev. Pathol. 2012, 7:247-265)

可以治疗的肉瘤是，例如:

- 软组织肉瘤

- 骨肉瘤

可以治疗的淋巴瘤是，例如:

- 非霍奇金淋巴瘤

- 霍奇金淋巴瘤

- 皮肤淋巴瘤

- 中枢神经***淋巴瘤

- AIDS相关的淋巴瘤

可以治疗的白血病是，例如:

- 急性髓性白血病

- 慢性髓性白血病

- 急性淋巴性白血病

- 慢性淋巴性白血病

- 毛细胞白血病

根据本发明的加合物可以全身地和局部地起作用。为此目的，其可以以合适的方式，例如通过口服、肠胃外、肺部、鼻部、舌下、舌、含服、直肠、皮肤、透皮、结膜或耳道途径或作为植入物或支架施用。

根据本发明的加合物可以以适合于这些施用途径的施用形式施用。

用于口服施用的合适的施用形式是根据现有技术起作用的那些，其可以快速且以改良的方式释放根据本发明的加合物，例如片剂(未包衣或包衣片剂，例如具有耐胃液或延迟溶出或不溶性包衣，其控制根据本发明的加合物的释放)、在口腔中快速崩解的片剂或膜剂/薄片(wafers)、膜剂/冻干产物、胶囊(例如硬或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丹剂、粉剂、乳剂、混悬剂或气雾剂。

可以在避免再吸收步骤(例如通过静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰髓内途径)或包括再吸收(例如通过肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内途径)的情况下完成肠胃外施用。适于肠胃外施用的施用形式包括混悬剂、乳剂、冻干产物或无菌粉末形式的注射和输注制剂。

用于其它施用途径的合适的施用形式是例如用于吸入的药物形式(包括粉末吸入器、喷雾器)、滴鼻剂或喷雾剂；用于舌、舌下或含服施用的片剂、膜剂/薄片或胶囊、栓剂、耳或眼制剂、***胶囊、水性混悬剂(洗剂、振摇混合物)、亲脂性混悬剂、软膏剂、乳膏剂、透皮治疗***(例如贴剂)、乳、糊剂、泡沫剂、撒粉剂、植入剂或支架。

根据本发明的加合物可以转化为所提及的施用形式。这可以通过与惰性的、无毒的药学上合适的助剂混合以本身已知的方式来完成。这些助剂包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂和分散剂或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧脱水山梨糖醇油酸酯)、粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂，例如抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料，例如氧化铁)和香料和/或矫味剂。

本发明还提供了药物，其包含典型地与一种或多种惰性的、无毒的药学上合适的助剂一起使用的根据本发明的加合物，以及其用于上述目的的用途。

根据本发明的加合物通过用药物制剂中常用的助剂将一种或多种活性成分转化成期望的施用形式以本身已知的方式配制以提供药物制剂。

所使用的助剂例如可以是载体物质、填充剂、崩解剂、粘合剂、湿润剂、助流剂、吸收剂和吸附剂、稀释剂、共溶剂、乳化剂、矫味剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、用于改变渗透压的盐或缓冲剂。应当参考Remington´s Pharmaceutical Science, 第15版. MackPublishing Company, East Pennsylvania (1980)。

药物制剂可以以如下形式存在

固体形式，例如作为片剂、糖衣片剂、丸剂、栓剂、胶囊、透皮***或

半固体形式，例如作为软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂、乳剂或

液体形式，例如作为酊剂、混悬剂或乳剂。

在本发明上下文中，助剂可以是例如盐、糖(单糖、二糖、三糖、寡糖和/或多糖)、蛋白质、氨基酸、肽、脂肪、蜡、油、烃及其衍生物，并且助剂可以是天然来源的或者可以通过合成或部分合成的手段获得。

用于口服或经口施用的有用形式尤其是片剂、糖衣片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、混悬剂或乳剂。

用于肠胃外施用的有用形式尤其是混悬剂或乳剂。

根据本发明的加合物可以单独使用或者如果需要，与一种或多种其它药理活性物质组合使用，条件是该组合不会导致不希望的和不可接受的副作用。因此，本发明进一步提供了特别是用于预防和治疗上述病症的包含根据本发明的加合物和一种或多种其它活性成分的药物。

例如，根据本发明的加合物可以与用于***病症的已知的抗过度增殖、细胞生长抑制或细胞毒性物质组合，但是与此同时其也可以与具有支持或组分性质的那些物质组合、与在血管发生中显示出积极作用的那些化合物组合。

尽管不是详尽的清单，但是可用于组合的适合的药理活性物质例如包括:

131I-chTNT、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿柏西普、阿地白介素、阿仑珠单抗、阿利维A酸、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿昔替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、硼替佐米、波舒替尼、brentuximab、布舍瑞林、白消安、卡巴他赛、苹果酸卡博替尼(cabozantinib-s-malate)、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡非佐米、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来考昔、西莫白介素、西地尼布、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、copanlisib、克立他酶、克唑替尼、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、阿法达贝泊汀、达沙替尼、柔红霉素、达帕菲尼、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、地舒单抗、地洛瑞林、盐酸右雷佐生、二溴螺氯铵、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星+雌酮、依库珠单抗、依决洛单抗、乙酸甲基羟基玫瑰树碱、艾曲波帕、内皮他丁、依诺他滨、恩杂鲁胺、表柔比星、环硫雄醇、红细胞生成素α、红细胞生成素β、依他铂、艾立布林、埃罗替尼、***、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福美坦、福莫司汀、氟维司群、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉姆单抗、谷卡匹酶、glutoxim、戈舍瑞林、二盐酸组胺、组氨瑞林、羟基脲、碘-125粒子、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、英丙舒凡、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、伊匹木单抗、伊立替康、伊沙匹隆、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、利舒脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索罗酚、二氯甲基二乙胺、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、美雄烷、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基乙酰丙酸甲酯、***、米法莫肽、米替福新、米铂、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奈达铂、奈拉滨、尼洛替尼、尼鲁米特、尼妥珠单抗、尼莫司汀、二胺硝吖啶、阿托珠单抗、奥法木单抗、高三尖杉酯碱、奥美拉唑、奥普瑞白介素、奥沙利铂、奥佐米星、p53基因疗法、紫杉醇、帕利夫明、钯-103粒子、盐酸帕洛诺司琼、帕米膦酸、帕米膦酸二钠、帕木单抗、帕唑帕尼、培门冬酶、PEG-红细胞生成素β(甲氧基PEG-红细胞生成素β)、聚乙二醇化非格司亭、聚乙二醇干扰素α-2b、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、培磷酰胺、培妥珠单抗、溶链菌、吡柔比星、普乐沙福、普利霉素、聚氨葡糖、聚磷酸***、多糖-K、泊马度胺、pomatinib、卟吩姆钠、普拉曲沙、泼尼氮芥、***、丙卡巴肼、喹高利特、氯化镭-223、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫芦单抗、拉布立酶、雷莫司汀、雷佐生、refametinib、瑞戈非尼、利塞膦酸、利妥昔单抗、罗米地新、甲砜霉素、roniciclib、ruxolitinib、沙格司亭、sipuleucel-T、西佐喃、索布佐生、甘氨双唑钠、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、他拉泊芬、滑石、他米巴罗汀、他莫昔芬、他索那敏、替西白介素、替加氟、替加氟+吉美嘧啶+奥替拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦西莫司、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、噻替派、胸腺法新、硫鸟嘌呤、托珠单抗、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、碘131托西莫单抗、曲美替尼、曲贝替定、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维甲酸、曲洛司坦、曲普瑞林、曲磷胺、色氨酸、乌苯美司、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、维莫德吉、伏力诺他、伏氯唑、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。

通常，可以用根据本发明的加合物与其它细胞生长抑制或细胞毒性活性剂的组合来实现以下目的：

• 与用单独的活性成分的治疗相比，在减缓肿瘤生长、减小其尺寸或甚至完全消除它的方面的改善的效力；

• 与单一疗法的情况相比，使用以更低剂量使用的化疗药物的可能性；

• 与各自施用相比，具有更少副作用的更可耐受的疗法的可能性；

• 治疗更广泛的肿瘤病症的可能性；

• 实现对疗法的更高的响应速度；

• 与当今的标准疗法相比，更长的患者的存活时间。

另外，根据本发明的加合物也可以与放射疗法和/或外科手术干预联合使用。

实验部分

实施例。

实施例1

3-(3-硝基-4-{[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]氨基}苯基)丙酸甲酯的制备

首先向作为在3.0 L乙腈中的溶液的402 g (1.77 mol) 3-(4-氟-3-硝基苯基)丙酸甲酯中装入367 g (2.66 mol)碳酸钾并加入300 g (2.12 mol) (1R,5R)-3,3,5-三甲基环己胺。将混合物在100℃的夹套温度下回流搅拌12小时。冷却至20℃后，向混合物中加入3.6L水。为了改善相分离，加入1.0L饱和氯化钠溶液。除去下层水相。将有机相在50℃的夹套温度下减压(约50mbar)浓缩，得到油状残余物。

产量: 640.5 g (理论的104%)高度粘稠的橙色油。

¹H-NMR (400MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.75 – 0.87 (m, 2H), 0.89 (d, 3H),0.93 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.10 (t, 1H), 1.34 – 1.39 (m, 1H), 1.68 – 1.83(m, 2H), 1.99 – 2.02 (m, 1H), 2.58 – 2.62 (m, 2H), 2.75 – 2.79 (m, 2H), 3.57(s, 3H), 3.73 – 3.82 (m, 1H), 7.07 (d, 1H), 7.44 (dd, 1H), 7.79 (br. d., 1H),7.89 (d, 1H)。

实施例2

3-(3-氨基-4-{[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]氨基}苯基)丙酸甲酯二盐酸盐二噁烷溶剂合物的制备

首先在氢化反应器中向作为在3.2 L四氢呋喃中的溶液的640.5 g (1.77 mol)3-(3-硝基-4-{[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]氨基}苯基)丙酸甲酯(来自实施例1的粗产物)中装入32 g钯催化剂(5重量%; 0.05当量, 32 g, 88.5 mmol)，并将该混合物在25℃的温度下在氢气气氛(1.5巴正压)下搅拌10小时。将反应混合物通过压力过滤器(Seitz K300滤板)过滤，并将滤液在50℃的夹套温度下减压(约50mbar)浓缩，得到油状残余物。将残余物溶于1.3L二噁烷中，并在20℃的内部温度下历时20分钟的时段向其中加入560mL 4N HCl的二噁烷溶液(4.4mol HCl)。在此过程中，产物结晶出来。将其搅拌2小时，滤出并每次用500mL MTBE洗涤两次。将该潮湿的产物在真空下在40℃的温度下的干燥箱中干燥4小时。

产量: 785 g (理论的91%，基于3-(4-氟-3-硝基苯基)丙酸甲酯的使用)淡黄色固体。

¹H-NMR (400MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.72 – 0.84 (m, 1H), 0.85 – 1.05(m, 10H), 1.19 – 1.28 (m, 1H), 1.31 – 1.35 (m, 1H), 1.59 – 1.71 (m, 2H), 1.90– 1.97 (m, 1H),2.56 – 2.62 (m, 2H), 2.72 – 2.78 (m, 2H) 3.51 – 3.54 (m, 1H),3.55 (s, 3H), 3.57 (s, 8H, 二噁烷), 6.28 – 6.37 (br. m., 5H), 6,69 (br. d.,1H), 6.70 (s, 1H), 7.01 (br. d., 1H)。

实施例3

3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸的制备

在20℃的温度下向500 g (1.043 mol) 3-(3-氨基-4-{[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]氨基}苯基)丙酸甲酯二盐酸盐二噁烷溶剂合物在3.0 L THF中的混悬液中加入296.5 g (2.29 mol) N,N-二异丙基乙胺并将混合物搅拌30分钟。加入 252 g (1.15 mol)4-(三氟甲氧基)苯基异硫氰酸酯，并将温度在50℃保持1小时。随后，加入300 g (1.56mol) EDCI并将混合物在80℃的夹套温度下在回流下搅拌4h。将混合物冷却至20℃，加入1.5L 20％柠檬酸水溶液，将混合物搅拌30分钟，加入1.5L MTBE，并将混合物再搅拌15分钟。除去下层水相。将有机相每次用1.5L 4.8％碳酸氢钠水溶液萃取两次。将有机相在50℃的夹套温度下减压(约50毫巴)浓缩，得到油状残余物，随后向其中加入3L THF和2L 3.7％氢氧化钠溶液(1.56mol)，并将混合物在50℃的温度下搅拌3小时。冷却至20℃后，用10％盐酸水溶液将混合物调节至pH 4，加入500mL饱和氯化钠溶液并除去水相。将有机相在80℃的夹套温度下浓缩，得到油性残余物，然后向其中加入4L异丙醇，并在100℃的夹套温度下蒸馏出约2.5L。与此同时在80℃的内部温度下历时20分钟的时段加入900毫升水。在此过程中，产物从热混合物中结晶出来。冷却至20℃后，滤出产物，并接连用500mL异丙醇和500mL水洗涤。将该潮湿的产物在真空下在60℃的温度下的干燥箱中干燥16小时。

产量: 398 g (理论的77%)白色结晶固体(m.p.: 248℃)。

¹H-NMR (400MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.93 (s, 3 H), 0.96 (s, 3 H), 1.03(s, 3 H), 1.04 - 1.12 (m, 1H), 1.35 - 1.44 (m, 2H), 1.70 - 1.92 (m, 3H), 2.03(t, 1H), 2.43 - 2.60 (m, 2H), 2.85 (t, 2H), 4.63 (t, 1H), 6.90 (d, 1H), 7.24(s, 1H), 7.32 (d, 2H), 7.42 (d, 1H), 7.79 (d, 2H), 8.98 (br. s., 1H), 12.06(br. s., 1H)。

实施例4

加合物(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(1:4)的制备

向296 g (603 mmol) 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸和35 g (301.5 mmol)富马酸中加入4.5 L异丙醇，并将混合物在回流温度下在搅拌下加热。将该温度控制在80℃的溶液过滤，随后蒸馏出3.25L异丙醇，在此期间产物结晶出来。冷却至20℃后，滤出产物，并用500mL异丙醇洗涤。将该潮湿的产物在真空下在60℃的温度下的干燥箱中干燥16小时。

产量: 280 g (理论的89%)白色结晶固体(m.p.: 235℃)。

¹H-NMR (400MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.93 (s, 3 H), 0.96 (s, 3 H), 1.03(s, 3 H), 1.04 - 1.12 (m, 1H), 1.35 - 1.44 (m, 2H), 1.70 - 1.92 (m, 3H), 2.03(t, 1H), 2.43 - 2.60 (m, 2H), 2.85 (t, 2H), 4.63 (t, 1H), 6,62 (s, 2 H; 富马酸), 6.90 (d, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.32 (d, 2H), 7.42 (d, 1H), 7.79 (d, 2H),8.98 (br. s., 1H), 12.1 – 12,6 (br. m., 1H + 富马酸)。

口服生物利用度

化合物A是结晶形式的纯3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸，如在根据实施例3的方法中获得。

化合物B是结晶形式的根据本发明的加合物(2E)-丁-2-烯二酸- 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸，如在根据实施例4的方法中获得。

通过在Wistar大鼠中的研究确定了相对生物利用度。

化合物A首先以溶液的形式口服施用。为此目的，将活性成分溶解于80％平均分子量为400的聚乙二醇(PEG400)和20％水的混合物中。活性成分溶液是用于确定相对生物利用度的参考点(制剂A1)。

化合物A也以tylose混悬剂(制剂A2)的形式口服施用。

化合物B同样以tylose混悬剂(制剂B)的形式口服施用。

Tylose (Tylose^® MH 300 (Sigma))是一种甲基羟乙基纤维素醚，在材料中用作水溶性非离子聚合物，以实现保水、粘合、增稠、成膜和胶体性质。

为了制备0.5%水性tylose混悬剂(w/v)，将tylose在纯水中搅拌并溶胀约12小时，由此形成粘性混合物。将化合物A和化合物B各自研磨成粘性混合物，于是形成相应的tylose混悬剂(制剂A2和制剂B)。

图1a、1b和1c显示在口服施用溶液形式的化合物A(制剂A1, 图1a)后、在口服施用混悬剂形式的化合物A(制剂A2, 图1b)后和在口服施用混悬剂形式的化合物B(制剂B, 图1c)后活性成分3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸(活性成分API)的血浆浓度。

对于制剂A1，施用5 mL/kg体重。这相当于10 mg/kg的活性成分API的量。

对于制剂A2，施用5 mL/kg体重。这相当于10 mg/kg的活性成分API的量。

对于制剂B，施用2 mL/kg体重。这相当于10.6 mg/kg的活性成分API的量。

在每种情况下通过置留的静脉导管收集约0.4mL血液来确定血浆浓度。将血液样品离心(约5分钟)以获得血浆。就活性成分3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸而言通过LC/MS/MS分析血浆样品。

纯3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸在F_Rel实验中显示25%的生物利用度。

对于与富马酸的4 : 1加合物，在F_Rel实验中测定了110%的生物利用度。

因此，根据本发明的加合物显示出比纯3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸明显更高的生物利用度。

X射线粉末衍射图

图2显示了如在根据实施例4的方法中获得的结晶形式的根据本发明的加合物的X射线粉末衍射图。

使用锗单色化CuKα₁辐射，以传输模式使用自动化STOE粉末衍射仪。带有铜阳极的X射线管在40kV和40mA下运行。2Θ扫描在2°≤ 2Θ ≤ 40°之间记录(步长0.5°)。使用软件STOE WinX^pow来评估数据。

2Θ值的最大值列于表1中。

图3显示了如在根据实施例4的方法中获得的结晶形式的根据本发明的加合物的拉曼光谱。表2中列出了谱带最大值的位置。

生物化学测定中的IDH1 R132H的抑制

IDH1 R132H催化α-酮戊二酸(α-KG)向(2R)-2-羟基戊二酸(2-HG)的NADPH依赖性还原。NADPH消耗量由发光确定。

生物化学反应在384孔滴定板中在32℃进行，在每种情况下的反应体积为41μL，并且是在下述缓冲条件下进行：50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 20 mM MgCl₂, 0.05%BSA, 0.01% Brij, 1 µM NADPH和250 µM α-KG。以1.5 nM的终浓度使用IDH1 R132H酶。测试化合物以0.002-10 µM的浓度范围测定。最终的DMSO浓度是2.4％。

将反应温育30分钟，然后加入40μL检测混合物(0.75μg/ml萤光素酶，0.02 U/ml氧化还原酶，4 µg/mL FMN, 2 µL/ml 癸醛/乙醇，50 mM Tris pH 7.5, 0.5% 甘油，0.01％吐温20，0.05% BSA)。使用发光读取器测定发光(10秒测量时间，1秒积分周期，30％灵敏度)。发光下降与mIDH1的活性成正比。IC₅₀值通过从相对发光对抑制剂浓度所作的图进行内推来确定。结果总结在表3中。

表3: 生物化学IDH1 R132H测定中的IC₅₀

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细胞测定中的IDH1 R132H的抑制

在具有突变的异柠檬酸脱氢酶蛋白的过度表达的细胞系的培养基中测定(2R)-2-羟基戊二酸(2HG)的浓度。mIDH催化α-酮戊二酸向2-HG的NADPH依赖性还原。将细胞(LN229R132H, Mohrenz等人, Apoptosis (2013) 18:1416–1425)在含有10％FCS的DMEM中培养。使用胰蛋白酶获得细胞并置于96孔滴定板中。将细胞在37℃在5% CO₂中温育过夜。第二天，将测试化合物加入到细胞中。DMSO的终浓度为0.1％，并使用DMSO对照。然后将滴定板置于培养箱中保持24小时。

使用Balss等人(Acta Neuropathol (2012) 124: 883–891)发表的方法测量2-HG。向各孔中加入HClO₄并将滴定板离心。取出等分试样并与羟基戊二酸脱氢酶(HGDH)、心肌黄酶、NAD+和刃天青一起温育。刃天青向试卤灵的转化通过在Ex 540 nm Em 600 nm处的荧光光谱测定。荧光信号的增加与2-HG的形成成正比。IC₅₀值通过从相对荧光对抑制剂浓度所作的图进行内推来确定。结果总结在表4中。

表4: 细胞IDH1 R132H测定中的IC₅₀

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Claims

1.加合物，包含一个富马酸分子比四个3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸分子。

2.结晶形式的根据权利要求1的加合物，其特征在于在以下2θ角的X射线衍射图中的最大值:5.4、6.8、10.2、10.3、10.8、11.1、16.8、21.6。

3.结晶形式的根据权利要求1的加合物，其特征在于以cm^-1为单位的在以下波数的拉曼光谱中的最大值:

4.用于制备根据权利要求1、2或3中的任一项的加合物的方法，该方法包括以下步骤:

-将3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸和(2E)-丁-2-烯二酸引入异丙醇中，其中对于1mol 3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸，使用0.3至0.8mol(2E)-丁-2-烯二酸，

-在搅拌下加热混合物至沸点以获得澄清溶液，

-使包含一个富马酸分子比四个3-(2-{[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基}-1-[(1R,5R)-3,3,5-三甲基环己基]-1H-苯并咪唑-5-基)丙酸分子的加合物结晶出来。

5.根据权利要求4的方法，其中通过浓缩所述溶液而结晶。

6.根据权利要求1、2或3中的任一项的加合物在制备用作IDH1 R132H抑制剂的药物中的用途。

7.根据权利要求1、2或3中的任一项的加合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途。

8.药物，其包含根据权利要求1、2或3中的任一项的加合物。

9.根据权利要求8的药物，其包含一种或多种其它活性成分。

10.根据权利要求8或9中的任一项的药物，其包含一种或多种惰性的、无毒的药学上可接受的助剂。