CN107807190B - 一种测定雪胆中3种活性成分的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法，所述活性成分为雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸，包括如下操作步骤：a、取待检雪胆粉末，以乙醇提取，过滤，制备供试品溶液；b、取雪胆甲素、雪胆乙素、齐墩果酸对照品，混合，加乙醇溶解，制备对照品溶液；c、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪检测；d、根据检测结果计算得到雪胆中的3种成分含量。本发明方法可以同时测定雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸这3种成分，方法高效准确且重现性良好，为雪胆的***评价和质量控制提供依据，可更全面地保障雪胆药材的质量。

Description

一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法。

背景技术

雪胆属(Hemsleya)植物为葫芦科(Cucurbitaceae)多年生攀援草本植物，《中国植物志》记载该属植物共31种10变种，主要分布于我国西南至中南部地区，其中云南、贵州、四川三省份拥有全属植物的92％。该属多种植物的干燥块根可供药用，是我国西南地区各民族常用的中草药、民族药，具有清热解毒、抗菌消炎的功效，广泛用于治疗菌痢、溃疡病、肺炎、支气管炎、肠炎及其他多种感染，具有用量少、效果明显、无依赖性等优点，也被初步判断为可替代抗生素的药品。

雪胆属植物因产地、物种等因素的差异，致使其所含的化学成分和含量也不尽相同，不同的标准中所收载的雪胆属植物不尽相同，导致药材来源混乱，质量参差不齐。《新华本草纲要》收载的雪胆属植物有曲莲(H.amabilis)、雪胆(H.chinensis)和罗锅底(H.macrosperma)。《四川省中药材标准》收载的雪胆属植物有长果雪胆(H.dolichocarpa)、峨眉雪胆(H.omeiensis) 和巨花雪胆(H.gigantha)。《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)中收载的雪胆属植物有蛇莲(H.sphaerocarpa)和中华雪胆(H. chinensis)。目前主要从水分、总灰分和浸出物等方面评价雪胆药材的品质，该方法不能全面真实地体现被控药材的品质。

现代研究表明，雪胆属植物的主要活性成分为雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸等，然而，目前关于雪胆质量控制的报道多测定其中1类成分。例如何效平等，高效液相色谱法测定雪胆中雪胆甲素的含量，川北医学院学报， 2007，264-266，用HPLC方法只测定了雪胆块根中雪胆甲素的含量。

秦小东等,高效液相色谱-蒸发光散射法测定不同产地雪胆中齐墩果酸的含量，中国临床药理学杂志，2017,33,1582-1584，用HPLC方法只只测定了雪胆中齐墩果酸的含量。尚未见用高效液相色谱法同时测定雪胆中3种活性成分的报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是同时提供一种同时测定雪胆中三种活性成分的HPLC方法，以进一步完善雪胆的质量控制标准。

本发明提供了一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法，所述活性成分为雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸，包括如下操作步骤：

a、取待检雪胆粉末，以乙醇提取，过滤，制备供试品溶液；

b、取雪胆甲素、雪胆乙素、齐墩果酸对照品，混合，加乙醇溶解，制备对照品溶液；

c、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈色谱柱；

流动相：流动相A为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序为：

0～20min，5％～20％B；

20～60min，20％～30％B；

60～95min，30％～90％B；

95～100min，90％B；

检测波长：203nm；

d、根据检测结果计算得到雪胆中的3种成分含量。

其中，步骤a中，提取的方法为：回流、超声和/或浸渍。

其中，步骤a中，乙醇提取的方法如下：

取雪胆粉末1重量份，先用25体积份无水乙醇回流提取3小时，然后超声提取60min，即可。

重量份与体积份的对应关系为：g/mL。

其中，步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；优选的色谱柱型号为InertSustain C₁₈色谱柱。

其中，所述梯度洗脱程序为：

0～20min，5％B；

20～60min，20％B；

60～95min，30％B；

95～100min，90％B。

其中，所述色谱条件的检测波长为203nm；柱温为35℃；流速为1.0 mL/min。

其中，所述供试品溶液的进样量为10μL。

其中，所述雪胆为长果雪胆(H.dolichocarpa)或巨花雪胆(H.gigantha)。

本发明检测方法可以在同一色谱条件下同时测定雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸这3种成分，方法高效准确且重现性良好，为雪胆的***评价和质量控制提供依据，可更全面地保障雪胆药材的质量。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1对照品的HPLC图；1：雪胆乙素；2：雪胆甲素；3：齐墩果酸。

图2巨花雪胆的HPLC图；1：雪胆乙素；2：雪胆甲素；3：齐墩果酸。

图3长果雪胆的HPLC图；1：雪胆乙素；2：雪胆甲素；3：齐墩果酸。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1本发明方法测定雪胆的三种活性成分含量

1、供试品溶液的制备

雪胆块根60℃干燥，粉碎，过60目筛。准确称取雪胆粉末1.00g，置于圆底烧瓶中，准确移取25.00mL无水乙醇，称重，回流提取3小时后，恒温超声提取60min，称其质量，用无水乙醇补齐质量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2、对照品溶液的制备

分别精密称取雪胆素甲、雪胆素乙和齐墩果酸对照品，加无水乙醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为0.62、0.75、0.70mg/mL的混合对照品溶液，备用。

3、3种活性成分含量测定标准曲线的建立

色谱柱为InertSustain C₁₈色谱柱(4.6×250mm，5μm)；

流动相为0.1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0min，5％B；

20min，20％B；

60min，30％B；

95min，90％B；

100min，90％B；

检测波长为203nm；柱温为35℃；流速为1.00mL/min。取混合对照品溶液分别进样1、5、10、15、20μL，建立标准曲线，计算每成分线性回归方程。

4、样品中活性成分含量的测定

按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，进样体积为10 μL，利用线性回归方程，计算样品中3种活性成分的含量。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明的方法学验证

1仪器与试剂

1.1仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备InertSustain C₁₈(250mm×4.6mm， 5μm)色谱柱、自动进样器、DAD检测器、四元泵、柱温箱；KQ-300GDV 恒温数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；BT124s电子天平(Sartorius 公司)；WP-Z-UV实验室超纯水机(四川沃特浦水处理有限公司)。

1.2试剂

雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸标准品(HPLC≥98％，含量以100％计)，购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈为色谱纯(fisher)，无水乙醇为分析纯，水为自制超纯水。

供试材料经四川农业大学生命科学学院杨瑞武教授鉴定为长果雪胆(H.dolichocarpa)和巨花雪胆(H.gigantha)，来源见表1。

表1材料来源

二、实验方法

2.1色谱条件与***适应性

色谱条件为：色谱柱为InertSustain C₁₈，流动相为0.1％磷酸水溶液(A) -乙腈(B)进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长203nm，柱温35℃，进样体积为10μL；梯度洗脱程序为0～20min，5％～20％B；20～60min，20％～30％B；60～95min，30％～90％B；95～100min，90％B。

按照实施例1的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液。

在上述色谱条件下，混合对照品溶液和供试品溶液中雪胆乙素、雪胆甲素、齐墩果酸分离良好，结果见图1-3。

2.2标准曲线的建立

准确称取雪胆素甲、雪胆素乙和齐墩果酸对照品，配制成质量浓度分别为0.62、0.075、0.070mg/mL的对照品溶液，分别进样1、5、10、15、 20μL，按照实施例1中的色谱条件测定峰面积，以各成分进样量(μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及相关关系。

精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验按常规方法进行。

三、实验结果

3.1线性关系考察

回归方程及相关关系结果见表2。

表2线性回归方程及线性范围

本方法测定三种活性成分在0.070～12.40μg范围内呈良好的线性关系 (r≥0.9999)。

可见，各成分对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。

3.2精密度试验

取混合对照品溶液，按照实施例1的色谱条件，连续进样5次，记录色谱图及共有峰峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD＝1.10％，各共有峰相对峰面积RSD＝1.71％。

可见，使用本发明色谱***，各成分的相对标准偏差均远远小于10％，精密度良好。

3.3重复性试验

精密称取同一雪胆粉末1.00g，按实施例1中的制备方法平行制备5份供试品溶液，按实施例1的色谱条件进行测定，记录色谱图及共有峰峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD＝1.32％，各共有峰相对峰面积的 RSD＝2.51％。

可见，使用本发明方法，各成分的相对标准偏差均远远小于10％，说明本发明方法重复性良好。

3.4稳定性试验

准确称取雪胆粉末1.00g，按实施例1中的制备方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件，分别于0、4、8、12、24h进行测定，记录色谱图及共有峰峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD＝1.26％，各共有峰相对峰面积RSD＝1.54％，

可见，供试品溶液配制24h内，使用本发明方法，各成分的相对标准偏差均远远小于10％，稳定性良好。

3.5加标回收率试验

精密称取已知含量的巨花雪胆样品粉末5份，按实施例1的色谱条件测定；加入适量的雪胆甲素，按制备样品供试液的方法处理，测得平均加样回收率为99.85％，RSD＝2.40％(n＝5)。

可见，使用本发明方法，样品回收率较高，说明本发明方法准确度高。

试验例2本发明方法对不同雪胆的测定结果

取长果雪胆(H.dolichocarpa)和巨花雪胆(H.gigantha)样品，按照实施例1的方法进行测定，根据线性回归方程计算三种活性成分的含量。

结果见表3。

表3种雪胆种3种活性成分的测定结果

可见，本发明方法可以测定不同雪胆块根中的成分含量。

试验例3本发明方法的筛选实验

1、供试品溶液的提取方法筛选

本研究以无水乙醇为提取溶剂，优选回流提取、超声提取和先回流再超声提取三种方法对雪胆中雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸提取率的影响，结果见表4。

其中，先回流再超声方法为：先回流提取3小时后，然后超声提取60min。

表4三种方法对比结果(长果雪胆)

可见，三种方法均可以提取出三种有效成分，其中，以先回流再超声的方法提取效率最高，作为本发明的样品提取方法。

2、测定波长的确定

为全面反映雪胆属植物中的化学组分，本研究采用DAD检测器扫描，对色谱图进行比较，其中在203nm检测波长下得到的色谱峰峰形较好，各峰吸收均匀，各色谱峰之间分离度较好，基线较平稳，因此本实验选择203nm 作为雪胆有效成分的检测波长。

综上，本发明检测方法可以在同一色谱条件下同时测定雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸这3种成分，方法高效准确且重现性良好，为雪胆的***评价和质量控制提供依据，可更全面地保障雪胆药材的质量。

Claims (6)

1.一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法，其特征在于：所述活性成分为雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸，包括如下操作步骤：

a、取待检雪胆粉末，以乙醇提取，过滤，制备供试品溶液；

b、取雪胆甲素、雪胆乙素、齐墩果酸对照品，混合，加乙醇溶解，制备对照品溶液；

c、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈色谱柱；

流动相：流动相A为体积分数为0.1%的磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序为：

0~20 min，5% B；

20~60 min，20% B；

60~95 min，30% B；

95~100 min，90% B；

检测波长：203 nm；

d、根据检测结果计算得到雪胆中的3种成分含量；

所述雪胆为长果雪胆 H.dolichocarpa或巨花雪胆 H. gigantha。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，提取的方法为：回流、超声和/或浸渍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤a中，乙醇提取的方法如下：

取雪胆粉末1重量份，先用25体积份无水乙醇回流提取3小时，然后超声提取60 min，即可。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；优选的色谱柱型号为InertSustain C₁₈色谱柱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱条件的检测波长为203 nm；柱温为35℃；流速为1.0 mL/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液的进样量为10 μL。

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