CN1077989A

CN1077989A - 微生物方法制备丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物

Info

Publication number: CN1077989A
Application number: CN93105288A
Authority: CN
Inventors: 萨宾·舒尔; 安德烈亚斯·切希
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 1992-04-29
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1993-11-03
Also published as: MX9302238A; LT3122B; EP0568004A2; CZ76393A3; KR930021796A; CZ279523B6; LTIP499A; CZ280145B6; CA2095166A1; CZ226494A3; LV10315B; TW241265B; EP0568004A3; LV10315A; US5338667A; JPH0646835A

Abstract

叙述一种新的微生物，其筛选方法是用内酯或其可溶性盐，结构式为(I)。

作为唯一的碳源、氮源和能源，通过丙二酰-内酯或其可溶性盐，结构式为(II)而被利用，后者不会被分解代谢。其次叙述一种微生物方法制备丙二酰 -7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，结构通式为 (III)。

此方法是由头孢菌素C衍生物或其可溶性盐，结构通式为(IV)用微生物制得的。此外还叙述了由丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物制备7-氨基头孢烷酸衍生物的新方法，其结构通式为(V)。

Description

本发明涉及一种新的丙二酰-7-氨基头孢烷酸（cephalosporansaure）衍生物及其可溶性盐，其结构通式为：

（其中R是氢原子、羟基或乙酸基）。论述一种新的从相应的头孢菌素C衍生物出发的制备方法，以及一种适用于此方法的新的微生物。

其次，本发明还涉及一种新的微生物方法，从丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物制备7-氨基头孢烷酸衍生物，并叙述一种假单孢菌属（Pesudomonas SP，DSM 7509）微生物的新的应用方法。

下面将说明丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物（结构式Ⅲ），头孢菌素C-衍生物（结构式Ⅳ），根据结构式Ⅱ的丙二酰-内酯，以及结构式Ⅰ的内酯及其可溶性盐，例如铵盐或碱金属盐。

丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物可作为制备7-氨基头孢烷酸衍生物的初始原料，它也是制备头孢菌属抗生素的重要初始化合物（J.Bacteriol.，1987，169：12，5815-5820）。

至今不知道由丙二酰-7-头孢烷酸衍生物来的化学的和微生物制备方法。

许多微生物方法是以头孢菌素C为原料制备7-氨基头孢烷酸，例如在JP-A 62 48380中所描述的。但是这种方法有许多缺点，以至大型工业生产技术变得不可行。

本发明的任务是提供一种利用新的微生物来制备新的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物的方法，这是一种简单而又经济的微生物方法。接着在任务是用这种新的衍生物采用新的微生物方法制备7-氨基头孢烷酸衍生物。

按照本发明，这一任务可以通过按照权利要求1的新的微生物，通过按照权利要求3的新的方法，通过按照权利要求8的新的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物，以及通过按照权利要求10的新方法来解决。

按照本发明，筛选一种微生物，它能把内酯，其结构式为

作为唯一的碳源、氮源和能源，通过丙二酰内酯其结构式为

而被利用，后者不会被分解代谢。这些微生物可以用按照结构式Ⅰ的内酯藉助传统的微生物技术，例如从各种各样的土样中进行筛选，也就是说从土样中接种进行微生物培养，可以得到微生物用按照结构式Ⅰ的内酯作为唯一的碳源、氮源和能源生长。然后按照专业的普通方法筛选这些微生物，筛选出能把按照结构式Ⅰ的内酯转化为结构式Ⅱ的丙二酰内酯，而不分解代谢的微生物。

筛选所需的内酯（结构式Ⅰ）可以从市场上购得的去乙酰头孢菌素C取得，为此，首先用已知的方法（Jefferay et al.，Biochem.J.，1961，81，591）把去乙酰头孢菌素C进行内酯化成相应的内酯，为生成希望得到的、具有内酰胺开环（结构式Ⅰ）的内酯，可以用专业的方法，例如借助青霉素酶将内酰胺环打开。

原则上在此筛选压力下取得的所有微生物都适用。这类微生物在文献中未曾描述，是本发明的组成部分。

据此目的，通过筛选可获得标记为FBI（DSM7007）的微生物及其突变体和子系体。这些均在1992年3月25日存入德国微生物和细胞培养公司（Mascheroderweg 1b，D-3300 Braunschweig）。

在提出关于16s RNA分析报告的优先日后这些微生物鉴定归入Sphingomonas SP。

Sphingomonas Sp：FB1（DSM7007）的描述

细胞形态微小杆菌

宽度，μm 0.4～0.6

长度，μm 0.8～1.5

活动性 +

鞭毛极生1

革兰氏反应 -

3%KOH溶菌作用 +

氨肽酶（Cerny） +

孢子 -

氧化酶 +

过氧化氢酶 +

主要苯醌组分：辅酶Q10

HPLC-快速法的DNA-碱基组成：63mol%G+C

一般是在无机盐介质中进行微生物的筛选和培养，这种无机盐介质的组成列于表1（a和b）。成功的筛选出微生物后，最理想的是在另一种介质中进行培养，例如商业上通用的完全培养基。

据此目的，培养和筛选时，将0.2～1重量%，最好是0.3～0.6重量%的结构Ⅰ内酯加入列机盐培养基中。

筛选和培养温度为0～60℃，最好是20～40℃。pH值5～9，最好是6～8。

在650nm（OD₆₅₀）时光密度达到0.1～1，可以按照专业通用的方法采集微生物，并使用本发明的方法。

按本发明，用这一方法筛选出的微生物使用本发明的方法将头孢菌素C衍生物，其结构通式为

其中R是氢原子、羟基或乙酸基（作为底物），转化为丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物，其结构通式为

其中R如前述。

适宜的是，这一方法用筛选出的如前所述保存的微生物Sphingomonas SP.FB1（DSM7007）或其子系体和突变体来实施。

一般，这一方法以专业通用的方法用未生长的细胞进行。

将头孢菌素C衍生物（结构通式Ⅳ）作为底物，其中R为前述。用头孢菌素C（R在结构式Ⅲ中＝乙酸基）作底物也是适宜的。

按照本方法，可将底物一次性或持续性地加入。理想的做法是，添加底物使其在培养基中的浓度不超过20重量%，最好是4重量%。

本方法可使用专业通用的介质，最好是在低分子的HEPES（4-（2-羟乙基）-哌嗪-1-乙烷-磺酸）缓冲液中进行。

一般，此方法可以用微生物悬浮液进行，此悬浮液OD₆₅₀为1～100，最好是2～50。

本方法适宜在温度为0～60℃之间，最好是20-40℃，pH值为5-9，最好是6-8时进行。

通常经1～24小时转化后，可以用专业通用的方法分离出至今尚未叙述过的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物，作为分离的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物的最好代表物是丙二酰-7-氨基头孢烷酸（R在结构式Ⅲ中＝乙酸基）。

本发明方法制备7-氨基头孢烷酸衍生物的结构通式为

其中R如前述，按下述方式进行：将丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐（结构通式Ⅲ）作为底物，借助假单孢菌属（DSM7509）微生物，或其子系体和突变体，或者用此微生物无细胞的酶转化为产物（结构式Ⅴ）。

这种假单孢菌属微生物Pseudomonas SP（DSM 7509）于1993年3月5日存入德国微生物与细胞培养公司（Mascheroderweg 1b，D-3300 Bravnschweig）。

这类微生物为已知的，在JP-A 62 483 80中叙述为假单孢菌微生物Pseudomonas SP.SE-495（FERM BP-818），按照JPA 62 48380所述，这类微生物的筛选方法是，将戊二酰-7-氨基头孢烷酸水解为7-氨基头孢酸。但未述及利用此微生物水解丙二酰-7-氨基头孢烷酸。

然后本发明再论述利用这类微生物水解丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物（结构式Ⅴ），特别是丙二酰-7-氨基头孢烷酸（R＝乙酸基）。

本发明也适宜用具有通透性的微生物细胞，或用无细胞的酶提取物来进行，最好是用无细胞的酶提取物。

可以用专业通用的方法制备无细胞酶提取物，例如用超声技术或应用“French-Press”方法。

可以用丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物作为底物（结构通式Ⅴ，其中R如前述）。用丙二酰-7-氨基头孢烷酸（R＝乙酸基）作底物更适宜。

可以将底物一次性或持续性地加入，适当的方式是底物在培养基中的浓度不超过10重量%，最好为2重量%。

在本方法中可使用专业通用的营养培养基。

要是本方法使用无细胞的酶提取物，则此提取物的蛋白质浓度应为0.1-20克/升，最好是1～5克/升。

本方法适合在温度4～50℃，最好为20-35℃，pH值为4-9，最好是7-8的条件下进行。

一般经过3-24小时的转化反应，就可分离出7-氨基头孢酸衍生物（结构式Ⅴ）。

实施例1

微生物分离

把从Visp（瑞士）郊区土壤中取得的各种土样作为接种物加入100毫升无机盐介质中（表1），pH7.0，含5毫克分子浓度（0.5mmol/100毫升）具有酰胺开环（结构式Ⅰ）的内酯，于25℃在摇床上培养，摇床为140UPm（每分钟转数）。把这些培养物在新鲜的无机盐培养基中移种4次，然后借助分析型HPLC对内酯转化反应进行测试。

然后将此培养物在含5毫克分子浓度内酯（结构Ⅰ）的无机盐培养基-琼脂-平板上于25℃时进行培养。接着分离Sphingomonas SP.FB1（DSM7007）菌株，它在内酯中生长时生成丙二酰-丙酯（结构式Ⅱ），后者不会完全分解。

实施例2：

丙二酰-7-氨基头孢烷酸（结构式Ⅲ）的生成

把微生物Sphingomonas SP.FB1（DSM7007）在含5毫克分子浓度内酯（结构式Ⅰ）无机盐培养基中培养，pH为7.0（表1b），4天内达到OD₆₅₀＝0.44。（在头2天后再加入此内酯，使总浓度达到1毫克分子/100毫升培养基）。接着离心分离细胞，并将细胞沉淀物在20毫升10毫克分子浓度HEPES缓冲液中（pH为7.0）再悬浮，此时将OD₆₅₀调节到2.2。在细胞悬浮液中加入0.4毫克分子头孢菌素C（结构式Ⅳ），在摇床上（140转/分钟）于25℃时进行培养。

在30分钟、60分钟、2.25小时、5小时和24小时后，用HPLC分析法测试样品。

丙二酰-7-氨基头孢烷酸的生成率在2.25小时时为410毫克/升/小时/OD₆₅₀。

5小时后分析可检出142mg丙二酰-7-氨基头孢烷酸，相当于转化99%头孢菌素C。丙二酰-7-氨基头孢烷酸可用制备型HPLC分离，得率为40%。

实施例3

丙二酰-7-氨基头孢烷酸（结构式Ⅲ）的鉴定

鉴定结构式Ⅲ的产物采用500ml无机盐培养基（表Ⅰ），pH7.0，加入结构式Ⅰ的内酯溶液，使最终浓度达到5毫克分子。然后将此预培养溶液，OD₆₅₀＝0.5，在25℃和140转/分条件下进行接种，一天后每500毫升培养基再加入5mmol内酰（结构式Ⅰ）。当OD₆₅₀达到0.5时收集细胞，然后将细胞沉淀物放入30ml10毫克分子浓度的HEPES缓冲液中再悬浮，pH为7.0，含0.6mmol头孢菌素C（结构式Ⅳ）。在25℃，140转/分培养5小时后将细胞离心分离，并用制备型HPLC将丙二酰-7-氨基头孢烷酸从上清液中净化。将净化的样品经冷冻干燥过夜，用NMR（¹H和¹³C）分析冻干物。

对照化学方法制备的参比物（从7-氨基头孢烷酸制得，按照Bull.Soc.Chem.Belg.，1977，86，991～1002），证实生成丙二酰-7-氨基头孢烷酸。

丙二酰-7-氨基头孢烷酸钠盐（化学标准）

¹³C-NMR（DMSO，100.5MHz，δ以ppm计）：

20，s;25，s;40，m;58，d;64，s;112，s;134，s;164，d;170，t。

丙二酰-7-氨基头孢烷酸（按照本发明的方法）：

¹³C-NMR（DMSO，100.5MHzδ以ppm计）：

20，s;25，s;40，m;58，d;64，s;112，s;134，s;164，d;170，t。

¹H-NMR（化学标准，DMSO，400MHz，δppm计）;

20，s;2.5，s;3.0，t;3.5，m;4.8，d;5.0，d;5.6，d。

¹H-NMR（按本发明的方法）：

2.0，s;2.5，s;3.0，t;3.5，m;4.8，d;5.0，d;5.6，d。

实施例4

去乙酰头孢菌素的内酯化

用下述方法从去乙酰头孢菌素C（Ciba-Geigy公司，Basel）制备去乙酰头孢菌素C-内酯：

将100g去乙酰头孢菌素C溶于1升20毫克分子浓度磷酸钠pH7.0缓冲液中，再将离子交换剂DOWEX50×8（H⁺型）（Fluka）加入此溶液中，使pH达到2.5。搅拌10分钟后（250转/分，室温下），滤出离子交换树脂，用浓盐酸将溶液的pH值调节到0.8;搅拌1小时后（室温，250转/分）在反应液中加DOWEX1×8（乙酸盐型）（Fluka）使pH达到3.0～3.2。

然后在室温，250转/分继续搅拌1.5小时，接着滤出离子交换树脂，重又加入DOWEX1×8（乙酸盐型）至pH达到3.3～3.5，搅拌1小时（室温，250转/分），接着再滤出离子交换树脂，然后将反应液在旋转蒸发器内蒸发（30毫巴，30℃）干燥。为去除尚存的乙酸，将蒸发后产物溶于水成35%溶液，然后用浓盐酸将pH调到1.5。将得到的溶液用等体积乙酸乙酯提取2次，液相净化并用3克分子浓度KOH溶液将pH调到3.5，再在旋转蒸发器内蒸发（30毫巴，30℃）。然后再将此产品置干燥器内于真空下（30毫巴，20℃）完全干燥。

总得率为60克，相当于100g去乙酰头孢菌素C中得率60%。

实施例5：

制备内酰胺开环的内酯（结构式Ⅰ）

为制备内酯，将去乙酰头孢菌素C-内酯置于含有β-内酰胺酶（青霉素酶〔E.C.3.5.2.6〕（Sigma））的储备溶液6（表1a）中进行处理。加入青霉素酶后反应立即开始，在反应过程中加入1当量NaoH溶液使pH保持在7.0，一俟不再加NaoH而pH值稳定在7.0时反应即结束。在反应结束后（约2小时）将此溶液灭菌过滤（0.2Mm滤器），保藏在-80℃。

实施例6

7-氨基头孢烷酸（结构式Ⅴ）的生成

将假单孢菌属微生物Pseudomonas Sp SE-495（DSM 7509;FERM BP-818）置于营养培养基中于30℃培养过夜，该营养培养基pH为7.0，含0.2%W/V肉汁，0.2%W/V酵母提取物，0.5%W/V胨，0.5%W/V谷氨酸钠和0.005%W/V硫酸镁。再将此培养物置于相同组成的新鲜培养基中进行移种（接种量为10%），再培养2-4天。

接着，通过离心分离（20分钟，600转/分）收集细胞，置于0.1克分子浓度磷酸钾缓冲液中悬浮，并再离心分离（总共各3次，为培养物的10%容量），然后在尽可能少容量的磷酸钾缓冲液中将细胞沉淀物再悬浮，在冰冷下用超声波处理（10次;每次30秒间隔20秒），然后离心分离（20分钟，至少10000转/分）将粗提取物从细胞碎片中分离出来。

为生成7-氨基头孢酸将此粗提取物（蛋白质浓度为2毫克/毫升）加热至室温，然后添加在磷酸钾缓冲液中的丙二酰-7-氨基头孢烷酸，使其浓度为5毫克分子/升。全部于25℃静置培养，并在24小时内分析生成的7-氨基头孢烷酸。

分析用薄层色谱法，（平板：硅胶60F₂₄₅，溶剂：丁醇-甲醇-冰醋酸-水，比例50∶30∶3∶17）。从丙二酰-7-氨基头孢烷酸（R_f-值：0.43）生成7-氨基头孢烷酸（R_f-值：0.51）可用UV-波长254nm检测，或者喷洒Fluram试剂（3mg Fluram;Fluka CH-9470 Buchs在10毫升丙酮中）后在UV-波长366nm检测。

用此粗提取物（含丙二酰-7-氨基头孢烷酸-酰基转移酶）在约14小时后可检测出50～100μmol7-氨基头孢烷酸。

表1

a)无机盐培养基储备液

储备液1:

NaH₂PO₄·2H₂O 156.0g

NH₄Cl 10.0g

K₂SO₄1.2g

蒸镏水 500.00ml

储备液2:

对氨基苯甲酸 8.0mg

D-生物素 2.0mg

烟酸 20.0mg

D-泛酸钙 10.0mg

吡哆醛盐酸盐 30.0mg

二氯化硫胺 20.0mg

氰钴胺素 10.0mg

蒸镏水 100.0ml灭菌

储备液3:

HCl(37%) 7.0ml

FeCl₂·4H₂O 1.5g

ZnCl₂0.07g

MnCl₂·4H₂O 0.1g

H₃BO₃0.006g

CoCl₂·6H₂O 0.19g

CuCl₂·6H₂O 0.002g

NiCl₂·6H₂O 0.024g

Na₂MoO₄·2H₂O 0.036g

蒸镏水 1000.00ml,

高压灭菌

121℃,20分钟

储备液4

NaoH 0.5g

Na₂SeO₃;·5H₂O 0.003g

Na₂WO₄·2H₂O 0.004g

蒸镏水 1000.0ml,

高压灭菌

121℃,20分钟

储备液5:

MgCl₂·6H₂O 40.0g

CaCl₂·2H₂O 5.0g

蒸馏水 200.0ml,

高压灭菌,

121℃,20分钟

储备液6:

去乙酰头孢菌素C-内酯 3.55g

蒸镏水 60.0ml

青霉素酶(EC3.5.2.6) 1.0mg(25000单位)

(Sigma pO389)

用NaOH调pH至 7.0

加蒸镏水至 100ml

b)制备无机盐培养基

储备液1: 25.0ml

用KOH调pH至 7.0然后蒸镏

水加至950.0ml,

高压灭菌,

121℃,20分钟

消毒灭菌后加入下列物质:

储备液2 0.5ml

储备液3 1.0ml

储备液4 1.0ml

储备液5 0.5ml

从实施例5得到的溶液 50.0ml

Claims

1、一种筛选的微生物，它能把内酯或其可溶性盐，结构式为

作为唯一的碳源、氮源和能源，通过丙二酰-内酯或其可溶性盐结构式为

被利用，而后者不会被分解代谢。

2、按照权利要求1的微生物，标号为Sphingomonas SP.FB1（DSM7007）及其子系体和突变体。

3、用微生物方法制备丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，其结构式为

（其中R是氢原子、羟基或乙酸基），其特征在于可把头孢菌素C衍生物或其可溶性盐其结构通式为

（其中R如前述）作为底物通过按照权利要求1的微生物方法转化为结构式Ⅲ的产物。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，转化反应可以用微生物Sphingomonas SP.FB1（DSM7007）或其子系体和突变体来进行。

5、至少按照权利要求3和4之一的方法，其特征在于，用头孢菌素C作底物。

6、至少用权利要求3-5之一的方法，其特征在于，转化反应在一次性或连续性加入底物的情况下进行，培养基中的底物浓度不超过20重量%。

7、至少按照权利要求3-6之一的方法，其特征在于，转化反应在温度0-60℃，pH5-9条件下进行。

8、丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，其结构式为

（其中R是氢原子、羟基或乙酸基）。

9、丙二酰-7-氨基头孢烷酸。

10、微生物方法制备7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，其结构通式为

（其中R如权利要求3所述），其特征在于，可以将丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐（结构式Ⅲ）作为底物，通过假单孢菌属微生物Pseudomonas SP.（DSM 7509）或其子系体和突变体，或用这些微生物的无细胞的酶转化成结构式Ⅴ的产物。

11、按照权利要求10的方法，其特征在于，可以用丙二酰-7-氨基头孢烷酸作底物。

12、至少按照权利要求10和11之一的方法，其特征在于，转化反应可以在一次性或连续性加入底物的情况下进行，培养基中底物浓度不得超过10重量%。

13、至少按照权利要求10-12之一的方法，其特征在于，转化反应在温度为4-50℃，pH为4-9条件下进行。

14、利用假单孢菌属Pseudomonas SP.（DSM7509）微生物，将丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物及其可溶性盐（结构式Ⅲ）水解生成7-氨基头孢烷酸衍生物（结构通式Ⅴ）。

15、用按照权利要求14的方法，其特征在于，将丙二酰-7-氨基头孢烷酸水解反应生成7-氨基头孢酸。