CN107797262B - 基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦的方法，包括以下步骤：使用低倍物镜；初始化Z轴位置；令载物台向下移动N步，同时等间隔计算摄像头图像清晰度，记录最大清晰度及其所在Z轴位置；载物台向上移动到当前位置与最大清晰度所在位置距离的90%处；根据此时图像清晰度确定载物台移动步长，重复此步骤直至清晰度达到最大清晰度的一定误差范围内；将载玻片上的有效区域分成m×n块，计算每个子块的清晰度值，将清晰度值最大的子块中心移至物镜正下方；将物镜换为高倍物镜及更高倍物镜，重复上述聚焦过程，最终完成联合聚焦。本发明有效地避免现有聚焦方法中陷入局部极值的问题，也解决了因视野中无目标而无法聚焦的困境。

Description

基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法

技术领域

本发明涉及光学聚焦技术领域，特别涉及一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法。

背景技术

基于数字图像处理和数字成像***的发展，全自动显微镜的发展逐渐走向了系列化、集成化和智能化，在生命科学、材料科学、国防安全等各个领域发挥着越来越大的作用。人工镜检需要操作人员反复调整聚焦平面，整个过程耗时多且耗费人力成本，聚焦的清晰度依靠个人的主观评价容易带来误差，因此，全自动数字显微镜的自动聚焦势在必行。

图像处理技术的蓬勃发展和图像自动采集***的日趋成熟为数字显微镜的自动聚焦实现提供了技术可能。数字图像处理理论认为，图像的能量大部分集中在幅度谱的低频和中频段，但图像轮廓的锐度和细节丰富度取决于图像的高频成分。因此，各种检测图像的边缘信息或计算图像高频分量的自动聚焦方法应运而生。检测待聚焦图像高频分量的函数被称为聚焦评价函数，自动聚焦的过程就是寻找聚焦评价函数最大值的过程，广泛采用的是爬山搜索法来寻找最佳聚焦点。然而在实际应用中，聚焦评价函数曲线是有局部极大值的，爬山搜索法遇到局部极值时很容易错误地认为已经找到焦面。另外，现有的自动聚焦方法多是在固定视野区域内寻找焦面，若是当前视野区域中没有或少有聚焦目标，则会聚焦失败。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法，该方法能够有效地提高高倍物镜下自动聚焦的准确度。

实现本发明的技术方案是：

一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：首先在低倍物镜下，电动载物台先把载玻片上的有效区域置于显微镜物镜的正下方；

步骤2：Z轴采用步进电机控制，步距固定，选定固定步数N，使得步进电机的N步数所对应的距离大于步进电机的回差与载玻片的厚度误差之和的两倍，且小于Z轴可移动的最大范围；初始化Z轴位置使其处于焦面上方并距离焦面在步数N以内；

步骤3：令载物台向下移动N步，与此同时等间隔采集摄像头图像并计算图像清晰度，记录最大清晰度及其所在Z轴位置；

步骤4：载物台向上快速移动到当前位置与最大清晰度所在位置距离的90％处；

步骤5：采集摄像头图像并计算清晰度，根据其偏离最大清晰度的程度确定载物台步长，离最大清晰度越近步长越小，越远步长越大；载物台向上移动该步长距离，重复此步骤直至清晰度达到最大清晰度的误差范围内，则聚焦成功，若载物台超过初始位置，则聚焦失败；

步骤6：若聚焦成功，载玻片上的有效区域分成m×n块，在此焦面下获得m×n个子块区域的图像信息，计算每个子块的清晰度值，控制电动载物台移动X和Y轴，把清晰度最大的子块中心置于物镜中心的正下方；

步骤7：将物镜换为高倍物镜，重复步骤2至第步骤6；

步骤8：将物镜换为更高倍物镜，重复步骤2至步骤5；聚焦完成；

其中，该方法采用聚焦评价函数来得到图像的清晰度。

所述聚焦评价函数具体为：

将彩色图像转为灰度图像；

对灰度图像进行高斯模糊，消除噪声的影响；

采用canny算子提取图像梯度，并统计非零梯度像素个数，除以图像总像素进行归一化，得到图像的清晰度。

所述步骤3具体为：

令载物台以慢速向下移动N步，同时定时采集并存储摄像头图像，为防止定时器回调函数执行时间过长，无法及时获取图像，另开启新线程取内存中的图像计算清晰度，记录清晰度最大值及其所在Z轴位置，直至所有图像计算完毕，释放图像所占的内存空间。

所述步骤4具体为：

计算当前Z轴位置与步骤3记录的最大清晰度所在Z轴位置的距离的90％，控制载物台向上快速移动此距离，使载物台接近焦面位置并位于焦面之下。

所述步骤5具体为：

用聚焦评价函数计算当前摄像头图像的清晰度，与清晰度最大值比较。开始时清晰度很小，载物台以较大步长向上移动，随着清晰度接近最大值，步长逐渐减半，重复此步骤直至：(1)清晰度与最大清晰度的相对误差在一定范围内(相对误差范围可设为5％-10％)，返回聚焦成功；(2)向上移动总步数超过N与一个用于估计步进回差的常数之和，则未找到焦面，返回聚焦失败。

所述步骤6具体为：

若步骤5聚焦成功，获取此视野下的清晰图像，将其均匀分割成m×n个子块，并对每个子块计算清晰度，取清晰度最大的子块的中心位置作为目标位置，记目标位置距离视野中心的水平距离为dx，垂直距离为dy；

将上述dx，dy根据放大倍数对应至载玻片上的水平距离和垂直距离，控制载物台移动此距离将目标位置移至视野中心。

本发明的有益效果是：本发明提出的一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法，由聚焦评价函数首先获取图像最大清晰度值的先验知识，后根据此先验知识不断调整聚焦平面，有效地避免聚焦时陷入局部极值的问题。在整个聚焦过程中，不断从低倍物镜切换到更高倍物镜，逐渐由粗至细地将内容最为丰富的目标区域自动移至视野正中央，也解决了因视野中无目标而无法聚焦的困境。

附图说明

图1为本发明在低倍、高倍或更高倍物镜下的聚焦机制示意图；

图2为本发明的流程示意图；

图3为判断清晰度与最大值接近程度的区段分割示意图；

图4为载玻片的有效区域示意图；

图5为载玻片的有效区域划分为m×n个子块的示意图。

具体实施方式

为了更加清楚明白地说明本发明所述的技术手段、技术改进及有益效果，以下结合附图对本发明进行详细的说明。

自动镜检平台多采用步进电机控制载物台的运动，理论上找图像清晰度最大的位置只需载物台移动的同时计算图像清晰度，发现其从小增大到峰值又开始减小时，后退相应距离使其到达最大值处即可聚焦成功。然而由于步进电机在精度方面的特性以及在运动过程中存在的回差问题，后退时并不能准确回到原来的最大值处，对于高倍显微镜而言，微小的误差会导致图像成像状态巨大的差别。因此针对聚焦问题，本发明所提供的一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法，参见图2，包括以下具体步骤：

S101：所用载玻片参见图4，把检测材料涂抹在载玻片的有效区域内。在低倍物镜下，电动载物台先把载玻片上的有效区域的中心点O置于显微镜物镜的正下方。

S102：Z轴采用步进电机控制，步距固定，选定固定步数N，使得步进电机的N步数所对应的距离大于步进电机的回差与载玻片的厚度误差之和的两倍，且小于Z轴可移动的最大范围；初始化Z轴位置使其处于焦面上方并距离焦面在步数N以内。

S103：令载物台向下移动N步，与此同时等间隔采集摄像头图像并计算图像清晰度，记录最大清晰度及其所在Z轴位置。

该步骤具体为：

令载物台以慢速向下移动N步，同时开启定时器用于采集摄像头图像，为防止定时器回调函数执行时间过长，无法及时获取图像，另开启新线程用于计算清晰度；

定时器在载物台移动时采集并储存摄像头图像，当载物台停止移动，等待新线程运行结束，关闭定时器。

新线程取图像计算清晰度，记录清晰度最大值rateMax及其所在Z轴位置z_max，直至所有图像计算完毕，释放图像所占的内存空间。

S104：载物台向上快速移动到当前位置与最大清晰度所在位置距离的90％处。

该步骤具体为：

设当前位置为z_current，令载物台向上移动0.9×(z_max-z_current)步，使载物台接近焦面位置并位于焦面之下。

S105：采集摄像头图像并用聚焦评价函数计算清晰度，根据其偏离最大清晰度的程度确定载物台步长，离最大清晰度越近步长越小，越远步长越大；载物台向上移动该步长距离，重复此步骤直至清晰度达到最大清晰度的误差范围内，则聚焦成功，若载物台超过初始位置，则聚焦失败。

该步骤具体为：

计算当前摄像头图像的清晰度rate，与清晰度最大值rateMax比较，根据rate所在的区段(参见图3)确定载物台向上移动的步长。开始时rate很小，即落在区段3，载物台以较大步长step3向上移动(本文设step3为64步)，随着载物台接近焦面位置，rate依次进入区段2、区段1、区段0，步长随之依次减半；

重复S105直至：(1)清晰度达到或接近最大清晰度，即落入区段0，返回聚焦成功；(2)向上移动总步数超过N与一个用于估计步进电机回差的常数C之和，则未找到焦面，返回聚焦失败。

S106：将载玻片上的有效区域分成m×n个子块，在此焦面下获得m×n个子块区域的图像信息，计算每块子块的清晰度值，控制电动载物台移动X和Y轴，把纹理信息最丰富的子块区域置于物镜中心的正下方。

该步骤具体为：

若步骤5聚焦成功，参见图5，将载玻片上的有效区域均匀分割成m×n个子块，并对每个子块(S₁₁、S₁₂、S₁₃……S_nm)计算清晰度值，取清晰度最大的子块(假设为S_kl)的中心位置(x，y)作为目标位置，目标位置距离视野中心(x₀，y₀)的水平距离dx＝x-x₀，垂直距离为dy＝y-y₀；

将上述dx，dy根据放大倍数对应至载玻片上的水平距离和垂直距离，控制载物台移动此距离将目标位置移至视野中心。

S107：将物镜换为高倍物镜，在这个过程中，有效区域为S106步骤中清晰度最大的子块S_kl，重复S102至S106。

S108：将物镜换为更高倍物镜，重复S102至S105。

综上所述，本发明所提出的一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦方法，在一固定倍数物镜下，通过预先移动载物台在一定范围内扫描的方式，获取焦面成像图像清晰度值的先验知识；而后使载物台一步接近焦面处并处于焦面下方，再以由大变小的步长逐渐接近焦面，提高聚焦的速度，得到此倍数物镜下的焦面后水平移动载物台，使内容丰富的区域位于视野中央。不断切换更高倍物镜重复上述过程，最终得到高倍物镜下视野内容丰富的清晰图像。利用本发明方法为后续显微图像处理提供高清晰度的有效图像。根据不同的应用背景，本发明经过适当的修改同样适用于其他成像设备的自动聚焦。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于图像纹理的显微镜不同倍数镜头联合聚焦的方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：首先在低倍物镜下，电动载物台把载玻片上的有效区域置于低倍物镜的正下方；

步骤2：Z轴采用步进电机控制，步距固定，选定固定步数N，使得步进电机的N步数所对应的距离大于步进电机的回差与载玻片的厚度误差之和的两倍，且小于Z轴可移动的最大范围；初始化Z轴位置使其处于焦面上方并距离焦面在步数N以内；

步骤3：令载物台向下移动N步，与此同时等间隔采集摄像头图像并计算图像清晰度，记录最大清晰度及其所在Z轴位置；

步骤4：载物台向上快速移动到当前位置与最大清晰度所在位置距离的90%处；

步骤5：采集摄像头图像并计算清晰度，根据其偏离最大清晰度的程度确定载物台步长，离最大清晰度越近步长越小，越远步长越大；载物台向上移动该步长距离，重复此步骤直至清晰度达到最大清晰度的误差范围内，则聚焦成功，若载物台超过初始位置，则聚焦失败；

步骤6：若聚焦成功，载玻片上的有效区域分成m×n块，在此焦面下获得m×n个子块区域的图像信息，计算每个子块的清晰度值，控制电动载物台移动X和Y轴，把清晰度最大的子块中心置于物镜中心的正下方；

步骤7：将物镜换为高倍物镜，重复步骤2至步骤6；

步骤8：将物镜换为更高倍物镜，重复步骤2至步骤5；完成聚焦；

其中，所述计算图像清晰度采用聚焦评价函数；

所述步骤3具体为：

令载物台以慢速向下移动N步，同时定时采集并存储摄像头图像，为防止定时器回调函数执行时间过长，无法及时获取图像，另开启新线程取内存中的图像计算清晰度，记录清晰度最大值及其所在Z轴位置，直至所有图像计算完毕，释放图像所占的内存空间；

所述步骤4具体为：

计算当前Z轴位置与步骤3记录的最大清晰度所在Z轴位置的距离的90%，控制载物台向上快速移动此距离；

所述步骤5具体为：

用聚焦评价函数计算当前摄像头图像的清晰度，与清晰度最大值比较；开始时清晰度很小，载物台以较大步长向上移动，随着清晰度接近最大值，步长逐渐减半，重复此步骤直至：（1）清晰度与最大清晰度的相对误差在一定范围内即相对误差范围设为5%-10%，返回聚焦成功；（2）向上移动总步数超过N与一个用于步进电机回差的常数之和，则未找到焦面，返回，聚焦失败；

所述步骤6具体为：

若步骤5聚焦成功，获取此视野下的清晰图像，将其均匀分割成m×n个子块，并对每个子块计算清晰度值，取清晰度最大的子块的中心位置作为目标位置，记目标位置距离视野中心的水平距离为dx_，垂直距离为dy；

将上述dx，dy根据放大倍数对应至载玻片上的水平距离和垂直距离，控制载物台移动此距离将目标位置移至视野中心。

2.根据权利要求1所述的显微镜不同倍数镜头联合聚焦的方法，其特征在于，所述聚焦评价函数具体为：

将彩色图像转为灰度图像；

对灰度图像进行高斯模糊，消除噪声的影响；

采用canny算子提取图像梯度，并统计非零梯度像素个数，除以图像总像素进行归一化，得到图像的清晰度。