CN107794272B - 一种高特异性的crispr基因组编辑体系 - Google Patents

一种高特异性的crispr基因组编辑体系 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高特异性的CRISPR基因组编辑体系，通过在CRISPR/Cas9基因组编辑***中引入靶向Cas9基因的gRNA，在靶细胞基因组编辑进行的同时(或之后)，靶向Cas9基因的gRNA能够介导对Cas9基因的切割，从而显著降低Cas9基因的表达时间，继而降低由于CRISPR体系中Cas9长期表达导致的脱靶效应，增加靶向特异性。

Description

一种高特异性的CRISPR基因组编辑体系
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种高特异性的CRISPR基因组编辑体系。
背景技术
基因组编辑技术(Genome Editing)，是一种能够对目的基因组进行定点改造，从而对未知功能基因进行研究和基因治疗的技术。人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术目前应用最普遍，其优势是摆脱传统技术对于胚胎干细胞的依赖并且使用范围广，在临床应用上有很大的潜力。人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶技术(ZFNs)、类转录激活因子核酸酶技术(TALENs)以及CRISPR/Cas技术。
ZFNs是最早发展的通用基因组编辑技术,可用以实施定点敲除和定点敲入变异，但ZFNs技术的发展受限于构建难度大、成本高等缺点。TALENs技术在ZFNs基础上发展而来，较ZFNs技术而言,TALENs技术具备构建灵活度高、成本低等优势。不同于ZFNs与TALENs技术，CRISPR/Cas技术具有独特的DNA靶向机制，使用更加方便和灵活，因此正在发展成为主要的基因组编辑工具。目前，CRISPR/Cas***已在多种物种中测试成功,例如小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫和家蚕。
但是，在基因组编辑中存在的脱靶效应一直阻碍着基因组编辑技术更广范围的应用，因此，本领域迫切需要开发靶向特异性更强的基因组编辑技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高特异性的基因组编辑体系及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种高特异性的CRISPR基因组编辑***，其中，所述CRISPR基因组编辑***包括：第一gRNA、第二gRNA、和Cas9蛋白；其中，所述第一gRNA靶向待编辑的靶细胞的基因组，所述第二gRNA靶向所述Cas9蛋白的编码基因。
在另一优选例中，所述第二gRNA靶向选自下组的基因序列：SEQ ID NO.3、和SEQID NO.4。
在另一优选例中，CRISPR基因组编辑***包括下式(I)所示的DNA构建物：
P1-R1-P2-R2-P3-C，(I)
式(I)中，R1为第一gRNA编码基因、R2为第二gRNA编码基因、C为Cas9蛋白编码基因，P1、P2、P3为任选地启动子序列，“-”表示任选地的连接序列。
本发明的第二方面，提供了一种用于CRISPR基因组编辑的DNA构建物，所述DNA构建物具有下式(I)所示的结构：
P1-R1-P2-R2-P3-C，(I)
式(I)中，R1为第一gRNA编码基因、R2为第二gRNA编码基因、C为Cas9蛋白编码基因，P1、P2、P3为任选地启动子序列，“-”表示任选地的连接序列。
在另一优选例中，所述第二gRNA靶向选自下组的基因序列：SEQ ID NO.3、和SEQID NO.4。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体表达本发明第一方面所述的CRISPR基因组编辑***；或者，所述表达载体含有本发明第二方面所述的DNA构建物。
本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的DNA构建物。
在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，较佳地为动物细胞。
本发明的第五方面，提供了一种基因组编辑方法，所述方法包括步骤：
(1)提供第一基因组编辑***，并使用所述第一基因组编辑***对靶基因进行基因组编辑；
(2)所述基因组编辑发生后，降低所述第一基因组编辑***的活性。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，提供第二基因组编辑***，所述第二基因组编辑***特异性地靶向所述第一基因组编辑***的编码基因；通过所述第二基因组编辑***对所述第一基因组编辑***的编码基因进行基因编辑，从而实现降低所述第一基因组编辑***的活性。
在另一优选例中，所述基因组编辑为细胞内部的基因组编辑；优选为细胞核内的基因组编辑。
在另一优选例中，所述第一基因组编辑***为人工核酸内切酶介导的基因组编辑***；进一步地，所述第二基因组编辑***特异性地靶向所述第一基因组编辑***的人工核酸内切酶的编码基因。
在另一优选例中，所述细胞选自：动物细胞、植物细胞、和微生物细胞。
在另一优选例中，所述第一基因组编辑***和/或所述第二选基因组编辑***自下组：CRISPR-Cas基因组编辑***、NgAgo-gDNA基因组编辑***、锌指核酸酶基因组编辑***(ZFNs)、类转录激活因子核酸酶基因组编辑***(TALENs)。
在另一优选例中，所述CRISPR-Cas基因组编辑***为CRISPR-Cas9基因组编辑***。
在另一优选例中，所述第一基因组编辑***为CRISPR-Cas9基因组编辑***；所述步骤(2)中，提供靶向所述CRISPR-Cas9基因组编辑***的Cas9基因的gRNA，在所述CRISPR-Cas9基因组编辑***的Cas9蛋白和所述靶向Cas9基因的gRNA的作用下，所述CRISPR-Cas9基因组编辑***的Cas9基因被切割，从而降低所述基因组编辑***的活性。
在另一优选例中，所述基因组编辑***为本发明第一方面所述的高特异性的CRISPR基因组编辑***。
本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的CRISPR基因组编辑***、本发明第二方面所述的DNA构建物、本发明第三方面所述的表达载体、或本发明第一四方面所述的宿主细胞在制备药物或基因组编辑试剂中的用途。
在另一优选例中，所述药物用于对靶细胞中的基因组进行基因组编辑。
本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的CRISPR基因组编辑***、本发明第二方面所述的DNA构建物、本发明第三方面所述的表达载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞在构建转基因动物中用途。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了自我控制型CRISPR基因组编辑体系作用原理，在普通CRISPR基因组编辑体系中(左)，一条针对靶向基因的向导RNA(guide RNA，gRNA)在人U6转录启动子下被启动表达。Cas9基因在EFS启动子下被启动表达，后翻译成Cas9蛋白。gRNA和Cas9蛋白同时作用，对靶向基因进行切割；在自我控制型CRISPR基因组编辑体系(self-restricted CRISPRsystem，下面简称为SeT CRISPR***)(右)中，一条针对靶向基因的gRNA在人U6转录启动子下被启动表达；另一条针对CRISPR***本身Cas9基因的gRNA在小鼠U6转录启动子下同时被启动表达。Cas9基因在EFS启动子下被启动表达，后翻译成Cas9蛋白。两条gRNA分别和Cas9蛋白作用，同时切割靶向细胞基因组和CRISPR***中Cas9序列，显著降低体系中Cas9基因的表达时间，继而降低由于CRISPR体系中Cas9长期表达导致的脱靶效应，增加靶向特异性。
图2左图显示了T7E1检测结果，显示guide-2和guide-3具有显著切割活性；右图为免疫印迹结果，显示在慢病毒感染96h后，在同时表达Cas9-gRNA-2或者Cas9-gRNA-3的实验组中Cas9蛋白的表达相比对照组(只表达lentiCRISPR v2载体)有显著下调。
图3左图显示了针对细胞P53基因靶向位点的T7E1检测结果，显示普通CRISPR慢病毒体系(标注为“P53gRNA”)和SeT CRISPR慢病毒体系(标注为“P53gRNA+Cas9gRNA”)具有相似的切割活性；右图显示了针对病毒体系中Cas9基因靶向位点的T7E1检测结果，显示在SeTCRISPR慢病毒体系中Cas9被同时切割。
图4.免疫印迹结果显示在SeT CRISPR***中，Cas9蛋白表达水平相比普通CRISPR***有显著下调，表达时间有显著缩短。
图5显示在普通lentiCRISPR体系中，在靶向基因组序列和gRNA序列之间存在一个非配对碱基的情况下，在4天和20天在多个gRNA(携带的非配对碱基处于不同位置)表达时均能检测到切割活性(即脱靶效率)，尤其在20天时，因为Cas9表达时间较长，脱靶效率更为明显。而在SeTlentiCRISPR体系中，大多数gRNA表达导致的切割活性相比普通lentiCRISPR体系均有显著降低。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种高特异性的CRISPR基因组编辑体系，通过在CRISPR/Cas9基因组编辑***中引入靶向Cas9基因的gRNA，在靶细胞基因组编辑进行的同时(或之后)，靶向Cas9基因的gRNA能够介导对Cas9基因的切割，从而显著降低Cas9基因的表达时间，继而降低由于CRISPR体系中Cas9长期表达导致的脱靶效应，增加靶向特异性。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
CRISPR/Cas***
该***为目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫***，以消灭外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白***(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。
目前已发现三种不同类型的CRISPR/Cas***，存在于大约40％和90％已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心的组成，由于其对DNA干扰(DNAi)的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具，与锌指核酸酶(ZFN)及类转录活化因子核酸酶(TALEN)同样利用非同源性末端接合(NHEJ)的机制，于基因体中产生去氧核糖核酸的双股断裂以利剪辑。二型CRISPR/Cas并经由遗传工程的改造应用于哺乳类细胞及斑马鱼的基因体剪辑。其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点。未来将可应用在各种不同的模式生物当中。
称为CRISPR的基因组重复丛集，即原核生物拟核DNA链中的丛生重复序列，在1987关于E.coli的一份研究报告中被首次描述。2000年，相似的重复序列在其它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列(Short Regularly Spaced Repeats，SRSR)。2002年SRSR被重命名为CRISPR。其中一部分基因编码的蛋白为核酸酶和解旋酶。这些关联蛋白(CAS,CRISPR-associated proteins)与CRISPR组成了CRISPR/CAS***。
CRISPR/Cas技术
本发明所称的“CRISPR/Cas技术”、“CRISPR/Cas基因组编辑”、“CRISPR/Cas基因组编辑技术”、“CRISPR/Cas基因组编辑方法”均指利用CRISPR/Cas***的原理对目的基因进行改造的基因组编辑技术。
Cas9蛋白
CRISPR/Cas的核心就是Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)。在不同物种中能够利用CRISPR/Cas***进行基因组编辑的核心技术，首要一步即在该物种中异源表达有DNA剪切酶活性的Cas9蛋白，第二步则是获得gRNA和靶点同源序列将Cas9引导至靶点进行DNA剪切。其中第二步中，具体的操作方法是本领域技术人员所熟知的。
来源于Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白是一种多结构域多功能的Cas蛋白，其N端具有类RuvC核酸酶的结构域，其中部具有HNH核酸酶结构域。Cas9蛋白与gRNA结合能够实现在特异位点处切割DNA，来源于Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas***识别序列为23bp,并能靶向20bp,其识别位点最末3位NGG序列被称作PAM(protospacer adjacentmotif)序列，其对于DNA切割非常重要。目前大多数真核生物(包括家蚕、拟南芥、酵母、线虫等)的CRISPR/Cas***最初均源自Streptococcus pyogenes，Cas9蛋白则均是经过人源化改造。
较佳地，本发明所提供的Cas9来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。在本发明的一个优选地实施方式中，所述Cas9蛋白的氨基酸序列如下：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENI IHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO.1)
为了便于Cas9基因在宿主中表达，还可在构建表达载体时，将优化的Cas9基因构建在强组成型启动子(如：pdc启动子(Li et al.Microbial Cell Factories 2012,11:84)，但不限于此)，和强诱导型启动子(如：cbh1启动子(Zou et al.Microbial Cel lFactories2012,11:21)，但不限于此)的下游。
本发明的DNA构建物包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述DNA构建物的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此DNA构建物的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明DNA构建物中涉及的核酸片段，通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
本发明也涉及包含本发明的DNA构建物的载体，以及用本发明的载体构建基因工程宿主细胞。
本发明的DNA构建物可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明的DNA构建物和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。本发明中使用的启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的DNA构建物在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明的主要优点在于：
(1)使用本发明的基因编辑体系能够显著降低脱靶效应，增加靶向特异性；
(2)本发明的基因编辑体系使用简便，无需除Cas9表达***之外的其他基因表达，无需小分子诱导试剂的使用；
(3)能完整保留病毒体系的高导入效率和细胞/组织导入特异性。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料和方法
1.实验材料
1)试剂
DMEM，胎牛血清，0.25％Trypsin-EDTA购自Thermo Fisher Scientific公司；青霉素—链霉素(100X)溶液购自碧云天公司；T7核酸内切酶I购自NEB公司；基因组DNA提取试剂盒和DNA产物快速回收试剂盒购自天根公司；ANTI-FLAG抗体购自SIGMA公司
2)细胞株
293T细胞和Huh7细胞购自上海生命科学研究院细胞库，在加入了10％胎牛血清和1％青霉素—链霉素(100X)的DMEM培养基中贴壁培养。
3)载体
plentiCRISRP v2(Plasmid#52961)质粒和慢病毒包装质粒：pMDLg/pRRE(Addgene#12251)，pRSV-Rev(Addgene#12253)，pMD2.G(Addgene#12259)购自Addgene公司。
2.方法
2.1慢病毒包装
用聚乙烯亚胺(polyethylenime，PEI)法转染293T细胞。细胞在转染前一天以适当密度分盘至10cm培养皿中，细胞生长至大约80％时将培养基换成DMEM进行后用PEI法转染。PEI转染慢病毒包装质粒为pMDLg/pRRE 6.53ug，pRSV-Rev 2.53ug，pMD2.G 3.51ug，核心质粒lentiCRISRP v2 10ug。转染后4-6小时换为完全培养基培养。48h和96h收集上清获取病毒液。
2.2T7E1检测
T7E1检测一种检测CRISPR剪切活性的方法。T7E1核酸内切酶可以识别并切割基因组中不完全配对的位点。提取基因组后，用PCR扩增出带有CRISPR靶位点的条带。纯化回收后95℃加热5min并缓慢冷却至室温，使DNA片段随机结合。用1ul T7EI核酸内切酶，37摄氏度切割500ng的DNA片段60min。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。通过比较切割开与未切割开的电泳条带亮度来判断CRISPR剪切活性。
实施例1设计和筛选针对靶向Cas9的高活性gRNA
实验步骤：
1)通过序列比对，设计五条靶向Cas9序列的高活性gRNA，gRNA序列见表1。
2)分别将五条gRNA克隆入lentiCRISPR v2载体(addgene#52961)
3)分别包装慢病毒后感染293T细胞
4)感染后48h和96h分别收细胞，分别通过T7E1检测试剂盒对细胞进行Cas9基因切割情况进行分析；以及免疫印迹反应对Cas9蛋白表达情况进行分析
表1针对Cas9设计靶向gRNA序列，以及用于T7E1检测的引物序列信息
Figure BDA0001110420390000111
实验结果如图2所示，左图显示了T7E1检测结果，在阴性对照组中条带没有发生切割，在Cas9guide-2和Cas9guide-3组中条带发生明显切割，显示guide-2(目标条带为243bp+423bp)和guide-3(目标条带为298bp+368bp)具有显著切割活性；右图为免疫印迹结果，显示在慢病毒感染96h后，在同时表达Cas9-gRNA-2或者Cas9-gRNA-3的实验组中Cas9蛋白的表达相比对照组(只表达lentiCRISPR v2载体)有显著下调。结果表明Cas9guide－2和Cas9guide－3具有较高的基因编辑活性。
实施例2构建SeT CRISPR慢病毒载体
实验步骤：
1)在合成质粒pmU6-gRNA(由金维智公司合成，其序列如SEQ ID NO.11所示)，其中包含靶向靶细胞基因组的向导RNA的骨架序列和小鼠U6启动子，并在小鼠U6启动子5’以及gRNA骨架序列3’带有EcoRI限制酶切割位点；
合成的质粒pmU6-gRNA的序列如下(SEQ ID NO.11)：
GAATTCAGATAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCCACCTTGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGTACTGAATTC
2)将靶向Cas9的gRNA-2克隆入pmU6-gRNA，得到pm6-Cas9-gRNA
3)通过EcoRI酶切，将m6-Cas9-gRNA片段接入plenti-CRISPRv2载体中EcoRI酶切位点处(具***置见图1)
实施例3验证SeT CRISPR慢病毒体系与普通CRISPR慢病毒体系中的基因靶向效率是否存在差异
实验步骤：
1)以靶向人的P53基因为例，分别构建普通CRISPR慢病毒体系(标注为“P53gRNA”)和SeT CRISPR慢病毒体系(标注为“P53gRNA+Cas9gRNA”)
2)分别包装慢病毒后感染人肝癌细胞株Huh7
3)感染4天和8天收细胞，通过T7E1试剂盒分别对P53和Cas9靶向位点的切割情况进行检测
表2.针对P53设计的靶向gRNA序列，以及用于T7E1检测的引物序列信息
Figure BDA0001110420390000121
实验结果如图3所示，P53T7E1检测结果中阴性对照lentiCRISPR v2组条带没有发生切割，而P53gRNA和P53gRNA+Cas9gRNA组条带都发生了明显的切割(目标条带为245bp+285bp)。在Cas9T7E1检测结果中，P53gRNA和lentiCRISPR v2一样都没有发生条带切割，只有P53gRNA+Cas9gRNA组条带发生了切割(目标条带为243bp+423bp)。结果表明构建的SeTCRISPR慢病毒载体和普通CRISPR慢病毒载体一样具有高效的基因编辑能力，而SeTCRISPR慢病毒载体同时可以成功地切割转入细胞内的Cas9基因。
实施例4.验证在SeT CRISPR体系中Cas9的表达时间是否显著缩短
实验步骤：
1)以靶向人的P53基因为例，分别构建普通CRISPR慢病毒体系(标注为“P53gRNA”)和SeT CRISPR慢病毒体系(标注为“P53gRNA+Cas9gRNA”)
2)分别包装慢病毒后感染人肝癌细胞株Huh7
3)感染2天，4天，6天和8天收细胞，通过免疫印迹反应检测细胞中Cas9蛋白的表达水平
实验结果如图4所示，结果表明P53gRNA组和lentiCRISPR v2组一样，2天后Cas9蛋白的含量没有发生明显变化。而P53gRNA+Cas9gRNA组的Cas9蛋白含量从2天后就发生了明显降低。说明在SeT CRISPR体系中Cas9的表达时间显著缩短。
实施例5.验证在SeT CRISPR体系中脱靶率是否显著下降
1)针对P53基因的靶向序列，设计多条guideRNA，在不同的位置引入一个非配对核苷酸，以***研究gRNA上序列和靶向基因组序列存在一个非配对核苷酸时CRISPR***的切割效率。具体gRNA序列见表格三。
2)分别包装慢病毒后感染人肝癌细胞株Huh7
3)分别感染4天和20天后收细胞，通过T7E1试剂盒针对P53靶向位点进行在不同CRISPR***中和表达不同gRNA情况下的切割情况
表3.携带一个非配对核苷酸的gRNA序列信息
Figure BDA0001110420390000131
Figure BDA0001110420390000141
实验结果如图5所示，普通CRISPR组从第4天起错配组就可以看到明显的编辑效率，而到第20天错配组的编辑效率则更加明显。而SeT CRISPR组从第4天起错配组可以观察到一定的编辑效率，到第20天错配组的编辑效率也有缓慢上升，但是较普通CRISPR其错配组的编辑效率要明显降低。结果表明SeT CRISPR质粒相比于普通CRISPR脱靶率明显降低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001110420450000011
Figure IDA0001110420450000021
Figure IDA0001110420450000031
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Figure IDA0001110420450000071
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Figure IDA0001110420450000101
Figure IDA0001110420450000111
Figure IDA0001110420450000121

Claims (9)

1.一种高特异性的CRISPR基因组编辑***，其特征在于，所述CRISPR基因组编辑***包括：第一gRNA、第二gRNA、和Cas9蛋白；其中，所述第一gRNA靶向待编辑的靶细胞的基因组，所述第二gRNA靶向所述Cas9蛋白的编码基因， 所述CRISPR基因组编辑***包括下式(I)所示的DNA构建物：
P1-R1-P2-R2-P3-C ，(I)
式(I)中，R1为第一gRNA编码基因、R2为第二gRNA编码基因、C为Cas9蛋白编码基因，P1、P2、P3为任选地启动子序列，“-”表示任选地的连接序列； 所述第二gRNA靶向选自下组的基因序列：SEQ ID NO.3。
2.一种用于CRISPR基因组编辑的DNA构建物，所述DNA构建物具有下式(I)所示的结构：
P1-R1-P2-R2-P3-C ，(I)
式(I)中，R1为第一gRNA编码基因，其靶向待编辑的靶细胞的基因组；R2为第二gRNA编码基因，其靶向所述Cas9蛋白的编码基因；C为Cas9蛋白编码基因，P1、P2、P3为任选地启动子序列，“-”表示任选地的连接序列；所述第二gRNA靶向选自下组的基因序列：SEQ IDNO.3。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述的CRISPR基因组编辑***；或者，所述表达载体含有权利要求2中所述的DNA构建物。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的DNA构建物。
5.如权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。
6.如权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为动物细胞。
7.一种基因组编辑方法，其特征在于，所述方法将权利要求3所述的表达载体导入待编辑细胞，所述方法用于非诊断和非治疗性的目的。
8.如权利要求1所述的CRISPR基因组编辑***、权利要求2所述的DNA构建物、权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞在制备基因组编辑试剂中的用途。
9.如权利要求1所述的CRISPR基因组编辑***、权利要求2所述的DNA构建物、权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞在构建转基因动物中的用途。
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
CN110592141B (zh) * 2018-06-13 2023-07-07 中国科学院上海有机化学研究所 用于调控基因编辑效率的化合物及其应用
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
CN112266418A (zh) * 2019-07-08 2021-01-26 中国科学院微生物研究所 改进的基因组编辑***及其应用
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN114958920A (zh) * 2021-02-25 2022-08-30 北京中因科技有限公司 一种新型CRISPR-Cas9***载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9873907B2 (en) * 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US9834791B2 (en) * 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
WO2016061481A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies
CN104513814A (zh) * 2014-11-18 2015-04-15 李云英 I-TevIN201-Cas9null融合蛋白及其应用
CN104450785A (zh) * 2014-12-08 2015-03-25 复旦大学 使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒
CN105647922A (zh) * 2016-01-11 2016-06-08 中国人民解放军疾病预防控制所 基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9***在制备乙肝治疗药物中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Self-restricted CRISPR System to Reduce Off-target Effects;Yanhao Chen 等;《Molecular Therapy》;20160929;第24卷(第9期);第1508-1510页 *

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