CN107782828A - 一种通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β‑谷甾醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β‑谷甾醇的方法，包括，标准溶液的配制，采用极性溶剂配制含菜油甾醇、豆甾醇和β‑谷甾醇混合标准储备液，经处理后，再用极性溶剂分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β‑谷甾醇的混合标准系列溶液。我方发明，不仅使3种甾醇单体达到基线分离，大大缩短了保留时间，最终确定了最优的色谱条件为1.0mL/min，检测波长208nm，柱温35℃，且该方法精密度和加样回收率均较高，能够满足准确定量3种甾醇单体含量的检测要求。
Description
技术领域
本发明属于植物甾醇的分离技术领域，具体涉及一种通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法。
背景技术
植物甾醇是一种以环戊烷全氢菲为基本骨架的天然活性化合物，C-3位上连有羟基，C-17位上连有8～10个碳原子构成侧链的甾族化合物，属于脂质中的不皂化物，其中菜油甾醇(Campesterol)、豆甾醇(Stigmasterol)和β-谷甾醇(Sitosterol)是植物甾醇中含量最高的甾醇单体，其结构同时见图1。植物甾醇具有降低胆固醇和心血管疾病风险、抗癌、抗炎和抗氧化等生理功能，在医药、食品、化妆品等领域越来越受到重视，截止2015年全球甾醇的需求量高达1.8万吨左右。目前，植物甾醇主要从植物油脱臭馏出物和妥尔油中分离纯化获得。因此，建立一种灵敏准确、快捷简便的检测方法，以此测定植物甾醇的含量对分析此类活性物质具有重要意义。
由于菜油甾醇和豆甾醇仅在C-22位和C-24位上存在结构差异，两者之间产生的极性中和效应会使菜油甾醇和豆甾醇在色谱分离过程中出现共洗脱现象，目前国内外研究大多针对其中的一种或两种甾醇进行同时分离测定，未见对三种甾醇同时进行分离测定研究。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的技术空白，提出了本发明。
因此，本发明的目的是解决现有技术中的不足，提供一种通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，包括，标准溶液的配制，采用极性溶剂配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇混合标准储备液，经处理后，再用极性溶剂分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的混合标准系列溶液；色谱条件，色谱柱为C18色谱柱，检测波长为200～220nm，柱温为25～45℃，流速为0.5～1.5mL/min。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述采用极性溶剂配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇混合标准储备液，其中，所述极性溶剂包括甲醇。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述经处理后，其是用氮吹仪将所述混合标准储备液中的甲醇吹干。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述再用极性溶剂分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的混合标准系列溶液，其中，所述极性溶剂包括乙腈。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的混合标准系列溶液，其是，配制含菜油甾醇2.5、5、10、20、40、50μg/mL的混合标准系列溶液，配制含豆甾醇5、10、20、40、80、100μg/mL的混合标准系列溶液，配制含β-谷甾醇5、10、20、40、80、100μg/mL的混合标准系列溶液。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述色谱条件，其中，流动相包括100％乙腈、100％甲醇、乙腈:水＝85:5～99:1(v/v)或甲醇:水＝85:5～99:1(v/v)。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述色谱条件，其中，流动相包括100％乙腈或乙腈:水＝85:5～99:1(v/v)。
作为本发明所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法的一种优选方案，其中：所述色谱条件，其中，进样量为10～60μL。
本发明所具有的有益效果：
我方发明，不仅使3种甾醇单体达到基线分离，大大缩短了保留时间，最终确定了最优的色谱条件为1.0mL/min，检测波长208nm，柱温35℃，且该方法精密度和加样回收率均较高，能够满足准确定量3种甾醇单体含量的检测要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例1三种甾醇混合标准样品的HPLC色谱图，图中1，2，3分别为菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，1，2，3三种甾醇均基线分离，检测在38min内完成。
图2为实施例2三种甾醇混合标准样品的HPLC色谱图。图中1，2，3分别为菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，1,2,3三种甾醇均基线分离，由于流动相中加入水的比例提高，流动相极性增大，洗脱能力减弱，所以检测时间延长至42min完成。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
标准溶液的配制:
采用甲醇配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇混合标准储备液，经氮吹仪吹干后，再用乙腈分别配制含菜油甾醇2.5、5、10、20、40、50μg/mL，豆甾醇和β-谷甾醇5、10、20、40、80、100μg/mL的标准系列溶液。
高效液相色谱条件为：
色谱柱：WaterC18柱(4.6mm×250mm,5μm)
检测器：Waters2489紫外可见光检测器
检测波长：208nm
柱温：35℃
流动相：乙腈:水＝98:2(v/v)
流动相速度：1.0mL/min
进样量为20μL
回收率和精密度的测定：
取均一的大豆甾醇样品，分为3组，分别加入3个不同浓度水平的混合标准系列溶液(菜油甾醇：10、20、40μg/mL；豆甾醇和β-谷甾醇：20、40、80μg/mL)构成高中低3个加标组及1个空白对照组，重复测定3次，计算回收率。
取回收率实验中高中低3个加标组在同一天内重复进样5次，计算日内精密度，在连续3d内每天重复进样3次，计算日间精密度，均以RSD表示。
实施例2
标准溶液的配制:
采用甲醇配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇混合标准储备液，经氮吹仪吹干后，再用乙腈分别配制含菜油甾醇2.5、5、10、20、40、50μg/mL，豆甾醇和β-谷甾醇5、10、20、40、80、100μg/mL的标准系列溶液。
高效液相色谱条件为：
色谱柱:Water C18柱(4.6mm×250mm,5μm)
检测器:Waters2489紫外可见光检测器
检测波长:208nm
柱温:30℃
流动相:乙腈:水＝94:6(v/v)
流动相速度:1.0mL/min
进样量为20μL
回收率和精密度的测定：
取均一的菜油甾醇样品，分为3组，分别加入3个不同浓度水平的混合标准系列溶液(菜油甾醇：10、20、40μg/mL；豆甾醇和β-谷甾醇：20、40、80μg/mL)构成高中低3个加标组及1个空白对照组，重复测定3次，计算回收率。
取回收率实验中高中低3个加标组在同一天内重复进样5次，计算日内精密度，在连续3d内每天重复进样3次，计算日间精密度，均以RSD表示。
由此可见，实施例1效果更佳，检测时间短，精密度高，回收率高，且RSD值相对较低。
值得一提的是，在我方发明过程中，由于菜油甾醇在C-22位上比豆甾醇多一个双键，使菜油甾醇极性略弱于豆甾醇，因此更易被非极性溶剂洗脱出来，但由于豆甾醇在C-24位相比于菜油甾醇多一个甲基，因此两者会产生极性中和效应。由于两者之间较小的极性差异，菜油甾醇和豆甾醇往往会产生共洗脱现象，大部分文献报道的色谱条件均使用甲醇或甲醇和水作为流动相，其对两者的分离效果并不好，难以达到基线分离。由于反相柱中溶剂的洗脱能力随样品极性的增强而减弱，甲醇的极性强于乙腈，故采用洗脱能力更强的乙腈更利于豆甾醇和菜油甾醇的分离。但是使用100％的乙腈作为流动相，其极性相对于甲醇的减弱，使豆甾醇和菜油甾醇在HPLC中分离时无法完全分离开，所以增加一定比例的水，增加流动相的极性，从而使豆甾醇和菜油甾醇能够达到基线分离。另外，添加水的比例应严格控制，否则若不在该配比下，就无法达到甾醇单体的基线分离，豆甾醇和菜油甾醇色谱峰会分不开。并且，我方发明通过流动相优化实验，发现乙腈和水在一定比例配比下等度洗脱，不仅使3种甾醇单体达到基线分离，且将保留时间从2个小时大大缩短了至35min，最终确定了最优色谱条件为1.0mL/min，检测波长208nm，柱温35℃，且该方法精密度和加样回收率均较高，能够满足准确定量3种甾醇单体含量的检测要求。
由此可见，我方发明不仅使3种甾醇单体达到基线分离，大大缩短了保留时间，最终确定了最优的色谱条件为1.0mL/min，检测波长208nm，柱温35℃，且该方法精密度和加样回收率均较高，能够满足准确定量3种甾醇单体含量的检测要求。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：包括，
标准溶液的配制：采用极性溶剂配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇混合标准储备液，经处理后，再用极性溶剂分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的混合标准系列溶液；
色谱条件：色谱柱为C18色谱柱，检测波长为200～220nm，柱温为25～45℃，流速为0.5～1.5mL/min。
2.根据权利要求1所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述采用极性溶剂配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇混合标准储备液，其中，所述极性溶剂包括甲醇。
3.根据权利要求1或2所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述经处理后，其是用氮吹仪将所述混合标准储备液中的甲醇吹干。
4.根据权利要求1所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述再用极性溶剂分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的混合标准系列溶液，其中，所述极性溶剂包括乙腈。
5.根据权利要求1、2或4中任一项所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述分别配制含菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的混合标准系列溶液，其是，配制含菜油甾醇2.5、5、10、20、40、50μg/mL的混合标准系列溶液，配制含豆甾醇5、10、20、40、80、100μg/mL的混合标准系列溶液，配制含β-谷甾醇5、10、20、40、80、100μg/mL的混合标准系列溶液。
6.根据权利要求5所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述色谱条件，其中，流动相包括100％乙腈、100％甲醇、乙腈:水＝85:5～99:1(v/v)或甲醇:水＝85:5～99:1(v/v)。
7.根据权利要求1、2、4或6中任一项所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述色谱条件，其中，流动相包括100％乙腈或乙腈:水＝85:5～99:1(v/v)。
8.根据权利要求7所述通过高效液相色谱法分离测定菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其特征在于：所述色谱条件，其中，进样量为10～60μL。
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