CN107779518A - 鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents

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崔海月
张继敏
游欣欣
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物及方法，该用于鉴别鲫鱼的分子特异性引物的上游引物JYF：如SEQ ID NO.1所示：下游引物JYR：如SEQ ID NO.2所示。本发明利用分子特异性标记引物JYF/JYR，通过常规PCR方法对鲫鱼进行快速的分子鉴定，方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成，是形态特征辨别鲫鱼的有效辅助。

Description

鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物及方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异引物对鲫鱼标本快速鉴别的方法。
背景技术
鲫鱼(学名：Carassius auratus)属于辐鳍鱼亚纲鲤形目鲤科鲫属，是中国的特有物种。鲫鱼主要是以植物为食的杂食性鱼，喜群集而行，择食而居。鲫鱼最大体长约30厘米，栖息深度为0～20米，无毒，经济型食用鱼类，多产于黄河流域、长江流域、珠江流域一带，其中洱海鲫鱼较为出名。目前，对鲫鱼的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于长江上游水坝修筑导致产卵地遭到破坏；加之外来物种的入侵及水体污染导致鲫鱼的生存环境遭受严重破坏，所以鲫鱼的种群数量日益下降。因此，对鲫鱼地方特有种进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。
DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase I,COI)基因的部分序列。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对鲫鱼进行快速、有效的鉴定。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。自从2003年，加拿大科学家Hebert提出以COI基因做为DNA条形码以来，越来越多的研究表明DNA条形码在物种分类上具有高效可行性。大量的研究结果显示以COI基因为标记的DNA条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用COI基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。
该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决鉴定中标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有鲫鱼的相关基因序列。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别鲫鱼的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
用于鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：
上游引物JYF：5’-TCTTCCCCCATCATTCCTGT-3’；
下游引物JYR：5’-AGGTTTCCTGCAAGAGGG-3’。
该对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对鲫鱼标本的核糖体ITS区序列的克隆序列，然后通过NCBI的序列比对设计的，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行PCR扩增，可以获得100bp左右的特异性片段。
本发明还涉及上述的分子特异性标记引物(JYF/JYR)在鉴别鲫鱼中的应用。
本发明还涉及上述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别鲫鱼的试剂盒中的应用。
一种用于鉴别鲫鱼的试剂盒，该试剂盒中包含上述的分子特异性标记引物。该试剂盒中还包含PCR常用试剂。
一种快速鉴别鲫鱼的方法，以待测样本的基因组DNA为模板，以上述的分子特异性标记引物(JYF/JYR)作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为鲫鱼。上述的DNA目的条带为约100±10bp的DNA目的条带。
上述PCR扩增的反应程序为：94℃变性5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
上述方法中扩增的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于鲫鱼的形态学特征初步的判断，再将判断为鲫鱼的标本运用发明方法鉴别。
对本发明所述鉴别鲫鱼方法进行验证的具体步骤如下：
(1)从浸泡标本中剪取形态学特征初步判断为鲫鱼的部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
(2)生物公司试剂盒方法提取样品中的基因组DNA，于-20℃保存备用。
(3)以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(JYF/JYR)作为扩增引物，进行PCR扩增；
PCR反应体系(总体积为25μL)组成为：
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min)；72℃条件下延伸10min。
取2μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像***检测，电泳图谱如图1所示，检出大小约为100±10bp的条带，可初步判定待测样本可能是鲫鱼。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明的分子特异性标记引物(JYF/JYR)可对野生鲫鱼进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别鲫鱼的有效辅助手段。
附图说明
图1是采用本发明的分子特异性标记引物对鲫鱼进行PCR扩增的电泳图。
其中，M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段；5,6为阴性对照。
具体实施方式
本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别鲫鱼。下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
(1)待测鲫鱼基因组DNA的提取
取鲫鱼组织样品，剪碎后使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，利用1.5％琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。
(2)设计合成特异性PCR扩增引物
设计合成基于鲫鱼的特异性引物，上游引物JYF：5’-TCTTCCCCCATCATTCCTGT-3’和下游引物JYR：5’-AGGTTTCCTGCAAGAGGG-3’，由技术人员设计，并由引物设计公司合成。
(3)分子特异性标记引物(JYF/JYR)的PCR扩增
PCR反应体系25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPS 0.5μL，Taq(5U/μl)0.2μL，MgCl2 1.5μL，JYF引物(10μM)1μL，JYR引物(10μM)1μL，DNA模板(约10ng/μl)1μL，ddH2O 17.3μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min)；72℃条件下延伸10min。
(4)电泳检测：
取2μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像***检测，电泳图谱如图1所示。
M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段；5,6为阴性对照。由图1可见，扩增出分子量约为100bp左右的特异性DNA条带。
实施例2
用实施例1的方法进行鲫鱼、鳊鱼、鲢鱼三种冰冻鱼块检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，结果表明仅仅有一种鱼块可扩增出分子量约为100bp左右的特异性DNA条带，另两种鱼块样本不能扩增出，检测结果与取样人记录信息完全一致。因此可表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别野生鲫鱼。
实施例3：
从鱼类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的鱼类，其中一组为鲫鱼(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，PCR产物测序结果显示其中一组的5个样品能够扩增出100bp左右的特异性DNA条带为鲫鱼的组织样本，另一组的5个样品为非鲫鱼的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。
上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 镇江华大检测有限公司
<120> 鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttccccca tcattcctgt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggtttcctg caagaggg 18

Claims (9)

1.用于鉴别鲫鱼的分子特异性标记引物，其特征在于：该引物的核苷酸序列如下：
上游引物JYF：5’-TCTTCCCCCATCATTCCTGT-3’；
下游引物JYR：5’-AGGTTTCCTGCAAGAGGG-3’。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别鲫鱼中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为鲫鱼。
4.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别鲫鱼的试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴别鲫鱼的试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含权利要求1所述的分子特异性标记引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中还包含PCR常用试剂。
7.一种快速鉴别鲫鱼的方法，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为鲫鱼。
8.根据权利要求7所述的鉴别鲫鱼的方法，其特征在于：所述的DNA目的条带为100±10bp的DNA目的条带。
9.根据权利要求7所述的鉴别鲫鱼的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃变性5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
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