CN104450881A

CN104450881A - 基于DNA Barcoding 的6种常见鱼类鉴别试剂盒

Info

Publication number: CN104450881A
Application number: CN201410561556.8A
Authority: CN
Inventors: 赵生国; 郑王山; 郭永博; 李永青; 权金强; 汪文强; 边琳鹤; 车拢杰
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了6种常见鱼类（桂鱼、大黄鱼、草鱼、白鲢、鲫鱼、鲤鱼）的一种鉴别方法。通过对编辑好的碱基序列长度进行比较来鉴别6种常见鱼类及其生肉制品，该方法是基于DNABarcoding建立的，不受被鉴定材料的形态限制，即便是个体的组织碎片，也能得出准确的结论，因此可广泛用于鱼类及其生肉制品的准确鉴定。

Description

基于DNA Barcoding 的6种常见鱼类鉴别试剂盒

技术领域

本发明公开了一种鱼类的鉴别方法，尤其涉及到6种常见鱼类（桂鱼、大黄鱼、草鱼、白鲢、鲫鱼、鲤鱼）鉴别方法。

背景技术

鱼类作为水生环境的指标生物，不仅可做为水体净化指标，还可以作为外来物种入侵检验指标，同时鱼类多样性指标也可以反映其生境状态。近年来，随着我国经济的高速发展，生态问题日益突出，为外来物种的入侵提供了便利条件，给当地鱼类开发和保护带来隐忧。如何快速有效的识别鱼类成为迫切需要解决的问题。但是，由于传统的形态分类学目前得不到足够的重视，形态分类的专业人员逐步减少，影响了鱼类资源保护以及生境研究等工作。

近年来广泛发展的一种由四川大学研发出的鱼类分子生物学快速鉴别方法CN200510022323.1，是通过编码鱼类RNA的核DNA序列的保守性及其转录间隔子的种间差异结合传统的电泳技术鉴别鱼类，这种方法耗时较长，成本较高，更关键的是这种方法无法用于筛选和鉴定特定的鱼类。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种6种常见鱼类及其生肉制品的鉴别方法，通过对编辑好的碱基序列长度进行比较来鉴别多种鱼类中是否有这6种鱼类中的某种，该方法是基于DNA Barcoding建立的，不受被鉴定材料的形态限制，即便是个体的组织碎片，也能得出准确的结论，因此可广泛用于6种常见鱼类及其生肉制品的准确鉴定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、根据已知鱼类的 DNA条形码数据库，设计和合成多组引物；

2、从包含这6种鱼的多种鱼类中提取DNA，利用引物对每个待测对象的DNA进行扩增，根据扩增的结果，选出最佳引物和反应条件；

3、利用步骤（2）筛选出的引物对每个待测对象的DNA进行扩增，扩增后的序列进行测序，然后进行数据分析，从而得到针对常见鱼类 DNA Barcoding 数据库；

4、在建立DNA Barcoding 数据库后，对新的待测对象采用步骤（2）筛选出的引物进行检测，将其与步骤（3）的DNA Barcoding 数据库中的序列长度进行比对，从而确定其是否为常见6种鱼类中的某种。

通过上述方法，先建立对应特定引物的准确的含有常见鱼类COI序列长度的DNA Barcoding 数据库，在后续检测新的待测样品是否为该6种鱼时只需进行序列长度比对即可进行鉴定得到准确结果。

其中，在上述方法中，采用酚氯仿抽提法提取DNA。

具体的说，通过上述方法筛选得到了两对具有良好PCR扩增性能的引物，分别为引物1（F-BaL1733/F-BaH2364：GTGGGCCTAAAAGCAGCC/AAGCTCCAAAGGGTCTTCT

CGT），引物2（F-BaL2344/F-BaH2617：CGAGAAGACCCTTTGGAGCTT/GCTGTTATCC

CTAGGGTAAC）。

通过上述引物，得到的6种常见鱼类DNA Barcoding 数据库如下表1所示：

表1:DNA Barcoding数据库

具体实施方式

1、从鱼类中提取DNA：

参考《分子克隆试验指南》，略有修改：（1）每份样品取10mg肌肉组织，用眼科解剖剪将其尽量剪碎。（2）将提取的样品小心的装在1.5ml的高压灭菌离心管中，然后加600ul的SET（裂解液）。（3）向各个EP管中加入10ul的Prok（20），再加入15ul的SDS，充分混匀。（4）消化过夜，55℃水浴，使肌肉组织消化完全。（5）向各个EP管中加入等体积约600u的Tris饱和酚，摇动混匀15min,然后离心1200rpm，10min。（6）将上清液取出，装入新的EP管中，再加等体积的Tris饱和酚，摇动混匀15min，离心12000rpm，10min。（7）取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混匀10min，离心12000rpm,10min。（8）取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），混匀10min,离心12000prm,10min。（9）取上清液加入2倍体积的冰乙醇（约1mL），再加入1/10体积的约60uL的NaAc水平摇动，可见絮状，白色DNA样品出现。（10）将样品置于-20℃冷冻30min，取出或挑出DNA或离心12000rpm,10min,DNA沉于管底。（11）将75％乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心12000rpm 5—10min。（12）弃去75％的乙醇，自然干燥后，加入适量（约50uL）TE溶解，放-20℃冰箱中保存（注意：DNA不能太干，否则难于溶于TE）。

2、针对引物1、引物2的具体PCR扩增的操作

引物1、2：PCR扩增采用60μL反应体系：Taq PCR Master Mix：30.0μL，上游引物和下游引物各0.5μL，模板DNA(1ng/μL)：1.0μL，ddH2O：28.0μL。PCR反应程序为： 94℃预变性2min，94℃变性20s，退火温度按各引物的最适温度进行（1号引物为51.3℃，2号引物为58.5℃）退火时间30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

3、序列编辑、人工校正，最后进行数据分析的具体过程

将测序返回的峰图读入MEGA5软件中，然后将MEGA5中同种引物所对应的鱼的碱基序列放在一起进行比对；接下来再用Chromas软件打开峰图，并将峰图和MEGA5中的碱基序列进行对照，根据峰图将丢失的碱基和错误的碱基进行人工校对更正；最后对MEGA5中同种引物所对应的鱼的碱基序列按照要求截成以特定碱基序列开头和结尾的碱基序列，之后比较其碱基长度。

SEQUENCE LISTING

<110> 甘肃农业大学

<120> 基于DNA Barcoding 6种常见鱼类鉴别试剂盒

<130> 2014

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 308

<212> DNA

<213> Siniperca chuatsi

<400> 1

tgctaatatg agtaataaga gagcataaaa ctctctcctt gcacacgtgt aaatcggaac 60

ggacccccca ccgaacatta acggccccaa acaaagaggg tactgaacaa cagaccaaac 120

aaccagaaga acattcaaaa cactaccgtt aaccccacac tggtgtgccc cctaggaaag 180

actaaaagaa agagaaggaa ctcggcaaac acatgaagcc tcgcctgttt accaaaaaca 240

tcgcctcttg caaagctgaa aaataaaagg tcccgcctgc cctgtgacta taagtttaac 300

ggccgcgg 308

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> Siniperca chuatsi

<400> 2

gttggggcga ccgcggggaa acaaaaaacc cccacgtgga atgggaatac tcctcctaca 60

actaagagct cctgctctaa caaacagaat ttctgaccaa taagatccgg caacgccgat 120

caacggaccg agttacccta gggataacag 150

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> Pseudosciaena crocea

<400> 3

tgctaatatg agtaataaaa aagtataaac ctctctcctt gcacaagtgt aactcggaac 60

ggaccaccca ccgaacatta acgaccccaa acaaagaggg ctttgaacaa cagacccgtc 120

aactaaaaaa acactcaata aactaatcgt taaacccaca ctggtgtgcc ttcaaggaaa 180

gactaaaaga aaaagaagga actcggcaaa cacatgaagc ctcgcctgtt taccaaaaac 240

atcgcctctt gcaaaattaa tgaataaaag gtcctgcctg ccctgtgacc atgagttcaa 300

cggccgcgg 309

<210> 4

<211> 155

<212> DNA

<213> Pseudosciaena crocea

<400> 4

gttggggcga ccacggggaa ctacaaaacc cccgcgtgga acgaaagcac caccccgctt 60

ttacaactaa gagcctctgc tctaataaac agaatatctg accaacaaga tccggcaacg 120

ccgatcaacg aaccgagtta ccctagggat aacag 155

<210> 5

<211> 309

<212> DNA

<213> Ctenopharyngodon idellus

<400> 5

tgctaaaatg agtaacaaga agacctgctc ttctccaagc acaagtgtaa accagatcgg 60

acaaaccact ggaaattaac gaacccaacc caagagagta atgtgaataa caaaaaaacc 120

aagaaaaccc cacaattaaa caatcgttaa ccccacactg gagtgctatt tttaaaggaa 180

agactaaaag aaagggaagg aactcggcaa acacaagcct cgcctgttta ccaaaaacat 240

cgcctcctgc aatcaaactc agtataggag gtccagcctg cccagggact acgggttcaa 300

cggccgcgg 309

<210> 6

<211> 152

<212> DNA

<213> Ctenopharyngodon idellus

<400> 6

gttggggcga ccacggagga aaaacaagcc tccgagtgga atgggccaaa tccctaaaac 60

taagagaaac atctctaagc cacagaacat ctgaccaaaa atgatccggc taataagtcg 120

atcaacgaac caagttaccc tagggataac ag 152

<210> 7

<211> 308

<212> DNA

<213> Hypophthalmichthysmolitrix

<400> 7

tgctaaaatg agtaacaaga aaacctgctc ttctccaagc acaagtgtaa accagatcgg 60

acaaaccact ggaaattaac gaacccaacc caagagagta atgtgaacaa caaaaaaacc 120

aagaaaaccc cacaattaaa caatcgttaa ccccacactg gagtgctatt ttaaaggaaa 180

gactaaaaga aagggaagga actcggcaaa cacaagcctc gcctgtttac caaaaacatc 240

gcctcctgca actaaactga gtataggagg tccagcctgc ccagtgacta cgggttcaac 300

ggccgcgg 308

<210> 8

<211> 154

<212> DNA

<213> Hypophthalmichthysmolitrix

<400> 8

gttggggcga ccacggagga aaaacaagcc tccgagtgga atgggctaaa tccctaaaac 60

caagagagac atctctaagc cacagaacat ctgaccaaaa atgatccggc taataaagcc 120

gatcaacgga ccaagttacc ctaggggata acag 154

<210> 9

<211> 306

<212> DNA

<213> Carassius auratus

<400> 9

tgctaaaatg agtaacaaga aggcccgccc ttctccaagc acaagtgtaa gccaaatcgg 60

acaagccatt ggcaactaac gaactcaacc aaagagagca atgtggtatc acaaaaaaac 120

ctaaaaaaac ccacaaccta aatatcgtta cccccacact ggagtgcaac aaaggaaaga 180

ctaaaagaaa aggaaggaac tcggcaaaca caagcctcgc ctgtttacca aaaacatcgc 240

ctcctgcaac acaaccaagt ataggaggtc cagcctgccc agtgactaca agttcaacgg 300

ccgcgg 306

<210> 10

<211> 154

<212> DNA

<213> Carassius auratus

<400> 10

gttggggcga ccacggagga aaaaaaagcc tccaggtgga acgggagaat ttcctaaaac 60

taagagagac atctctaagc cacagaacat ctgaccaaat atgatccggc taatacaagc 120

cgatcaacga accaagttac cctagggata acag 154

<210> 11

<211> 306

<212> DNA

<213> Cyprinus carpio

<400> 11

tgctaaaatg agtaacaaga aggcccgccc ttctccaagc acaagtgcaa gccaaatcgg 60

acaagccatt ggcaactaac gaactcaacc aaagagagca atgtggtatc acaaaaaaac 120

ctaaaaaaac ccacaaccta aatatcgtta cccccacact ggagtgcaac aaaggaaaga 180

ctaaaagaaa aggaaggaac tcggcaaaca caagcctcgc ctgtttacca aaaacatcgc 240

ctcctgcaac acaaccaagt ataggaggtc cagcctgccc agtgactaca agttcaacgg 300

ccgcgg 306

<210> 12

<211> 155

<212> DNA

<213> Cyprinus carpio

<400> 12

gttggggcga ccacggagga aaaaaaagcc tccaggtgga acgggaaaat ttcctaaaac 60

taagagagac atctctaagc cacagaacat ctgaccaaat atgatccggc taatacaagc 120

cgatcaacga accaagttac cctaggggat aacag 155

Claims

1.6种常见鱼类（桂鱼、大黄鱼、草鱼、白鲢、鲫鱼、鲤鱼）及其生肉制品鉴别试剂盒，其特征在于它是通过对试验所得的碱基序列长度进行比较从而准确鉴别常见6种鱼类及其生肉制品的方法，简便易行，操作容易； 6种常见鱼类及其生肉制品的鉴别方法，包括下述步骤：（1）根据已知鱼类的 DNA条形码数据库，设计和合成多组引物；（2）从包含这6种鱼的多种鱼类中提取DNA，利用引物对每个待测对象的DNA进行扩增，根据扩增的结果，选出最佳引物和反应条件；（3）利用步骤（2）筛选出的引物对每个待测对象的DNA进行扩增，扩增后的序列进行测序，然后进行数据分析，从而得到针对6种常见鱼类 DNA Barcoding 数据库；（4）在建立DNA Barcoding 数据库后，对新的待测对象采用步骤（2）筛选出的引物进行检测，将其与步骤（3）的DNA Barcoding 数据库中的序列长度进行比对，从而确定其是否为6种常见鱼类种的某种。

2.根据权利要求1的鉴定方法，其特征在于采用酚氯仿抽提法提取DNA。

3.根据权利要求1的鉴定方法，其特征在于筛选出两组特异引物，引物1为：F-BaL1733/F-BaH2364：GTGGGCCTAAAAGCAGCC/AAGCTCCAAAGGGTCTTCTCGT；引物2为：F-BaL2344/F-BaH2617：CGAGAAGACCCTTTGGAGCTT/GCTGTTATCCCTAGGGTAAC。

4.根据权利要求3的鉴定方法，其特征在于基于这两组引物建立的6种常见鱼类 DNA Barcoding 数据库如下所示：

5.6种常见鱼类及其生肉制品的鉴别试剂盒，其特征在于包含权利要求3中的引物1和引物2。