CN107771088A

CN107771088A - 多孔结构以及制备该多孔结构的方法

Info

Publication number: CN107771088A
Application number: CN201680034436.XA
Authority: CN
Inventors: 金泰希; 任钉男; 都圣埈; 金彩禾; 金润珍; 李奎东
Original assignee: Korea Institute of Industrial Technology KITECH
Current assignee: Korea Institute of Industrial Technology KITECH
Priority date: 2015-06-12
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2018-03-06
Also published as: EP3308807A1; EP3308807A4; KR101693696B1; US11833257B2; KR20160146378A; EP3308807B1; US20200139001A1; WO2016200218A1

Abstract

本发明公开了一种多孔结构和该多孔结构的制备方法，所述多孔结构包括水溶性壳聚糖；和羧甲基纤维素类化合物，其中，所述水溶性壳聚糖和所述羧甲基纤维素类化合物的重量比为65:35至25:75。

Description

多孔结构以及制备该多孔结构的方法

技术领域

本申请要求于2015年6月12日在韩国提交的韩国专利申请号No.10-2015-0083576的优先权权益，其公开内容通过引用并入本说明书中。本公开涉及一种多孔结构和制备该多孔结构的方法，更具体地，涉及一种具有显著的血液吸收容量、快速血液凝固和提高的形状稳定性的多孔结构，以及制备该多孔结构的方法。

背景技术

在各种环境中，动物包括人可能受伤。伤口常常伴随流血。在一些情况下，伤口和流血并不危险，无需外界帮助，通过常规的血液凝固活性即可停止流血。不幸的是，在其他的情况下，可能产生大量的流血。

特别是，过量流血会立刻危及人的生命并且是导致死亡的主要因素之一，有报道美国由于过量流血而死亡的数目每年超过50,000。即刻有效的停止流血可以大大提高存活的概率，因此在战场上、现实生活中的急救情况和手术室中使用止血剂是非常必须的。

人们长期致力于开发止血剂以快速止血，并且已经开发了各种用于治疗由于多种原因产生的流血和皮肤损伤的制剂。

普通的纱布或绷带具有对轻微流血的止血作用，但是在威胁生命的严重流血中使用受限，氧化的纤维素类止血剂，由于它们具有某种程度较差的凝血能力和对伤口的粘附性而存在缺点。

目前可获得的止血绷带，例如胶原蛋白伤口敷料或干纤维蛋白凝血酶伤口敷料在手术应用中的用途有限，特别是，在血液快速流动如大出血的情况下，它们容易溶解，这使得使用受到限制。这些现在可获得的手术止血绷带不结实，因此容易由于弯曲或压力的负荷造成损坏。

此外，胶原蛋白类止血剂价高且难于保存，含有凝血酶和纤维蛋白原的止血剂在治疗中具有感染风险和过敏反应的问题。

此外，为了促进血液凝固，已经研究了无机类止血剂如沸石，但是，据报道使用活化沸石进行凝血时，产生不希望的热损伤。已经开发了无伴随发热的无机类止血产品，但是它们的凝血能力仍然没有好到足以应用于过量流血。

现在，因此，仍然需要开发比已经研究的早期止血剂具有改善的、更好的血液凝固性能和止血效果的止血剂。

发明内容

技术问题

本公开旨在提供具有显著的血液吸收容量、快速血液凝固和优异形状稳定性的多孔结构。

本公开还旨在提供一种制备所述多孔结构的方法。

技术方案

为了实现上述目的，根据本公开的一个方面，提供一种多孔结构，包括水溶性壳聚糖，和羧甲基纤维素类化合物，其中水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比为从65:35至25:75。

多孔结构的表观密度可以为从0.003g/cm³至0.050g/cm³。

根据本公开的另一方面，提供一种多孔结构，包括水溶性壳聚糖，和羧甲基纤维素类化合物，其中所述羧甲基纤维素类化合物与钙离子键合，并且水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比为从50:50至25:75。

每100重量份的水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物中，钙离子的含量可以是0.2重量份至10重量份。

根据本公开的另一方面，提供一种多孔结构的制备方法，包括制备包含水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素类化合物和水的组合物，冷冻干燥所述组合物，其中水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素的重量比为从65:35至25:75。

所述方法还可以包括将多孔结构浸没在含有钙化合物和溶剂的溶液中，并干燥。

所述方法还可以包括，在干燥后，浸没在水和水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的不良溶剂的混合溶剂中，用热或热压干燥。

此外，所述方法还可以包括在干燥后的伽玛辐射。

有益效果

根据本公开的一个实施方案的多孔结构，同时包含羧甲基纤维素类化合物和水溶性壳聚糖，其中在重复单元中具有-COO^-负电荷的羧甲基纤维素类化合物和其表面上具有-NH₃ ⁺正电荷的水溶性壳聚糖，通过离子键结合在一起形成复合物，由此通过冷冻干燥的方法提供具有高形状稳定性的多孔结构，而在制造多孔结构或加入酸溶解壳聚糖后，不需要用于形状稳定性的操作，如添加交联剂的交联或使羧甲基纤维素的可溶性下降的酸处理。

根据本公开的一个实施方案的多孔结构，同时具有水溶性壳聚糖的优异的止血功能，和羧甲基纤维素类化合物的突出的液体吸收和保持性能以及吸水增稠效果，它们之间的离子键解决了当单独使用壳聚糖时某种程度的低吸收率，或单独使用羧甲基纤维素类化合物时由于凝胶化造成的较差的止血效率和形状不稳定性的常规问题，并提供优异的液体吸收性能和止血效果的协同作用。

此外，由于额外具有与钙离子的键，根据本公开的一个实施方案的多孔结构即使接触血液时，由于提高的形状稳定性而具有延长的形状保持时间，并且在与血液或体液接触时释放钙离子，从而进一步提高止血效果。

根据本公开的一个实施方案的多孔结构可以用作各种医用材料，包括止血剂、防粘连屏障和伤口敷料。

附图说明

附图说明本公开的优选实施方案，与前面的公开一起用于提供对本公开的技术精神的进一步理解。然而，本公开不能理解为局限于附图。

图1是根据实施例1制备的多孔结构的照片图像。

图2是将实施例1至实施例3和比较例2和比较例4的多孔结构浸没在蒸馏水中后经过1分钟时显示结果的照片图像。

图3是将实施例1至实施例3和比较例2和比较例4的多孔结构浸没在蒸馏水中并以每分钟60个周期震荡5分钟后显示结果的照片图像。

图4是显示使用根据实施例1至实施例3和比较例1至比较例4的多孔结构、比较例5至比较例10的商购止血剂和只有血液(比较例11)评价血液凝固性能的结果的图。

图5是显示评价实施例1和实施例4至实施例6的多孔结构的血液凝固性能的结果的图。

图6是显示评价使用实施例1和实施例3的多孔结构、比较例5至比较例7的商购止血剂和只有血液(比较例11)在不同凝固时间的血液凝固性能的图。

图7是将实施例3和实施例7的多孔结构浸没在蒸馏水中并以每分钟60个周期震荡后，显示评价形状保持性能的照片图像。

图8是使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,SU 8010)观察到的实施例3的多孔结构的横截面的照片图像，和显示重复5次所做的基于EDX测量的元素分析的图像。

图9是使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,SU 8010)观察到的实施例7的多孔结构的横截面的照片图像，和显示重复5次所做的基于EDX测量的元素分析的图像。

图10是显示使用根据实施例1、3、7和8的多孔结构评价血液凝固性能的结果的图。

图11是显示使用实施例3和实施例7的多孔结构评价在不同的凝固时间的血液凝固性能的图。

图12a和图12b是分别显示使用实施例1的多孔结构的止血效果和凝血结果的照片图像。

具体实施方案

下文中，将详细地描述本公开。在描述之前，应当理解，说明书和所附权利要求中使用的术语或词语不应当解释为局限于常规和字典含义，而是基于允许发明人适当定义术语以最好地解释的原则将术语或词语理解为与本公开的技术方面相应的含义和概念。

因此，在此描述的公开内容仅是本公开的一个最优选的实施例，不能用于代表本公开的所有技术方面，因此，应当理解在提交该申请时可以对其进行替换、其它等价方式和变化。

根据本公开的一个方面的多孔结构包括水溶性壳聚糖，和羧甲基纤维素类化合物，其中水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比为从65:35至25:75。

壳聚糖是虾、蟹、龙虾和墨鱼的主要成分——几丁质，的脱乙酰基形式的化合物，并且以多种形式出售用于工业应用。

水溶性壳聚糖是指溶解在中性水中的壳聚糖，即无需加入用于溶解的酸而溶解在水中的壳聚糖。

水溶性壳聚糖提供具有强渗透性和高比表面积的带正电荷的表面，并且带正电荷的表面可形成对红细胞和血小板之间的相互作用具有高活性的表面。红细胞膜带负电荷，被吸引到水溶性壳聚糖的带正电荷的表面上，被吸引的红细胞膜和水溶性壳聚糖接触并相互结合，非常快的形成血块。由于这个原因，水溶性壳聚糖具有非常好的血液凝固性能，而且与细菌、内毒素和微生物连接并发挥杀死细菌、微生物和/或病毒制剂的作用。

水溶性壳聚糖包括，但不限于，水溶性壳聚糖乳酸盐、水溶性壳聚糖盐酸盐、水溶性壳聚糖抗坏血酸盐和低分子量的水溶性壳聚糖的衍生物。水溶性壳聚糖的衍生物包括例如壳聚糖-PEG和壳聚糖-胆汁酸。

根据本公开的一个实施方案，水溶性壳聚糖的脱乙酰度可以是，例如从60％至100％，或从80％至100％，水溶性壳聚糖的重均分子量可以是，例如从5,000g/mol至500,000g/mol。当脱乙酰度和重均分子量满足上述范围时，水溶性提高，止血功能和伤口敷料效果进一步提高。

羧甲基纤维素类化合物是指羧甲基纤维素或其盐，所述盐包括但不限于羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钾或它们的混合物。

羧甲基纤维素是指羧甲基取代形成纤维素的葡萄糖的羟基，通常缩写成CMC。羧甲基纤维素使用在包括胶水、食品、化妆品、药物添加剂和石油提取的各领域中，特别是，由于生物相容性高，广泛用于医用材料。

因此，羧甲基纤维素可以使用在粘附抑制剂、伤口敷料和止血剂中。在粘附抑制剂的情况下，重要的是在***身体后在预定的时间段内降解，而在伤口敷料或止血剂的情况下，重要的是在预定的时间段保持形状。

根据本公开的一个实施方案，羧甲基纤维素的取代度可以是，例如从0.4至3.0、或者从0.6至2.5、或者从0.7至1.5。当取代度满足上述范围时，水溶性可以提高。

然而，本公开的多孔结构同时包含羧甲基纤维素类化合物和水溶性壳聚糖，其中，在重复单元中具有-COO^-负电荷的羧甲基纤维素类化合物和表面具有NH₃ ⁺正电荷的水溶性壳聚糖，通过离子键结合在一起形成复合物。即，在不需要用于提高形状稳定性的工艺的情况下，如在制备多孔结构后加入交联剂的交联，或酸处理以降低羧甲基纤维素的溶解性或加入酸溶解壳聚糖，通过冷冻干燥的方法可以提供具有高形状稳定性的多孔结构。

即，根据本公开的一个实施方案的多孔结构既具有水溶性壳聚糖的优异的止血功能又具有羧甲基纤维素类化合物的突出的液体吸收和保持性能，二者之间的离子键解决了当单独使用壳聚糖时某种程度上的低吸收效率或当单独使用羧甲基纤维素类化合物时由于凝胶化导致的止血功能和形状稳定性下降的常见问题，并提供优异的液体吸收性能和止血功能的协同效果。

此外，根据本公开的一个实施方案的止血剂由于具有优异的物理性能可以用作填充体腔的止血剂，并且在接触体液时羧甲基纤维素和水溶性壳聚糖之间的离子键解离，使得随着时间生物降解，这样在处理后省去单独移除的需要，因此有望作为血管中的止血剂的应用性高。

在多孔结构中水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比可以为从65:35至25:75，特别是，从60:40至30:70，更特别是从50:50至30:70。在重量比满足该范围时，形状稳定性高，液体吸收速率快并且止血效果优异。

此外，根据本公开的一个实施方案的多孔结构的表观密度可以从0.003g/cm³至0.050g/cm³、特别是从0.005g/cm³至0.045g/cm³、更具体地从0.010g/cm³至0.040g/cm³。

在此使用的术语“表观密度”是指在例如粉末、颗粒、纤维和泡沫的物体内部具有固体部分和孔部分的多孔结构内包括孔部分的密度，可以通过将孔结构的质量除以包括固体部分和孔部分的总体积计算。

当表观密度满足该范围时，形状稳定性高，液体吸收速率快，液体保持和止血效果优异。

根据本公开的另一个方面的多孔结构包括水溶性壳聚糖；和羧甲基纤维素类化合物，其中所述羧甲基纤维素类化合物与钙离子键合，并且水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比是从50:50至25:75。

多孔结构如上所述是阳离子的水溶性壳聚糖和阴离子的羧甲基纤维素类化合物通过离子键结合在一起形成复合物。在这种状态下，通过额外的钙处理使钙离子与羧甲基纤维素类化合物结合。

进一步结合有钙离子的多孔结构即使与血液接触时，由于延长的形状保持时间可以具有提高的形状稳定性，并具有进一步提高的止血性能。

在根据本公开的一个实施方案的结合有钙离子的多孔结构中，水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比可以为从50:50至25:75，具体地为从50:50至30:70，更具体地为从45:55至30:70。当重量比满足该范围时，有利于钙离子的引入，止血组合物的液体吸收速率快，止血效果优异。

根据本公开的一个实施方案，每100重量份的水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物中的钙离子的含量可以是0.2至10重量份，特别是0.2至7重量份，更特别是1至6重量份。当钙离子的含量满足该范围时，多孔支撑体的形状稳定性提高，止血效果增强，液体吸收速率提高。

根据本公开的一个实施方案的多孔结构的血液吸收速率为15秒以下、特别是10秒以下、更特别是3秒以下。

在这种情况下，血液吸收速率被评价为在血液滴入止血多孔材料后，100的血液被尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的止血多孔材料完全吸收所需要的时间。

此外，根据本公开的一个实施方案的多孔结构在评价血液凝固性能时具有0.30以下、特别是0.25以下、更特别地0.20以下的吸光度。

在这种情况下，血液凝固性能的评价如下进行：将100的体积比为9:1的血液和抗凝剂(柠檬酸钠,3.8w/v％)的混合溶液滴到尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的多孔结构中，加入10的0.2M CaCl₂水溶液在37℃的恒温箱中诱导凝固10分钟，使得未参与凝固的一部分血液在12.5mL的蒸馏水中被再次洗脱。取200的洗脱液在540nm波长处测量确定吸光度[AB]，200的蒸馏水测量确定540nm波长处的吸光度[AW]，通过下面的公式进行计算以消除在血液洗脱液中含有的蒸馏水对吸光度的影响。

评价凝血性能的吸光度＝血液洗脱液的吸光度[AB]–蒸馏水的吸光度[AW]

此外，根据本公开的一个实施方案的多孔结构可以是通过冷冻干燥含有水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的组合物获得产物。在多孔结构是通过冷冻干燥工艺制备的冷冻干燥产品的情况下，优点是容易储存且多孔结构的组分没有变化，可以避免微生物的分解或感染，容易加入对工艺温度敏感的活性成分、抗菌剂和止血物质。

此外，本公开的多孔结构根据用于冷冻溶液的架构的形状可以获得各种外观形状，包括球形如球、六面体和四面体。

此外，根据本公开的一个实施方案的多孔结构还可以包含添加剂，添加剂可以根据需要的性能自由选择，其实例包括生物活性材料、增塑剂、止血材料、抗菌材料、细胞、酶、抗原和色素。

根据本公开的一个实施方案，无毒的增塑剂甘油可以以最优化的量混合以提高多孔结构的韧性或粘合强度，或者可以加入如银、银类化合物、三氯生、双胍类和亚甲基蓝的抗菌物质以防止微生物如细菌侵入皮肤中。

此外，生物活性物质是指以痕量极大地影响身体的功能的物质，包括维生素、激素、酶和神经递质，例如包括但不限于，人血清白蛋白、牛凝血酶、人凝血酶(h凝血酶)、rh凝血酶、VIIa因子、XIII因子、重组凝血因子XIII(rFXIII)、血栓素A2、***素-2a、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、血管性血友病因子、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、***、成纤维细胞生长因子、角质化细胞生长因子、神经生长因子、青霉素、氨苄青霉素、甲氧苯青霉素、羟氨苄青霉素、阿莫西林、克拉维酸、阿莫西林、氨曲南、亚胺培南、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、万古霉素、克林霉素、红霉素、多粘菌素、杆菌肽、两性霉素、制霉菌素、利福平、四环素、多西环素、氯霉素和它们的组合，根据患者的伤口性质或医疗条件而定。作为止血物质，可以添加胶原蛋白、明胶、海藻酸盐、氧化纤维素、几丁质和几丁质的衍生物、壳聚糖衍生物以及氯化钙。

根据本公开的另一方面的多孔结构的制备方法，包括制备包含水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素类化合物和水的组合物，冷冻干燥所述组合物，其中水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比为从65:35至25:75。

首先，制备包含水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素类化合物和水的组合物。

水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素类化合物的种类与上述相同。

所述组合物可以通过将羧甲基纤维素类化合物溶于水制备水溶液，随后向其中加入水溶性壳聚糖并震荡获得。或者，相反，所述组合物通过将羧甲基纤维素类化合物加入水溶性壳聚糖水溶液中并震荡获得。

单独的羧甲基纤维素类化合物或单独的水溶性壳聚糖可以分别在水溶液相中获得，但是，当它们共同存在时，形成离子键，不能成为水溶液相。通过震荡，可以得到将羧甲基纤维素类化合物和水溶性壳聚糖的离子复合物分散或浸没在水中的组合物。

根据本公开的一个实施方案，组合物的浓度可以为从0.5至5.0w/v％、特别是从1.0至4.0w/v％、更特别是从1.5到3.0w/v％。

在这种情况下，"w/v％"是指浓度单位，表示组合物的单位体积的固体的重量，例如1.0w/v％表示1g的固体分散在分散介质中使总体积为100mL的组合物。

当组合物的浓度满足该范围时，可以控制各种表面结构并保持形状稳定性，血液吸收速率快止血效果优异。

随后，冷冻干燥如上制备的组合物。

在这种情况下，冷冻步骤可以在例如0℃以下、或从-40至0℃的温度下进行。当冷冻温度满足该范围时，得到的多孔结构保持形状稳定性，控制孔的形状和尺寸以及孔分布以提高止血性能并具有优异的液体吸收性能。

根据本公开的一个实施方案，该方法还可以包括干燥步骤后的伽玛辐射步骤。

伽玛辐射步骤提供对多孔结构的杀菌处理，直接施加于皮肤而不使用热或化学品。特别是，伽玛辐射处理即使在多孔结构密封成最终产品的状态下也可以进行。伽玛辐射可以在例如从5至30kGy的剂量下进行。

根据本公开的一个方面，水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比可以是从50:50至25:75。

在具有该重量比的情况下，该方法还可以包括将通过上述冷冻干燥步骤获得的多孔结构浸没在含有钙化合物和溶剂的溶液中，随后干燥、制备结合钙离子的多孔结构。

钙化合物包括，但不限于，选自氯化钙、碳酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、葡乳醛酸钙、氢氧化钙和草酸钙中的至少一种。

此外，溶剂可以是水和水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的不良溶剂的混合溶剂。水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的不良溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯和氯仿。例如，溶剂可以是水和醇的混合溶剂。在用钙离子处理中使用的溶剂是水和水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的不良溶剂的混合溶剂的原因是，防止壳聚糖或羧甲基纤维素类化合物被处理过程中和加入水溶液相中的钙离子时使用的过量的水溶解。

当使用上述的钙化合物的溶液处理时，钙离子与羧甲基纤维素类化合物的羧基阴离子结合。在这种情况下，该方法还包括洗涤以除去未参与离子键的未反应的钙化合物。

根据本公开的一个实施方案，通过冷冻干燥步骤得到的多孔结构然后浸没在含有钙化合物和溶剂的溶液中，可以在进行干燥前洗涤。通过洗涤步骤，可以除去未反应的钙化合物或残留溶剂。

根据本公开的一个实施方案，通过冷冻干燥或进一步如上所述的用钙处理获得的多孔结构，可以进一步再进行将其浸没在水和水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的不良溶剂的混合溶剂中的步骤，并通过热或热压干燥。

因此，水溶性壳聚糖与羧甲基纤维素类化合物中存在的羟基之间的氢键通过在浸没步骤中加入水形成，在接下来的热或热压干燥的步骤中形成热定型效果，提高多孔支撑体的强度。当施用到受伤部位时，即使在吸收血液后，具有改善的强度的多孔结构的湿态强度也增加，因而提高手术中的便利性并更牢固地压迫血管，因此进一步促进止血。

此外，根据本公开的一个实施方案，伽玛辐射还可以进行在已进行过钙处理步骤的多孔结构上。伽玛辐射步骤同上。

此外，在水和不良溶剂的混合溶剂中浸没后，多孔结构可以进行热或热压干燥以及伽玛辐射。在这种情况下，可以不考虑顺序进行上述步骤，特别是，伽玛辐射可以在最后一步进行。

下面，为了有助于理解，通过实施例详细描述本公开。然而，本公开的实施方案可以改变成很多不同的形式，本公开的范围不能解释为限于下面的实施例。提供本公开的实施方案用于向本公开所属的技术领域的普通技术人员更加充分地解释本公开。

实施例1

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将200mL的2％(w/v)CMC溶液放入混合搅拌器中，加入200mL的水并与之混合，加入4g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度:87％,重均分子量350,000mol/g)粉末并强烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后2-3分钟内，再次强烈震荡混合搅拌器，制备2％(w/v)不透明的白色浆液相的组合物，包含50重量份的水溶性壳聚糖和50重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。制备的多孔结构在图1中示出。制备的多孔结构的表观密度为0.0273g/cm³。

实施例2

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)水溶液。将160mL的2％(w/v)CMC溶液放入混合搅拌器中，加入240mL的水并与之混合，加入4.8g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000mol/g)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备2％(w/v)不透明的白色浆液相的组合物，包含60重量份水溶性壳聚糖和40重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。制备的多孔结构的表观密度为0.0234g/cm³。

实施例3

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)水溶液。将280mL的2％(w/v)的CMC溶液放入混合搅拌器中，加入120mL的水并与之混合,加入2.4g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000mol/g)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备2％(w/v)的不透明的白色浆液相的组合物，包含30重量份的水溶性壳聚糖和70重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。制备的多孔结构的表观密度为0.0230g/cm³。

实施例4

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将100mL的2％(w/v)的CMC溶液放入混合搅拌器中，加入300mL的水并与之混合，加入2.0g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000mol/g)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备1％(w/v)的不透明的白色浆液相的组合物，包含50重量份的水溶性壳聚糖和50重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。制备的多孔结构的表观密度为0.0199g/cm³。

实施例5

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将150mL的2％(w/v)的CMC溶液放入混合搅拌器中，加入250mL的水并与之混合，加入3.0g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备1.5％(w/v)的不透明的白色浆液相的组合物，包含50重量份的水溶性壳聚糖和50重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。制备的多孔结构的表观密度为0.0270g/cm³。

实施例6

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将250mL的2％(w/v)的CMC溶液放入混合搅拌器中，加入150mL的水并与之混合，加入5.0g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000g/mol)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备2.5％(w/v)的不透明的白色浆液相的组合物，包含50重量份的水溶性壳聚糖和50重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。制备的多孔结构的表观密度为0.0375g/cm³。

实施例7

将实施例3中制备的0.2g的多孔结构(水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比为30:70)浸没在200mL的在乙醇和水的体积比为8:2的混合溶剂中的0.05M CaCl₂溶液中，并在室温下震荡1小时。在体积比为8:2的乙醇和水的混合溶液中洗涤2次后，再在甲醇中洗涤一次，在50℃下使用对流恒温烘箱进行干燥90分钟以制备还包含钙离子的多孔结构。

实施例8

除了使用在实施例1中制备的多孔结构(水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比为50:50)之外，通过实施例7的相同方法制备还包含钙离子的多孔结构。

比较例1

将水溶性壳聚糖(脱乙酰度:87％，重均分子量350,000g/mol)粉末溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。

比较例2

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将120mL的2％(w/v)的CMC溶液放入混合搅拌器中，加入280mL的水并与之混合，加入5.6g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000g/mol)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备2％(w/v)的不透明的白色浆液相的组合物，包含70重量份的水溶性壳聚糖和30重量份的羧甲基纤维素钠。

将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。

比较例3

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将制备的溶液倒入125mm×125mm×20mm的聚苯乙烯方形培养皿中，在0℃下冷冻4小时并在-15℃下冷冻24小时，在60℃下真空干燥制备泡沫型多孔结构。

比较例4

将羧甲基纤维素钠(CMC，取代度为0.9)溶于蒸馏水中制备2％(w/v)的水溶液。将320mL的2％(w/v)的CMC溶液放入混合搅拌器中，加入80mL的水并与之混合，加入1.6g的水溶性壳聚糖(脱乙酰度87％，重均分子量350,000g/mol)粉末并剧烈震荡。在加入水溶性壳聚糖后的2-3分钟内，再次剧烈震荡混合搅拌器，制备2％(w/v)的不透明的白色浆液相的组合物，包含20重量份的水溶性壳聚糖和80重量份的羧甲基纤维素钠。

试验例：评价液体吸收和保持

在需要快速止血并吸收大量血液的止血敷料的情况下，对液体如血液的优异的液体吸收性能是必要的。此外，即使在某种程度的压迫后，如果血液没有通过多孔结构渗出并保持在多孔结构中，操作容易并且在多孔结构中积累的凝血相关因子有效帮助血液凝固。

测量实施例1和3以及比较例1至3中制备的多孔结构的重量(液体吸收前的重量)，在25℃下，在0.9％的生理盐水溶液中浸没10分钟后，测量液体吸收后的重量，通过下面的公式计算液体吸收，并将结果显示在表1中。

液体吸收(g/g)＝[液体吸收后的重量(g)-液体吸收前的重量(g)]/[液体吸收前的重量(g)]

测量实施例1和3以及比较例1至3中制备的多孔结构的重量(液体吸收前的重量)，在25℃下，在0.9％的生理盐水溶液中浸没10分钟后，对吸收后的多孔结构施加40㎜Hg的压力1分钟，测量多孔结构的重量(压迫后的重量)，通过下面的公式计算液体保持，并将结果显示在表1中。

液体保持(g/g)＝[压迫后的重量(g)-液体吸收前的重量(g)]/[液体吸收前的重量(g)]。

[表1]

	液体吸收(g/g)	液体保持(g/g)
			实施例1	16	10
实施例3	65	41
			比较例1	不能测量	不能测量
比较例2	不能测量	不能测量
			比较例3	20	不能测量

参考表1，在实施例1和3的情况下，液体吸收足以吸收比止血结构的重量大至少16倍的0.9％生理盐水溶液的量，即使在施加压力后形状稳定性也优异并且保持高水平的液体吸收性能，显示出高液体保持容量。

在比较例1的情况下，吸收0.9％生理盐水溶液时形状立刻坍塌，在比较例2中，形状稳定性太差以至无法测量液体吸收和保持。在比较例3的情况下，当吸收0.9％生理盐水溶液时，形成凝胶，当施加压力测量液体保持时，形状无法保持，因此无法测量液体保持。

试验例:评价浸没和震荡后的形状稳定性

将实施例1至3和比较例2和4的多孔结构切割成尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的碎片，在25℃的蒸馏水中浸没后经过1分钟时的结果和以每分钟60周期震荡5分钟后的结果分别显示在图2和图3中。

在水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比为从65:35至25:75的实施例1至3的情况下，即使在震荡后，液体吸收速率快并且形状保持性能优异。相反，在水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比为70:30的比较例2的情况下，浸没后，蒸馏水的吸收速率与实施例样品相比非常慢，在震荡后，泡沫形状快速坍塌并且形状稳定性非常差。在水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比20:80的比较例4的情况下，当浸没在蒸馏水中时，多孔结构的表面上出现凝胶，即使震荡5分钟，由于凝胶阻塞现象，蒸馏水也不能渗入到多孔结构中。

试验例：观察多孔结构的表面和横截面

通过扫描电子显微镜(SEM)相片图像观察实施例1和3以及比较例1至3中制备的多孔结构的表面和横截面的多孔结构。

在液氮中冷冻各个多孔结构的样品，切割横截面，使用离子镀膜机(E-1045)涂覆金150秒，使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,SU 8010)在50倍放大倍数下观察表面和横截面。在下面的表2中显示出观察结果。

[表2]

参考上面的表2，所有显示出横截面的多孔结构，但是在单独使用水溶性壳聚糖的比较例1和含有过量的水溶性壳聚糖的比较例2的情况下，观察到表面上的很多封闭的孔。相反，在实施例1和3中，发现它们具有在表面和横截面很好的多孔结构，因此，预测血液吸收对它们有利。

试验例:评价血液吸收速率

使用实施例和比较例中制备的多孔结构以及表3中的目前市售的止血敷料产品(比较例5-8)评价血液吸收速率。

[表3]

血液吸收速率如下评价：血液滴入止血多孔结构后，通过测量100的血液(取自狗的血液)被尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的止血多孔结构完全吸收所需要的时间，由此，用于评价作为止血敷料的适用性。在比较例5至9的商购的止血敷料产品的情况下，使用一层作为产品的形状并且测量尺寸为1cm×1cm(宽×长)。

血液吸收前和吸收后的血液吸收速率的结果和照片图像显示在下表4。吸收后的照片图像是在血液滴入并被完全吸收后的照片图像。在比较例3和8的情况下，即使经过30分钟后也没有吸收血液，因此照片图像是经过30分钟后的一张。

[表4]

参考表4，单独使用水溶性壳聚糖的比较例1需要14秒完全吸收血液，并观察到接触血液的部分溶解。在单独使用羧甲基纤维素钠的比较例3的情况下，接触血液的部分形成凝胶，导致阻止血液被吸收到内部的凝胶阻塞现象，因此即使30分钟后也没有吸收血液。

另一方面，使用水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的实施例1、3和7以及比较例2在几秒钟内显示出快速的血液吸收性能，特别是，水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比为50:50的实施例1和含有钙离子的实施例7，在接触血液时立即吸收血液。在商购产品中，比较例5(Surgicel)、比较例6(QuikClot)和比较例7(Celox Rapid)的产品在接触血液时立即吸收血液，而壳聚糖泡沫型的比较例8(Hemcon Bandage)即使经过30分钟后也没有完全吸收血液。因此，根据本公开的实施方案的多孔止血剂具有与商购止血产品相似或优于其的吸收性能。

试验例：评价血液凝固性能–凝固时间10分钟

使用实施例1至6和比较例1至4中制备的多孔结构、在表3中的现有商购的止血敷料产品(比较例5-8)、涂覆有人纤维蛋白原和人凝血酶Baxter TachoSil的胶原蛋白产品(比较例9)、棉纱布(比较例10)和单独的血(比较例11)评价血液凝固性能。

对于血液凝固性能，在实施例和比较例中制备的多孔结构的情况下，将100体积比为9:1的血液和抗凝剂(柠檬酸钠，3.8w/v％)的混合溶液滴入尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的样品中，并在加入10的0.2M CaCl₂水溶液后在37℃恒温箱中凝固10分钟，在12.5mL的蒸馏水中再次洗脱未参与凝固的血液。取200的洗脱液并在540nm的波长处测量确定吸光度[AB]，测量200的蒸馏水以确定540nm波长处的吸光度[AW]，以消除血液洗脱液中包含的蒸馏水对吸光度的影响，通过下列公式计算止血材料的吸光度。

评价血液凝固性能的吸光度＝血液洗脱液的吸光度[AB]–蒸馏水的吸光度[AW]

在比较例5至10的商购止血敷料产品的情况下，使用一层作为产品的形状并且测量尺寸为1cm×1cm(宽×长)。在比较例11中，通过上述的相同方法单独使用血液且没有任何止血敷料测量吸光度。评价的结果和吸光度的照片图像分别显示在下面的表5和图4和图5中。

[表5]

参考表5和图4，证实实施例1至3的多孔结构比比较例5至10的现有产品具有较少量的未凝固和剩余的血液，因而具有非常低的血液洗脱液的吸光度和突出的血液凝固性能。

在含有大量的水溶性壳聚糖的比较例1和2的情况下，血液凝固性能良好，但是当与血液接触时，发生溶解，形状稳定性显著下降。

在由水溶性壳聚糖单独制备的比较例1的情况下，壳聚糖结构接触血液时立即坍塌，在含有过量水溶性壳聚糖的比较例2的情况下，当接触血液时，形状稳定性显著下降并发生松散现象。另一方面，单独使用羧甲基纤维素钠的比较例3和含有少量壳聚糖的比较例4显示出与商购产品相似的水平，但是血液凝固性能比实施例1至3差的非常多。

此外，对实施例1和实施例4至6的多孔结构进行评价以确定血液凝固性能，实施例1和实施例4至6的多孔结构是冷冻干燥具有50:50相同重量比的水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的组合物在不同浓度下制备的，其结果显示在图5中。

参考图5，当水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的重量比为50:50时，吸光度非常低，与用于冷冻干燥的水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的浓度无关，因此发现止血性能优异。另一方面，证实随着用于冷冻干燥的水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的浓度增加，血液凝固性能逐渐变好。似乎是随着用于制备多孔结构的组合物的浓度增加，可与血液反应的壳聚糖和羧甲基纤维素钠以较高含量存在于制备的多孔结构中，凝固性能变好。

试验例：血液凝固速率

血液凝固性能作为凝固时间的函数，即血液凝固速率，使用实施例1和3制备的多孔结构、比较例5至7的商购产品和单独的血液(比较例11)进行评价。

通过在“试验例：评价血液凝固性能–凝固时间10分钟”中描述的相同方法测量血液洗脱液的吸光度评价血液凝固速率，不同之处在于，使用血液凝固时间为1、2、3、5和10分钟的在37℃恒温箱中进行凝固的样品。在比较例11的情况下，通过上述相同的方法使用没有任何止血敷料的单独的血液测量吸光度。评价的结果显示在下面的图6中。

参考图6，在包含水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素钠的实施例1和实施例3的情况下，在1分钟之内通常发生血液凝固，在2分钟内的吸光度为0.25以下。特别是，在实施例1的情况下，证实在1分钟之内完成血液凝固。在比较例的商购产品中，在比较例7(CELOX RAPID)的情况下，在1分钟内相当的部分发生血液凝固，但是在开始凝固后的5分钟内的吸光度为0.30以上。特别是，在比较例6和7的情况下，血液凝固速率具有非常低的值。

试验例:观察血液凝固行为

观察实施例1和3以及比较例1至3中制备的多孔结构的血液凝固行为。

将200的体积比为9:1的血液和抗凝剂(柠檬酸钠，3.8w/v％)的混合溶液滴入尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的多孔结构中，加入20的0.2M CaCl₂水溶液在37℃的恒温箱中凝固10分钟。接下来，用2％甲醛溶液的PBS(磷酸盐缓冲盐水)固定2小时，随后以逐渐增加乙醇比例(10:0,8:2,5:5,2:8,0:10)的水和乙醇的混合溶液洗涤，并干燥。使用离子镀膜机(E-1045)用金涂布每个干燥的样品150秒并使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,SU 8010)在6000倍的放大倍数下观察，观察结果显示在下面的表6中。

[表6]

参考表6，在比较例3的情况下，在表面上明显地发现未参与血块形成的红细胞，证实随着水溶性壳聚糖含量的增加，在表面上形成较厚的血块层并覆盖红细胞。特别是在实施例1和3的情况下，清楚地观察到包围红细胞的纤维素纤维。

试验例:钙离子引入的影响

将在实施例3和实施例7中制备的多孔结构切成尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的小片后，浸没在蒸馏水中，在25℃下以每分钟60个周期震荡5分钟，评价形状保持性能，结果显示在图7中。

参考图7，证实与实施例3相比，在实施例7的情况下，形状保持性能得到进一步提高，液体吸收的速率变快。这是因为，在实施例7的情况下，未与水溶性壳聚糖离子键合的羧甲基纤维素链之间的交联通过钙离子诱导形成网络，因此进一步提高形状稳定性。此外，在没有钙离子处理时，凝胶阻塞现象少量发生，导致低的吸收速率，而在钙离子处理的情况下，二价钙离子与羧甲基纤维素的羟基形成键，导致凝胶阻塞现象下降和快速的液体吸收。此外，在实施例7的情况下，当与血液接触时，释放钙，预测进一步促进血液凝固。

使用离子镀膜机(E-1045)用金涂布实施例3和实施例7的多孔结构150秒，使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，SU 8010)通过SEM观察横截面获得的图像和5次重复EDX测量和元素分析，分别显示在图8(实施例3)和图9(实施例7)中。

在实施例3(图8)情况下，检测来自于在制备中使用的羧甲基纤维素钠的Na原子并且检测到4.13重量％，未检测到Ca原子。在实施例7(图9)的情况下，未检测到Na原子，由于钙处理检测到Ca原子并检测到4.58重量％。由此看出，有效引入了钙离子。

参考图8和图9，即使以处理之前相同的方式进行钙处理后仍然存在多孔结构，使得快速血液吸收非常有利，并且钙通过宽的表面积迅速释放，因此认为这样对促进血液凝固有效。

对于实施例7和8制备的多孔结构，通过与上述的“试验例：评价血液凝固性能–凝固时间10分钟”和评价血液凝固性能的“试验例：血液凝固速率”的相同方法评价血液凝固性能，其结果显示在图10和图11中。

参考图10，在水溶性壳聚糖的含量和羧甲基纤维素化合物的含量为50:50的实施例1和实施例8中，发现吸光度非常低，与钙离子的引入无关。相反，在水溶性壳聚糖的含量和羧甲基纤维素化合物的含量为30:70的实施例3和实施例7比较时，两种样品的吸光度为0.2以下，因此血液凝固性能突出，但是在具有引入的钙离子的实施例7的情况下，吸光度显著降低，由此，证实血液凝固性能由于钙离子引入进一步改善。

参考显示凝血速率的图11，当比较水溶性壳聚糖的含量和羧甲基纤维素化合物的含量为30:70的实施例3和实施例7时，证实具有引入的钙离子的实施例7的情况下，血液凝固速率也变得非常快，因此，在1分钟内发生血液凝固。

试验例：观察止血效果

使用大鼠作为过量流血动物模型，观察实施例1的止血效果。在大鼠的股动脉的纵向方向制造3mm的伤口，造成流血30秒后，实施例1的多孔结构放置在伤口上，在施加200gf的力1分钟后观察。确认在常规的纱布的情况下，流血不能停止并且继续，而用实施例1的多孔结构处理的情况下，伤口部位的流血在3分钟内停止，在除去多孔结构后，快速形成血块。通过测量止血前和止血后的多孔结构的重量评价吸收血液的量，结果显示，在血液吸收之前的多孔结构的重量为0.115g，而在止血评价完成后吸收了血液的多孔结构的重量为1.793g，因此血液吸收的量与血液吸收前的重量的比为14.59g/g，显示高液体吸收性能。止血效果和血块形成结果的照片图像分别显示在图12a和图12b中。

Claims

1.一种多孔结构，包括:

水溶性壳聚糖；和

羧甲基纤维素类化合物，

其中，所述水溶性壳聚糖和所述羧甲基纤维素类化合物的重量比为65:35至25:75。

2.根据权利要求1所述的多孔结构，其中，所述多孔结构的表观密度为0.003g/cm³至0.050g/cm³。

3.根据权利要求1所述的多孔结构，其中，所述羧甲基纤维素类化合物选自羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羧甲基纤维素钾中的至少一种。

4.一种多孔结构，包括:

水溶性壳聚糖；和

羧甲基纤维素类化合物，

其中，所述羧甲基纤维素类化合物与钙离子键合，所述水溶性壳聚糖和所述羧甲基纤维素类化合物的重量比为50:50至25:75。

5.根据权利要求4所述的多孔结构，其中，每100重量份的水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物，所述钙离子的含量是0.2重量份至10重量份。

6.根据权利要求1或4所述的多孔结构，其中，所述多孔结构的血液吸收速率为15秒以下，所述血液吸收速率是在血液被滴入止血多孔材料后，100μl的血液被尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的止血多孔材料完全吸收所需要的时间。

7.根据权利要求1或4所述的多孔结构，其中，所述多孔结构在评价血液凝固性能中的吸光度为0.30以下，并且

所述血液凝固性能的评价按如下进行：将100μl的体积比为9:1的混合有抗凝剂(柠檬酸钠,3.8w/v％)的血液滴入尺寸为1cm×1cm×1cm(宽×长×高)的多孔结构中，在37℃的恒温箱中加入10μl的0.2M CaCl₂水溶液诱导凝固10分钟，使得未参与凝固的一部分血液在12.5mL的蒸馏水中再次被洗脱，取出200μl的洗脱液在540nm波长处测量吸光度[AB]，测量200μl的蒸馏水在540nm波长处的吸光度[AW]，使用下面的公式进行计算以消除血液洗脱液中含有的蒸馏水对吸光度的影响：

评价血液凝固性能的吸光度＝血液洗脱液的吸光度[AB]–蒸馏水的吸光度[AW]。

8.根据权利要求1或4所述的多孔结构，其中，所述多孔结构还包括活性成分、增塑剂、抗菌材料、止血材料、细胞、酶、抗原和色素中的至少一种。

9.根据权利要求1或4所述的多孔结构，其中，所述多孔结构是泡沫型。

10.一种制备多孔结构的方法，包括:

制备包含水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素类化合物和水的组合物；和

冷冻并干燥所述组合物，

其中水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素的重量比为65:35至25:75。

11.根据权利要求10所述的多孔结构的制备方法，其中，所述组合物的浓度为0.5w/v％至5.0w/v％。

12.根据权利要求10所述的多孔结构的制备方法，其中，所述水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的重量比为50:50至25:75。

13.根据权利要求10所述的多孔结构的制备方法，还包括：

将所述多孔结构浸没在含有钙化合物和溶剂的溶液中，并干燥。

14.根据权利要求13所述的多孔结构的制备方法，其中，所述溶剂是水和水溶性壳聚糖和羧甲基纤维素类化合物的不良溶剂的混合溶剂。