CN107764992A - 一种微球与抗体的定向偶联方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微球与抗体的定向偶联方法,羧基微球与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联,形成抗体微球复合物。该方法能够有效控制抗体与微球连接时的方向,实现定向偶联从而提高胶乳增强免疫比浊试剂的灵敏度,并能提高试剂对于类风湿因子(RF)的抗干扰能力。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域,尤其涉及一种通过定向偶联提高胶乳试剂灵敏度和特异性的方法和应用。
背景技术
胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是一种稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法分为两种,一种是散射比浊检测法;另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理都是在高分子胶乳微球的表面交联多克隆抗体或者单克隆抗体,当交联有抗体的微球与抗原结合后,在短时间内会迅速聚集在一起,改变反应液的散光性能或透光性能。反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是基于这一原理在均相反应体系中进行抗原抗体免疫反应从而测定待检测体液蛋白的含量。此外,该方法使用全自动生化分析仪进行检测,自动化程度高,排除了环境等因素的干扰,使得该方法相比于酶联免疫吸附法、免疫层析法等方法学具有更好的测试稳定性、准确性,检测通量高。
目前,PETIA检测试剂所采用的微球粒径分布从20nm~4μm,在微球与抗体之间增加的桥联化学臂一定程度上降低了抗体与微球结合时的位阻效应,一方面提高了抗体的有效偶联量,另一方面有效的保护了抗体的三维结构,有效保护了抗体的生物活性区域。检测试剂的灵敏度因此得到了极大的改善,可以达到1.0ng/ml。虽然比ELISA等方法学的灵敏度要差一些,但是对于现有的许多体液蛋白在正常人体内的含量,已基本可以满足临床检测要求。
然而随着检验医学的飞速发展,对于低浓度检测物质的检测越来越多,其检测浓度已从μg/ml级别下降至ng/ml级别,甚至是更微量的pg/ml级别,这对于体外诊断试剂的灵敏度要求也越来越高。目前常用于提高胶乳增强免疫比浊试剂测试灵敏度的方法,包括使用更高亲和力的抗体,使用粒径更大且稳定性更好的微球等,但是对于这些方法的实现,开发难度大,且会在现有基础上大幅度提高试剂的研发及生产成本,无法在胶乳免疫比浊试剂开发上实现普及应用。
在胶乳增强免疫比浊试剂制备过程中,抗体与微球的偶联方法众多,但是都存在一个问题,即抗体在连接到微球上的方向无法控制。众所周知,抗体与抗原结合的区域位于抗体的F(ab)片段上,若在偶联过程中,与微球相连的是抗体的F(ab)片段,那么向外伸展的就是与抗原没有结合活性的Fc片段,这就导致这一偶联抗体为无效抗体。而在抗体与微球进行偶联过程中,抗体的连接方向存在很大的随机性,无效连接抗体的存在使得抗体的利用率不高,并大大降低试剂最终的灵敏度。已经提出的方法有CN106501505A中提及的定向偶联方法,但该方法仍有两个缺点。一是本实验室研究结果及梁延桂在其硕士学位论文中的研究结果表明,全长抗体还原后目的产物的得率很低。还原全长抗体的目的是打开位于Fc段的重链间的两对二硫键,获得一条重链和一条轻链通过二硫键连接的抗体片段,并利用形成的自由巯基进行定向偶联。但通过使用不同种类的还原剂、不同的还原时间以及不同的还原条件进行抗体还原方案的筛选,最终目的产物得率均不超过25%。二是该方法易造成类风湿因子(RF)的干扰,降低试剂的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种微球与抗体的定向偶联方法,该方法能够有效控制抗体与微球连接时的方向,实现定向偶联从而提高胶乳增强免疫比浊试剂的灵敏度与稳定性,并同时提高试剂对于类风湿因子(RF)的抗干扰能力及实现试剂对全血样本的检测。本发明的另一目的是提供该方法在PETIA方法学制备的体外诊断试剂盒中的应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
本发明提供一种微球与抗体的定向偶联方法,羧基微球与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联,形成抗体微球复合物。
本发明所述的抗体F(ab’)片段是指由F(ab’)2片段还原重链间的二硫键形成的带有自由巯基的片段;所述F(ab’)2片段指包含抗体的F(ab)2以及抗体全部铰链区的一种抗体片段。
更为具体的,本发明所述的微球与抗体的定向偶联方法,包括如下步骤:
1)全长抗体通过蛋白酶切反应制备得到抗体的F(ab’)2片段,F(ab’)2片段指包含抗体的F(ab)2以及抗体全部铰链区的一种抗体片段;还原F(ab’)2片段重链间的二硫键形成带有自由巯基的片段,即抗体F(ab’)片段;
2)活化羧基微球,使活化后的羧基微球与步骤1)所述的抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联,形成抗体微球复合物。
本发明所述方法以抗体F(ab’)片段实现与微球的定向偶联,提高抗体与微球的利用率,提高了胶乳试剂的灵敏度及特异性,同时能够消除RF干扰并实现全血样本的检测。
本发明还提供一种更为具体的微球与抗体的定向偶联方法,包括如下步骤:
(1)抗体F(ab’)2片段的制备:向抗体中加入蛋白酶进行酶切反应,4~40℃反应0.5~4小时后终止反应,得到F(ab’)2片段;
(2)抗体F(ab’)2片段的还原:向步骤(1)得到的F(ab’)2片段中加入还原剂,4~40℃条件下反应0.5~2小时,纯化得到含有自由巯基的F(ab’)片段;
(3)F(ab’)片段与微球偶联:羧基微球加入活化剂,35~38℃活化孵育0.5~1小时,除去活化剂,加入步骤(2)得到的含有自由巯基的F(ab’)片段,使之以巯基偶联的方式定向偶联到微球上。
本发明步骤(1)所述的蛋白酶可以为任何可以酶切获得F(ab’)2片段的酶,如胃蛋白酶。所述蛋白酶的浓度优选在30~200U/mg抗体,更优选50~100U/mg抗体,进一步优选为60U/mg抗体。
本发明步骤(1)酶切反应优选30~40℃反应0.5~1.5小时后终止反应。
采用本发明步骤(1)所述方法还原抗体,对抗体进行了Fc段的酶切,使得步骤(2)所得的含有自由巯基的F(ab’)片段回收率大于90%,抗体使用率高。
本发明步骤(2)加入还原剂后,优选30~40℃条件下反应0.5~2小时。优选的,本发明步骤(2)所述的还原剂包括但不限于三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、β-巯基乙胺中的一种或多种,优选β-巯基乙胺。所述还原剂的浓度在0.2~50mM,优选0.2~10mM,更优选2mM。
在本发明所述的步骤(1)和步骤(2)中反应温度、时间、酶和还原剂范围内,对抗体的酶切效率、还原效率以及抗体活性的保持效果最佳。
本发明步骤(2)中含有自由巯基的F(ab’)片段的纯化可以用HiTrap Desalting5ml脱盐柱进行。
本发明步骤(3)35~38℃活化孵育0.5~1小时,可以大大提高活化效率。
本发明步骤(3)所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(NH2-MAL),优选的,EDC与NH2-MAL的摩尔比是1:1~1:10;EDC与羧基微球的比例和微球的羧基含量相关,优选摩尔比为EDC:羧基=0.2:1~10:1,更优选0.2:1~5:1,在此范围内可以保证胶乳微球稳定性、提高抗体偶联效率,高于或低于此范围,都会导致胶乳微球稳定性的下降、凝集以及抗体偶联效率的降低。
通过活化剂的活化孵育,NH2-MAL中的氨基与微球上的羧基反应,将马来酰亚胺基团修饰到微球上。
本发明所述方法适用于各种不同抗体与羧酸微球的偶联。
本发明还提供所述微球与抗体的定向偶联方法在PETIA方法学制备体外诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供所述微球与抗体的定向偶联方法在制备免疫诊断或检测试剂中的应用。
本发明还提供所述方法制备的抗体微球复合物,所述复合物的微球与抗体的F(ab’)片段以巯基偶联。本发明所述的复合物中抗体F(ab’)片段向外伸展,可以实现样本中的待测抗原与抗体的高效结合。
本发明所述抗体微球复合物,可以有效降低RF对检测结果的干扰。
本发明还提供一种组合物,包含所述抗体微球复合物和药学上的常用辅料。
本发明还提供一种包含所述抗体微球复合物的体外诊断试剂盒。
本发明还提供所述微球复合物、组合物或试剂盒在制备免疫诊断或检测试剂中的应用。
本发明还提供所述微球复合物或组合物在制备治疗疾病药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下优势:
1、本发明提供的微球与抗体偶联的方法,利用定向偶联的技术使抗体在微球上的连接方向可控,降低了抗体偶联的随机性,提高了抗体与微球的利用率,本方法适用于各种不同抗体与胶乳微球的偶联,易于形成规模化的工艺。
2、使用该方法还原抗体,首先对抗体进行了Fc段的酶切,使得最后所得的含有自由巯基的F(ab’)片段回收率大于90%,抗体使用率高。
3、使用该方法制备的胶乳增强免疫比浊检测试剂,灵敏度能够达到0.13ng/ml,可以实现在cTnI、PCT等诸多对灵敏度检测要求高的项目上的应用。
4、使用该方法制备的胶乳增强免疫比浊检测试剂,可以有效降低RF对检测结果的干扰。
5、使用该方法制备的胶乳增强免疫比浊检测试剂,抗体与微球采用化学偶联的方式进行定向偶联,连接更加牢固,可以耐受更多的表面活性剂,有效避免表面活性剂的添加导致抗体从微球表面脱落的情况,因此可以实现全血样本的检测,符合即时诊断(POCT)的要求。
附图说明
图1为还原前后的FP1抗体;
图2为37℃条件下试剂盒B稳定性检测的结果;
图3为试剂盒B全血及血清测试结果比对。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定,但并不是对本发明的限制,仅作示例说明。下述实施例中未注明具体条件的实验方法,均按照常规条件,或者按照制造厂商所建议的条件执行,无特别说明,所用到的试剂均为市售。
实施例1 含有自由巯基的F(ab’)抗体片段的制备与纯化
1、抗体F(ab’)2片段的制备
(1)称取pepsin,溶于0.1M柠檬酸钠缓冲液pH3.5中混匀,终浓度1mg/ml;
(2)取心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体FP1,用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH3.5稀释至2mg/ml,并混匀;
(3)向稀释后的抗体中加入pepsin溶液,其中pepsin:FP1=60U/mg,37℃恒温震荡反应1小时,加入6%体积的3M Tris-HCl缓冲液pH9.0终止反应。
2、抗体F(ab’)片段的制备
(1)称取β-巯基乙胺,溶于0.1M PBS pH7.4中混匀,终浓度0.2mol/L;称取NEM,溶于异丙醇中混匀,终浓度问1mol/L;
(2)用PBS缓冲液稀释β-巯基乙胺,混匀后加入上述FP1的F(ab’)2片段,使得β-巯基乙胺终浓度为2mM,且F(ab’)2片段终浓度为1mg/ml,37℃恒温孵育1.5小时,孵育后完成后保存在4℃,并取部分用1/10体积的NEM溶液封闭后跑胶验证还原效果,验证结果如图1所示。
结果表明,还原后抗体分子量为50kDa左右,由一条轻链和酶切后的重链组成。分子量为25kDa左右的两条杂带是轻链和重链间的二硫键被进一步打开造成的,抗体的酶切和还原效率都很高。
3、F(ab’)片段的纯化
使用HiTrap Desalting HP 5mlx2(GE)脱盐层析柱进行F(ab’)片段纯化,用PBS缓冲液平衡层析柱后将上述步骤制备得到的F(ab’)片段2ml/次进样脱盐,并将脱盐纯化后产物浓缩至2mg/ml,F(ab’)片段的回收率大于90%。
实施例2 基于羧基微球的巯基偶联
1、羧基微球的活化
(1)取P0323(JSR)聚苯乙烯羧基微球用20mMMES pH6.0稀释至0.1mg/ml;
(2)称取EDC和NH2-MAL,分别水溶至1mg/ml,并以1:5的比例投料入上述微球稀释液,并活化微球,37℃恒温震荡孵育0.5小时,完成后离心去除上清,用20mM HEPES pH 7.5重悬混匀。
2、抗体偶联
(1)取20mM HEPES pH 7.5稀释FP1-F(ab’),将步骤1-(2)中混匀的微球加入稀释好的抗体中,37℃恒温震荡孵育1小时,并在完成后加入5%牛血清白蛋白溶液封闭,37℃恒温震荡孵育1小时;
(2)取上述封闭后试剂离心去上清,并用10mM HEPES pH7.0重悬混匀,混匀后抗体微球复合物于4℃保存。
实施例3 利用定向偶联方法制备脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)
1、试剂盒制备
抗人Lp-PLA2的两株配对抗体F(ab’)片段的制备以及其分别与微球偶联后的抗体微球复合物的制备与实施例1和2中所提到的过程相同,制备完成后将两种抗体微球复合物1:1混匀即为R2试剂中的抗人Lp-PLA2抗体胶乳微球复合物。
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)检测试剂盒具体成分配制如下:
试剂R1:
试剂R2:
硼酸-四硼酸钠缓冲液(pH 8.5) 0.02M
抗人Lp-PLA2抗体胶乳微球复合物 0.1g/L
Proclin 300 0.2%
2、灵敏度检测
收集9例Lp-PLA2测试结果为阳性的患者血清,诊断方法学为酶法试剂盒检测,1例正常人血清,来源均为南京鼓楼医院;
用Lp-PLA2质量法检测试剂盒(购自Diazyme,酶联免疫吸附法,本试验中称试剂盒A)给这10例血清分别赋值,并选取其中一例高值样本用PBS缓冲液进行梯度稀释至1ng/ml;
用步骤1制得的Lp-PLA2检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(本试验中称试剂盒B)分别检测这10例样本以及梯度稀释的样本,每个样本测试3遍,取平均值,连续监测10天,天间CV小于20%的临界浓度即为试剂灵敏度。同时选用市售某厂家Lp-PLA2检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(本试验中称试剂盒C)作为对照试剂盒进行平行试验。
表1 试剂盒A对样本赋值信息及试剂盒B和C测试天间CV
由表1可以看到,通过本发明,Lp-PLA2检测试剂盒,即试剂盒B(胶乳增强免疫比浊法)可以达到1ng/ml的灵敏度,而现有市售的Lp-PLA2检测试剂盒,即试剂盒C灵敏度仅能达到4ng/ml。
3、RF干扰检测
按照如下方法检测试剂盒B的抗RF干扰能力:
(1)收集较低范围的测值接近的无溶血、黄疸、乳糜、浑浊现象的人血清样本(鼓楼医院),进行混合,对该混合人血清样本进行测定,得到其Lp-PLA2的值为78.23ng/ml;
(2)按照下表1、表2所示,在混合人血清中添加不同浓度梯度的RF干扰物;
(3)分别使用试剂盒B、C对添加了不同RF单位浓度的血清样本进行对照测定,重复3遍,计算均值、CV和偏差,偏差范围在±10%以内视为无干扰,偏差范围超过±10%视为干扰。
表2 试剂盒B检测添加不同浓度RF干扰物的血清样本的结果
表3 试剂盒C检测添加不同浓度RF干扰物的血清样本的结果
表2结果显示,随着RF浓度从0到2000的范围变化,试剂盒B的检测值偏差的变化较小,检测值与未添加干扰时检测值的偏差均在±10%以内,判定为不存在干扰。
表3结果显示,随着RF浓度从0到2000的范围变化,试剂盒C的检测值偏差也随之增大,当RF浓度大于500IU/ml时,检测值与未添加干扰时检测值的偏差大于10%,判定为存在干扰。
本试验显示了相比现有的胶乳增强免疫比浊方法试剂盒,本发明所提供的方法明显提高了试剂对RF的抗干扰能力。
4、稳定性检测
按照如下方法检测试剂盒B的稳定性:
在试剂盒B制备完成后置于37℃恒温培养箱,并在第1、2、3、5、7、14、21、30天分别取出部分试剂对同一质控品(低值质控品:150.0±15.0ng/mL,高值质控品:350.0±35.0ng/mL)进行测试,重复测定3次,取平均值(M),并计算第n天的测试均值Mn与第1天测试均值M1的相对偏差R,相对偏差≤15%视为试剂盒稳定,测试结果如图2所示。
由图可知,试剂盒B在37℃的恒温条件下能够稳定至少30天。
5、全血样本检测
收集160例Lp-PLA2全血样本及其对应的血清样本(来源为南京鼓楼医院),用上述试剂盒B同时检测全血样本及血清样本,并将测试的结果进行相关性分析,相关性系数R2≥0.96时,则认为测试结果相关性好。
由图3可知,试剂盒B测试血清及全血样本的相关性系数R2≥0.96,可以判断试剂盒B能够准确测试全血样本。
实施例4利用定向偶联方法制备肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)
1、试剂盒制备
抗人cTnI的两株配对抗体F(ab’)片段的制备以及其分别与微球偶联后的抗体微球复合物的制备与实施例1和2中所提到的过程相同,制备完成后将两种抗体微球复合物1:1混匀即为R2试剂中的抗人cTnI抗体胶乳微球复合物。
肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒具体成分配制如下:
试剂R1:
试剂R2:
2、灵敏度检测
收集9例cTnI测试结果为阳性的患者血清,诊断方法学为化学发光法检测,来源为南京鼓楼医院,并选取其中一例高值样本用PBS缓冲液进行梯度稀释至0.06ng/ml;
用步骤1制得的cTnI检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(本试验中称试剂盒D)分别检测这10例样本以及梯度稀释的样本,每个样本测试3遍,取平均值,连续监测10天,天间CV小于20%的临界浓度即为试剂灵敏度。同时选用市售某厂家cTnI检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(本试验中称试剂盒F)作为对照试剂盒进行平行试验。
表4 试剂盒D和F测试天间CV
由表4可以看到,通过本发明,cTnI检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)可以达到0.13ng/ml的灵敏度,而现有市售的cTnI检测试剂盒灵敏度仅能达到0.52ng/ml。
Claims (10)
1.一种微球与抗体的定向偶联方法,羧基微球与抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联,形成抗体微球复合物。
2.根据权利要求1所述的定向偶联方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)全长抗体通过蛋白酶切反应制备得到抗体的F(ab’)2片段,F(ab’)2片段指包含抗体的F(ab)2以及抗体全部铰链区的一种抗体片段;还原F(ab’)2片段重链间的二硫键形成带有自由巯基的片段,即抗体F(ab’)片段;
2)活化羧基微球,使活化后的羧基微球与步骤1)所述的抗体F(ab’)片段以巯基偶联的方式实现定向偶联,形成抗体微球复合物。
3.根据权利要求2所述的定向偶联方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)抗体F(ab’)2片段的制备:向抗体中加入蛋白酶进行酶切反应,4~40℃反应0.5~4小时后终止反应,得到F(ab’)2片段;
(2)抗体F(ab’)2片段的还原:向步骤(1)得到的F(ab’)2片段中加入还原剂,4~40℃条件下反应0.5~2小时,纯化得到含有自由巯基的F(ab’)片段;
(3)F(ab’)片段与微球偶联:羧基微球加入活化剂,35~38℃活化孵育0.5~1小时,除去活化剂,加入步骤(2)得到的含有自由巯基的F(ab’)片段,使之以巯基偶联的方式定向偶联到微球上。
4.根据权利要求3所述的定向偶联方法,其特征在于,步骤(1)所述的蛋白酶为胃蛋白酶;蛋白酶的浓度为30~200U/mg抗体,优选50~100U/mg抗体,进一步优选为60U/mg抗体。
5.根据权利要求3所述的定向偶联方法,其特征在于,步骤(2)所述的还原剂包括但不限于TCEP、DTT、β-巯基乙醇、β-巯基乙胺中的一种或多种,优选β-巯基乙胺;
所述还原剂的浓度在0.2~50mM,优选0.2~10mM,更优选2mM。
6.根据权利要求3所述的定向偶联方法,其特征在于,步骤(3)所述的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺,优选1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺的摩尔比是1:1~1:10;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与羧基微球的摩尔比优选为0.2:1~10:1。
7.一种抗体微球复合物,所述复合物的微球与抗体的F(ab’)片段以巯基偶联。
8.一种组合物,包含所述抗体微球复合物和药学上的常用辅料。
9.权利要求1~6任一项所述的方法、权利要求7所述的抗体微球复合物或权利要求8所述的组合物在制备免疫诊断或检测试剂中的应用。
10.权利要求1~6任一项所述的方法、权利要求7所述的抗体微球复合物或权利要求8所述的组合物在制备治疗疾病药物中的应用。
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