CN107764908B - 一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法，本发明所述方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和含量测定，本发明所述方法能够有效去除干扰成分，同时可以对生物碱成分进行有效富集，该方法高效快速，稳定性好，灵敏度高、能够在5分钟内实现四种生物碱成分的有效分离，经验证本发明的质量控制方法精密度、重现性、稳定性良好，能够有效测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分。

Description

一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法
技术领域
本发明涉及一种中药提取物中有效成分的含量测定方法，特别涉及一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法。
背景技术
养血清脑颗粒和养血清脑丸是由当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠母、延胡索、细辛十一味中药和辅料制成的复方中药。养血清脑水提浸膏是养血清脑颗粒和养血清脑丸的制剂中间体。制备工艺为：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加水煎煮，滤过，浓缩，加乙醇静置，滤过，回收乙醇并浓缩至适量，即得养血清脑水提浸膏。
《中国药典》2015年版公开了养血清脑两种制剂的含量检测，都是对芍药苷的检测，其供试品的制备方法为：取本品内容物，研细，取约0.08g，精密称定，置20ml烧杯中，加0.2％碳酸氢钠，超声处理5分钟，通过D101大孔吸附树脂柱，用水洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，加水至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液，滤过，取续滤液，即得；色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以异丙醇-甲醇枸橼酸溶液(2：18：80)为流动相，检测波长为240nm，理论板数按照芍药苷峰计算应不低于2000。
养血清脑制剂中，钩藤在配方中发挥着重要作用，具有清热平肝，息风定惊功效，与养血清脑制剂“养血平肝，活血通络”的功效相契合。而生物碱是钩藤药材的主要活性成分，在药典中并没有对养血清脑制剂中的钩藤成分进行检测的报道。
发明人前期针对养血清脑水提浸膏中的生物碱成分进行了深入研究，利用SPE-UPLC方法，建立了生物碱成分的分离纯化方法，实现生物碱成分的有效分离。采用串联四级杆飞行时间质谱(Q-TOF/MS)液质联用仪对养血清脑水提浸膏中的生物碱成分进行了结构鉴定，通过对一级、二级碎片分析和对照品比对，确定主要含有四种生物碱成分，分别为钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱。
针对养血清脑水提浸膏，目前已经建立起了一整套全面地的工艺质量控制体系，但是，还没有针对生物碱成分的质量分析方法。
为进一步提升产品质量控制水平，全面掌握产品质量，发明人针对养血清脑水提浸膏中的生物碱成分建立了含量测定方法，并进行了方法学验证。
发明内容
本发明涉及一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法，该方法采用超高效液相色谱法。
本发明所述方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和含量测定。
其中，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，35％-45％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的ProElut C18-U(500mg/6mL)柱，用35％-45％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得；
其中，所述对照品溶液的制备包括以下步骤：
以钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱作为对照品，用甲醇配制成每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.008-0.012mg、0.01-0.02mg、0.001-0.002mg和0.004-0.006mg的溶液，既得；
其中，所述含量测定，包括以下步骤：分别取对照品溶液和供试品溶液各1-3ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算供试品溶液中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的含量；
其中，所述含量检测中的液相色谱仪色谱条件如下：色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)，梯度洗脱，其中流动相为：流动相A为0.02％-0.2％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；流速：0.35-0.45ml/min；检测波长：240-250nm。
所述流动相的乙酸铵优选为0.02-01％。
优选的，本发明所述方法包括以下步骤：
步骤1：对照品溶液的制备
精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得；
步骤2：供试品溶液的制备
取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，35％-45％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的ProElut C18-U(500mg/6mL)柱，用35％-45％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得；
步骤3：含量测定法
分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量；
所述的液相色谱仪色谱条件如下：
色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)，流动相：流动相A为0.02％-0.2％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见表1；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：240-250nm；
表1流动相梯度程序
Figure BDA0001088510750000031
最优选的，本发明所述方法包括以下步骤：
步骤1：对照品溶液的制备
精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得；
步骤2：供试品溶液的制备
取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，40％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的ProElut C18-U(500mg/6mL)柱，用40％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得；
步骤3：含量测定法
分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量；
所述的液相色谱仪色谱条件如下：
色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)，流动相：流动相A为0.05％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见表1；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：246nm。
本发明提供的方法中：
没有对甲醇浓度进行限定的，应为药典中规定的浓度为100％的甲醇，40％甲醇，其中的百分比含义为体积百分比，如100ml溶液中含有40ml甲醇。
本发明优选的方法、色谱条件，是经过筛选得到的，筛选过程如下：
1、前处理方法的建立
1.1供试品溶剂的选择
取养血清脑水提浸膏0.2g，分别用20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、50％甲醇超声，进行固相萃取后进样，色谱图见图3(图3为不同溶剂溶解样品所得的UPLC图谱，其中A：20％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；B：30％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；C：40％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；D：50％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱)。
从色谱图上可知，50％甲醇溶解的样品存在泄漏，峰面积小于40％甲醇的。20％和30％甲醇溶解的样品不能很好地溶解生物碱类，除样品液浑浊外，回收率也比较低。综合考虑，选择用40％的甲醇溶解样品较为合适。
1.2 SPE柱的选择
分别采用选择ProElut C18-U、ProElut C18、ProElut PXW固相萃取柱对样品溶液进行纯化，结果表明ProElut C18-U固相萃取柱选择性以及回收率最佳。ProElut C18-U柱是硅胶键合C18后未进行封端处理的反相C18萃取柱。硅胶基质表面残余的硅羟基与极性化合物存在极性相互作用，因而增强了对极性化合物尤其是胺基化合物的保留，适用于极性和非极性化合物萃取。所以发明人选用了ProElut C18-U SPE柱。
1.2.1 SPE上样速度的选择
称取0.2g养血清脑水提浸膏，10mL 40％甲醇超声溶解，分别以0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min流速在医用甲醇、水活化过的ProElut C18-U SPE柱上样并甲醇洗脱收集五毫升。分别测定其回收率，钩藤碱的回收率为100.5％、100.0％、94.5％；异钩藤碱回收率为100.2％、100.8％、96.7％。选择上样速度为1.0mL/min较优。
1.2.2 SPE上样洗涤体积的选择
称取0.2g养血清脑水提浸膏，10mL 40％甲醇超声溶解，以1.0mL/min流速在已用甲醇、水活化过的ProElut C18-U SPE柱上样，分别用甲醇洗脱收集3mL、5mL、6mL、10mL。分别测定其回收率，钩藤碱的回收率为96.5％、99.3％、99.5％、99.4％；异钩藤碱回收率为95.2％、100.5％、100.9％、101.2％。说明5mL足以将样品洗脱且能节约洗脱时间，故选择5mL的洗脱体积。
2.2色谱条件
2.2.1色谱柱选择
分别采用的是ACQUITY UPLC CSH C18和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱进行样品测定。
图4(图4为采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱的UPLC图谱)、5(图5为采用ACQUITYUPLC CSH C18色谱柱的UPLC图谱)显示，ACQUITY UPLC CSH C18柱具有较好分离度，峰型良好，所以选择ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱。
2.2.2波长的选择
按照“2.1.1”中的方法制备混合标准品，进行紫外扫描，获取图谱，结果见图5。
由图6(图6为钩藤碱、异钩藤碱混合对照品紫外扫描图)结果可知，在246nm处有最大的紫外吸收，所以在实验中选择246nm作为检测波长。
2.2.3流动相比例的选择
取养血清脑水提浸膏0.2g，按“2.1.6”项下方法制备，分别用流动相乙腈溶液(A)、0.05％乙酸铵水溶液(B)以流动相初始比例25：75、35：65、35：55的色谱方法进样2μL，色谱图见图7(图7为三种流动相初始比例下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱，其中A：流动相初始比例为45：55下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱；B：流动相初始比例为35：65下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱；C：流动相初始比例为25：75下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱)。
图7结果显示，当流动相比例为35：65时，达到最佳分离度并具有平稳基线。
2.3检测成分的结构确认
对样品进行UPLC-Q-TOF/MS联用仪测定，质谱条件以飞行管检测模式V型，采用正离子(ESI+)扫描模式，毛细管电压3.5/kV(+)，锥孔电压4/30V(+)，萃取锥孔电压5.0V，离子源温度100℃，脱溶剂气温度500℃，锥孔气流1L/h，脱溶剂气594L/h，分辨率采用Resolution模式，碰撞池入口电压25V，碰撞池出口电压60V，扫描时间11min，扫描时间间隔0.3s，质荷比范围：m/z 50～1200；数据采集形式Centroid；灵敏性Normal；锁定质量数POS556.2771.按“2.1.6”项下制备样品，液相条件同“2.2”项。得到质谱信息(图8为养血清脑水提浸膏总离子流图)。
通过与对照品质谱数据的比对分析，确定养血清脑水提浸膏中主要含有四种生物碱成分，分别为钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱。
2.4方法学验证
2.4.1线性和范围
精密称取经钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，测定其峰面积，对照品图谱见图2(因为对照品之间有干扰，所以有两个对照品图谱，即图2-1、2-2，图2-1为钩藤碱、异钩藤碱；图2-2为去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱)。测定峰面积的方法是：加甲醇配制成每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量分别为0.1mg、0.04g、0.08g和0.1mg的混合对照溶液，再分别取量取0.5、1、2、5、10ml混合对照溶液置于50ml量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，制成系列溶液，注入液相色谱仪，测定，以浓度对测得的峰面积进行线性回归，求得回归方程。结果见表2、图9(图8为钩藤碱线性关系)、表3、图10(图9为异钩藤碱线性关系)、表4、图11(图11为去氢钩藤碱线性关系)、表5、图12(图12为异去氢钩藤碱线性关系)。
表2钩藤碱线性关系
浓度(mg/ml) 0.001028 0.002056 0.004112 0.008224 0.02056
峰面积 9185 21377 43923 50960 100892
表3异钩藤碱线性关系
浓度(mg/ml) 0.00405 0.0081 0.01619 0.04048 0.08096
峰面积 4643 10937 21940 26222 51814
表4去氢钩藤碱线性关系
浓度(mg/ml) 0.04106 0.08212 0.16424 0.32848 0.8212
峰面积 10040 23143 46188 54043 107382
表5异去氢钩藤碱线性关系
浓度(mg/ml) 0.00716 0.01431 0.03578 0.07155 0.1431
峰面积 13614 31705 62675 73378 145242
2.4.2进样精密度试验：
取D20140204批样品，依法制备供试品溶液，重复进样6次，记录钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的峰面积，计算相对标准偏差。结果见表6。
表6钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱进样精密度
Figure BDA0001088510750000071
2.4.3重现性试验：
取D20140204批样品，依法制备供试品溶液6份，分别测定钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的含量，计算相对标准偏差。结果见表7。
表7钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱重现性
Figure BDA0001088510750000072
2.4.4回收率试验：
精密称取D20140204批浸膏6份，每份约0.1g，置50ml量瓶中，各分别精密加入混合对照品溶液2ml(每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱分别为0.01384mg、0.0936mg、0.0631mg、和0.1618mg)，自“加70％甲醇溶液适量，超声溶解”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取2ul注入色谱仪，分别计算钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的回收率。结果见表8、表9、表10和表11。
表8钩藤碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001088510750000073
Figure BDA0001088510750000081
表9异钩藤碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001088510750000082
表10去氢钩藤碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001088510750000083
表11异去氢钩藤碱回收率(mg，n＝6)
Figure BDA0001088510750000084
2.4.5稳定性
取D20140204批制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，记录钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的峰面积，计算相对标准偏差。结果见表12。
表12钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱重现性
Figure BDA0001088510750000091
2.4.6样品测定
取样品，按照本发明提供的方法测得供试品图谱(见图1)。
验证结论：
针对养血清脑水提浸膏中同时测定钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱等四种成分的方法，进行了方法学验证，结果表明，本测定方法线性关系和回收率良好，精密度、重现性和样品稳定性符合验证要求，可以用于养血清脑水提浸膏中生物碱成分的测定。
2.5检测条件范围
供试品溶媒：35-45％甲醇溶液；流动相溶剂A：0.02-0.2％乙酸铵水溶液；固相萃取柱：可用Waters Oasis MAX、Cleanert S C18等型号替代。
本发明的有益效果
1、本发明采用超高效液相色谱法进行测定，高效快速，稳定性好，灵敏度高、能够在5分钟内实现四种生物碱成分的有效分离。
2、本发明采用固相萃取技术，能够有效去除干扰成分，同时可以对生物碱成分进行有效富集。
3、现有技术：
CN103630614A(申请号为201210301559.9，下简称2012年专利)公开了一种养血清脑颗粒的高效液相色谱检测方法，该方法中：供试品的制备是用25％甲醇作为溶剂，超声提取；色谱条件中流动相A为0.01-0.05％磷酸溶液，B为乙腈。与2012年专利相比：该文献的主要区别是测定的成分不同，该文献测定的成分是：没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷，本发明针对的是钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱。
在“超高效液相色谱法测定不同提取工艺样品中钩藤碱含量”一文中，(作者刘萍、王英锋，首都师范大学学报，32卷第2期)使用的方法中，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，以甲醇-5mmol/L乙酸铵水溶液用氨水调pH＝9.8(60∶40)为流动相，进行等度洗脱，检测波长为240nm.，测定成分为钩藤碱，出峰时间为4.87分钟。与该方法比较，本专利分析速度更快，分离度更佳，分析成分更多，流动相组成更简单。
本发明的优点是：
1)针对的是养血清脑复方，复方制剂，成分复杂，干扰物质多，增加了测定难度。
2)对钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱四种成分的检测，同时测定四种生物碱成分，全面掌握了生物碱成分组成和含量比例，快速检测，分离难度大，效率高。提高了产品质量控制水品，为产品药效成分研究提供数据支持。
3)供试品制备中：采用甲醇超声溶解，采用ProElut C18-U固相萃取柱进行纯化，有效去除了干扰杂质，并实现了对测定目标物的富集，提高了色谱峰分离度，有助于延长色谱柱寿命。
4)色谱条件中流动相的选择，通过色谱柱及流动相筛选，通过简单的流动相组成，达到了完美峰形和高分离度，克服了生物碱在反相色谱分离中容易拖尾的弊端。
5、经验证本发明提供的质量控制方法精密度、重现性、稳定性良好，能够有效测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分。
附图说明
图1为供试品图谱；
图2-1、2-2为对照品图谱；
图3为不同溶剂溶解样品所得的UPLC图谱，其中A：20％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；B：30％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；C：40％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；D：50％甲醇溶解供试品得到的UPLC图谱；
图4为采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱的UPLC图谱；
图5为采用ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱的UPLC图谱；
图6为钩藤碱、异钩藤碱混合对照品紫外扫描图；
图7为三种流动相初始比例下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱，其中A：流动相初始比例为45：55下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱；B：流动相初始比例为35：65下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱；C：流动相初始比例为25：75下养血清脑水提浸膏的UPLC图谱；
图8为养血清脑水提浸膏总离子流图；
图9为钩藤碱线性关系；
图10为异钩藤碱线性关系；
图11为去氢钩藤碱线性关系；
图12为异去氢钩藤碱线性关系。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1：一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法
1、色谱条件和***适用性试验：仪器为Waters ACQUITY UPLC，采用ACQUITY UPLCCSH C18(2.1×100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1；检测波长为246nm。
2、对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得。
3、供试品溶液的制备：取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，40％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的ProElut C18-U(500mg/6mL)柱，用40％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得。
4、测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
5、检测结果：取三批在线养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表13。
表13采用实施例1的方法测定的养血清脑水提浸膏中生物碱成分的含量
号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
1 0.264 0.095 0.040 0.152
2 0.246 0.083 0.032 0.130
3 0.239 0.086 0.041 0.149
实施例2：一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法
1、色谱条件和***适用性试验：仪器为Waters ACQUITY UPLC，采用ACQUITY UPLCCSH C18(2.1×100mm)色谱柱，以0.1％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1；检测波长为240nm。
2、对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得。
3、供试品溶液的制备：取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，40％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的ProElut C18-U(500mg/6mL)柱。用40％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得。
4、测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积。外标法计算含量。
5、检测结果：取三批在线养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表14：
表14采用实施例2的养血清脑水提浸膏中生物碱成分的含量
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
1 0.258 0.097 0.041 0.155
2 0.241 0.085 0.033 0.125
3 0.245 0.084 0.041 0.146
实施例3：一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法
1、色谱条件和***适用性试验：
仪器为Waters ACQUITY UPLC，采用ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)色谱柱，以0.02％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1；检测波长为250nm。
2、对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得。
3、供试品溶液的制备：取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，40％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的ProElut C18-U(500mg/6mL)柱。用40％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得。
4、测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积。外标法计算含量。
5、检测结果：取三批在线养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表15：
表15采用实施例3的养血清脑水提浸膏中生物碱成分的含量
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
1 0.260 0.096 0.040 0.156
2 0.247 0.084 0.033 0.127
3 0.240 0.081 0.040 0.143
实施例4：一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法
1、色谱条件和***适用性试验：
仪器为Waters ACQUITY UPLC，采用ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1；检测波长为246nm。
2、对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得。
3、供试品溶液的制备：取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，45％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的Cleanert S C18(500mg/6mL)柱。用45％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得。
4、测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
5、检测结果：取三批在线养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表16：
表16采用实施例4的养血清脑水提浸膏中生物碱成分的含量
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
1 0.261 0.093 0.041 0.153
2 0.244 0.084 0.033 0.129
3 0.237 0.088 0.042 0.147
实施例5：一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法
1、色谱条件和***适用性试验：
仪器为Waters ACQUITY UPLC，采用ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1；检测波长为246nm。
2、对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得。
3、供试品溶液的制备：取养血清脑水提浸膏约0.25g，精密称定，35％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的Waters Sep-pak C18(500mg/6mL)柱。用35％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得。
4、测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量。
5、检测结果：取三批在线养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表17：
表17采用实施例5的养血清脑水提浸膏中生物碱成分的含量
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
1 0.265 0.093 0.041 0.151
2 0.251 0.082 0.032 0.132
3 0.237 0.081 0.041 0.146
实施例6
1、色谱条件和***适用性试验：
仪器为Waters ACQUITY UPLC，采用ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm)色谱柱，以0.05％乙酸铵水溶液以流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1；检测波长为246nm。
2、对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得。
3、供试品溶液的制备：取养血清脑水提浸膏约0.15g，精密称定，40％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的Waters Sep-pak C18(500mg/6mL)柱。用40％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得。
4、测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积。外标法计算含量。
5、检测结果：取三批在线养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表18：
表18采用实施例6的养血清脑水提浸膏中生物碱成分的含量
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
1 0.255 0.094 0.038 0.154
2 0.242 0.085 0.032 0.131
3 0.232 0.088 0.040 0.146
对上面所有的实施例数据进行汇总，得到表19-1、19-2、19-3：
表19-1：01批检测数据
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
实施例1 0.264 0.095 0.040 0.152
实施例2 0.258 0.097 0.041 0.155
实施例3 0.260 0.096 0.040 0.156
实施例4 0.261 0.093 0.041 0.153
实施例5 0.265 0.093 0.041 0.151
实施例6 0.255 0.094 0.038 0.154
平均值 0.261 0.095 0.040 0.154
RSD％ 1.4 1.7 1.9 1.2
表19-2：02批检测数据
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
实施例1 0.246 0.083 0.032 0.130
实施例2 0.241 0.085 0.033 0.125
实施例3 0.247 0.084 0.033 0.127
实施例4 0.244 0.084 0.033 0.129
实施例5 0.251 0.082 0.032 0.132
实施例6 0.242 0.085 0.032 0.131
平均值 0.245 0.084 0.033 0.129
RSD％ 1.5 1.4 1.7 2.0
表19-3：03批检测数据
序号 钩藤碱 异钩藤碱 去氢钩藤碱 异去氢钩藤碱
实施例1 0.239 0.086 0.041 0.149
实施例2 0.245 0.084 0.041 0.146
实施例3 0.240 0.086 0.040 0.143
实施例4 0.237 0.088 0.042 0.147
实施例5 0.237 0.085 0.041 0.146
实施例6 0.232 0.088 0.040 0.146
平均值 0.238 0.086 0.041 0.146
RSD％ 1.8 1.9 1.8 1.3
上述表19-1、19-2、19-3内容结果表明，按照实施例中的实施方案测定，以上三个批次的检测结果无明显差异，均可以得到正确的检测结果。

Claims (4)

1.一种测定养血清脑水提浸膏中生物碱成分含量的方法，所述方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和含量测定，
其中，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，35％-45％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的规格为500mg/6mL的ProElut C18-U柱，用35％-45％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得，
其中，所述对照品溶液的制备包括以下步骤：以钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱作为对照品，用甲醇配制成每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.008-0.012mg、0.01-0.02mg、0.001-0.002mg和0.004-0.006mg的溶液，即得，
其中，所述含量测定，包括以下步骤：分别取对照品溶液和供试品溶液各1-3ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算供试品溶液中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱的含量，
所述含量检测时液相色谱仪色谱条件如下：色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18，规格为2.1×100mm，梯度洗脱，其中流动相为：流动相A为0.02％-0.2％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；流速：0.35-0.45ml/min；检测波长：240-250nm，
梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0003195074820000011
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的乙酸铵优选为0.02-0.1％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：对照品溶液的制备
精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得；
步骤2：供试品溶液的制备
取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，35％-45％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的规格为500mg/6mL的ProElut C18-U柱，用35％-45％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得；
步骤3：含量测定法
分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量；
所述的液相色谱仪色谱条件如下：
色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18规格为2.1×100mm，流动相：流动相A为0.02％-0.2％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见下表；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：240-250nm；
Figure FDA0003195074820000021
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：对照品溶液的制备
精密称取钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解，分别制得每毫升含钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱为0.01mg、0.015mg、0.0016mg和0.005mg的溶液，既得；
步骤2：供试品溶液的制备
取养血清脑水提浸膏约0.2g，精密称定，40％甲醇10mL超声溶解，上至已处理好的规格为500mg/6mL的ProElut C18-U柱，用40％甲醇5mL洗涤，洗涤液弃去，用甲醇4.5mL洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至5mL，摇匀，即得；
步骤3：含量测定法
分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量；
所述的液相色谱仪色谱条件如下：
色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18规格为2.1×100mm，流动相：流动相A为0.05％乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见下表；流速：0.35-0.45ml/min，检测波长：246nm；
Figure FDA0003195074820000031
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