CN107764789A - 半固体筛选培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种半固体筛选培养基及其制备方法和应用。该半固体筛选培养基包括如下体积份数的组分：0.8～1.5份100×Eu3+微球标记的抗原溶液；0.05～0.15份1000×EGF溶液；0.05～0.15份1000×IL‑6溶液；0.5～1份100×青霉素和链霉素的双抗溶液；0.5～1份100×B细胞刺激因子溶液；2～4份50×HAT溶液；18～25份胎牛血清；65～80份甲基纤维素半固体培养基。本发明提供的半固体筛选培养基是具有时间分辨荧光特性的，在筛选杂交瘤细胞时，大大缩短筛选所需的时间，极大降低背景荧光的假阳性，使得筛选成功率大大提高。

Description

半固体筛选培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种半固体筛选培养基及其制备方法和应用，具体为一种时间分辨荧光半固体筛选培养基及其制备方法和应用。

背景技术

时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，是以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，建立的一种新型的非放射性微量分析技术。TRFIA是根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。由于其高灵敏度，在临床上得到了广泛的应用，逐渐代替了放射免疫分析。

单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合时，B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏中分离出来的，骨髓瘤细胞是经过诱变和筛选得到的缺陷型，其本身不能分泌抗体；并且是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型，不能在含有次黄嘌呤(hypoxanthine H)、氨基蝶呤(aminopterin,A)、胸腺嘧啶(thymidine T)的筛选培养基(HAT)中存活，HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。在融合后的细胞群中，未融合的脾细胞和相互融合的脾细胞，不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的骨髓瘤细胞和融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活下来，所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。

一个脾脏中，能分泌抗体的细胞占的比例很少，90％以上的细胞是不能分泌抗体的。即使进行了人工免疫，能分泌出针对人工免疫的抗原的抗体的细胞比例也是很低的，并且两个细胞的融合是随机的，因此，尽管一个成功免疫的脾脏可达到2×10⁸个细胞以上，但细胞融合后能得到目标杂交瘤的数量也是很有限的，如何筛选克隆出这些能分泌目的抗体的杂交瘤细胞是一个非常关键的问题。

传统的单抗生产过程中，细胞融合后的有价值细胞株的筛选非常繁琐，首先ELISA检测，检测到有价值的细胞孔，此时该孔内的细胞不是单克隆细胞株，为了得到单克隆细胞株需要对该孔的细胞利用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后细胞长起来再用ELISA进行检测得到阳性的细胞孔，再对阳性孔进行亚克隆，再ELISA检测，直到最终得到的细胞是由一个细胞繁殖而来的单克隆株。这个过程耗时、耗力、耗材特别严重，一次亚克隆周期要15天，且整个流程由于太繁琐，使细胞培养过程中容易污染，使整个单克隆制备过程失败。

杂交瘤细胞的克隆化是单克隆抗体制备过程中工作量最大的部分，实验室传统的克隆化方法为有限稀释法，该法需要多次进行有限稀释获得单克隆杂交瘤，耗时较长，在克隆化之前一些不分泌抗体的杂交瘤往往生长很快，影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长易导致阳性克隆丢失，筛选效率较低。

除了有限稀释法，目前也有应用HAT半固体培养基筛选克隆化细胞的方法，但目前的HAT半固体培养基存在以下几个问题：

1.目前的半固体培养基筛选过程中并不能保证产生的克隆是由单细胞而来；

2.目前的半固体培养基筛选过程中用荧光素标记抗原筛选的方法虽然一定程度上提高了筛选效率，缩短了筛选时间，但是其中细胞、尤其是克隆化后的细胞其自身荧光背景会对筛选造成很大干扰，易造成假阳性，使筛选效率大大降低。

因此需要开发一种筛选周期短、筛选效率高、假阳性率低的筛选培养基。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有时间分辨荧光特性的半固体筛选培养基，该半固体筛选培养基能大大缩短筛选时间，极大降低背景荧光的假阳性，使得筛选成功率大大提高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

半固体筛选培养基，包括如下体积份数的组分：

本发明的半固体筛选培养基，使整个亚克隆和筛选过程变的简单快捷。融合完的细胞不再如传统的方法用液体培养基来种96孔培养板，而是直接种在本发明的半固体筛选培养基中，等融合后的细胞开始生长10天左右形成200细胞左右的克隆团，因为半固体培养基非常粘稠，长成的克隆团不会扩散开，种前计算好密度克隆团之间都有明显的距离，所以克隆团之间没有交叉混合。由于在半固体筛选培养基中加入了含有针对特异性抗体的、带时间分辨荧光微球的抗原，因而在这种培养条件下，分泌抗体的细胞表面能结合特异性的抗原。在时间分辨荧光仪下，用365nm波长的激发光激发，在200-300ms后用615nm波长下观察，有红色荧光的即为分泌针对目标抗原抗体的阳性融合细胞，在镜下将这些细胞可控标记好后，再在解剖镜下用无菌的移液器把每个克隆团分别挑到96孔板的孔中，使其进一步生长，然后ELISA检测，阳性的孔就是单克隆细胞株，即筛选和亚克隆用该发明的半固体筛选培养基一步就能完成。使单抗生产的工艺变的相对简单快捷，且避免了由于细胞克隆团本身带有的自发荧光造成的假阳性。

进一步，所述Eu3+微球标记的抗原溶液中Eu3+微球与抗原的质量比为：0.02～1：1。所述抗原溶液中抗原为能偶联Eu3+荧光微球的可溶性蛋白。

本发明Eu3+微球与抗原的比例有助于形成抗原微球，微球表面充分包被上抗原，同时降低未被抗原包被的微球造成的假阳性，从而提高筛选的灵敏度。

所述Eu3+微球为Eu3+纳米荧光微球，Eu是稀土元素铕，Eu3+是铕离子，稀土元素可以由电磁辐射激发产生光。

所述Eu3+微球标记的抗原溶液的制备方法为：将Eu3+纳米荧光微球溶于0.01MpH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×10¹²个/mL，400w超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺(EDC)，室温匀速搅拌温育15min后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01M pH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤离心2次即得活化的荧光微球。将活化的荧光微球复溶于0.01M

pH8.0的硼酸缓冲液中，加入可溶性抗原溶液，4℃搅拌反应12h后，12000g离心10分钟，收集沉淀，复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得荧光微球标记的可溶性抗原，置于4℃保存备用。

Eu3+荧光微球可商品化购买，也可以自行包被，商品化的荧光微球粒径为0.2μm，购自于Thermo Fisher Scientific，商品名为Fluoro-Max Carboxylate-Modified andStreptavidin-Coated Europium ChelateParticles。

在制备杂交瘤细胞时，细胞融合过程中会受到PEG(聚乙二醇)的损伤，且细胞融合后种植密度较低，加入EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子)和IL-6(Interleukin 6，白介素6)能促进细胞的生长。

进一步，所述的半固体筛选培养基，包括如下体积份数的组分：

作为一种优选，所述的半固体筛选培养基，由如下体积份数的组分组成：

进一步，所述甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1：1的2×DMEM培养基和4％的甲基纤维溶液充分混匀得到。

所述2×DMEM培养基的一种制备方法为：将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节pH值为7.2～7.4，最后通过0.22μm滤膜过滤除菌，得2×DMEM培养基。

所述4％的甲基纤维溶液的一种制备方法为：称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4℃下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4％的甲基纤维溶液。

本发明的目的之二在于提供一种所述的半固体筛选培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)按上述体积比配置甲基纤维素半固体培养基；

2)按上述体积比将50×HAT溶液、胎牛血清、100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1000×EGF溶液、1000×IL-6溶液混合均匀、100×B细胞刺激因子溶液和100×Eu3+微球标记的抗原溶液混合均匀，得混合物；

3)将步骤1)所述甲基纤维素半固体培养基与步骤2)所述混合物混合均匀得半固体筛选培养基。

进一步，步骤2)混合的温度为4℃，混合的时间为6～24h；步骤3)中混合的温度为4℃。

本发明的目的之三在于提供一种所述的半固体筛选培养基在抗原抗体检测中的应用。

本发明的目的还在于提供一种利用所述的半固体筛选培养基筛选杂交瘤细胞的方法，包括如下步骤：

1)将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后，用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液；

2)将步骤1)所述细胞悬液加到预热至35℃～38℃的半固体筛选培养基中混匀，静置并排除气泡后倒入平皿中，置于孵育箱中培养；

3)步骤2)中平皿长出肉眼可见克隆集落时，时间分辨荧光仪下，用365nm波长的激发光激发，在200-300ms后用615nm波长下观察，有红色荧光的即为分泌针对目标抗原抗体的阳性克隆，并做好标记；

4)将步骤3)已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为杂交瘤细胞。

进一步，所述HAT液体培养基由如下成分组成：1×DMEM培养基、20％的胎牛血清和1×HAT。

进一步，所述筛选方法还包括步骤：

5)对步骤4)挑出的已标记的阳性克隆的确认：将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，取上清对阳性克隆进行确认。

具体的一种杂交瘤细胞的筛选方法，包括如下步骤：

1)将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后，用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液；

2)将步骤1)所述细胞悬液加到预热至35℃～38℃的半固体筛选培养基中混匀，37℃静置并排除气泡后倒入平皿中，置于37℃、5％CO₂的孵育箱培养10～14天；

3)步骤2)中平皿长出肉眼可见克隆集落时，时间分辨荧光仪下，用365nm波长的激发光激发，在200-300ms后用615nm波长下观察，有红色荧光的即为分泌针对目标抗原抗体的阳性克隆，并做好标记；

4)在显微镜下将步骤3)已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为杂交瘤细胞。

5)对步骤4)挑出的已标记的阳性克隆的确认：将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，取上清采用ELISA的方法对阳性克隆进行确认。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的半固体筛选培养基中加入了由Eu3+与微球相偶联的抗原，属于时间分辨荧光包被的抗原，与阳性细胞分泌的抗体相结合后，阳性细胞会在激发光下发出红色荧光，避免了由于克隆细胞团本身自发荧光带来的假阳性，有效地提高了筛选的成功率。

2)用所述半固体筛选培养基筛选杂交瘤细胞时，融合细胞在半固体培养基上呈集落生长，彼此分离，每个克隆由单个细胞形成，避免了不分泌抗体的杂交瘤生长很快而影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长，与传统的有限稀释法相比，筛选效率较高。

3)本发明的筛选方法相比于之前传统的有限稀释法，本法将筛选分泌抗体的融合细胞与获得单一细胞来源的细胞克隆融为一体，提高了获得分泌单一抗体阳性细胞克隆的效率。

附图说明

图1为一种实施方式的杂交瘤细胞的筛选方法的流程图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1半固体筛选培养基

包括如下体积份数的组分：

实施例2半固体筛选培养基

包括如下体积份数的组分：

实施例3半固体筛选培养基

100mL半固体筛选培养基，由如下体积份数的组分组成：

实施例4半固体筛选培养基的制备方法

100mL半固体筛选培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)配置甲基纤维素半固体培养基：

2×DMEM培养基的制备：将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节pH值为7.2～7.4，最后通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到所述2×DMEM培养基；

4％的甲基纤维溶液的制备：称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4℃下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4％的甲基纤维溶液；

将2×DMEM培养基和4％的甲基纤维溶液按照体积比1：1充分混匀得到甲基纤维素半固体培养基；

2)Eu3+微球标记的抗原溶液的制备：将Eu3+纳米荧光微球50μg溶于10ml0.01MpH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×10¹²个/mL，400w超声处理30秒，然后缓慢加入200ul 15mg/mL的碳二亚胺(EDC)，室温匀速搅拌温育15min后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01M pH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤离心2次即得活化的荧光微球。将活化的荧光微球复溶于5ml 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg可溶性抗原，4℃搅拌反应12h后，12000g离心10分钟，收集沉淀，复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得荧光微球标记的可溶性抗原，置于4℃保存备用；

3)按体积比将50×HAT溶液、胎牛血清、100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1000×EGF溶液、1000×IL-6溶液混合均匀、100×B细胞刺激因子溶液和100×Eu3+微球标记的抗原溶液在4℃、混合6～24h，其余用甲基纤维素半固体培养基补足，在4℃混合均匀得半固体筛选培养基。

甲基纤维素购自sigma公司，货号为M0512。

DMEM粉末购自Gibco公司，货号为12800-017。

50×HAT贮存液通过如下操作制备：将HAT粉末加入10mL无菌的PBS溶液中，溶解后得到50×HAT贮存液。

50×HAT贮存液由如下成分组成：5mM次黄嘌呤、20μM氨基蝶呤和800μM胸腺嘧啶核苷。

HAT粉末购自Sigma公司，货号为H0262。

无菌的PBS溶液购自Gibco公司，货号为C20012500BT。

胎牛血清购自Hyclone公司，货号为SV30087。

100×B细胞刺激因子(B cell activating factor，BAFF)购自R&D公司，货号为2149-BF-010/CF，其工作浓度为200～100ng/L。

Eu3+荧光微球可商品化购买，也可以自行包被，商品化的荧光微球粒径为0.2μm，购自于Thermo Fisher Scientific，商品名为Fluoro-Max Carboxylate-Modified andStreptavidin-Coated Europium ChelateParticles。

实施例5一种杂交瘤细胞的筛选方法

一种杂交瘤细胞的筛选方法，包括如下步骤：

1)将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后，用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液；

2)将步骤1)所述细胞悬液加到预热至35℃～38℃的半固体筛选培养基中混匀，37℃静置并排除气泡后倒入平皿中，置于37℃、5％CO₂的孵育箱培养10～14天；

3)步骤2)中平皿长出肉眼可见克隆集落时，时间分辨荧光仪下，用365nm波长的激发光激发，在200-300ms后用615nm波长下观察，有红色荧光的即为分泌针对目标抗原抗体的阳性克隆，并做好标记；

4)在显微镜下将步骤3)已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为杂交瘤细胞。

5)对步骤4)挑出的已标记的阳性克隆的确认：将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，取上清采用ELISA的方法对阳性克隆进行确认。

这种杂交瘤细胞的筛选方法使用本发明的半固体筛选培养基，融合细胞在半固体培养基上呈集落生长，彼此分离，每个克隆由单个细胞形成，避免了不分泌抗体的杂交瘤生长很快而影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长，与传统的有限稀释法相比，筛选效率较高。

实施例6对比例

分别用本发明的时间分辨半固体筛选培养基、有限稀释法和荧光半固体培养基筛选杂交瘤细胞，对这三种不同的单克隆筛选方法进行比较，检测了假阳性率及获得阳性单克隆细胞所需时间，通过比较得到下表：

通过比较试验发现用本发明的时间分辨半固体筛选培养基来筛选杂交瘤细胞耗时短，为1～2个月，时程短，不易污染，且筛选后获得的单克隆细胞的假阳性率＜10％，远低于有限稀释法和一般荧光半固体培养基的假阳性率。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.半固体筛选培养基，其特征在于，包括如下体积份数的组分：

2.根据权利要求1所述的半固体筛选培养基，其特征在于，所述Eu3+微球标记的抗原溶液中Eu3+微球与抗原的质量比为0.02～1：1。

3.根据权利要求1所述的半固体筛选培养基，其特征在于，包括如下体积份数的组分：

4.根据权利要求1所述的半固体筛选培养基，其特征在于，所述甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1：1的2×DMEM培养基和4％的甲基纤维溶液充分混匀得到。

5.权利1-4任一项所述的半固体筛选培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按上述体积比配置甲基纤维素半固体培养基；

2)按上述体积比将50×HAT溶液、胎牛血清、100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1000×EGF溶液、1000×IL-6溶液混合均匀、100×B细胞刺激因子溶液和100×Eu3+微球标记的抗原溶液混合均匀，得混合物；

3)将步骤1所述甲基纤维素半固体培养基与步骤2)所述混合物混合均匀得半固体筛选培养基。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)混合的温度为4℃，混合的时间为6～24h；步骤3)中混合的温度为4℃。

7.权利1-4任一项所述的半固体筛选培养基在抗原抗体检测中的应用。

8.利用权利1-4任一项所述的半固体筛选培养基筛选杂交瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后，用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液；

2)将步骤1)所述细胞悬液加到预热至35℃～38℃的半固体筛选培养基中混匀，静置并排除气泡后倒入平皿中，置于孵育箱中培养；

3)步骤2)中平皿长出肉眼可见克隆集落时，时间分辨荧光仪下，用365nm波长的激发光激发，在200-300ms后用615nm波长下观察，有红色荧光的即为分泌针对目标抗原抗体的阳性克隆，并做好标记；

4)将步骤3)已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为杂交瘤细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述HAT液体培养基由如下成分组成：1×DMEM培养基、20％的胎牛血清和1×HAT。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述筛选方法还包括步骤：

5)对步骤4)挑出的已标记的阳性克隆的确认：将挑出的阳性克隆放入含有HT液体培养基的96孔板中进行培养，每孔一个克隆，待细胞长满孔底后，取上清对阳性克隆进行确认。