CN1077629A - 多核苷酸营养素产品及制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种以酵母作RNA及多核苷酸源,以植物花粉
特别是玉米花粉为DNA及脱氧多核苷酸源制成多
核苷酸营养素产品及制造方法,其特点是将酵母及花
粉在适当的高低温和酸碱条件下彻底破壁提取
RNA和DNA,再用酶水解及提纯得单核苷酸,按人
体核苷酸比例制成核苷酸复合物及脱氧核苷酸复合
物,并与RNA、DNA一起按规定用量配制成多核苷
酸营养素产品,分别用于高级的多核苷酸食品,饮料
(含婴幼品)、调味品、药品、化妆品等的生产,具有增
强体质及抗病力,面部皮肤年轻化,提高机体免疫力、
抗癌防癌、抗老防衰及增强调味品鲜味等系列保健功
效。
Description
本发明涉及酵母及植物花粉为原料进行加工的方法
核酸是生命信息的载体,担任遗传信息的储存、传递和表达的生命本质作用。核苷酸是组成核酸的基本单位,不论是核糖核酸[RNA]还是脱氧核糖核酸[DNA]均由核苷酸组成,区别在于RNA的核苷酸为D-核糖,DNA的核苷酸为D-脱氧核糖;另外还有碱基种类、比例及单、双链等的区别。人体合成核酸的主要途径是:先主要在肝脏中合成嘌呤及嘧啶核苷酸,再通过血液运输进入细胞作为合成RNA的原料;细胞内的核苷酸在系列酶的催化下脱氧生成脱氧核苷酸而作为合成DNA的原料。食物中的核酸多与蛋白质结合为核蛋白质,在胃中受胃酸及胃酶的作用分解为核酸与蛋白,蛋白质可进一步在胃中消化,核酸则不能,而是进入小肠后,在胰液及肠液水解酶的作用下,水解为单核苷酸及核苷,二者均可被吸收进入血液,在与人体肝脏内合成的核苷酸及核苷一样供作合成RNA或DNA的原材料。这说明外源核酸经人体消化吸收后可作为合成自体核酸原料。
以前一直认为人体并不一定需要依靠膳食等供给核酸,理由是核苷酸在体内可由其他物质合成。近年的研究说明,由于人体的衰老,肝脏合成能力降低;婴幼肝脏未发育完全,合成能力较差;因肝脏疾患合成能力降低等因素均可减少人体合成核酸的能力,孕妇因合成核苷酸的原料首先要满足胎儿迅速增长的细胞及组织的需要故更易缺乏核酸。而人体缺乏核苷酸,核酸合成及受损伤后的修补使之恢复正常结构和功能的机制就会严重受阻,导致遗传信息的改变,细胞活力下降、早衰甚至发生诸如癌症等严重疾患并难以逆转。试验说明:处在胚胎期的老鼠就早已具备对DNA的修补能力,在临将出世前的一段时间,修补能力更为强烈;对人类的研究也得到类似的结果:叶酸是合成嘌呤核苷酸的阶段产物甲酰叶酸的原料,脐血含量一般高于母血数倍,说明生长发育快的胎儿较母体需求核酸量大数倍,当孕母有明显叶酸缺乏时,供给胎儿营养的脐血中叶酸含量仍比母血高并且同样在妇娠后期表现出胎儿血中叶酸含量较前、中期增加,叶酸在合成嘧啶核苷酸的过程中也起到重要作用。妇娠后期约有20%的孕母因此而自身缺乏叶酸,甚至有的在妇娠早期就缺乏叶酸,发生巨红细胞性贫血、中性粒细胞分叶增多,严重的甚至早产及畸型儿。嘌呤核苷酸的缺乏目前用增加叶酸供给量来间接治疗,因为一般的日常膳食、饮料诸如米饭、面食、牛奶、蛋类、肉类(细胞密集的内脏虽然含少许核酸,但能量等又嫌过高,不能长久大量食用,否则会顾此失彼)、果蔬(体积大、95%为水,核酸含量微乎其微)均不含或极少含有核酸,不能满足人体对外源核酸的摄食需求。当人体自身合成能力不足或下降时,即使补充足够的叶酸,也难以避免核酸缺乏引起的各种人体损害,《核酸疗法》因此应运而生,普遍收到耐力提高,体质及体力增强、面部皮肤年轻化、心脏功能增强及许多种老年病诸如动脉硬化、肺气肿、青光眼、高血压、糖尿病等获得好转之显著抗老防衰功效。核酸制品因之被国外誉为“葆春膳品”,颇为畅销,WHO(世界卫生组织)、FAO(***粮农组织)、FDA(美国食品与药品管理局)、日本、欧洲经济共同体等均批准食用(多种核酸盐-为增加其溶解性及稳定性),用量(ADI)一般不作特殊规定,可按产品需求量使用(GRAS),动物(大鼠)经口急性、亚急性、慢性、致畸突变及繁殖试验均无异常发生,所以是安全无毒的食品添加剂。尽管如此,限于当时的认识水平,仅从核苷酸呈味增鲜角度考虑用作调味营养增补品而已,这是一大遗憾。即使近几年来国外采用核酸抗衰的临床应用已超过数百万人次并未见有不良副作用,但多数制剂主要采用动物DNA如鱼精中提取热变性DNA作原料,这就使DNA注射液的产量及售价受资源和成本的极大影响,并因物种相差甚远且四种核苷酸的比例也难达到人体合理配比,故难发挥高的生理效价,一般人也消费不起。现在有人用人流胚胎DNA即所谓同源DNA作原料来提高其生理效价,但资源和成本绝大多数人均难以承受。
本发明的目的就是为解决现有技术之不足而提供一种多核苷酸产品及制造方法,即以人体核酸的合成途径和能力、人体对外源核酸的消化吸收利用途径以及人体各种核苷酸的合理比例等为依据,用资源广泛,纯正单一,且易收集,核酸含量丰富及价格低的酵母核酸(RNA)和植物花粉核酸(DNA)为核酸源,平衡各种核苷酸比例以提高产品效价,以人们乐意接受且质优价廉的产品来满足广大消费者日益增长的抗老防衰、增强体质的保健需求。
本发明提供的多核苷酸营养素产品是用RNA、DNA、RNA四种核糖核苷酸(AMP、CMP、GMP、UMP)和DNA水解后的四种脱氧核糖核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP及dTMP)按人体内核苷酸构成比例(克分子含量)制成,其原料用量(按绝干重量计)为:
RNA 0-75份
DNA 0-25份
核苷酸复合物(按AMP24份、CMP15份、GMP16份、UMP21份) 0-75份
脱氧核苷酸复合物(按dAMP8份、dCMP4.5份、dGMP5份、dTMP7.5份) 0-25份
脱氧核苷酸营养素产品及制造方法是:
1、RNA的制取:取酵母于2-3℃下加2-3倍体积的水浸泡24-48小时,加水稀释到5-10%的重量比浓度,在20℃下边搅拌(1转/秒)边加入40%NaOH水溶液使NaOH最终浓度为1%,继续搅拌(1转/秒)40分钟后,用6NHCl中和至PH7.0,再搅拌10分钟(酸、碱破壁),加热至90-95℃并持续5-10分钟(热破壁)10000xg离心并使自然迅速冷却(冷破壁),继续离心10-15分钟,弃去的沉淀用作酵母综合利用原料或用作饲料及食品优质蛋白原料。离心的上清液用6NHCl调到RNA的等电点PH2.5,10℃以下静置6-12小时,10000xg离心10分钟,弃去的上清液用作酵母综合利用原料。收集的离心沉淀用食品级以上无水乙醇脱水,干燥(回收乙醇重复使用),得RNA制品。
2、RNA的水解:
水解RNA可用NaOH或核酸酶P1水解法,因为NaOH法水解RNA,生成的是2′-和3′-核苷酸、而生物体内游离存在的大多是5′-核苷酸,且需耗用大量高氯酸中和NaOH,在分离四种核苷酸时增加离子交换负担和占用设备,采用桔青霉产生的核酸酶P1水解RNA主要生成5′-核苷酸。具体作法如下:在试管里装入8%麦芽汁琼脂培养基用0.12兆帕蒸汽压力灭菌消毒15-20分钟,无菌条件下自然冷却到30℃以下,接入桔青霉原种,无菌棉塞封闭试管口,30℃温箱培养三天后,按上述操作步骤和条件转接入茄子瓶进行种子扩大培养。用5%葡萄糖或蔗糖、0.5%蛋白胨、K2HPO4及KH2PO4各0.05%、MgSO4·7H2O及CaCl2·2H2O各0.04%、ZnSO4·7H2O0.02%组成培养基,调PH到6.0,0.1兆帕蒸汽灭菌15-20分钟,冷却到30℃无菌条件下接入茄子瓶种子,28-30℃通入无菌空气进行发酵,待酶活力分泌达最大值时停止发酵,放罐,压滤机过滤除去菌体即得粗酶液,2-10℃下冷藏备用,数月内酶活力变化不大。水解RNA时将上述冷藏备用的酶液预先在65-70℃热处理15-20分钟以恢复并提高核酸酶P1的活力,并灭活3′-核糖核酸酶及磷酸单酯酶等,避免副反应以提高5′-核苷酸的得率。将RNA用无离子水配成1-1.5℃的RNA液,用5%NH40H调PH为5.0-5.4,升温至65-70℃,加入10%体积的桔青霉核酸酶P1粗酶液(预热至45-50℃)63-65℃保温降解1.5-2小时,迅速升温至95-100℃并持续5分钟灭酶终止反应,冷却到10℃以下,冷却后加盐酸调PH为2.0,静置过滤或10000xg离心10分钟,分出上清液,即为含有四种核苷酸的RNA酶解液,用于核苷酸的分离。
3、四种核苷酸的分离:
将RNA酶解液用2NHCl调PH到1.5,通过阳离子交换柱(阳离子交换柱先用PH1.5的水洗涤直到流出液的PH值也为1.5为止),上柱量为阳离子交换树脂全交换量的5-7%。上柱完后,用2倍于树脂体积的PH1.5的水洗脱柱上附着的UMP。PH1.5的水洗完毕后改用无离子水洗脱,第一峰为5′-GMP,第二峰为5′-CMP,第三峰为5′-AMP,按洗脱区间分别收集洗脱液。将GMP和CMP(二者易混合)混合液用2NNaOH调PH为4.0上阴离子柱(阴离子柱应先用PH4.0的水平衡),得CMP(不被吸附)液。上柱毕,用10倍柱体积的0.003NHCl和10倍柱体积的0.005NHCl(内含0.004NaCl)溶液洗脱柱中少量的CMP,再用加热到50℃的3%的NaCl溶液洗脱柱上吸附的GMP,收集洗脱液即为GMP液。将UMP液用2NNaOH调PH9.0-9.5,上阴柱(阴柱先用PH9.0的水平衡)后,用0.003NHCl洗涤至UMP开始流出时,改用内含3%NaCl的0.05NHCl洗脱UMP并收集洗脱液得UMP液。
4、核苷酸液浓缩和成品制备:将阴柱分离的GMP洗脱液用2NNaOH调PH为7.0,加入2倍体积的95%乙醇,即产生白色GMP沉淀,10℃以下静置8-12小时,5000xg离心10分钟,沉淀用无水乙醇脱水,50-60℃烘干(沉淀液及脱水液中的酒精回收利用)得纯GMP。将自阳柱得到的GMP液用2NNaOH调PH为7.0,80℃以下减压浓缩到原体积的5-10%,加入2倍体积95%乙醇沉淀出AMP,进一步处理同GMP,得纯AMP。将自阴柱得到的CMP稀溶液用2NNaOH调PH为8.0-8.5,再上阴柱(阴柱先用PH8.0的水平衡)后,柱用含有3%NaCl的0.05NHCl,加热至50℃洗脱,收集洗脱液并用2倍体积95%乙醇沉淀,进一步处理同GMP,得纯CMP。将自阴柱的UMP洗液用2倍体积的95%乙醇沉淀,进一步处理同GMP,得UMP。
5、DNA的制取,取玉米花粉、蜂花粉或其它无毒的植物花粉(不论有无生活力)于2-3℃下加1倍体积的水浸泡4-6小时得花粉泥,置于-20℃下速冻并持续40-60分钟用65-75℃热水迅速解冻并稀释到10-15%重量浓度,使NaOH最终浓度为1%,1转/秒搅拌40-60分钟升温到70℃并以1转/秒的转速搅拌10-15分钟,速冷到10℃以下。10000xg离心10-20分钟,弃沉淀(用作高级营养添加剂等),上清液用无离子水稀释NaCl含量为0.14M,沉淀2-4小时,弃上清液(回收NaCl)得DNP(DNA核蛋白体)沉淀物。用2倍DNP体积的水饱和的新蒸馏苯酚与DNP振荡助溶5-10分钟,10000xg离心10-20分钟,取出上层水相后,弃去中间变性蛋白凝胶层,再加下层苯酚液恢复到第一次离心时的原体积,振荡助溶5-10分钟,10000xg离心10-20分钟,取出上层水相后,再按上述方法重复操作5至8次。吸出上清液水相加入相当于2.5倍水相体积的冷无水乙醇沉淀DNA并用玻棒绕团取出(母液作回收乙醇、苯酚、蛋白等净化处理后排放),无水乙醇洗净脱水,自然干燥得DNA。作注射用药等精度要求高的DNA原料可用上述方法多次提纯,并用80%乙醇水溶液洗除盐分,最后用无水乙醇脱水,无菌条件下干燥即得高纯度的DNA。
6、DNA的水解:将DNA用无离子水配成1-1.5%的DNA液,调PH为4.2-4.6,升温至65-70℃,加入45-50℃的降解RNA用的10%体积的桔青酶P1粗酶液,63-65℃保温降解1.5-2小时,迅速升温到95-100℃,并持续5分钟灭酶终止反应,冷却到30℃以下,过滤除掉与DNA结合的蛋白在加热状况下形成的絮状沉淀,加盐酸调PH为1.8-2.2,静置过夜或10000xg离心10分钟,分出上清液,即为含有四种脱氧核苷酸的DNA酶解液,用于脱氧核苷酸的分离。
7、四种脱氧核苷酸的分离:将核酸酶P1水解DNA得到的脱氧核苷酸液采取与分离RNA水解液中四种核苷酸相似的方法和条件上柱分离四种脱氧核苷酸,应注意分离过程中分别调整PH值到四种脱氧核苷酸的适宜值,最适PH值较核苷酸低0.5左右。
8、脱氧核苷酸液的浓缩和成品制备:采取与浓缩和制备核苷酸的相同方法和条件浓缩和制备成品脱氧核苷酸,浓缩过程中应注意调整PH分别到四种脱氧核苷酸的适宜值。
9、核苷酸复合物的制备:
取AMP24份、CMP14份、GMP16份、UMP21份(均按绝干物质重量比),放入不锈钢研体中充分研匀5-10分钟,即得到只含RNA四种核苷酸的已水解成核苷酸单体的核苷酸复合物。
10、脱氧核苷酸复合物的制备:
取dAMP8份、dCMP4.5份、dGMP5份、dTMP7.5份(均按绝干物质重量比),放入不锈钢研钵中充分研匀5-10分钟,即得到近似人体DNA的四种脱氧核苷酸及碱基比例的已水解成脱氧核苷酸单体的脱氧核苷酸复合物。
11、多核苷酸营养素产品的配制
在无菌室内,将RNA、DNA、核苷酸复合物和脱氧核苷酸复合物,按不同用途产品的配方比例称量,加入在带有搅拌器的不锈钢设备内,以200-400转/分的转速搅拌5-10分钟,充分混匀后,即得多核苷酸营养素产品。
多核苷酸营养素产品,每100克中含有的主要营养成分(按绝干物质计算)为:
AMP 24克 CMP 14克
GMP 16克 UMP 21克
dAMP 8克 dCMP 4.5克
dGMP 5克 dTMP 7.5克
本发明多核苷酸营养素产品的用途除可作为生产多核苷酸药片、口服液及注射液的核酸主剂外,还可作为各类食品、饮料、调味品、化妆品的核酸添加剂,配成系列具有核酸保健功能的高效价食品、饮料、调味品及化妆品,用量均可按GMP规范添加,如各种饮料、甜食、咸食、汤料、酱油、醋、核酸特鲜强力味精、护肤膏、护肤液等。
本发明多核苷酸营养素产品及制造方法有如下优点:
1、采用来源广泛、价格低、核酸含量高,干物质量高、水份低的酵母和花粉(特别是玉米花粉,品质单一纯正,无毒、副作用,DNA含量达1.6%以上,产量大, 一直未得到大量工业化应用,自生自灭自然生物资源浪费极大)为核酸源且不要求花粉有活性而易批量储存,故可获得大量质优价廉的核酸源,工厂可以常年生产,克服受资源限制的季节性生产而利于降低成本,扩大核酸制品的产量,使多数人能消费得起而受益,并可提高婴、幼儿的抗病力,促进病人迅速康复。
2、为满足不同层次消费水平的需要和经济承受能力,本发明设计了多种规格的多核苷酸营养素产品方案,成本上有很大区别,但生理功能相近,便于消费者根据自己的实情选用,以使科技最大限度地为广大民众服务,生产者也因此获得更好的社会和经济效益。
3、采用同一种核酸水解酶和同一套生产设备水解RNA和DNA,有利于生产工艺的简化,设备利用率高、厂房占用少,故投资省。酶水解专一性强,副产物少,收得率高,利于提高产品质量,降低成本,减少环境污染。酶水解彻底纯度高且得呈味的5′-核苷酸,故除可用于生产精度要求较低的食品、饮料、调味品及化妆品外,还可用于生产精度较高的药品,如核苷酸口服液及注射液和要求呈味能力极强的核酸强力味精,具体应用见实施例。另外,因体内的游离核苷酸为5′-核苷酸,故可提高其生理效价。
4、在DNA和RNA的提取和水解中使用的NaOH和HCl中和后产生的是NaCl,它是食品和药品(含注射剂)中均允许使用和残留的物质,易溶于水且易除去,对人体无害,这有利于减少精制次数和损耗且不影响质量。
5、最终使用的化学药品是可食用的乙醇且易在室温下彻底挥发,母液可回收乙醇重复使用,利于降低成本,干燥效果好,环境污染小。
6、花粉及酵母破壁提取DNA和RNA过程中,同时采用适当强度的高、低温、碱和酸处理细胞壁,不仅能使破壁率(植物花粉双层破壁)达到100%,而且可最大限度地防止RNA及DNA解离成核苷酸及其它物质,从而提高核酸收率。
7、根据生物体中主体碱基A、T、G、C、U通用只是配比和排列顺序相异原理,本发明多核苷酸营养素中上述主要碱基含量十分接近人体中的比例;从而有效克服了外源核酸因物种差异远碱基比例差异大而效价不高的缺点,也克服了人流胚胎DNA资源少及价格高的缺点,具有优质、低价、来源广等系列重要优点。
实施例:
1、取核苷酸复合物40克,脱氧核苷酸复合物13克,加注射用水26.5升充分溶解,得2%浓度的多核苷酸注射液或口服液产品,按注射5ml/安瓶或口服液10ml/安瓶无菌封装成终成品,也可按需要封装各种容积的产品。
2、取RNA75克、DNA25克,在不锈钢研钵中充分研匀,放入带有搅拌器的不锈钢设备内,加入蔗糖或葡萄糖10公斤,200-400转/分搅拌5-10分钟,充分混匀,得浓度为0.1%的多核苷酸原糖料,用于制作多核苷酸食品及饮料,用量可按GMP。
3、取核苷酸复合物75克、脱氧核苷酸复合物25克,加水溶解为多核苷酸饱和溶液(浓度约30%),用于制造各类高级核酸护肤化妆品,使用过程中可直接由皮肤及毛发根部细胞吸收利用,而提高细胞活力,面部皮肤因之年轻化且无副作用。使用量可按GMP。
4、取RNA40克、DNA13克、核苷酸复合物47克,在不锈钢研钵中充分研匀,得用于制作保健及增鲜的各类调味品的多核苷酸营养素产品。按5%用量加入味精即谷氨酸钠中,并混匀(晶体味精应先粉碎为末)即得特鲜多核苷酸保健强力味精;按0.005-0.01%的用量加入日常生活用的酱油、醋、调味盐等调味料中,即得特鲜多核苷酸保健酱油、醋、调味盐等调味料。由于RNA及DNA、核苷酸均易溶于浓盐溶液,故呈鲜效果十分理想。
5、取核苷酸复合物10克、脱氧核苷酸复合物3克、DNA6克、RNA20克,放入不锈钢研钵内研匀3-5分钟,得用于牛奶、婴幼奶粉(如中国发明专利申请号93110889.6-母乳化婴幼奶粉及制造方法)等婴幼食品中补充牛乳中的核苷酸,及诱导核酸酶活力,以增强婴幼儿对细菌性等疾病的抵抗能力。用量0.005-0.01%。
Claims (3)
1、一种提取酵母RNA及植物花粉DNA及其水解产物作多核苷酸源制成多核苷酸营养素产品及制造方法,其特征在于该多核苷酸营养素的原料用量(按绝干重量计)为:
RNA0-75份
DNA0-25份
核苷酸复合物(按AMP24份、CMP14份、GMP16份、UMP21份)0-75份
脱氧核苷酸复合物(按dAMP8份、dCMP4.5份、dGMP5份、dTMP7.5份)0-25份
2、按照权利要求1所述多核苷酸营养素产品的制造方法,其特征在于:
(1)、RNA的制备
取酵母于2-3℃下加2-3倍体积的水浸泡24-48小时,加水稀释到5-10%的重量比浓度,20℃下以1转/秒的转速边搅拌边加入40%NaOH水溶液到NaOH最终浓度达1%,继续搅拌40分钟后,用6NHCl中和至PH7.0,再搅拌10分钟,加热至90-95℃并持续5-10分钟,10000xg离心并使其自然迅速冷却,继续离心10-15分钟后弃去沉淀,上清液用6NHCl调PH为2.5,10℃以下冷置6-12小时,10000xg离心10分钟,弃去上清液,收集沉淀,用食品级以上无水乙醇脱水干燥,得RNA制品。
(2)、DNA的制备
取玉米花粉、蜂花粉或其它无毒的植物花粉(不论有否生活力)于2-3℃下加1倍体积的水浸泡4-6小时,置于-20℃下速冻40-60分钟,用65-75℃热水迅速解冻,稀释到10-15%重量浓度,加入40%NaOH液,使NaOH终浓度为1%,1转/秒搅拌40-60分钟,升温到70℃并以1转/秒的转速搅拌5-10分钟,速冷到10℃以下。10000xg离心10-20分钟,弃沉淀,上清液用无离子水稀释NaCl含量为0.14M,沉淀2-4小时,弃上清液得DNP。用2倍于DNP体积的水饱和的新蒸馏苯酚与DNP振溶5-10分钟后,10000xg离心10-20分钟,取出上层水相后去中间变性蛋白凝胶层,再加入下层苯酚液恢复到第一次离心时的体积振溶5-10分钟,10000xg离心10-20分钟,取出上层水相后再按上述方法重复操作5-8次,直到中间界面处不再出现蛋白质凝胶为止,吸出上清液用2.5倍食品级以上无水乙醇沉淀脱水DNA并用玻棒绕取DNA,自然干燥得DNA成品。
(3)、核苷酸复合物的制备
在试管中加入8%麦芽汁-琼脂培养基,用0.12兆帕蒸汽压灭菌消毒15-20分钟,无菌条件下自然冷却到30℃以下接入桔毒霉原种,30℃温箱培养3天,转入茄子瓶按上述操作步骤和条件进行种子扩大培养。生产培养基由5%葡萄糖或蔗糖、0.5%蛋白胨、0.05%k2HPO4、0.05KH2PO4、MgSO4·7H2O及CaCl2·H2O各0.04%,ZnSO4·7H2O 0.02%供应营养,并调PH为6.0,0.1兆帕蒸汽灭菌15-20分钟,冷却到30℃以下接入茄子瓶种子,25-30℃通入无菌空气进行有氧发酵,待酶活力分泌达最大值时停止发酵,放罐,压滤除去菌体得粗酶液,10℃以下冷藏备用。将RNA配成1-1.5%的水液,5%NH4OH调PH为5.0-5.4,升温到65-70℃,加入10%体积的事先经65-70℃热处理提高酶活力的粗酶液(温度在45-50℃),63-65℃降解1.5-2小时,迅速升温至95-100℃持续5分钟灭酶,冷却到10℃以下,加HCl调PH为2.0,静置过夜或10000xg离心10分钟,分出上清液,再用2NHCl调PH到1.5,上阳离子交换柱毕,得UMP液,用2倍于树脂体积的PH1.5的水洗脱柱上附着的UMP毕,改用无离子水洗柱依次得GMP、CMP和AMP洗液。将GMP和CMP混合液用2NNaOH调PH为4.0上阴离子柱毕,得CMP液,改用10倍柱体积的0.003NHCl和10倍柱体积的0.005NHCl(内含0.004NNaCl)溶液洗脱柱中残存的CMP,再用50℃的3%NaCl液洗柱得GMP洗液。将UMP液用2NNaOH调PH9.0-9.5上阴柱后,用0.003NHCl洗柱到UMP开始流出时,改用内含3%NaCl的0.05NHCl洗柱得UMP液。将阴柱分离的GMP洗液用2NNaCl调PH为7.0,加入2倍体积的95%乙醇,10℃以下静置8-12小时,5000xg离心10分钟,沉淀用无水乙醇脱水,50-60℃烘干得GMP。将阳柱得到的AMP稀浓度洗液用2NNaOH调PH为7.0,80℃以下减压浓缩到原体积的5-10%,加入2倍体积的95%乙醇沉淀AMP,进一步处理同GMP,得AMP。将自阴柱得到的CMP稀溶液用2NNaOH调PH为8.0-8.5,再上阴柱后,柱用含3%NaCl的0.05NHCl加热至50℃洗脱,收集洗液并用2倍体积95%乙醇沉淀,进一步处理同GMP,得CMP。将自阴柱的UMP洗液用2倍体积的95%乙醇沉淀,进一步处理同GMP,得UMP。
取AMP24份、CMP14份、GMP16份、UMP21份(均按绝干物质重量比),放入不锈钢研钵中充分研匀5-10分钟,得核苷酸复合物。
(4)脱氧核苷酸复合物的制备:将DNA用无离子水配成1-1.5%重量比浓度的DNA液,调PH为4.2-4.6,升温到65-70℃,加入10%体积降解RNA用的桔青霉核酸酶P1粗酶液,63-65℃保温降解1.5-2小时迅速升温到95-100℃灭酶5分钟,冷却到30℃以下,滤除絮状蛋白沉淀,HCl调PH为1.8-2.2,静置过夜或10000xg离心10-15分钟,取上清液进行脱氧核苷酸的分离,浓缩和成品制备,方法和步骤与制备四种核苷酸的相似,只是脱氧核苷酸的最适PH值低0.5左右,采取与制备四种核苷酸相似的方法制备四种脱氧核苷酸。
取dAMP8份,dCMP4.5份,dGMP5份,dTMP7.5份(均按绝干重量比),放入不锈钢研钵中充分研匀5-10分钟,得脱氧核苷酸复合物。
(5)多核苷酸营养素的配制:在无菌室内,将RNA、DNA,核苷酸复合物和脱氧核苷酸复合物,按不同用途的产品配方比例称量,加入在带搅拌器的不锈钢设备内,以200-400转/分的转速搅拌5-10分钟即得多核苷酸营养素产品。
3、按照权利要求1所述多核苷酸营养素的用途,其特征在于该产品除可作为多核苷酸药片,口服液及注射液的核酸主剂外,还可作为各类食品、饮料、调味品及化妆品的核酸添加剂,配成系列具有核酸保健功能的高效价食品、饮料、调味品及化妆品,用量可按GMP添加,如各种饮料、甜食、咸食、汤料、酱油、醋、核酸特鲜强力味精、护肤膏、护肤液等。
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