CN107750946B - 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法 - Google Patents

一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107750946B
CN107750946B CN201710971971.4A CN201710971971A CN107750946B CN 107750946 B CN107750946 B CN 107750946B CN 201710971971 A CN201710971971 A CN 201710971971A CN 107750946 B CN107750946 B CN 107750946B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
callus
dioscorea
polyploid
sweet wormwood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201710971971.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107750946A (zh
Inventor
黄丽芳
夏新界
刘永源
欧阳敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming Pharmaceutical Group Chongqing Wuling Mountain Pharmaceutical Co ltd
Institute of Subtropical Agriculture of CAS
Original Assignee
Kunming Pharmaceutical Group Chongqing Wuling Mountain Pharmaceutical Co ltd
Institute of Subtropical Agriculture of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming Pharmaceutical Group Chongqing Wuling Mountain Pharmaceutical Co ltd, Institute of Subtropical Agriculture of CAS filed Critical Kunming Pharmaceutical Group Chongqing Wuling Mountain Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN201710971971.4A priority Critical patent/CN107750946B/zh
Publication of CN107750946A publication Critical patent/CN107750946A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107750946B publication Critical patent/CN107750946B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A01H1/08—Methods for producing changes in chromosome number
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法。该方法利用青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣优选单株的愈伤组织为材料，通过钙离子溶液，秋水仙素溶液短时间浸泡处理后低温共培养，然后接种到培养基中加入不同浓度秋水仙素进一步进行诱变处理，使植株加倍后，再运用倍性鉴定技术进行鉴定，获得多倍体的青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣植株。该方法提供了诱导青蒿和薯蓣多倍体的最佳秋水仙素浓度、处理时间、钙离子浓度、低温共培养时间等等。该方法不仅能显著提升青蒿、薯蓣植株多倍体的诱导率，而且时间短，效率高，成本低。

Description

一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法
技术领域
本发明属于植物多倍体诱导培育技术领域，尤其涉及一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种创新培育的方法。
背景技术
青蒿(Artemisiaannua L.)又称黄花蒿，是异花授粉植物，由于该群体的复杂异质性，后代总是出现性状分离，表现出多样性，优良性状难以稳定地遗传下去，这就是目前我国青蒿品种易混杂、退化的根本原因。青蒿的常规育种往往为了获得较稳定的纯合后代和保证选择效果，必须在适当控制授粉的条件下，进行多次选择，而且异花授粉植物不耐自交，自交会导致生活力显著衰退，因而育种难度较大、且耗时长，种质性状不稳定。运用多倍体育种技术使植物染色体加倍后，通过提高青蒿的生物学产量来达到提高其青蒿素产量的目的，是目前在国际上应用比较广泛，适用于功能活性成分药用植物的育种方法，同时为了获得较稳定的纯合后代和保证选择效果，目前最直接、快捷的方法是运用组培快繁技术对选择出的多倍体株系直接进行无性繁殖，避免种子及扦插繁殖种苗的种质变异，从而可获取大量的多倍体青蒿优质种苗。
薯蓣属植物(Dioscorea)具有重要的药用价值，被医药界称之为“药用黄金”。据记载，全球薯蓣科植物约650种，我国62 种。盾叶薯蓣是我国特有种，耐寒耐旱。墨西哥菊叶薯蓣 (Dioscorea composite Hemsl.)耐旱不耐寒，在我国云南和海南地区种植，菊叶薯蓣一年四季持续生长。因此，薯蓣中盾叶薯蓣和菊叶薯蓣进行产业化栽培具有较好的经济前景，是值得推广种植非粮能源和医药两用作物。盾叶薯蓣和菊叶薯蓣主要靠人工种植，长期以来由于只种不选，导致品种种性退化，药材质量和产量下降，化学成分不稳定。通过离体培养及化学诱变技术，人工诱导所得到的同源四倍体由于染色体数目增加了一倍，细胞核和细胞的体积也相应地增大，其结果使得多倍体植株的营养体的器官增大，产量提高，并且，能使体内一些有效成分含量的增加。
多倍体材料具有潜在应用价值的育种资源，相信随着研究的深入，有望在这些多倍体植株中选育出高产、高薯蓣皂素和高青蒿素含量的新种质。所以，开展青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣多倍体品种选育并获得多倍体创新品种，对解决生产上存在的上述问题有重要意义。
一般采用化学试剂进行多倍体诱导，多是利用所选试剂对植物微管蛋白的结合作用来有效阻止微管聚合，从而抑制纺锤体的形成，达到诱导染色体加倍的效果。秋水仙素(Colchicine)是一种常用的多倍体诱变剂，在利用活体诱导处理方法时，其外植体死亡率高、诱变率低、嵌合率高、获得四倍体植株稔性低、不易获得大量四倍体；虽然在离体培养条件下处理获得多倍体的频率稍高，但是也很少有植物能够有理想的多倍体诱导率。这可能与各种植物的特性不同，以及影响多倍体诱导率的因素众多有关。本发明综合不同诱变剂的浓度，处理时间以及不同Ca2+浓度和共培养时间等因素，通过设计相应的实验方案对青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣的愈伤组织进行不同处理，探讨以上因素在青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣多倍体诱导过程中的作用，以期找到同时适合于青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣等多种药用植物的多倍体诱导最佳的处理组合方案。
发明内容
本发明针对上述问题，目的在于提供一种青蒿、薯蓣植株多倍体的快繁培育方法。该方法不仅能显著提升青蒿、薯蓣植株多倍体的诱导率，而且时间短，效率高，成本低。本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择
选择形成绿色芽点的青蒿或薯蓣的胚性愈伤组织，取出切小块；
(2)诱变处理
将步骤(1)处理好的愈伤组织用1.0-3.0mmol/LCa2+溶液浸泡处理；然后浸泡于含有浓度为0.1％秋水仙素的溶液中30-90 min；然后不清洗直接转入固体培养基中，在4℃条件下共培养，取出清洗，超净工作台上吹干水分；再接种于含有浓度为1.0-5.0 mg/L秋水仙素的固体培养基上处理20-60d；
(3)形态与染色体鉴定
将步骤(2)中植株生长到3-4cm，根长出0.5-1cm时，与二倍体对照植株做比对分析，根据二者在外观形态叶片宽度、厚度、茎粗度及气孔保卫细胞的大小和密度的差异，初步筛选表型变异明显的植株进行生根，然后取变异苗根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体；
(4)移栽管理
将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗，定植，通风，进行种苗正常管理。
所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，所述的薯蓣包括盾叶薯蓣或菊叶薯蓣。
所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，优选步骤(1)选择青蒿或薯蓣的胚性愈伤组织，转入分化培养基中培养，当愈伤组织开始形成绿色芽点时，取出切1.0-3.0cm 小块。进一步优选步骤(1)选择优质单株青蒿、盾叶薯蓣或菊叶薯蓣的胚性愈伤组织，转入MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L分化培养基中培养3-10d；当愈伤组织开始形成绿色芽点时，取出切成1.0-3.0cm大小，均匀放置垫4-5层无菌滤纸的培养皿中，然后在超净工作台吹1-5h，优选2h。
所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，优选：
步骤(2)中将步骤(1)处理好的愈伤组织用1.0-3.0 mmol/LCa2+溶液浸泡处理20-40min，优选3.0mmol/LCa2+溶液，优选浸泡处理时间30min。
步骤(2)中Ca2+溶液浸泡处理过的愈伤组织浸泡于含有浓度为0.1％秋水仙素的溶液中60min。
步骤(2)中秋水仙素浸泡后的愈伤组织不清洗直接转入MS0培养基中，在4℃条件下共培养72h，取出清洗5-6次，放置在无菌滤纸上沥干水分，超净工作台上吹10-60min，优选30 min。
步骤(2)中将愈伤组织再接种于含有浓度为1.0-5.0mg/L 秋水仙素的固体培养基MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+多效唑2.0 mg/L上处理20-60d，优选在含有1.0mg/L秋水仙素的固体培养基中培养40d。
步骤(2)的愈伤组织在含有秋水仙素的固体培养基中培养的温度25℃，光照强度2000LX，光照时间10-12h。
所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，优选：
步骤(4)将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗，取出清洗根部培养基，定植于装有高压灭菌后栽培基质的培养箱中，栽完浇透水，盖上盖子，移栽20d后开始通风1-2次/7d，通风时间由10min逐渐增加至全天，揭盖前不用浇水，在通风时喷少量清水在叶面上，30-35d后逐渐撤去盖子，进行种苗正常管理。移栽成活率95％以上。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
本发明是一种适用于药用植物青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣多倍体培育的方法，该方法操作简单，可快速实现青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣新品种选育，缩短育种周期，进而有效提高青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣优质种苗的培育速率，克服其在常规育种中易出现的性状分离，优良性状难以稳定地遗传下去，培育出的新品种易混杂、退化等问题。
本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明的方法不仅适用于蒿属植物青蒿，还适用于薯蓣属植物盾叶薯蓣、菊叶薯蓣进行多倍体创新育种。
2、本发明用Ca2+浸泡处理愈伤组织诱发微管骨架的解聚，再用秋水仙素短时间浸泡处理，溶液更容易渗入到愈伤组织中，然后转入MS0基本培养基中低温共培养，愈伤组织没有长时间浸泡在秋水仙素溶液中，毒害作用小，培养基又能提供充足的营养，利于外植体恢复生长。
3、本发明秋水仙素低温共培养后，在超净工作台上风干，愈伤组织中的含水量明显减少，降低了外植体毒害作用，利于外植体恢复生长。
4、本发明因多重优势的影响，外植体死亡率低、嵌合率低，大大提高了诱变效率，彻底解决了秋水仙素长时间浸泡处理的劣势。
附图说明:
图1二倍体与四倍体再生苗瓶内长势分析
1.为本发明青蒿诱变苗的生长情况；
2.为本发明盾叶薯蓣诱变苗的生长情况；
3.为本发明菊叶薯蓣诱变苗的生长情况；
4.为本发明青蒿二倍体再生苗的生长情况；
5.为本发明盾叶薯蓣二倍体再生苗的生长情况；
6.为本发明菊叶薯蓣二倍体再生苗的生长情况；
7.为本发明青蒿四倍体再生苗的生长情况；
8.为本发明盾叶薯蓣四倍体再生苗的生长情况；
9.为本发明菊叶薯蓣四倍体再生苗的生长情况；
图2二倍体与四倍体再生苗大田长势分析
1.为本发明青蒿二倍体植株；
2.为本发明青蒿四倍体植株；
3.为本发明青蒿叶片大小比较(左为二倍体，右为四倍体)；
4.为本发明盾叶薯蓣二倍体植株；
5.为本发明盾叶薯蓣四倍体植株；
6.为本发明盾叶薯蓣叶片大小比较(左为二倍体，右为四倍体)；
7.为本发明菊叶薯蓣二倍体植株；
8.为本发明菊叶薯蓣四倍体植株；
9.为本发明菊叶薯蓣叶片大小比较(左为二倍体，右为四倍体)；
图3二倍体与四倍体再生苗的染色体核型分析
1.青蒿二倍体染色体形态和核型图，×1000(2n＝2x＝18)；
2.盾叶薯蓣二倍体染色体形态和核型图，×1000 (2n＝2x＝20)；
3.菊叶薯蓣二倍体染色体形态和核型图，×1000 (2n＝2x＝20)；
4.青蒿四倍体染色体形态和核型图，×1000(2n＝4x＝36)；
5.盾叶薯蓣四倍体染色体形态和核型图，×1000 (2n＝4x＝40)；
6.菊叶薯蓣四倍体染色体形态和核型图，×1000 (2n＝4x＝40)。
具体实施方式
以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，但本发明所述的方法和保护的范围并不限于此：
(一)材料与方法
(1)外植体选择
选择青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣的胚性愈伤组织，分别转入MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L分化培养基中培养3-10d；当愈伤组织开始形成绿色芽点，取出切成1.0-3.0cm大小，均匀放置垫4-5层无菌滤纸的培养皿中，然后在超净工作台吹1-5h；
(2)诱变处理
将步骤(1)处理好的愈伤组织用1.0-3.0mmol/L氯化钙溶液浸泡处理30min；然后浸泡于含有浓度为0.1％秋水仙素的溶液中30-90min，重点不清洗，直接转入MS0培养基中4℃条件下共培养72h后，再取出清洗5-6次，放置在无菌滤纸上沥干水分，超净工作台上吹10-60min，然后接种于含有浓度为 1.0-5.0mg/L秋水仙素的固体培养基 MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+多效唑2.0mg/L上处理20-60d，培养温度25℃左右，光照强度2000LX左右，光照时间10-12h。以常规的长时间浸泡处理法(48-72小时)为对照。
(3)形态与染色体鉴定
将步骤(2)中植株生长到3-4cm，根长出0.5-1cm时，与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态叶片宽度、厚度、茎粗度及气孔保卫细胞的大小和密度的差异，初步筛选表型变异明显的植株进行生根，然后取变异苗(青蒿20株，盾叶薯蓣和菊叶薯蓣各10株)根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体；
(4)移栽管理
将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗，取出清洗根部培养基，定植于装有高压灭菌后栽培基质的培养箱中，栽完浇透水，盖上盖子，移栽20d后开始通风1-2次/7d，通风时间由10min逐渐增加至全天，揭盖前不用浇水，只是在通风时稍喷一些清水在叶面上，30-35d后逐渐撤去盖子，进行种苗正常管理，移栽成活率95％。
(二)结果与分析
2.1秋水仙素溶液长时间浸泡处理法对愈伤组织细胞多倍体的诱导
秋水仙素溶液长时间浸泡处理盾叶薯蓣和菊叶薯蓣可以得到少量的多倍体细胞(表1)，青蒿为0。盾叶薯蓣和菊叶薯蓣多倍体出现的频率随处理浓度的升高和处理时间的延长而增加，小于0.1％秋水仙素浓度处理对诱导多倍体作用小，仅获得2株嵌合体；0.1％及其以上浓度处理对诱导产生多倍体效果较好，但随处理浓度增加秋水仙素对外植体的毒害作用增大，尤其是选择最高浓度(0.2％)和处理时间(48h或72h)将杀死所有的外植体。实验证明，以处理浓度为0.1％、处理时间72h的组合的效果最好，但是愈伤组织随着培养时间的延长，死亡率升高，仅获得5 株成活有效苗，4株为盾叶薯蓣，1株为菊叶薯蓣。在所有的浸泡处理中杀死了所有青蒿外植体。
表1离体培养条件下秋水仙素浸泡诱变处理
Figure BDA0001437740570000111
长时间浸泡处理法是多倍体诱变最常用的方法，但是秋水仙素溶液长时间浸泡处理法对愈伤组织的伤害较直接，尤其是长时间浸泡处理，将杀死所有的外植体，影响其诱变效率。
2.2秋水仙素溶液短时间浸泡+共培养处理法对愈伤组织细胞多倍体的诱导
选取浸泡处理时间、Ca2+浓度、固体培养基诱变剂浓度、共培养时间4个因素，将各因子分别设3个水平(表1)，采用L9(34) 正交试验设计。
表2正交试验设计参数
Figure BDA0001437740570000112
表3秋水仙素浸泡处理时间、Ca2+浓度、固体培养基诱变剂浓度、共培养时间组合方案
Figure BDA0001437740570000121
表4秋水仙素溶液短时间浸泡+共培养处理法的诱变效果
Figure BDA0001437740570000122
Figure BDA0001437740570000131
愈伤组织经1-9号处理方法诱变后，继代于分化培养基中，培养初期(15～20d)芽块表面出现褐化现象，继续培养30d，逐步长出少量绿色小芽(图1，1-3)，得到的小芽第二次继代活性较高。与对照试管苗相比(图1，4-6)，部分试管苗出现植株粗壮，叶片增厚增大，表面出现轻微皱折，叶色深绿，部分叶片畸形(图1，7-9)。本发明方法优势在于1-9号处理均获得了成活诱变苗，而且成活率高。
秋水仙素溶液短时间浸泡+共培养可以得到大量的青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣多倍体细胞(表4)，随处理浓度增加秋水仙素对外植体的毒害作用逐渐增大，多倍体出现的频率随处理浓度的升高和处理时间的延长而增加。最佳处理组合为6号处理方法，具体操作如下:选择分化培养7-10d形成绿色芽点的愈伤组织，超净工作台上风干2h，再用3.0mmol/LCa2+溶液浸泡处理30min，然后浸泡于含有浓度为0.1％秋水仙素的溶液中60min，不清洗转入MS0基本培养基中共培养72h，取出清洗5-6次，放置在无菌滤纸上沥干水分，超净工作台上吹30min，然后接种于含有浓度为1.0mg/L秋水仙素的固体分化培养基 MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+多效唑2.0mg/L上培养40d，外植体褐化、死亡率低于20％，青蒿、薯蓣的诱变率分别达到60％、 55％。本发明方法效果明显优于秋水仙素长时间浸泡处理。
2.3多倍体的鉴定
2.3.1形态学鉴定
与对照试管苗相比，经过处理的部分试管苗表现出扭曲矮化、生长缓慢、茎秆***、叶片增厚增大、叶变宽、叶片颜色加深、叶表面粗糙呈泡状等植株形态变异。对诱变成功的四倍体植株进行增殖，仍然表现出器官巨大性，茎段粗壮，叶片比二倍体大而厚，甚至叶形都发生了显著的变化。
青蒿试管苗移栽后，对照二倍体植株(图2，1)与当年的四倍体植株相比(图2，2-3)，发现四倍体植株形态性状与二倍体有较大差异，且大多表现出超亲优势。依据性状的差异，对照二倍体植株青蒿素含量为14.5‰，培育成四倍体植株形态性状在株高、叶色、叶宽、叶厚、茎粗等性状表现出超亲优势，尤其是株高达到3.8米以上，青蒿素含量达到16.5‰，高出二倍体 2.0‰，应用价值高。
盾叶薯蓣试管苗移栽后，对照二倍体植株(图2，4)与当年的四倍体植株相比(图2，5-6)，发现生长2年后的四倍体植株形态性状与二倍体有较大差异，且大多表现出超亲优势。依据性状的差异，对照二倍体植株盾叶薯蓣皂素含量为12.4‰，培育成四倍体植株形态性状在叶色、叶宽、叶厚、茎粗、种荚、种子等性状表现出超亲优势，尤其是单株块茎产量超出一半以上，皂素含量高达13.6‰，超出二倍体1.2‰，应用价值高。
菊叶薯蓣试管苗移栽后，对照二倍体植株(图2，7)与当年的四倍体植株相比(图2，8-9)，发现生长2年后的四倍体植株形态性状与二倍体有较大差异，且大多表现出超亲优势。依据性状的差异，对照二倍体植株盾叶薯蓣皂素含量为15.6‰，培育成四倍体植株形态性状在叶色、叶宽、叶厚、茎粗等性状表现出超亲优势，尤其是单株块茎产量超出一半以上，皂素含量高达 17.3‰，超出二倍体1.7‰，应用价值高。
2.3.2染色体制片技术检测
细胞学染色体计数法可直接观察染色体并计数，是一种可靠、直观的鉴定倍性的方法。青蒿二倍体材料(图3，1)染色体2n＝2x＝18(x＝9)，盾叶薯蓣二倍体材料(图3，2)染色体 2n＝2x＝20(x＝10)，菊叶薯蓣二倍体材料(图3，3)染色体2n＝2x＝20 (x＝10)，而筛选出的变异植株50％～60％染色体数超过18或20 条，但由于染色体小，染色体重叠等，54株青蒿四倍体(图3， 4)2n＝4x＝36(x＝9)，有55株制片清楚显示薯蓣四倍体(图3， 5-6)2n＝4x＝40(x＝10)，其中盾叶薯蓣32株，菊叶薯蓣23株。根据可数染色体数接近36或40的情况看，初步筛选的变异植株10-60％为四倍体。在变异植株中也发现染色体多样性，如青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣各获得八倍体植株1株，还有染色体增加或减少，染色体重叠等。本发明方法嵌合体植株少。
本方法可快速实现青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣新品种选育，缩短育种周期，进而有效提高青蒿优质种苗的培育速率，克服青蒿、盾叶薯蓣、菊叶薯蓣在常规育种中易出现的性状分离，优良性状难以稳定地遗传下去，培育出的新品种易混杂、退化等问题。

Claims (9)

1.一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体选择
选择形成绿色芽点的青蒿或薯蓣的胚性愈伤组织，取出切小块；
（2）诱变处理
将步骤（1）处理好的愈伤组织用1.0-3.0 mmol/LCa2+溶液浸泡处理；然后浸泡于含有浓度为0.1%秋水仙素的溶液中30-90 min；然后不清洗直接转入固体培养基中，在4°C条件下共培养，取出清洗，超净工作台上吹干水分；再接种于含有浓度为1.0-5.0 mg/L秋水仙素的固体培养基MS+BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+多效唑2.0 mg/L上处理20-60 d；
（3）形态与染色体鉴定
将步骤（2）中植株生长到3-4 cm，根长出0.5-1 cm 时，与二倍体对照植株做比对分析，根据二者在外观形态叶片宽度、厚度、茎粗度及气孔保卫细胞的大小和密度的差异，初步筛选表型变异明显的植株进行生根，然后取变异苗根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体；
（4）移栽管理
将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗，定植，通风，进行种苗正常管理。
2.根据权利要求1所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，所述的薯蓣包括盾叶薯蓣或菊叶薯蓣。
3.根据权利要求1或2所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（1）选择青蒿或薯蓣的胚性愈伤组织，转入分化培养基中培养，当愈伤组织开始形成绿色芽点时，取出切1.0-3.0 cm小块。
4.根据权利要求3所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（1）选择优质单株青蒿、盾叶薯蓣或菊叶薯蓣的胚性愈伤组织，转入MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L分化培养基中培养3-10 d； 当愈伤组织开始形成绿色芽点时，取出切成1.0-3.0 cm大小，均匀放置垫4-5层无菌滤纸的培养皿中，然后在超净工作台吹1-5 h。
5.根据权利要求1或2所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（2）中将步骤（1）处理好的愈伤组织用1.0-3.0 mmol/LCa2+溶液浸泡处理20-40min。
6.根据权利要求1或2所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（2）中Ca2+溶液浸泡处理过的愈伤组织浸泡于含有浓度为0.1%秋水仙素的溶液中60min。
7.根据权利要求1或2所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（2）中秋水仙素浸泡后的愈伤组织不清洗直接转入MS0培养基中，在4°C条件下共培养72 h，取出清洗5-6次，放置在无菌滤纸上沥干水分，超净工作台上吹10-60 min。
8.根据权利要求1或2所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（2）的愈伤组织在含有秋水仙素的固体培养基中培养的温度25℃，光照强度2000LX，光照时间10-12h。
9.根据权利要求1或2所述的适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法，其特征在于，步骤（4）将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗，取出清洗根部培养基，定植于装有高压灭菌后栽培基质的培养箱中，栽完浇透水，盖上盖子，移栽20 d后开始通风1-2 次/7d，通风时间由10 min 逐渐增加至全天，揭盖前不用浇水，在通风时喷少量清水在叶面上，30-35 d 后逐渐撤去盖子，进行种苗正常管理。
CN201710971971.4A 2017-10-18 2017-10-18 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法 Expired - Fee Related CN107750946B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710971971.4A CN107750946B (zh) 2017-10-18 2017-10-18 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710971971.4A CN107750946B (zh) 2017-10-18 2017-10-18 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107750946A CN107750946A (zh) 2018-03-06
CN107750946B true CN107750946B (zh) 2020-04-24

Family

ID=61268333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710971971.4A Expired - Fee Related CN107750946B (zh) 2017-10-18 2017-10-18 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107750946B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111616047B (zh) * 2020-05-21 2022-06-21 中国农业大学 一种玉米单倍体加倍的方法及其应用
CN112243862A (zh) * 2020-11-09 2021-01-22 三明市农业科学研究院 一种从混倍体参薯分离纯化出倍性稳定再生植株的方法
CN114711144A (zh) * 2022-05-05 2022-07-08 天津博奥聚能生物科技有限公司 一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法和培养基
CN114982636A (zh) * 2022-06-28 2022-09-02 天津博奥聚能生物科技有限公司 一种提高菊叶薯蓣皂苷含量的培育方法
CN116267611B (zh) * 2023-03-14 2024-03-22 江苏省农业科学院 一种山药离体茎段ems诱变创制山药突变体的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101447892B1 (ko) * 2012-10-17 2014-10-08 김영생 개똥쑥을 이용한 닭 사료 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN107750946A (zh) 2018-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107750946B (zh) 一种适用于药用植物青蒿和薯蓣多倍体品种培育的方法
Israeli et al. In vitro culture of bananas
Kacar et al. Gelling agents and culture vessels affect in vitro multiplication of banana plantlets
CN100553445C (zh) 新铁炮百合制种亲本组培快繁和杂交制种方法
CN102204512B (zh) 细叶百合的组织培养方法
CN105230497A (zh) 一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法
CN101322474A (zh) 离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体毛泡桐的方法
CN113519394B (zh) 一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法
CN109156358B (zh) 一种德国鸢尾幼胚诱导胚性愈伤组织的方法
CN106386478A (zh) 一种楠木组培快繁方法
Ramakrishnan Nair et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in black pepper (Piper nigrum L.): I. Direct somatic embryogenesis from tissues of germinating seeds and ontogeny of somatic embryos
CN108739370B (zh) 一种利用成熟莲胚进行快繁的方法
CN108575747A (zh) 一种福建山樱花的不定芽再生方法
CN110651717A (zh) 一种菊花苗组培脱毒与快速繁殖的方法
Ranalli et al. Genotypic influence on in vitro induction, dormancy length, advancing age and agronomical performance of potato microtubers (Solanum tuberosum L.)
CN104488696B (zh) 一种金柑三倍体的育种方法
CN112715355A (zh) 一种安全高效的草地早熟禾诱变方法
CN106613993A (zh) 一种枳的组织培养再生苗的培养方法
CN114831025B (zh) 一种魔芋多倍体的快速诱导方法
CN110800609A (zh) 一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法
CN105359961B (zh) 一种通过幼胚离体挽救获得朱顶红‘苹果’杂交种的方法
Manawadu et al. Colchicine induced tetraploids of radish (Raphanus sativus L.).
CN111480574B (zh) 甜樱桃种内杂交f1代快速成苗的组培方法
CN103270951B (zh) 一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法
CN108719046B (zh) 一种诱导培育杂种枫香四倍体的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200424

Termination date: 20201018

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee