CN107737586A - 一种基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料及其制备方法 - Google Patents

一种基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种合成基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料的新方法，该方法简单快速，成本低廉。通过优化合成条件，得到的材料具有很高的比表面积，且表面含有丰富的氨基基团，表现出显著的亲水性。通过优化富集条件，该材料能够应用于高选择性富集生物样品中的糖肽。

Description

一种基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料及其制备方法
技术领域
本发明属于材料合成领域，具体涉及一种以石墨相薄层氮化碳为基底的苯硼酸糖肽富集材料及其制备方法。
背景技术
氮化碳的早期研究可以追溯到1834年，Berzelius和Liebig合成了一种聚合物并命名为“melon”。1922年Franklin对“melon”的结构进行了进一步研究，并提出了氮化碳(C3N4)的概念，他认为氮化碳(C3N4)是加热“melon”脱去氨基后得到的最终产物。此后一段时间鲜有对氮化碳的研究报道，直到1989年美国伯克利大学教授A.Y.Liu和M.L.Cohen以β-Si3N4晶体结构为模型，用C来替换Si并进行理论计算，发现β-C3N4具有与金刚石相似的硬度和导热性能。然而由于β-C3N4的单相sp3杂化使得其热力学稳定性较低，制备困难。
1996年Teter和Hemley采用第一性原理对氮化碳进行了重新计算，并提出氮化碳具有5种结构，即α-C3N4，β-C3N4，C-C3N4(立方体)，P-C3N4(赝立方)和g-C3N4(类石墨)。在氮化碳的这几种结构中，前面四种都是超硬材料，具有与金刚石相比拟的弹性模量，而g-C3N4(类石墨)是一种黄色粉末，被认为是常温常压状态下最稳定的结构相。g-C3N4是通过CN的sp2杂化组成了七嗪环(C6N7)结构单元，各个环之间通过端基的N原子相连，组成无穷大的π共轭平面(如图1示)，这种特殊的结构使得g-C3N4在光催化等领域具有广阔的应用前景，因此受到广泛关注。
石墨相氮化碳具有价格低廉、热稳定性和化学稳定性好、光电化学性能优异等优点，使得它适用于许多方面。例如石墨相氮化碳在光催化领域主要用于光催化分解水制氢、光催化降解有机污染物、光催化有机合成。此外，石墨相氮化碳因其具有无细胞毒性、良好的生物兼容性以及易官能团化的特点，还可以应用于抗菌材料、生物成像【Zhang,X.,Xie,X.,Wang,H.,Zhang,J.,Pan,B.,&Xie,Y.(2013).Enhanced photoresponsive ultrathingraphitic-phase C3N4nanosheets for bioimaging.Journal of the American ChemicalSociety,135(1),18】等方面。
由于高温下制备得到的石墨相氮化碳g-C3N4一般都具有块状结构，使其具有较低的比表面积以及较少的官能团暴露。在一般的二维薄层g-C3N4合成过程中，一些物理或化学的处理方法常用于合成过程。然而，由于氮化碳层间存在较强的π-π相互作用，一般的物理方法(如超声法)难以取得良好的效果。而化学的减薄方法(如浓酸处理法)会破坏氮化碳表面丰富的氨基团，这对富集糖肽是不利的。因此寻求一种新型的氮化碳剥层方法成为相关领域的研究热点。
近年来，硼酸及其衍生物在糖肽富集的研究中得到了迅速发展【Tian Y,Zhou T,Elliott S,Aebersold R,Zhang H,Nature Protocols 2007；2:334；Sparbier K,Koch S,Kessler I,Wenzel T,Kostrewa M,J.Biomol.Tech.2005；16；407.】，在硼酸基团和糖链的顺式1，2-二羟基之间能够形成稳固且可逆的共价键【Rawn JD,Lienhard GE,Biochemistry1974；13:3124】。通常情况下，硼酸材料富集糖肽或糖蛋白在碱性缓冲盐体系下进行，但非糖肽与硼酸盐之间存在的氢键作用可能降低该方法的选择性。降低或消除硼酸材料与非糖肽之间的氢键作用，同时增强糖肽与硼酸之间的相互作用对提高硼酸材料对糖肽的选择性是非常必要的。因此，迫切需要寻找一种修饰后的硼酸材料来提高硼酸材料对糖肽的选择性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料及其制备方法。本发明所提供的制备方法简单快速，成本低廉。制备出的材料表面含有丰富的氨基基团，表现出显著的亲水性，同时具有选择性富集糖肽的性质。
本发明所提供的基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料，具有螺旋状自组装片层花球结构，大小均一，直径为2-3μm，自组装片层较薄，花球分散均匀。
本发明所提供的基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料，是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
1)将三聚氰胺C3N3(NH2)3固体煅烧后均化处理，得到石墨相氮化碳(g-C3N4)粉末；
2)将石墨相氮化碳(g-C3N4)粉末分散于水中形成分散液，微波反应，对反应后体系进行离心处理，收集上层悬浮液，得到水相分散的薄层氮化碳(M-C3N4)分散液；
3)由水相分散的薄层氮化碳(M-C3N4)分散液制备载金的薄层氮化碳(Au@M-C3N4)；
4)将上述载金的薄层氮化碳(Au@M-C3N4)分散于甲醇溶液中，滴加4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液，滴加完毕后继续搅拌，离心分离，甲醇洗涤固体，干燥，得到氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)。
上述方法步骤1)中，所述煅烧的温度可为500-700℃，具体可为600℃，时间可为1-3h，具体可为2h。
所述煅烧的升温速率可为1-5℃/min。
具体可为以3℃/min的升温速率进行煅烧，可使三聚氰胺中未反应的部分进一步缩聚，提升聚合度，同时节约反应时间，节省能源。
所述煅烧可在空气条件下进行。
所述煅烧可在管式炉中进行。
上述方法步骤2)中，所述石墨相氮化碳粉末与水的配比可为：0.5-1.5mg：1mL。
所述分散液的浓度可为0.5-1.5mg/mL，以1mg/mL浓度为最佳，分散液总体积不超过300mL为宜。
分散液浓度和总体积适中可以使g-C3N4充分接受微波辐射，促使水分子进入g-C3N4片层间隙，有利于g-C3N4的剥层效果，而使本发明达到使用微波快速将块状g-C3N4制备为薄层状g-C3N4并保留其表面氨基基团的目的。
所述微波反应可在温控微波反应器中进行。
所述微波反应的温度可为80-100℃，具体可为95℃，时间可为8-16h，具体可为12h。
所述微波反应在100-300W磁力搅拌(300转/min)下进行。
所述离心的条件为1000转/min离心2min。
上述方法步骤3)中，所述载金的薄层氮化碳(Au@M-C3N4)的制备包括下述步骤：
向薄层氮化碳(M-C3N4)分散液中加入HAuCl4溶液，搅拌，超声处理，继续搅拌，离心分离保留固体，水洗固体至上清液无颜色；将洗净的固体分散至去离子水中，快速搅拌下缓慢滴加NaBH4溶液，搅拌下还原反应，离心分离保留固体，水洗，干燥，得到载金的薄层氮化碳(Au@M-C3N4)。
所述HAuCl4溶液的浓度可为10-40mM，具体可为10、20、30、40mM，优选以20mM浓度最佳。
所述薄层氮化碳(M-C3N4)分散液与HAuCl4溶液的体积比为100-300mL：100μL，具体可为100mL：100μL。
所述超声处理的时间可为10min，超声处理的功率可为1000-1600W。
所述继续搅拌的时间可为8h。
所述NaBH4溶液中NaBH4与HAuCl4溶液中HAuCl4的摩尔比可为0.5-1.5：1。
所述还原反应的时间可为1h。
上述方法步骤4)中，在搅拌条件下滴加4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液。
所述4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液的浓度为10-40mM，具体可为10、20、30、40mM，优选以20mM浓度最佳。
所述载金的薄层氮化碳与4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液中4-巯基苯硼酸的质量比为100：1-10。
所述4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液中，甲醇与乙酸的体积比可为6:1。
滴加完毕后继续搅拌6-12h。
所述甲醇洗涤固体可进行多次，具体可为3次。
所述干燥具体可为60℃下真空干燥。
上述基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料在选择性富集糖肽中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一目的是提供一种利用上述基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料选择性富集糖肽的方法。
本发明所提供的利用上述基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料选择性富集糖肽的方法，为：
首先使基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料与肽段样品接触，然后离心处理，冲洗富集了糖肽的富集材料以除去非糖肽，最后将富集的糖肽洗脱下来，即可。
上述方法中，冲洗以除去非糖肽的流动相为：水、乙腈和三氟乙酸的混合溶液。
洗脱糖肽的流动相为水和三氟乙酸的混合溶液。
冲洗非糖肽的流动相为水：乙腈：三氟乙酸体积比10-30:70-90:0.2的混合溶液，具体可为体积比30:70:0.2、25:75:0.2、20:80:0.2，15:85:0.2，12:88:0.2，10:90:0.2的混合溶液，其中三者体积比为20:80:0.2效果最佳。
洗脱糖肽的流动相为0.1％的三氟乙酸溶液。
所述肽段样品的样品浓度为0.1ng/mL-1mg/mL，富集温度为室温。
所述肽段样品来源包括组织、血液、尿液等生物样品中的蛋白或者糖蛋白标准品中的一种或多种蛋白混合。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的薄层石墨相氮化碳(M-C3N4)剥层方法比其他剥层方法更加快速有效，红外光谱测试分析表明剥层过程中并没有产生新的官能团，而3000-3500cm-1的不对称伸缩振动峰的增强表明在剥层过程中暴露出更多的氨基基团。
2、本发明提供的氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)无需水热反应即可获得大小均一，分散性良好的富集材料，操作方便，原料易得，生产成本低廉。
3、本发明提供的氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)具有选择性高，富集量大，操作简便可控等优点，适用于生物样本中糖肽的选择性富集。
附图说明
图1为g-C3N4的七嗪环(C6N7)结构单元示意图。
图2为本发明实施例1所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)(a)以及薄层石墨相氮化碳(M-C3N4)(b)的扫描电镜图。
图3为本发明实施例1所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及薄层石墨相氮化碳(M-C3N4)红外光谱图。
图4为本发明实施例1所制备的氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)不同尺度下的扫描电镜图。
图5为本发明实施例1所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)的XRD衍射图。
图6为本发明实施例1所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)的XPS能谱图。
图7为本发明所制备的薄层氮化碳(M-C3N4)、氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)以及该材料在碱性条件下富集IgG后的红外光谱图。
图8为本发明所制备氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)富集IgG糖肽前后的MALDI质谱谱图。图a为未富集的IgG肽段质谱谱图，图b为富集后的IgG肽段质谱谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、糖肽富集材料的制备
(1)将三聚氰胺C3N3(NH2)3固体在管式炉中空气条件下600℃煅烧，升温速度为3℃/min，保温2h，自然冷却后均化处理得到淡黄色粉末；
(2)上述粉末200mg分散于200mL去离子水中形成分散液，在温控微波反应器中95℃，200W磁力搅拌300转/min，加冷凝水回流，微波反应12h，反应后冷却至室温，所得分散液1000转/min离心2min，弃沉淀，留上层悬浮液，得到乳白色悬浮分散液；
(3)将上述薄层氮化碳(M-C3N4)分散液100mL，磁力搅拌下加入100μL 20mM HAuCl4溶液，在功率1200W下超声处理10min，300转/min搅拌8h，离心分离，水洗固体至上清液无颜色，分散至去离子水中，快速搅拌下缓慢滴加200μL新制10mM NaBH4溶液(4℃预制)，继续搅拌1h，离心分离，水洗固体至上清液无气泡，60℃真空干燥，得到载金的薄层氮化碳(Au@M-C3N4)，淡紫色固体粉末；
(4)将上述载金的薄层氮化碳分50mg散于50mL甲醇溶液，300转/min搅拌条件下滴加200μL20mM4-巯基苯硼酸甲醇乙酸溶液(甲醇与乙酸体积比6:1)，继续搅拌6h后，离心分离，甲醇洗涤固体3次，60℃真空干燥，得到氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)，灰白色固体粉末。
图1为g-C3N4的七嗪环(C6N7)结构单元示意图。
图2为本实施例所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)(a)以及薄层石墨相氮化碳(M-C3N4)(b)的扫描电镜图。
由图可知，所制备的薄层石墨相氮化碳(M-C3N4)片层分散均匀，没有呈现出块状结构。
图3为本实施例所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及薄层石墨相氮化碳(M-C3N4)红外光谱图。
由图可知石墨相氮化碳在微波剥层过程中并没有产生新的官能团，而3000-3200cm-1的不对称峰为-NH2以及-NH的伸缩振动峰，该峰位的增强表明在剥层过程中暴露出更多的氨基基团。
图4为本实施例所制备的氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)不同尺度下的扫描电镜图。
由图可知，本材料分散性好，形貌一致，大小均匀，呈现为片层自组装螺旋形花球结构，直径约为2-3μm。
图5为本实施例所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)的XRD衍射图。
由图可知，10-20°衍射峰消失以及27.6°的衍射峰降低均说明氮化碳已经不再是块状结构，而嫁接的有机官能团也使得整体峰度有所下降。
图6为本实施例所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)的XPS能谱图。
由图可知，在小于200eV出现的新峰位分别表示B，S，Au元素，精细扫描Au的XPS能谱，经分析后发现有明显的Au-S的结合峰，说明负载在氮化碳基底上的Au已经有效结合了4-巯基苯硼酸。
表1.石墨相氮化碳(g-C3N4)以及氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)的原子比
表1展示了本实施例所制备的石墨相氮化碳(g-C3N4)以及氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)的原子比，石墨相氮化碳(g-C3N4)中C、N原子比为40.87:56.74，经计算约为3:4，氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)中C原子的比例明显增加是源于苯硼酸中苯环碳骨架，而B原子的原子比为4.17也说明了4-巯基苯硼酸在基底材料上较高的结合量。
实施例2、人免疫球蛋白(IgG)糖肽富集实验
(1)人IgG溶解在50mM碳酸氢铵溶液中配成浓度为中配成浓度为1mg·mL-1的蛋白质溶液。在95℃下直接加热变性10min。用10mM二硫苏糖醇溶液在56℃下还原1h后，用50mM碘乙酰胺溶液在暗处烷基化处理1h。以1:50(w/w)的酶/蛋白质比例在溶液中加入胰蛋白酶，在37℃下孵育16h来酶解消化标准蛋白质样品。所有蛋白质酶解液经过Sep-Pak脱盐柱除盐后使用真空冷冻离心机冻干，并储存在-20℃备用。
(2)将IgG酶切肽段溶于50～500μL含有80％～90％乙腈和0.2％三氟乙酸的溶液中，按1:50(w/w)的肽段/富集材料比例加入氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)，孵育1～2h离心弃上层溶液，收集沉淀。
(3)使用50～500μL含有80％～90％乙腈和0.2％三氟乙酸的溶液洗涤沉淀，孵化0.5～1h后，离心弃上层溶液，收集沉淀，重复此步骤1～10次。
(4)收集的沉淀加入50～500μL含有0.1％三氟乙酸溶液洗脱富集材料结合的糖肽，孵化0.5～1h后，离心并收集上清，重复此步骤1～10次。
(5)收集的上清冻干后用5～50μL含有0.1％三氟乙酸溶液复溶，取1μL点靶并用MALDI-TOF质谱仪进行分析。
图7为本实施例所制备的薄层氮化碳(M-C3N4)、氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)以及该材料在碱性条件下富集IgG后的红外光谱图。图a中1330cm-1与1465cm-1的增强峰分别为-B(OH)2和B-C的振动峰，3000cm-1的小宽峰为苯环的振动峰，800cm-1附近的振动峰为苯环的对位取代峰，以上峰位均说明4-巯基苯硼酸很好结合在氮化碳基底上。图b中材料在富集IgG后，1330cm-1的峰强度明显下降，3000-3200cm-1的不对称峰明显向低波数段移动，说明氨基和羟基有明显的络合作用，以上变化说明基底上的氨基和苯硼酸上的羟基对于糖肽均起到了显著的富集作用。
按照上述实施例2的实验条件可以利用该材料(MPBA-Au@M-C3N4)选择性富集单个糖蛋白(IgG)中的糖肽。图8为本实施例所制备氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)富集IgG糖肽前后的MALDI质谱谱图。图a中可以观察到在经过该材料富集前，质谱图被大量高强度的非糖基化肽段的信号峰占据，仅能观察到具有较低强度的4条糖肽信号峰。图b中，在经MPBA-Au@g-C3N4复合材料富集后，可以轻易检测到32条可识别的N-糖肽信号峰，S/N比和质谱峰信号强度显著增加，且谱图背景清晰。上述结果表明，MPBA-Au@g-C3N4复合材料在糖肽富集方面表现出优良的性能。
实施例3、人血浆全蛋白糖肽富集实验
(1)取1～5μL人血浆溶解在50mM碳酸氢铵溶液，在95℃下直接加热变性10min。加入到30KD超滤管中，用20mM二硫苏糖醇溶液在37℃下还原4h后，13000转/min离心15min，再用50mM碘乙酰胺溶液在暗处烷基化处理30min，3000转/min离心15min，再次用20mM二硫苏糖醇溶液反应15min，13000转/min离心15min。加入200μL的50mM碳酸氢铵溶液以洗涤，13000转/min离心15min，重复洗涤3次。按1:50(w/w)的酶/蛋白质比例在溶液中加入胰蛋白酶，在37℃下孵育16h来酶解消化人血浆蛋白质样品。所有蛋白质酶解液经过Sep-Pak脱盐柱除盐后使用真空冷冻离心机冻干，并储存在-20℃备用。
(2)将全蛋白酶切肽段溶于50～500μL含有80％～90％乙腈和0.2％三氟乙酸的溶液中，按1:50(w/w)的肽段/富集材料比例加入氮化碳基底的苯硼酸材料(MPBA-Au@M-C3N4)，孵育1～2h，离心弃上层溶液，收集沉淀。
(3)使用50～500μL含有80％～90％乙腈和0.2％三氟乙酸的溶液洗涤沉淀，孵化0.5～1h后，离心弃上层溶液，收集沉淀，重复此步骤1～10次。
(4)收集的沉淀加入50～500μL含有0.1％三氟乙酸溶液洗脱富集材料结合的糖肽，孵化0.5～1h后，离心并收集上清，重复此步骤1～10次。
(5)收集的上清冻干后加入50～500μL的50mM碳酸氢铵溶液以及5U的PNGase F蛋白酶，在37℃下反应16h。
(6)酶解液经过Sep-Pak脱盐柱除盐后使用真空冷冻离心机冻干，并储存在-20℃备用。
(7)用5～50μL含有0.1％甲酸溶液复溶，使用LC-MS/MS质谱仪进行分析。
表2.MPBA-Au@M-C3N4富集鉴定人血清酶解产物中的糖蛋白和肽段序列
注：N-糖基化位点用“N#”表示。
按照上述实施例3的实验条件可以利用该材料(MPBA-Au@M-C3N4)选择性富集生物样本(人血浆)中的糖肽。如表2所示，通过该材料富集到209个N-糖蛋白，包含463条非冗余N-糖肽和501个N-糖基化位点，明显高于目前已报道的新材料的富集效果(140个N-糖蛋白，和424条非冗余N-糖肽)【Sun,N.,Wang,J.,Yao,J.,&Deng,C.H.(2017).Hydrophilicmesoporous silica materials for highly specific enrichment of n-linkedglycopeptide.Analytical Chemistry.】，表明该材料在复杂生物样品糖肽富集中具有实用性和优异性。

Claims (10)

1.一种基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料，具有螺旋状自组装片层花球结构，大小均一，直径为2-3μm，自组装片层较薄，花球分散均匀。
2.制备权利要求1所述的基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料的方法，包括：
1)将三聚氰胺固体煅烧后均化处理，得到石墨相氮化碳粉末；
2)将石墨相氮化碳粉末分散于水中形成分散液，微波反应，对反应后体系进行离心处理，收集上层悬浮液，得到水相分散的薄层氮化碳分散液；
3)由水相分散的薄层氮化碳分散液制备载金的薄层氮化碳；
4)将上述载金的薄层氮化碳分散于甲醇溶液中，滴加4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液，滴加完毕后继续搅拌，离心分离，甲醇洗涤固体，干燥，得到氮化碳基底的苯硼酸材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述煅烧的温度为500-700℃，时间为1-3h；
所述煅烧的升温速率为1-5℃/min。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述石墨相氮化碳粉末与水的配比可为：0.5-1.5mg：1mL；
所述微波反应在温控微波反应器中进行；
所述微波反应的温度为80-100℃，时间为8-16h；
所述微波反应在100-300W磁力搅拌300转/min下进行。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于：
步骤3)中，所述载金的薄层氮化碳的制备包括下述步骤：
向薄层氮化碳分散液中加入HAuCl4溶液，搅拌，超声处理，继续搅拌，离心分离保留固体，水洗固体至上清液无颜色；将洗净的固体分散至去离子水中，快速搅拌下缓慢滴加NaBH4溶液，搅拌下还原反应，离心分离保留固体，水洗，干燥，得到载金的薄层氮化碳。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述HAuCl4溶液的浓度为10-40mM；
所述薄层氮化碳分散液与HAuCl4溶液的体积比为100-300：100μL；
所述超声处理的时间为10min，超声处理的功率为1000-1600W；
所述继续搅拌的时间为8h；
所述NaBH4溶液中NaBH4与HAuCl4溶液中HAuCl4的摩尔比为0.5-1.5：1；
所述还原反应的时间为1h。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液的浓度为10-40mM；
所述载金的薄层氮化碳与4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液中4-巯基苯硼酸的质量比为100：1-10；
所述4-巯基苯硼酸的甲醇乙酸溶液中，甲醇与乙酸的体积比为6:1；
滴加完毕后继续搅拌6-12h。
8.权利要求1所述的基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料在选择性富集糖肽中的应用。
9.一种利用权利要求1所述的基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料选择性富集糖肽的方法，为：
首先使基于氮化碳基底的苯硼酸糖肽富集材料与肽段样品接触，然后离心处理，冲洗富集了糖肽的富集材料以除去非糖肽，最后将富集的糖肽洗脱下来，即可。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：冲洗以除去非糖肽的流动相为：水、乙腈和三氟乙酸的混合溶液；
洗脱糖肽的流动相为水和三氟乙酸的混合溶液；
所述肽段样品的样品浓度为0.1ng/mL-1mg/mL，富集温度为室温。
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