CN107727758A - 一种测定痕量硒元素形态的方法及其检测富硒饲料的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饲料质量检测技术领域,具体涉及一种富硒饲料中硒形态的测定方法,更具体涉及一种基于超声探针辅助酶解技术结合高效液相色谱‑氢化物发生原子荧光光谱(HPLC‑HG‑AFS)测定富硒饲料中硒形态的方法。该方法能够较为准确的对提取出的硒元素进行含量测定,能有效分离并测定富硒饲料中常含有5种形态硒物质的含量,以此能够准确分析富硒饲料中的硒元素形态,有助于快速安全的对富硒饲料产品进行选择运用。
Description
技术领域
本发明属于饲料质量检测技术领域,具体涉及一种富硒饲料中硒形态的测定方法,更具体涉及一种基于超声探针辅助酶解技术结合高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)测定富硒饲料中硒形态的方法。
背景技术
硒(Selenium,Se)是人和动物所必需的14种微量元素之一,是硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和含硒酶(如谷胱甘肽过氧化物酶)的必需组分,并在机体抗癌、抗氧化等方面发挥着重要作用。据研究,动物体内硒缺乏将直接影响骨骼、肝脏、甲状腺等重要器官的生理功能,可导致克山病、大骨节病等一系列疾病。因此,在饲料配方中合理补充硒,可有效预防相关疾病的发生。但是,目前市场上的富硒饲料产品种类繁多,并因其在生产过程中添加硒源的种类(无机硒源或有机硒源)和添加量不同以及使用菌种的差别,从而导致最终富硒饲料产品中硒的含量及存在形式都有很大的差别。
由于硒是一种典型的双功能元素,即可以无机硒和有机硒的形态存在,其在动物体内的生物利用度、有效性、毒性以及代谢规律等不仅与硒的总量有关,而且与硒存在的化学形态也是密切相关的。饲料样品中硒的形态主要有硒酸[Selenate,Se(VI)]、***[Selenite,Se(IV)]、硒代蛋氨酸(Selenomethionine,SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine,MeSeCys)、硒代胱氨酸(Selenocystine,SeCys2)、硒代乙硫氨酸(Selenoethionine,SeEt)等。一般情况下,无机硒的含硒量较高、且价格低廉,但其吸收和利用率却较低、而且毒性较大,欧美等发达国家早已禁止在食品动物中添加***钠等无机硒;而有机硒则含硒量较低、且价格高,但其生物利用率高,更易于作为添加剂使用。目前富含有机硒的酵母(酵母硒)已被列入《饲料添加剂品种目录(2013)》,并作为添加剂广泛应用于饲料产品中。因此,仅仅对富硒饲料中总硒的含量予以测定,已远不能满足硒安全性的评价要求,而对富硒饲料中硒的形态进行准确分析则显得更为必要。然而,饲料样品往往存在基质复杂、硒含量低、有机硒多以蛋白结合态存在、硒形态在分析过程中可能发生转变等问题,严重影响了对富硒饲料中硒形态的判断。因此,饲料企业及养殖户对于如何选择安全、有效的富硒饲料产品存在诸多疑惑,进而对此类产品中硒含量和硒形态测定提出了更高的要求。
目前,我国饲料行业通行的测定有机硒的方法主要是差减法,其基本原理是利用有机硒和无机硒在水中的溶解性不同,无机硒易溶于水,有机硒则由于结合在硒蛋白中而不溶于水,借此可用水将饲料中的无机硒提取出来,通过分别测定总硒和无机硒的含量,二者相减即得到有机硒的含量。如中国专利CN103884785A公开了一种硒的检测方法,其通过分别测定总硒和无机硒的含量,然后利用差减法得到样品中有机硒的含量。但是,该方法只能分别得到无机硒和有机硒的总量,而对于具体的硒形态并不清楚,且由于部分胞内硒可能是无机硒,但因为在细胞内而不能够被水溶出而导致测定的结果并不准确。
硒形态分析属于前沿研究领域,当前国内外均无相应的检测方法标准,已有的硒形态分析方法主要是针对富硒保健品、富硒真菌和水产品等,专门针对饲料样品中硒形态的分析检测方法则尚未见报道。如中国专利CN102928500A公开的利用微波消解-ICP-MS法直接测定海产品中有机硒、蛋白硒或多糖硒的检测方法,以及中国专利CN103217407A公开的富硒大米中有机硒、蛋白硒、多糖硒或RNA硒含量测定方法,均是利用不同形态硒在各溶液中的溶解性不同,分别提取样品中的有机硒、蛋白硒、多糖硒和RNA硒,然后使用ICP-MS测定各组分总硒含量。但该方法不仅测定结果不精确,而且只能确定硒与何种生物大分子进行了结合,并不能对有机硒、无机硒进行分离,从而无法确切得出样品中不同形态硒的含量。中国专利CN105259284A所公开的富硒螺旋藻中硒形态测定的方法、中国专利CN105181850A所公开的富硒益生菌中硒形态测定的方法、以及中国专利CN 105277636A所公开的高硒真菌中硒形态测定的方法,均是分别利用溶菌酶对样品进行破壁处理,然后再采用分布连续提取的方式进行酶解后HPLC-HG-AFS测定。但是,该方法处理过程较为复杂,尤其酶解时间长达24h,并且在处理过程中极易发生硒形态之间的转变,导致测定结果并不能够真实反映样品中硒的形态。
因此,如何对生物样品中痕量硒元素及其形态进行分析,已成为分析化学中亟待解决的一个富有挑战性的课题,也是目前分析科学的研究热点之一。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种富硒饲料中硒形态的测定方法,以解决现有技术中无法准确测定及分析富硒饲料中硒形态的问题。
为解决上述技术问题,本发明所述的一种测定痕量硒元素形态的方法,包括如下步骤:
(1)酶解提取:取待测样品加入蛋白酶XIV和提取溶剂Tris缓冲液,混匀并进行酶解,取酶解液离心并过膜得到待测样品溶液;
(2)硒形态测定:采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术,对待测样品中硒酸Se(VI)、***Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代胱氨酸(SeCys2)五种硒形态的含量进行在线检测。
所述步骤(2)中,所述高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱中,所述色谱条件为:
色谱柱:Hamilton阴离子交换柱PRP-X100,4.1mm×250mm,10μm;
流动相:20mmol/L磷酸氢二铵缓冲液,以用甲酸调pH至6.0;
流速:1.0mL/min;
柱温:30℃;
进样量:100μL;
分析时间:15-30min。
所述步骤(2)中,所述高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱中,所述氢化物发生器条件:
载液:7%盐酸溶液;
还原剂:2%硼氢化钾溶液,并含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾;
所述载气和屏蔽气均为高纯度氩气,并控制载气流速300mL/min,屏蔽气流速600mL/min。
所述步骤(2)中,所述高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱中,所述原子荧光检测器条件为:硒高性能空心阴极灯;控制负高压为270V;控制炉温200℃;控制主灯电流120mA、辅灯电流120mA;控制原子化器高度9.0mm。
所述步骤(2)中,所述在线检测步骤中,还包括在整个过程中打开在线紫外消解灯的步骤。
所述步骤(2)中,所述待测样品中硒酸Se(VI)、***Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代胱氨酸(SeCys2)五种硒形态的含量采用外标法定量测定,具体计算公式为:
X——样品中硒形态的含量,mg/kg;
Pi——样品溶液中硒形态的峰面积;
Cst——硒形态标准溶液的浓度,μg/mL;
V——样品溶液的稀释体积,mL;
Vst——标准溶液的进样体积,μL;
m——样品质量,g;
Pst——硒形态标准溶液的峰面积;
Vi——样品溶液的进样体积,μL。
所述步骤(1)中,所述酶解步骤为超声探针辅助酶解,酶解时间为45-75s。
所述步骤(1)中,蛋白酶XIV的添加量与所述待测样品的质量比为1:2-10。
所述步骤(1)中,所述提取溶剂Tris缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH 7.0,所述待测样品与所述提取溶剂Tris缓冲液的料液比为1:100-1000。所述料液比的单位为g/ml的关系。
本发明还公开了所述的测定痕量硒元素形态的方法用于检测富硒饲料中硒元素形态的用途。
本发明所述测定富硒饲料中痕量硒元素形态的方法,以高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术,对酶解后的富硒饲料样品进行硒元素形态检测,该方法能够较为准确的对提取出的硒元素进行含量测定,能有效分离并测定富硒饲料中常含有5种形态硒物质的含量,以此能够准确分析富硒饲料中的硒元素形态,有助于快速安全的对富硒饲料产品进行选择运用。
本发明所述方法,采用超声探针辅助酶解,其超声波输出能量可达普通超声波水浴的100-200倍,因而能够极大地加速酶促反应,提取时间仅需45-75s即可将硒蛋白彻底水解,而且蛋白酶XIV使用量少,节约成本,提取时间短、效率高;同时,采用pH中性的Tris缓冲液,酶解体系条件温和,且提取时间短,从而保证硒形态在提取过程中不会发生转变,整个方法操作简便、快速,提取效率高,重现性好。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中,
图1为本发明所述超声探针辅助酶解操作的装置模拟图;
图2为本发明所述硒形态混合标准溶液的分离谱图,按出峰顺序分别为SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet和Se(VI)的保留时间;
图3为本发明实施例1中富硒酵母饲料添加剂标准物质SELM-1的硒形态测定结果色谱图,按出峰顺序分别为MeSeCys、Se(IV)、SeMet的保留时间;
图4为本发明实施例2富硒饲料添加剂的硒形态测定结果色谱图,按出峰顺序分别为SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet的保留时间;
图5为本发明实施例3富硒饲料添加剂的硒形态测定结果色谱图,按出峰顺序分别为SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet的保留时间;
图中附图标记表示为:1-超声波发生器,2-超声探针,3-消解管,4-样品。
具体实施方式
如图1所示,本发明所使用超声探针模拟装置图见图1所示,本发明所述装置不同于实验室常规的超声波清洗仪,为一种超声波发生器1连接直径为3mm的钛合金超声探针2。使用时,将所述待测样品4置于消解管3中,利用所述超声发生器1控制超声探针2,对其进行酶解处理45-75s。实施例1富硒酵母饲料添加剂标准物质SELM-1中硒形态测定
本实施例使用从加拿大National Research Council of Canada购买的富硒酵母饲料添加剂标准物质SELM-1进行方法验证,该标准物质经过了国际实验室间比对,其标示总硒含量为2031±70mg/kg,硒代蛋氨酸(SeMet)含量为3190±260mg/kg。
本实施例所述测定富硒饲料中痕量硒元素形态的方法,具体包括如下步骤:
(1)酶解提取:称取20-50mg富硒饲料样品于50mL离心管中,加入10mg蛋白酶XIV和25mL Tris缓冲液,旋涡混匀1min;将超声探针置于样品溶液中,设定输出功率为50%,室温下超声探针辅助酶解60s;取出酶解处理后的样品溶液在4℃下,10000r/min离心5min,上清液过0.2μm水相滤膜,制得待测样品溶液;
所述蛋白酶XIV为来自于灰色链霉菌属(Streptomyces griseus)、活力≥3500U/g的非特异性蛋白酶,下同;
(2)硒形态测定:采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术,对待测样品中硒形态进行测定;HPLC-HG-AFS仪器条件设置如下:
色谱条件:Hamilton阴离子交换柱PRP-X100(4.1mm×250mm,10μm);柱温30℃;流动相为20mmol/L磷酸氢二铵缓冲液,用甲酸调pH至6.0;流速1.0mL/min;进样量100μL;分析时间为15-30min;
氢化物发生器条件:载液:7%盐酸溶液;还原剂:2%硼氢化钾溶液,且含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾;载气、屏蔽气均为高纯氩气,载气流速300mL/min,屏蔽气流速600mL/min;
原子荧光检测器条件:硒高性能空心阴极灯;负高压:270V;炉温:200℃;主灯电流:120mA;辅灯电流:120mA;原子化器高度:9.0mm;
开机后按照上述条件对液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪进行设置,待仪器稳定后,首先进标准溶液(浓度1.0μg/mL),然后测定步骤(1)中超声探针辅助酶解处理好的样品溶液。
如图2所示,在上述条件下SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet和Se(VI)的出峰时间分别为2.6min、3.4min、4.5min、6.2min和15.4min,待测样品中的SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化在±5%之内即认为是该待测物质。图3给出了待测样品中硒形态测定结果色谱图,显示本实施例所述方法可测定该富硒饲料产品中存在的3种硒形态,根据峰面积计算可得到各形态的含量及占总硒的比例。
利用外标法定量,采用峰面积或峰高进行计算,计算样品中各硒形态的含量,所述待测样品中硒酸Se(VI)、***Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代胱氨酸(SeCys2)五种硒形态的含量采用外标法定量测定,具体计算公式为:
X——样品中硒形态的含量,mg/kg;
Pi——样品溶液中硒形态的峰面积;
Cst——硒形态标准溶液的浓度,μg/mL;
V——样品溶液的稀释体积,mL;
Vst——标准溶液的进样体积,μL;
m——样品质量,g;
Pst——硒形态标准溶液的峰面积;
Vi——样品溶液的进样体积,μL。
按照上述计算方法对待测样品中硒元素形态和含量进行计算,富硒饲料添加剂中硒形态测定结果如下表1所示,所述方法的线性、准确度和精密度结果如下表2-3所示。
表1富硒酵母饲料添加剂标准物质SELM-1中硒形态测定结果(n=3)
从表1可以看出,采用本发明方法测定SeMet和总硒含量均与标示值相吻合,MeSeCys、Se(IV)和SeMet之和占总硒的比例为95.1%,表明本发明方法对硒形态的提取效率非常理想。
表2方法的加标回收率和批内、批间变异系数
从表2可以看出,本发明方法的平均回收率为85.8-101.2%,变异系数小于9.6%,表明本发明超声探针辅助酶解结合HPLC-HG-AFS测定硒形态准确可靠。
表3方法的线性、检出限和定量限
从表3可以看出,本发明方法的线性关系良好(R2≥0.999)、灵敏度高(定量限仅为5-50μg/kg)。
实施例2某知名品牌富硒饲料添加剂中硒形态测定
本实施例所述测定富硒饲料中痕量硒元素形态的方法,具体包括如下步骤:
(1)酶解提取:称取20-50mg富硒饲料样品于50mL离心管中,加入10mg蛋白酶XIV和25mL Tris缓冲液,旋涡混匀1min;将超声探针置于样品溶液中,设定输出功率为50%,室温下超声探针辅助酶解60s;取出酶解处理后的样品溶液在4℃下,10000r/min离心5min,上清液过0.2μm水相滤膜,制得待测样品溶液;
(2)硒形态测定:采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术,对待测样品中硒形态进行测定;HPLC-HG-AFS仪器条件设置如下:
色谱条件:Hamilton阴离子交换柱PRP-X100(4.1mm×250mm,10μm);柱温30℃;流动相为20mmol/L磷酸氢二铵缓冲液,用甲酸调pH至6.0;流速1.0mL/min;进样量100μL;分析时间为15-30min;
氢化物发生器条件:载液:7%盐酸溶液;还原剂:2%硼氢化钾溶液,含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾;载气、屏蔽气均为高纯氩气,载气流速300mL/min,屏蔽气流速600mL/min;
原子荧光检测器条件:硒高性能空心阴极灯;负高压:270V;炉温:200℃;主灯电流:120mA;辅灯电流:120mA;原子化器高度:9.0mm。
开机后按照上述条件对液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪进行设置,待仪器稳定后,首先进标准曲线样品(浓度1.0μg/mL),然后测定超声探针辅助酶解处理好的样品溶液。
如图2所示,在上述条件下SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet和Se(VI)的出峰时间分别为2.6min、3.4min、4.5min、6.2min和15.4min,待测样品中的SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化在±5%之内即认为是该待测物质。图4给出了待测样品中硒形态测定结果色谱图,显示本实施例所述方法可测定该富硒饲料产品中存在的4种硒形态,根据峰面积计算可得到各形态的含量及占总硒的比例。
利用外标法定量,采用峰面积或峰高进行计算,计算样品中各硒形态的含量,具体计算方法同实施例1。
按照上述计算方法对待测样品中硒元素形态和含量进行计算,富硒饲料添加剂中硒形态测定结果如下表4所示。
表4某知名品牌富硒饲料添加剂中硒形态测定结果(n=3)
硒形态 | SeCys2 | MeSeCys | Se(IV) | SeMet | Se(VI) | 总硒 |
测定值(mg/kg) | 3019±72 | 559±22 | 86±6.7 | 428±9.6 | — | 1978±37 |
占总硒比例(%) | 72.2 | 12.3 | 4.3 | 8.7 | — | — |
从表4可以看出,采用本发明方法测定SeCys2、MeSeCys、Se(IV)和SeMet之和占总硒的比例为97.5%,表明本发明方法对硒形态的提取效率非常理想。
实施例3某品牌富硒饲料添加剂硒形态测定
本实施例所述测定富硒饲料中痕量硒元素形态的方法,具体包括如下步骤:
(1)酶解提取:称取20-50mg富硒饲料样品于50mL离心管中,加入10mg蛋白酶XIV和25mL Tris缓冲液,旋涡混匀1min。将超声探针置于样品溶液中,设定输出功率为50%,室温下超声探针辅助酶解60s。取出酶解处理后的样品溶液在4℃下,10000r/min离心5min,上清液过0.2μm水相滤膜,制得待测样品溶液;
(2)硒形态测定:采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术,对待测样品中硒形态进行测定;HPLC-HG-AFS仪器条件设置如下:
色谱条件:Hamilton阴离子交换柱PRP-X100(4.1mm×250mm,10μm);柱温30℃;流动相为20mmol/L磷酸氢二铵缓冲液,用甲酸调pH至6.0;流速1.0mL/min;进样量100μL;分析时间为15-30min;
氢化物发生器条件:载液:7%盐酸溶液;还原剂:2%硼氢化钾溶液,含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾;载气、屏蔽气均为高纯氩气,载气流速300mL/min,屏蔽气流速600mL/min;
原子荧光检测器条件:硒高性能空心阴极灯;负高压:270V;炉温:200℃;主灯电流:120mA;辅灯电流:120mA;原子化器高度:9.0mm;
开机后按照上述条件对液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪进行设置,待仪器稳定后,首先进标准曲线样品(浓度1.0μg/mL),然后测定超声探针辅助酶解处理好的样品溶液。
如图2所示,在上述条件下SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet和Se(VI)的出峰时间分别为2.6min、3.4min、4.5min、6.2min和15.4min,待测样品中的SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化在±5%之内即认为是该待测物质。图5给出了待测样品中硒形态测定结果色谱图,显示本实施例所述方法可测定该富硒饲料产品中存在的4种硒形态,根据峰面积计算可得到各形态的含量及占总硒的比例。
利用外标法定量,采用峰面积或峰高进行计算,计算样品中各硒形态的含量,具体计算方法同实施例1。
按照上述计算方法对待测样品中硒元素形态和含量进行计算,富硒饲料添加剂中硒形态测定结果如下表4所示。
表5某品牌富硒饲料添加剂中硒形态测定结果(n=3)
硒形态 | SeCys2 | MeSeCys | Se(IV) | SeMet | Se(VI) | 总硒 |
测定值(mg/kg) | 1019±72 | 389±32 | 566±12 | 2274±39 | — | 2214±11 |
占总硒比例(%) | 21.8 | 7.6 | 25.6 | 41.4 | — | — |
从表5可以看出,采用本发明方法测定SeCys2、MeSeCys、Se(IV)和SeMet之和占总硒的比例为96.4%,表明本发明方法对硒形态的提取效率非常理想。
综上所述,本发明能够快速、高效的提取富硒饲料样品中的硒形态,从而实现对各种硒形态的准确分析,对于指导饲料企业及畜禽养殖业合理使用硒源具有重要意义。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)酶解提取:取待测样品加入蛋白酶XIV和提取溶剂Tris缓冲液,混匀并进行酶解,取酶解液离心并过膜得到待测样品溶液;
(2)硒形态测定:采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术,对待测样品中硒酸Se(VI)、***Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代胱氨酸(SeCys2)五种硒形态的含量进行在线检测。
2.根据权利要求1所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱中,所述色谱条件为:
色谱柱:Hamilton阴离子交换柱PRP-X100,4.1mm×250mm,10μm;
流动相:20mmol/L磷酸氢二铵缓冲液,以用甲酸调pH至6.0;
流速:1.0mL/min;
柱温:30℃;
进样量:100μL;
分析时间:15-30min。
3.根据权利要求1或2所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱中,所述氢化物发生器条件:
载液:7%盐酸溶液;
还原剂:2%硼氢化钾溶液,并含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾;
所述载气和屏蔽气均为高纯度氩气,并控制载气流速300mL/min,屏蔽气流速600mL/min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱中,所述原子荧光检测器条件为:硒高性能空心阴极灯;控制负高压为270V;控制炉温200℃;控制主灯电流120mA、辅灯电流120mA;控制原子化器高度9.0mm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述在线检测步骤中,还包括在整个过程中打开在线紫外消解灯的步骤。
6.根据权利要求1-5任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述待测样品中硒酸Se(VI)、***Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代胱氨酸(SeCys2)五种硒形态的含量采用外标法定量测定,具体计算公式为:
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<mi>X</mi>
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<mi>P</mi>
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<mi>t</mi>
<mo>&times;</mo>
<mi>V</mi>
<mi>i</mi>
</mrow>
</mfrac>
</mrow>
X——样品中硒形态的含量,mg/kg;
Pi——样品溶液中硒形态的峰面积;
Cst——硒形态标准溶液的浓度,μg/mL;
V——样品溶液的稀释体积,mL;
Vst——标准溶液的进样体积,μL;
m——样品质量,g;
Pst——硒形态标准溶液的峰面积;
Vi——样品溶液的进样体积,μL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述酶解步骤为超声探针辅助酶解,酶解时间为45-75s。
8.根据权利要求1-7任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,蛋白酶XIV的添加量与所述待测样品的质量比为1:2-10。
9.根据权利要求1-8任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述提取溶剂Tris缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH 7.0,所述待测样品与所述提取溶剂Tris缓冲液的料液比为1:100-1000。
10.权利要求1-9任一项所述的测定痕量硒元素形态的方法用于检测富硒饲料中硒元素形态的用途。
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