CN107709565A - 聚类异戊二烯、载体、转基因植物的制造方法，充气轮胎的制造方法及橡胶制品的制造方法 - Google Patents

聚类异戊二烯、载体、转基因植物的制造方法，充气轮胎的制造方法及橡胶制品的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种聚类异戊二烯的制造方法，其能够提高橡胶颗粒的橡胶合成活性，增加天然橡胶的产量。本发明涉及体外生产聚类异戊二烯的方法，其涉及使用编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo‑B受体(NgBR)家族蛋白的基因，进一步地涉及使用与通过这些基因编码的蛋白质结合的橡胶颗粒；或生产聚类异戊二烯的方法，其包括向植物中引入一种载体，其中具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子与编码CPT家族蛋白的基因和编码NgBR家族蛋白的基因相连接，从而表达由在乳管中特异性的基因编码的蛋白质。

Description

聚类异戊二烯、载体、转基因植物的制造方法，充气轮胎的制 造方法及橡胶制品的制造方法
技术领域
本发明涉及聚类异戊二烯，载体，转基因植物的制造方法，充气轮胎的制造方法以及橡胶制品的制造方法。
背景技术
目前，用于工业橡胶制品的天然橡胶(聚类异戊二烯的一个实例)是通过培育其乳管细胞生物合成天然橡胶的产胶植物例如属于大戟科(Euphorbiaceae)的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)或属于桑科(Moraceae)的印度橡胶树(Ficus elastica)，并手工从植物中收取天然橡胶而获得的。
目前，巴西橡胶树实际上是用于工业橡胶制品的天然橡胶的唯一来源。巴西橡胶树是一种只能在某些地区种植的植物，包括东南亚和南美洲。此外，巴西橡胶树从种植到足够成熟至能生产橡胶需要约七年，并且仅在二十至三十年内能生产天然橡胶。天然橡胶的需求预计会在未来增加，特别是在发展中国家，但由于上述原因，难以大大增加巴西橡胶树的天然橡胶生产。因此，存在天然橡胶来源会枯竭的问题，需要开发成熟的巴西橡胶树以外的稳定的天然橡胶来源，并提高巴西橡胶树的天然橡胶的生产率。
天然橡胶具有主要由异戊烯二磷酸酯(IPP)单元形成的顺式-1,4-聚异戊二烯结构，该结构的性质表明顺式异戊烯基转移酶(CPT)参与天然橡胶的生物合成。例如，在巴西橡胶树中发现了几种CPT，包括三叶橡胶转移酶1(HRT1)和三叶橡胶转移酶2(HRT2)(参见例如非专利文献1和2)。还已知通过抑制CPT表达可以在蒲公英种短角蒲公英(Taraxacumbrevicorniculatum)中减少橡胶合成(参见例如非专利文献3)。
与天然橡胶生物合成相关的蛋白质的先前研究集中在橡胶延伸因子(REF)和小橡胶颗粒蛋白(SRPP)(参见例如非专利文献4和5)。然而，这些蛋白质和CPT之间的关联尚未完全了解。
还有人提出，Nogo-B受体(NgBR)参与人类CPT的多萜醇生物合成(参见例如非专利文献6)。
随着近来基因工程的发展，现在可以通过向天然植物中引入所需的外源基因来转化天然植物。例如，专利文献1中报道，通过将用于巴西橡胶树的异戊烯转移酶编码的基因导入植物而产生的转基因植物可以获得提高的橡胶生产率。
然而，如果引入植物中的外源基因的表达在除了乳管之外的位点中被驱动，则可能对植物中的代谢或胶乳产生施加一定的负荷，从而导致不利影响。为了解决这个问题，正在寻求特别是在乳管中驱动基因表达的启动子(参见例如专利文献2和非专利文献7和8)。
引用列表
专利文献
专利文献1：JP 5035871B
专利文献2：JP 2010-119373 A
非专利文献
非专利文献1:Rahaman等,BMC Genomics,2013,第14卷
非专利文献2:Asawatreratanakul等,European Journal of Biochemistry,2003,第270卷,第4671-4680页
非专利文献3:Post等,Plant Physiology,2012,第158卷,第1406-1417页
非专利文献4:Hillebrand等,PLoS ONE,2012,第7卷
非专利文献5:Priya等,Plant Cell Reports,2007,第26卷,1833-1838页
非专利文献6:K.D.Harrison等,The EMBO Journal,2011,第30卷,第2490-2500页
非专利文献7:P.Priya等,Plant Science,2006,第171卷,第470-480页
非专利文献8:Sandeep Kumar Tata等,Industrial Crops andProducts,2012,第40卷,第219-224页
发明内容
技术问题
如上所述，需要开发成熟的巴西橡胶树以外的稳定的天然橡胶来源，并提高巴西橡胶树的天然橡胶的生产率。此外，已经进行了一些尝试来开发用于增强天然橡胶生产的基因重组技术。然而，目前天然橡胶的生物合成机制，特别是调节机制尚不清楚。因此，大大增加天然橡胶生产仍有很大的进步空间。在本文中，解决这些问题的一种可能的方法是稳定和提高天然橡胶生物合成中CPT的活性，以增加天然橡胶的产量。
本发明的目的在于解决上述问题，提供聚类异戊二烯的制造方法，其能够提高橡胶颗粒的橡胶合成活性，增加天然橡胶产量。
本发明还旨在解决上述问题，并提供可以使用遗传重组技术引入植物的载体以增强聚类异戊二烯产量。进一步的目的是提供引入载体的转基因植物，并通过将载体引入植物中来提供在植物中增强顺式-类异戊二烯或聚类异戊二烯的产量的方法。
技术方案
本发明涉及一种生产聚类异戊二烯的方法，该方法包括将编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒在体外结合的步骤。该发明在下文中称为本发明的第一方面，也称为第一发明。
顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白优选含有：
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第41位或相应位置处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第42位或相应位置处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第45位或相应位置处的精氨酸残基；和
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第89位或相应位置处的天冬酰胺残基。
顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白在由SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第41至49位或相应位置处优选含有，
以下氨基酸序列(A)：
DGNX1RX2AKK(A)
其中X1和X2彼此相同或不同，并且各自代表任何氨基酸残基，或
具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(A)的X1和X2以外的7个氨基酸残基中的至少5个相同。
顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第81至97位或相应位置处优选含有，
以下氨基酸序列(B)：
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV(B)
其中X11～X19彼此相同或不同，各自表示任何氨基酸残基，或
具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(B)的X11～X19以外的8个氨基酸残基中的至少5个相同。
优选地，选自编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因中的至少一种源自植物。
优选地，选自编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因中的至少一种源自巴西橡胶树。
结合步骤优选包括在橡胶颗粒和含有编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的mRNA和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成，从而将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合到橡胶颗粒上。
无细胞蛋白质合成溶液优选含有胚芽提取物。
胚芽提取物优选衍生自小麦。
橡胶颗粒优选以5至50g/L的浓度存在于无细胞蛋白质合成溶液中。
第一发明还涉及一种充气轮胎的制造方法，所述方法包括以下步骤：将通过所述第一发明的生产聚类异戊二烯的方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；由混炼物制造生胎；并对生胎进行硫化。
第一发明还涉及一种橡胶制品的制造方法，该方法包括以下步骤：将通过第一发明的生产聚类异戊二烯的方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；由混炼物形成生胶制品；并硫化生胶制品。
本发明还涉及一种载体，其包括：启动子，其具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性；和编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。该发明在下文中称为本发明的第二方面，也称为第二发明。
第二发明还涉及载体，其包括：启动子，其具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性；以及编码与启动子功能性连接的顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。
具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子优选为选自编码橡胶延伸因子(REF)的基因的启动子，编码小橡胶颗粒蛋白质(SRPP)的基因的启动子，编码Hevein2.1(HEV2.1)的基因的启动子和编码MYC1转录因子(MYC1)的基因的启动子。
第二发明还涉及引入任何一种上述载体的转基因植物。
第二发明还涉及通过将任何上述载体引入植物来增强植物中顺式-类异戊二烯产量的方法。
第二发明还涉及通过将任何上述载体引入植物来增强植物中的聚类异戊二烯产量的方法。
第二发明还涉及一种充气轮胎的制造方法，所述方法包括以下步骤：将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，所述转基因植物通过引入任何上述的载体到植物中制备得到；由混炼物制造生胎；并对生胎进行硫化。
第二发明还涉及一种橡胶制品的制造方法，所述方法包括以下步骤：将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，所述转基因植物通过引入任何上述的载体到植物中制备得到；由混炼物形成生胶制品；并硫化生胶制品。
发明的有益效果
第一发明的聚类异戊二烯的制造方法包括将编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒体外结合的步骤。CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒的结合预计将稳定并增加CPT家族蛋白的活性。因此，可以增加橡胶颗粒的橡胶合成活性，从而允许在反应容器(例如试管，工厂)中更有效地生产橡胶。
第一发明的充气轮胎的制造方法包括以下步骤：将通过第一发明的聚类异戊二烯的制造方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；由混炼物中制造生胎；并对生胎进行硫化。利用该方法，通过以高生产率生产聚类异戊二烯的方法制备的聚类异戊二烯制造充气轮胎。因此，有可能有效地利用植物资源生产环保的充气轮胎。
第一发明的橡胶制品的制造方法包括以下步骤：将通过第一发明的聚类异戊二烯的制造方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混合，得到混炼物；由混炼物形成生胶制品；并硫化生胶制品。通过该方法，可以通过以高生产率生产聚类异戊二烯的方法制造的聚类异戊二烯制造橡胶制品。因此，有可能有效利用植物资源生产环保橡胶制品。
第二发明的载体包括：具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子；和编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。第二发明的另外的载体包括：具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子；以及编码与启动子功能性连接的顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。通过将这种载体引入植物中，在载体中编码参与聚类异戊二烯生物合成的蛋白质的基因在乳管中特异性表达，从而增强植物中的顺式-类异戊二烯或聚类异戊二烯产量。
第二发明的充气轮胎的制造方法包括以下步骤：将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，其中转基因植物通过将第二发明的载体引入植物中来制备；由混炼物中制造生胎；并对生胎进行硫化。利用该方法，充气轮胎由具有增强聚类异戊二烯产量的转基因植物产生的聚类异戊二烯制备。因此，有可能有效地利用植物资源生产环保的充气轮胎。
第二发明的橡胶制品的制造方法包括以下步骤：将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混合以获得混炼物，其中转基因植物通过将第二发明的载体引入植物中来制备；由混炼物形成生胶产品；并硫化生胶制品。利用该方法，充气轮胎由具有增强聚类异戊二烯产量的转基因植物产生的聚类异戊二烯制备。因此，有可能有效利用植物资源生产环保橡胶制品。
附图说明
图1是表示橡胶颗粒上通过CPT和NgBR合成的橡胶的推定图。
图2是表示聚类异戊二烯生物合成路径的一部分的示意图。
图3是表示实施例中的透析处理的概要图。
图4表示测定的实施例1～3(图4(a))，参考例1～4(图4(b))以及参考例5和6(图4(c))中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布图。
图5是表示来自各种生物体的CPT家族蛋白的多个序列比对的结果的概要图。
具体实施方式
这里，第一发明和第二发明也统称为本发明。将首先解释第一发明，并且稍后解释第二发明。
(第一发明)
第一发明的聚类异戊二烯的制造方法包括将编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒体外结合的步骤。
本发明人首先发现橡胶颗粒的橡胶合成是通过将体外CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒体外结合来活化的。本发明人在此也首次发现CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的组合直接参与橡胶合成。推测CPT家族蛋白质和NgBR家族蛋白质位于橡胶颗粒上进行橡胶合成，如图1所示。图1示意性地示出了其中CPT和NgBR被视为CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的橡胶合成实例，并且异戊烯二磷酸酯(IPP)底物通过CPT聚合以在橡胶颗粒内合成天然橡胶。
因此，例如如第一发明的制造方法中所述的在反应容器(例如试管，工厂)中，通过将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒体外结合，可以增加橡胶颗粒的橡胶合成活性。因此，可以在反应容器(例如试管，工厂)中更有效地生产橡胶。
第一发明的制造方法可以包括任何其他步骤，只要其包含上述结合步骤，并且每个步骤可以执行一次或重复多次。
与橡胶颗粒结合的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的量在第一发明中没有特别限定。
其中，CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒的结合意味着例如CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白完全或部分地结合到橡胶颗粒中或***到橡胶颗粒的膜结构中。不限于这些实施方案，还包括其中例如蛋白质定位在橡胶颗粒的表面或内部的实施方案。此外，与橡胶颗粒结合的概念还包括其中CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与如上所述与橡胶颗粒结合的另一种蛋白质形成络合物的实施方案，以便以络合物形式存在于橡胶颗粒上。
橡胶颗粒的来源没有特别限制。例如，橡胶颗粒可以源自产胶植物例如巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)、灰白银胶菊(Partheniumargentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus),或橡皮树(Ficus elastica)的胶乳。
橡胶颗粒的粒径也没有特别限定。可以对具有预定粒径的橡胶颗粒进行分选和使用，或者可以使用具有不同粒径的橡胶颗粒的混合物。当分选并使用具有预定粒径的橡胶颗粒时，橡胶颗粒可以是具有小粒径的小橡胶颗粒(SRP)或具有大粒径的大橡胶颗粒(LRP)。
可以采用常用的方法来分选具有预定粒径的橡胶颗粒，包括例如涉及离心的方法，优选多级离心。具体方法包括以如下顺序进行离心：以500-1,500×g离心，以1,700-2,500×g离心，以7,000-9,000×g离心，以15,000-25,000×g离心，以40,000-60,000×g离心。每次离心处理的持续时间优选为20分钟以上，更优选为30分钟以上，进一步优选为40分钟以上，优选为120分钟以下，更优选为90分钟以下。每次离心处理的温度优选为0℃至10℃，更优选为2℃至8℃，特别优选为4℃。
在结合步骤中，由编码顺式异戊烯转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒体外结合。
编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因的来源没有特别限制。它们可以衍生自微生物，动物或植物，优选来自植物，更优选选自橡胶树属Hevea、苦苣菜属Sonchus、银胶菊属Taraxacum、和蒲公英属Parthenium的植物中的至少一种。其中更优选来自选自以下的至少一种植物：巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)和橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)，特别优选巴西橡胶树Hevea brasiliensis。最优选地，它们都来源于巴西橡胶树。在另一个合适的实施方案中，编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因源自相同的物种。
该植物没有特别的限制，其实例包括橡胶树属，如巴西橡胶树；苦苣菜属，如苦苣菜(Sonchus oleraceus),花叶滇苦菜(Sonchus asper)和苣荬菜(Sonchus brachyotus)；秋麒麟草属，如Solidago altissima,Solidago virgaurea subsp.asiatica,Solidagovirgaurea subsp.leipcarpa,Solidago virgaurea subsp.leipcarpa f.paludosa,Solidago virgaurea subsp.gigantea,和Solidago gigantea Ait.var.leiophyllaFernald；向日葵属，如Helianthus annus,Helianthus argophyllus,Helianthusatrorubens,Helianthus debilis,Helianthus decapetalus,和Helianthus giganteus；蒲公英属，如蒲公英(Taraxacum),Taraxacum venustum H.Koidz,Taraxacum hondoenseNakai,Taraxacum platycarpum Dahlst,Taraxacum japonicum,Taraxacum officinaleWeber,Taraxacum kok-saghyz和短角蒲公英；榕属，如Ficus carica,Ficus elastica,Ficus pumila L.,Ficus erecta Thumb.,Ficus ampelas Burm.f.,Ficus benguetensisMerr.,Ficus irisana Elm.,Ficus microcarpa L.f.,Ficus septica Burm.f.和Ficusbenghalensis；银胶菊属，如灰白银胶菊,Parthenium hysterophorus和豚草Ambrosiaartemisiifolia(Parthenium hysterophorus)；莴苣(Lactuca sativa)；孟加拉榕(Ficusbenghalensis)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
本文中，术语“顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白”是指催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶。具体来说，在植物中，例如，聚类异戊二烯通过如图2所示的聚类异戊二烯生物合成路径生物合成，其中CPT家族蛋白被认为是催化图2中虚线框包围的反应的酶。CPT家族蛋白的特征在于具有顺式-IPPS结构域(NCBI登录号：cd00475)中所含的氨基酸序列。
本文中，术语“类异戊二烯化合物”是指含有异戊二烯单元(C5H8)的化合物。此外，术语“顺式-类异戊二烯”是指包含类异戊二烯化合物的化合物，其中异戊二烯单元是顺式键合的，实例包括顺式-法呢基二磷酸酯，十一异戊二烯基二磷酸酯和天然橡胶。
图5是表示来自各种生物体的CPT家族蛋白的多个序列比对的结果的概要图。根据例如Shota Endo等,Biochimica et Biophysica Acta,1625期(2003),291-295页和Masahiro Fujihashi等,PNAS,98卷,8期(2001),4337-4342页的文献，图5中方框A(对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的41至49位)和方框B(对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的81至97位)是来自各种生物体的CPT家族蛋白的高度保存区域(conserved region)的部分。术语“保存区域”是指具有相似序列(结构)的位点，其被认为具有相似的蛋白质功能。特别地，认为在对应于由SEQ ID NO：2(图5中的(1))表示的来自巴西橡胶树的HRT1的41位的位置上保存的天冬氨酸残基，在对应于由SEQ ID NO：2(图5中的(2))表示的来自巴西橡胶树的HRT1的42位的位置上保存的甘氨酸残基，在对应于由SEQ ID NO：2(图5中的(3))表示的来自巴西橡胶树的HRT1的45位的位置上保存的精氨酸残基，和在对应于由SEQ ID NO：2(图5中的(4))表示的来自巴西橡胶树的HRT1的89位的位置上保存的天冬酰胺残基是CPT家族蛋白的酶促反应的必需氨基酸，使得在各自位置具有这些氨基酸的蛋白质具有CPT家族蛋白的功能。
多个序列比对可以如后面实施例中所述进行。
具体地，CPT家族蛋白优选含有：由SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列41位或相应位置处的天冬氨酸残基；SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列42位或相应位置处的甘氨酸残基；在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中45位或相应位置处的精氨酸残基；以及由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的89位或相应位置处的天冬酰胺残基。如上所述，具有这种序列的CPT家族蛋白被认为具有CPT家族蛋白的功能，包括作为催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶的功能。因此，通过将该CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合，可以提高橡胶颗粒的橡胶合成活性，从而在橡胶颗粒中合成天然橡胶。
更优选地，CPT家族蛋白在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的41至49位或相应位置含有下列氨基酸序列(A)：
DGNX1RX2AKK(A)
其中X1和X2彼此相同或不同，并且各自表示任何氨基酸残基或具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(A)的X1与X2以外的七个氨基酸残基中的至少五个相同。更优选地，在氨基酸序列(A)中，X1表示H，G或R，X2表示W，F或Y。
具有使其与氨基酸序列(A)的X1和X2以外的7个氨基酸残基中的至少5个相同的序列同一性的氨基酸序列更优选与除X1和X2以外的7个氨基酸残基中的至少6个相同。
还更优选地，CPT家族蛋白在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的81至97位含有或在相应的位置含有以下氨基酸序列(B)：
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV(B)
其中X11至X19彼此相同或不同，并且各自表示任何氨基酸残基或具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(B)的除了X11至X19之外的八个氨基酸残基中的至少五个相同。
更优选地，在氨基酸序列(B)中，X11表示L，V，A或I；X12表示Y，F或H；X13表示S，T，I，M或L；X14表示E，D或H；X15表示W或F；X16表示N，S，K，G或R；X17表示P，S，H，G，R，K或Q；X18表示A，K，S或P；X19表示Q，D，R，I，E，H或S。
具有与氨基酸序列(B)的X11～X19以外的8个氨基酸残基中的至少5个相同的序列同一性的氨基酸序列更优选与除了X11至X19以外的8个氨基酸残基中的至少6个，更优选至少7个相同。
此外，CPT家族蛋白特别优选在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的41～49位或相应位置上含有具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的41～49位的9个氨基酸残基(DGNRRFAKK，SEQ ID NO：51)中的至少6个相同。序列同一性更优选地使得氨基酸序列与九个氨基酸残基中的至少七个，还更优选至少八个相同。
此外，CPT家族蛋白特别优选在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的81～97位或相应位置含有具有相同序列同一性的氨基酸序列，使其与由SEQ IDNO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的81至97位的17个氨基酸残基(TIYAFSIDNFRRKPHEV，SEQ ID NO：52)中至少14个相同。序列同一性更优选使得氨基酸序列与17个氨基酸残基中的至少15个，更优选至少16个相同。
具体而言，对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的41至49位的保存区域对应于，例如：
由SEQ ID NO：45所示的来自大肠杆菌(Escherichia coli)的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的25至33位；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌(Micrococcus)的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的29至37位；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母(yeast)的SRT1的75至83位；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtCPT5的79至87位；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的43至51位；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草(tobacco)的DDPS的42至50位；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的41至49位；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的41至49位；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的42至50位；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的41至49位；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣(Lactuca sativa)的LsCPT3的58至66位；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)的TbCPT1的58至66位；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠(mouse)的DDPS的34至42位；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的34至42位。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的81至97位的保存区域对应于，例如：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的65至81位；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的69至85位；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的115至131位；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的119至135位；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的84至100位；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的82至98位；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的81至97位；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的81至97位；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的82至98位；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树CPT5的81至97位；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的98至114位；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的98到114位；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的74至90位；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的74至90位。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的41位处的天冬氨酸残基对应于，例如：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的25位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)在29位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的75位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的79位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的43位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的42位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的41位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的41位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的42位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的41位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的58位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的58位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的34位处的天冬氨酸残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的34位处的天冬氨酸残基。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的42位的甘氨酸残基对应于，例如：
由SEQ ID NO：45所示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的26位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的30位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的76位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的80位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的44位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的43位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的42位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的42位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的43位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的42位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的59位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的59位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的35位处的甘氨酸残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的35位处的甘氨酸残基。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的45位处的精氨酸残基对应于，例如：
由SEQ ID NO：45所示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的29位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的33位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：47表示的自酵母的SRT1的79位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的83位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的47位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的46位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的45位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的45位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4在46位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的45位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的62位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：43所示的来自短角蒲公英的TbCPT1的62位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：49所示的来自小鼠的DDPS的38位处的精氨酸残基；和
由SEQ ID NO：50所示的来自人的HDS的38位处的精氨酸残基。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的89位处的天冬酰胺残基对应于，例如：
来自SEQ ID NO：45所示的大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的73位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的77位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的123位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的127位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的92位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的90位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的89位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的89位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的90位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的89位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的106位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的106位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的82位处的天冬酰胺残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的82位处的天冬酰胺残基。
CPT家族蛋白的实例包括来自巴西橡胶树(HRT1，HRT2，CPT3至CPT5)的CPT，来自拟南芥的AtCPT1至AtCPT9，来自莴苣的CPT1至CPT3，来自短角蒲公英的CPT1至CPT3，来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶，来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)，来自酵母的SRT1，来自烟草的DDPS，来自小鼠的DDPS和来自人的HDS。
不仅生产橡胶的产胶植物，而且其他生物体如植物，动物和微生物也具有编码CPT家族蛋白的基因。当然，来自这些生物体的CPT家族蛋白本质上不参与橡胶合成。尽管如此，在本发明中，通过不管蛋白质的来源，类型和其它因素将任何CPT家族蛋白与橡胶颗粒结合，可以将橡胶颗粒的橡胶合成活性提高从而在橡胶颗粒中合成天然橡胶。此外，橡胶颗粒的橡胶合成活性可以通过将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合而进一步提高。这可能是由于CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白之间的相互作用。
因此，根据本发明，令人惊奇的是，使用任何CPT家族蛋白可以增加橡胶颗粒的橡胶合成活性，从而在橡胶颗粒中合成天然橡胶，例如，不管编码CPT家族蛋白的基因是否来自产胶植物或任何其他生物体，或者是否涉及橡胶天热合成。本发明人认为，引入基因的宿主，或换句话说，表达CPT家族蛋白的环境对于橡胶合成活性比CPT家族蛋白的来源或类型更重要。
在这方面，本发明人假定了以下机制。
也就是说，假设由CPT家族蛋白合成的产物的链长取决于合成产物积聚的位点的疏水性和空间。
具体地说，在诸如大肠杆菌等原核生物中，CPT家族蛋白显示出不产生可检测的反应产物的活性，或者即使它们对合成产物显示出活性，该产物的链条仅延伸到CPT家族蛋白的疏水性裂缝(cleft)结构内的可接收长度。
在诸如酵母的真核生物中，由CPT家族蛋白合成的产物从CPT家族蛋白的疏水性裂缝结构转移到细胞的脂质双层中，例如转移到内质网管腔(endoplasmic reticulumlumen)中，并且积聚在环境为疏水性但其空间不是非常大的脂质双层，因此产物的链长度有限。
同样在拟南芥等非产胶植物中，类似于酵母，由CPT家族蛋白合成的产物积聚在空间不是非常大的细胞的脂质双层中，因此合成的产物也具有有限的链长度。
相比之下，当CPT家族蛋白与橡胶颗粒结合时，由CPT家族蛋白合成的产物聚集在环境疏水且其空间远大于细胞的脂质双层的橡胶颗粒中，如图1所示。因此，产物的链长度在这样的疏水环境中充分地延伸，几乎没有空间限制，从而可以合成超长链的聚类异戊二烯(天然橡胶)。
根据该原理，本发明中使用的CPT家族蛋白优选在N-末端侧具有对橡胶颗粒有更高亲和力的跨膜结构域。在没有跨膜结构域的野生型的情况下，可以将跨膜结构域人工融合到CPT家族蛋白的N末端侧。融合的跨膜结构域可以具有任何氨基酸序列，理想地是天然地结合橡胶颗粒的蛋白质的跨膜结构域的氨基酸序列。
Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白是具有通过蛋白质N-末端侧上的一个或多个跨膜结构域与膜结合，并且具有在其C-末端侧与CPT家族蛋白或其它蛋白质相互作用的功能的蛋白质，其通过将CPT家族蛋白保留在膜上来辅助CPT家族蛋白的功能。NgBR家族蛋白的特征在于在N-末端侧具有跨膜结构域和在C末端侧具有包含在顺式-IPPS超家族域(NCBI登录号：COG0020)中的氨基酸序列。
使用的NgBR家族蛋白的实例包括来自巴西橡胶树(HRTBP)的NgBR，来自拟南芥的AtLEW1，来自莴苣的LsCPTL1至LsCPTL2，以及来自蒲公英的TbRTA。
使用的CPT家族蛋白的具体实例包括以下蛋白质[1]：
[1]具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质。
已知相对于原始氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代，缺失，***或添加的蛋白质可以具有固有功能。因此，CPT家族蛋白的另一个具体实例是以下蛋白质[2]：
[2]一种蛋白质，其具有相对于由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列含有一个或多个氨基酸取代，缺失，***和/或添加的氨基酸序列，并具有催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶活性。
为了保持CPT家族蛋白的功能，相对于由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，优选其具有含有1个以上，更优选1～58个，更优选1～44个，进一步优选1～29个，特别优选1～15个，最优选1至6个，还最优选1至3个的氨基酸取代，缺失，***和/或添加的氨基酸序列。
在其他氨基酸取代中，优选保存取代。具体实例包括括号内的以下各组中的取代：(甘氨酸，丙氨酸)，(缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸)，(天冬氨酸，谷氨酸)，(天冬酰胺，谷氨酰胺)，(丝氨酸，苏氨酸)，(赖氨酸，精氨酸)和(苯丙氨酸，酪氨酸)。
还已知具有与原始氨基酸序列高序列同一性的氨基酸序列的蛋白质也具有相似的功能。因此，CPT家族蛋白的另一个具体实例是以下蛋白质[3]：
[3]一种蛋白质，其具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列，并具有催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶活性。
为了保持CPT家族蛋白的功能，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的序列同一性优选为至少85％，更优选至少90％，还更优选至少95％，特别优选至少98％，最优选至少99％。
CPT家族蛋白的具体实例还包括以下蛋白质[11]：
[11]具有由SEQ ID NO：32,36,41,22,14,43，47或50表示的氨基酸序列的蛋白质。
还已知具有与原始氨基酸序列高序列同一性的氨基酸序列的蛋白质也具有相似的功能。因此，CPT家族蛋白的另一个具体实例是以下蛋白质[12]：
[12]一种蛋白质，其具有与SEQ ID NO：32,36,41,22,14,43,47或50所示的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列，并具有催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶活性。
为了保持CPT家族蛋白的功能，与SEQ ID NO：32,36,41,22,14,43,47或50所示的氨基酸序列的序列同一性优选为至少85％，更优选至少90％，还更优选至少95％，特别优选至少98％，最优选至少99％。
这里，氨基酸序列或核苷酸序列之间的序列同一性可以使用由Karlin和Altschul开发的算法BLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA[Methods Enzymol.,183,63(1990)]确定。
是否为具有上述酶活性的蛋白质可以通过常规技术来确定，例如在通过将编码靶蛋白的基因导入大肠杆菌或其他宿主生物体而产生的转化体中表达靶蛋白，并通过相应的活性测定方法确定其存在或不存在靶蛋白的功能。
NgBR家族蛋白的具体实例包括以下蛋白质[4]：
[4]具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质。
已知相对于原始氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代，缺失，***或添加的蛋白质可以具有固有功能。因此，NgBR家族蛋白的另一具体实例是以下蛋白质[5]：
[5]一种蛋白质，其具有相对于由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列含有一个或多个氨基酸取代，缺失，***和/或添加的氨基酸序列，并具有通过在蛋白质的N-末端侧的一个或多个跨膜结构域与膜结合，并且在其C-末端侧与另一蛋白质相互作用的功能。
为了保持NgBR家族蛋白质的功能，相对于由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列，优选其氨基酸序列含有1个以上，更优选1～52个，更优选1～39个，进一步优选1～26个，特别优选1～13个，最优选1至6个，还最优选1至3个氨基酸取代，缺失，***和/或添加。
在其他氨基酸取代中，优选保存取代。具体实例包括括号内的以下各组中的取代：(甘氨酸，丙氨酸)，(缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸)，(天冬氨酸，谷氨酸)，(天冬酰胺，谷氨酰胺)，(丝氨酸，苏氨酸)，(赖氨酸，精氨酸)和(苯丙氨酸，酪氨酸)。
如上所述，还已知具有与原始氨基酸序列高序列同一性的氨基酸序列的蛋白质也具有相似的功能。因此，NgBR家族蛋白的另一个具体实例是以下蛋白质[6]：
[6]一种蛋白质，其具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且具有通过蛋白质N-末端侧上的一个或多个跨膜结构域与膜结合并在其C-末端侧与另一蛋白质相互作用的功能。
为了保持NgBR家族蛋白的功能，与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的序列同一性优选为至少85％，更优选至少90％，还更优选至少95％，特别优选至少98％，最优选至少99％。
NgBR家族蛋白的具体实例还包括以下蛋白质[14]：
[14]具有SEQ ID NO：24或16所示的氨基酸序列的蛋白质。
如上所述，还已知具有与原始氨基酸序列高序列同一性的氨基酸序列的蛋白质也具有相似的功能。因此，NgBR家族蛋白的另一具体实例是以下蛋白质[15]：
[15]一种蛋白质，其具有与SEQ ID NO：24或16所示的氨基酸序列至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且具有通过蛋白质的N-末端侧上的一个或多个跨膜结构域与膜结合，并且在其C-末端侧与另一蛋白质相互作用的功能。
为了保持NgBR家族蛋白的功能，与SEQ ID NO：24或16所示的氨基酸序列的序列同一性优选为至少85％，更优选至少90％，还更优选至少95％，特别优选至少98％，最优选至少99％。
是否为上述的NgBR家族蛋白可以通过常规技术来确定，例如通过鉴定氨基酸序列，然后确定其是否具有顺式-IPPS超家族域(NCBI登录号：COG0020)中所含的氨基酸序列。
编码CPT家族蛋白的基因没有特别的限制，只要编码CPT家族蛋白来表达和产生CPT家族蛋白即可。该基因的具体实例包括以下DNAs[1]和[2]：
[1]具有由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的DNA；和
[2]在严格条件下与具有SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，其编码具有催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶活性的蛋白质。
如本文所用，术语“杂交”是指DNA与具有所述DNA的特定核苷酸序列或一部分的DNA杂交的过程。因此，具有DNA的特定核苷酸序列或一部分的DNA可以具有足够长的核苷酸序列，可用作Northern或Southern印迹分析中的探针或作为聚合酶链反应(PCR)分析中的寡核苷酸引物。用作探针的DNA可以具有至少100个碱基，优选至少200个碱基，更优选至少500个碱基的长度，但可以是长度为至少10个碱基，优选至少15个碱基的DNA。
进行DNA杂交实验的技术是众所周知的。进行实验的杂交条件可以根据例如分子克隆(Molecular Cloning),第2版和第3版(2001),普通和分子细菌学方法(Methods forGeneral and Molecular Bacteriology),ASM出版社(1994)，免疫学方法手册(Immunologymethods manual)，Academic出版社(Molecular)等许多标准教科书来确定。
严格条件可以包括，例如在42℃的DNA固定过滤器和DNA探针下，在含有50％甲酰胺，5×SSC(750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/L变性鲑***DNA的溶液中过夜培育，然后例如在约65℃下在0.2×SSC溶液中洗涤过滤器。也可以使用不太严格的条件。严格性的变化可以通过操作甲酰胺浓度(甲酰胺的较低百分比导致较低的严格性)，盐浓度或温度来实现。例如，低严格条件包括在含有6×SSCE(20×SSCE：3mol/L氯化钠，0.2mol/L磷酸二氢钠，0.02mol/L EDTA，pH7.4)，0.5％SDS，30％甲酰胺和100μg/L变性鲑鱼精DNA的溶液中在37℃下过夜培育，然后在含有0.1％SDS的1×SSC溶液中在50℃下洗涤。此外，为了实现更低的严格性，在上述低严格条件下，杂交后进行的洗涤可以在较高的盐浓度(例如5×SSC)下进行。
上述各种条件的变化可以通过包含或取代用于抑制杂交实验背景的阻断剂(blocking reagent)来实现。包含阻断剂可能需要修改杂交条件以获得相容性。
能够在如上所述的严格条件下进行杂交的DNA可以具有与使用上述参数的BLAST或FASTA等程序计算的由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的序列同一性为至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，特别优选至少99％的核苷酸序列。
编码CPT家族蛋白的基因的具体实例还包括以下DNA[11]和[12]：
[11]具有由SEQ ID NO：31,35,40,21,13,42,63或64表示的核苷酸序列的DNA；和
[12]一种在严格条件下与具有与SEQ ID NO：31,35,40,21,13,42,63或64表示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，其编码具有催化类异戊二烯化合物的顺式链延长反应的酶活性的蛋白质。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
能够在如上所述的严格条件下进行杂交的DNA可以具有与使用具有上述参数的BLAST或FASTA等程序计算的由SEQ ID NO：31,35,40,21,13,42,63或64表示的核苷酸序列的序列同一性为至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，特别优选至少99％的核苷酸序列。
在严格条件下与上述DNA杂交的DNA是否编码具有预定酶活性的蛋白质可以通过常规技术来确定，例如通过将编码靶蛋白的基因导入大肠杆菌或其他宿主生物体所产生的转化体中表达靶蛋白，并通过相应的活性测定方法测定靶蛋白的功能的存在或不存在来确定。
编码NgBR家族蛋白的基因的具体实例包括以下DNA[3]和[4]：
[3]具有由SEQ ID NO：3表示的核苷酸序列的DNA；和
[4]在严格条件下与其核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列互补的DNA杂交的DNA，其编码具有通过在蛋白质的N-末端侧的一个或多个跨膜结构域与膜结合，并且在其C-末端侧与另一蛋白质相互作用的功能的蛋白质。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
能够在如上所述的严格条件下进行杂交的DNA的核苷酸序列与使用具有上述参数的BLAST或FASTA等程序计算的由SEQ ID NO：3表示的核苷酸序列可以具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，特别优选至少99％的序列同一性。
编码NgBR家族蛋白的基因的具体实例还包括以下DNA[13]和[14]：
[13]具有由SEQ ID NO：23或15表示的核苷酸序列的DNA；和
[14]在严格条件下与其核苷酸序列与SEQ ID NO：23或15所示的核苷酸序列互补的DNA杂交的DNA，其编码具有通过在蛋白质的N-末端侧的一个或多个跨膜结构域与膜结合，并且在其C末端侧与另一蛋白质相互作用的功能的蛋白质。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
能够在如上所述的严格条件下进行杂交的DNA的核苷酸序列与使用具有上述参数的诸如BLAST或FASTA的程序计算的由SEQ ID NO：23或15表示的核苷酸序列可以具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，还更优选至少98％，特别优选至少99％的序列同一性。
在严格条件下与上述DNA杂交的DNA是否是编码NgBR家族蛋白的DNA可以通过常规技术来确定，例如通过将DNA翻译成氨基酸序列，然后确定氨基酸序列是否具有顺式IPPS超家族域(NCBI登录号：COG0020)中含有的氨基酸序列来确定。
可以使用常规技术来鉴定蛋白质的氨基酸序列或核苷酸序列。例如，从生长的植物中提取总RNA，任选地纯化mRNA，并通过逆转录反应合成cDNA。随后，基于对应于靶蛋白的已知蛋白质的氨基酸序列设计简并引物，通过RT-PCR部分扩增DNA片段，并且部分鉴定该序列。然后，进行RACE方法等以鉴定全长核苷酸序列或氨基酸序列。RACE方法(cDNA末端快速扩增的方法)是指当cDNA的核苷酸序列部分已知时，基于这样的已知区域的核苷酸序列信息进行PCR来克隆延伸至cDNA末端的未知区域，并且该方法能够通过PCR克隆全长cDNA而无需制备cDNA库。
简并引物各自优选由与靶蛋白具有高度相似序列部分的植物来源序列制备得到。
如果编码蛋白质的核苷酸序列是已知的，则可以通过使用已知的核苷酸序列设计包含起始密码子的引物和含有终止密码子的引物，然后使用合成的cDNA作为模板进行RT-PCR来鉴定全长核苷酸序列或氨基酸序列。
在结合步骤中，其它蛋白质可进一步与橡胶颗粒结合，只要由编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质在体外与橡胶颗粒结合即可。
其他蛋白质的来源没有特别限制，但优选其他蛋白质来源于上述任何植物，更优选选自橡胶树属，苦苣菜属，蒲公英属和银胶菊属的植物中的至少一种。其中更优选来自选自以下的至少一种植物：巴西橡胶树,苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草,特别优选巴西橡胶树。
其他蛋白质可以各自为任何蛋白质而没有任何限制，但是为了增加橡胶颗粒的橡胶合成活性，它们优选固有地存在于产胶植物中的橡胶颗粒上的蛋白质。存在于橡胶颗粒上的蛋白质可以是与橡胶颗粒的膜表面的大部分结合的蛋白质，或***并结合到橡胶颗粒的膜上的蛋白质，或者与另一种与膜结合的蛋白质形成络合物以便存在于膜表面上的蛋白质。
固有地存在于产胶植物中的橡胶颗粒上的蛋白质的实例包括橡胶延伸因子(REF)，小橡胶颗粒蛋白(SRPP)，β-1,3-葡聚糖酶和Hevein。
结合步骤可以通过在体外将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合到橡胶颗粒上的任何方法进行，例如通过在橡胶颗粒和含有编码CPT家族蛋白的mRNA和编码NgBR家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成从而将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合到橡胶颗粒上。
结合步骤优选包括在橡胶颗粒和含有编码CPT家族蛋白的mRNA和编码NgBR家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的同时存在下进行蛋白质合成以将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合等方法。
换句话说，与CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合的橡胶颗粒优选通过在橡胶颗粒和含有编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液同时存在的情况下进行蛋白质合成而获得，或更具体地，使用橡胶颗粒与含有编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的混合物。
由于脂质体是由磷脂，甘油糖脂，胆固醇或其他组分形成的人工产生的脂质双层膜，所以没有蛋白质与制得的脂质体的表面结合。相比之下，虽然从产胶植物的胶乳收集的橡胶颗粒也涂有脂质膜，但是橡胶颗粒的膜是天然衍生的膜，其中在植物中合成的蛋白质已经结合到膜的表面。因此，其它蛋白质与已经结合蛋白质并被蛋白质包覆的橡胶颗粒的结合预计比与不结合任何蛋白质的脂质体结合更困难。还存在已经结合到橡胶颗粒上的蛋白质可以抑制无细胞蛋白质合成的问题。由于这些原因，已经可以预期在橡胶颗粒存在下进行无细胞蛋白质合成时的困难。在这种情况下，本发明人首先发现，通过在橡胶颗粒的存在下进行CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的无细胞合成，可以制备与CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合的橡胶颗粒，这在过去从未尝试过。
在橡胶颗粒和含有编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液同时存在下的蛋白质合成即是通过无细胞蛋白质合成进行CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的合成，合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白保持其生物学功能(天然状态)。由于在橡胶颗粒存在下进行无细胞蛋白质合成，所以合成的天然状态下的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白可以与橡胶颗粒结合。
通过在无细胞蛋白质合成溶液和橡胶颗粒的存在下的蛋白质合成将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合意味着，例如通过蛋白质合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白各自完全或部分地结合到橡胶颗粒中或***橡胶颗粒的膜结构中。不限于这些实施方案，还包括其中例如蛋白质定位在橡胶颗粒的表面或内部的实施方案。此外，与橡胶颗粒结合的概念还包括如上所述其中蛋白质与结合到橡胶颗粒上的另一种蛋白质形成络合物的实施方案，使其在橡胶颗粒上以络合物的形式存在。
编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA用作翻译模板，可以被翻译以分别合成CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白。
编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA的来源没有特别限制，并且mRNA可以源自微生物，动物或植物，优选植物，更优选上述任何植物，还更优选地选自由以下植物的至少一种：橡胶树属，苦苣菜属，蒲公英属和银胶菊属。其中，特别优选来源于选自巴西橡胶树,苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草的至少一种植物,最优选巴西橡胶树。在另一个合适的实施方案中，编码CPT家族蛋白的mRNA和编码NgBR家族蛋白的mRNA来自相同的物种。
制备编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA的方法没有特别限制，只要所制备的mRNA用作翻译模板能够被翻译以合成CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白即可。例如，mRNA可以通过如下方式制备：例如通过热酚法从产胶植物的胶乳中提取总RNA，由总RNA合成cDNA，使用基于编码CPT家族蛋白或NgBR家族蛋白的基因的核苷酸序列数据制备的引物得到编码CPT家族蛋白或NgBR家族蛋白的基因的DNA片段，并进行DNA片段的普通体外转录反应。
只要无细胞蛋白质合成溶液含有编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA，则它可以含有编码其他蛋白质的mRNA。
编码其他蛋白质的mRNA可以是能被翻译以表达相应蛋白质的mRNA。其他蛋白质可以如上所述。
在第一发明的结合步骤中，优选在橡胶颗粒存在下进行CPT族蛋白和NgBR家族蛋白的无细胞合成。这种无细胞蛋白质合成可以以与现有技术相似的方式使用无细胞蛋白质合成溶液进行。所用的无细胞蛋白质合成***可能是常见的无细胞蛋白质合成手段，如快速翻译***RTS500(Roche Diagnostics)；或根据Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：559-564(2000)，JP-A 2000-236896，JP-A 2002-125693和JP-A 2002-204689制备的小麦胚芽提取物或使用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成***(JP-A 2002-204689，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：14652-14657(2002))。其中优选使用胚芽提取物的***。因此，在第一发明的另一个合适的实施方案中，无细胞蛋白质合成溶液含有胚芽提取物。
胚芽提取物的来源没有特别限制。从翻译效率的观点来看，当通过无细胞蛋白质合成法合成植物蛋白时，优选使用植物来源的胚芽提取物。特别优选使用小麦来源的胚芽提取物。因此，在第一发明的另一个合适的实施方案中，胚芽提取物源自小麦。
用于制备胚芽提取物的方法没有特别限制，可以按照例如如JP-A 2005-218357中所述地常规进行。
无细胞蛋白质合成溶液优选还含有环状核苷单磷酸酯衍生物或其盐(以下也简称为“活性增强剂”)。通过包含活性增强剂可进一步增加蛋白质合成活性。
环状核苷单磷酸酯衍生物或其盐没有特别限制，只要能够增加无细胞蛋白质的合成活性即可。实例包括腺苷-3'，5'-环状单磷酸及其盐；腺苷-3'，5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐；腺苷-3'，5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐；鸟苷-3'，5'-环状单磷酸及其盐；鸟苷-3'，5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐；鸟苷-3'，5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐；8-溴腺苷-3'，5'-环状单磷酸(溴-cAMP)及其盐；8-(4-氯苯硫基)腺苷-3'，5'-环状单磷酸(氯苯硫基-cAMP)及其盐；5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑腺苷-3'，5'-环状单磷酸(二氯呋喃核糖基苯并咪唑cAMP)及其盐；腺苷-2'，5'-环状单磷酸及其盐；腺苷-2'，5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐；腺苷-2'，5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐；鸟苷-2'，5'-环状单磷酸及其盐；鸟苷-2'，5'-环状单硫代磷酸(Sp-异构体)及其盐；和鸟苷-2'，5'-环状单硫代磷酸(Rp-异构体)及其盐。
与环状核苷单磷酸酯衍生物形成盐的碱没有特别限制，只要其为生物化学上可接受的并且与衍生物形成盐即可。优选的是例如碱金属原子如钠或钾，以及有机碱如三羟基氨基甲烷等。
在这些活性增强剂中，特别优选腺苷-3'，5'-环状单磷酸或腺苷-3'，5'-环状单磷酸钠盐。这些活性增强剂可以单独使用，也可以两种以上组合使用。
活性增强剂可以预先加入无细胞蛋白质合成溶液中。如果活性增强剂在溶液中不稳定，则优选在无细胞蛋白质合成溶液和橡胶颗粒存在下进行的蛋白质合成反应期间添加。
活性增强剂的添加量没有特别限制，只要活性增强剂处于能够激活(增加)无细胞蛋白质合成溶液中的蛋白质合成反应的浓度即可。具体地说，反应体系中的最终浓度通常可以为至少0.1毫摩尔/升。浓度的下限优选为0.2毫摩尔/升，更优选为0.4毫摩尔/升，特别优选为0.8毫摩尔/升，浓度的上限优选为24毫摩尔/升，更优选为6.4毫摩尔/升，特别优选3.2毫摩尔/升。
添加活性增强剂的无细胞蛋白质合成溶液的温度没有特别限定，优选为0℃～30℃，更优选为10℃～26℃。
除了编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA(翻译模板)外，无细胞蛋白质合成溶液还含有ATP，GTP，磷酸肌酸，肌酸激酶，L-氨基酸，钾离子，镁离子，和蛋白质合成所需的其它组分，以及任选的活性增强剂。这种无细胞蛋白质合成溶液可以作为无细胞蛋白质合成反应体系。
由于如JP-A 2005-218357中所述制备的胚芽提取物含有蛋白质合成反应所需量的tRNA，因此当在无细胞蛋白质合成溶液中使用上述制备的胚芽提取物时，不需要添加单独制备的tRNA。换句话说，可以根据需要将tRNA加入到无细胞蛋白质合成溶液中。
第一发明中的结合步骤优选包括在橡胶颗粒和含有编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的同时存在下进行蛋白质合成。具体地说，可以通过在蛋白质合成之前或之后的合适的点，优选蛋白质合成之前将橡胶颗粒添加到无细胞蛋白质合成溶液中来完成。
橡胶颗粒优选以5至50g/L的浓度存在于无细胞蛋白质合成溶液中。换句话说，优选在1L无细胞蛋白质合成溶液中存在5～50g的橡胶颗粒。当存在于无细胞蛋白质合成溶液中的橡胶颗粒的浓度小于5g/L时，可能不会通过用于收集与合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合的橡胶颗粒的分离处理(例如超速离心)形成橡胶层，因此可能难以收集与合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合的橡胶颗粒。此外，当无细胞蛋白质合成溶液中存在的橡胶颗粒的浓度超过50g/L时，橡胶颗粒可能凝结，使得合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白质可能不能很好地与橡胶颗粒结合。橡胶颗粒的浓度更优选为10～40g/L，进一步优选为15～35g/L，特别优选为15～30g/L。
在橡胶颗粒和无细胞蛋白质合成溶液存在下的蛋白质合成中，随着反应进行，可以适当添加另外的橡胶颗粒。无细胞蛋白质合成溶液和橡胶颗粒优选在无细胞蛋白质合成体系为活性时的期间内(例如橡胶颗粒加入到无细胞蛋白质合成溶液中后3至48小时，优选3至30小时，更优选3至24小时)一起存在。
橡胶颗粒不必经受任何处理，例如，在第一发明的结合步骤中使用之前，优选在与无细胞蛋白质合成溶液组合之前进行预处理。然而，蛋白质可以预先用表面活性剂从橡胶颗粒中除去，以在橡胶颗粒中存在的蛋白质中增加通过第一发明的方法期望被结合的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的比例。因此，在第一发明的另一个合适的实施方案中，在用于第一发明的结合步骤之前，优选在与无细胞蛋白质合成溶液组合之前，将第一发明中使用的橡胶颗粒用表面活性剂洗涤。
表面活性剂没有特别限制，其实例包括非离子表面活性剂和两性表面活性剂。非离子表面活性剂和两性表面活性剂等是适用的，因为它们对膜上的蛋白质仅具有一点变性作用，两性表面活性剂是特别合适的。因此，在第一发明的另一个合适的实施方案中，表面活性剂是两性表面活性剂。
这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种以上组合使用。
非离子表面活性剂的实例包括聚氧化烯醚非离子表面活性剂，聚氧化烯酯非离子表面活性剂，多元醇脂肪酸酯非离子表面活性剂，糖脂肪酸酯非离子表面活性剂，烷基多糖苷非离子表面活性剂和聚氧化烯聚葡糖苷非离子表面活性剂；和聚氧化烯烷基胺和烷基链烷醇酰胺。
其中优选聚氧化烯醚非离子表面活性剂或多元醇脂肪酸酯非离子表面活性剂。
聚氧化烯醚非离子表面活性剂的实例包括聚氧化烯烷基醚，聚氧化烯烷基苯基醚，聚氧化烯多元醇烷基醚和聚氧化烯单-，二-或三苯乙烯基苯基醚。其中，聚氧化烯烷基苯基醚是合适的。多元醇优选为C2-C12多元醇，如乙二醇，丙二醇，甘油，山梨糖醇，葡萄糖，蔗糖，季戊四醇或脱水山梨糖醇。
聚氧化烯酯非离子表面活性剂的实例包括聚氧化烯脂肪酸酯和聚氧化烯烷基松香酸酯。
多元醇脂肪酸酯非离子表面活性剂的实例包括C2-C12多元醇的脂肪酸酯和聚氧化烯多元醇的脂肪酸酯。更具体的实例包括山梨糖醇脂肪酸酯，脱水山梨糖醇脂肪酸酯，甘油脂肪酸酯，聚甘油脂肪酸酯和季戊四醇脂肪酸酯，以及前述的聚环氧烷加合物(例如聚氧化烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧化烯甘油脂肪酸酸酯)。其中，脱水山梨糖醇脂肪酸酯是合适的。
糖脂肪酸酯非离子表面活性剂的实例包括蔗糖，葡萄糖，麦芽糖，果糖和多糖的脂肪酸酯，以及前述的聚环氧烷加合物。
烷基多糖苷非离子表面活性剂的实例包括具有例如葡萄糖，麦芽糖，果糖或蔗糖作为糖苷的那些，例如前述的烷基葡糖苷，烷基聚葡糖苷，聚氧化烯烷基葡糖苷和聚氧化烯烷基聚葡糖苷，以及脂肪酸酯。也可以使用任何前述的聚环氧烷加合物。
这些非离子表面活性剂中的烷基的实例包括C4-C30直链或支链，饱和或不饱和的烷基。聚氧化烯基可以具有C2-C4亚烷基，例如可以具有约1～50摩尔的加成的环氧乙烷。脂肪酸的实例包括C4-C30直链或支链，饱和或不饱和脂肪酸。
在非离子表面活性剂中，特别优选聚氧乙烯亚乙基(10)辛基苯基醚(Triton X-100)或脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span 20)，因为它们具有在保持橡胶颗粒的膜稳定的同时适度去除膜结合蛋白的能力，并且还对蛋白质只有一点变性作用。
两性表面活性剂的实例包括两性离子表面活性剂如季铵基/磺酸盐基(-SO3H)表面活性剂，水溶性季铵基/磷酸酯基表面活性剂，水不溶性季铵基/磷酸酯基表面活性剂和季铵基/羧基表面活性剂。这些两性离子表面活性剂中的酸基可以是盐。
特别地，两性离子表面活性剂优选在分子中具有正电荷和负电荷。酸基的酸解离常数(pKa)优选为5以下，更优选为4以下，进一步优选为3以下。
两性表面活性剂的具体实例包括磺基甜菜碱铵，例如3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)，3-[3-(胆酰胺丙基)-二甲基氨基]-丙磺酸盐(CHAPS)，N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)-胆酰胺，正十八烷基-N，N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，正癸基-N，N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，正十二烷基-N，N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐，正十四烷基-N，N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐(ZwittergentTM-3-14}，正十六烷基-N，N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐和正十八烷基-N，N'-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐；磷酸胆碱如正辛基磷酸胆碱，正壬基磷酸胆碱，正癸基磷酸胆碱，正十二烷基磷酸胆碱，正十四烷基磷酸胆碱和正十六烷基磷酸胆碱；以及磷脂酰胆碱如二月桂酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。其中，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-丙磺酸盐(CHAPS)是特别优选的，因为其能适度去除蛋白质，同时保持橡胶颗粒的膜稳定。
用于处理的表面活性剂的浓度优选在所用表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的三倍以内。如果用超过临界胶束浓度三倍的表面活性剂处理橡胶颗粒，则橡胶颗的膜稳定性可能会降低。浓度更优选在CMC的2.5倍以内，进一步优选在2.0倍以内。浓度的下限优选为CMC的0.05倍以上，更优选为0.1倍以上，进一步优选为0.3倍以上。
可用于无细胞蛋白质合成的反应体系或装置的实例包括分批方法(Pratt,J.M.等,转录和翻译(Transcription and Translation),Hames,179-209,B.D.&Higgins,S.J.编辑,IRL出版社,牛津(1984))，一种连续的无细胞蛋白质合成***，其中将氨基酸，能量源和其它组分连续供入反应体系(Spirin,A.S.等,Science,242,1162-1164(1988))，透析法(Kigawa等,21st Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan,WID6)和覆盖方法(instruction manual of PROTEIOSTMwheat germ cell-free proteinsynthesis core kit,Toyobo Co.,Ltd.)。另一种方法可以是根据需要向蛋白质合成反应体系提供模板RNA，氨基酸，能量源和其它组分，并根据需要排出合成产物或分解产物。
其中，覆盖法具有操作容易的优点，但不幸的是，橡胶颗粒分散在反应溶液中，因此难以有效地结合合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白。相反，在透析法中，由于作为待合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的原料的氨基酸可以通过透析膜，而橡胶颗粒不能通过，因此可以防止橡胶颗粒的分散，因此可以将合成的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白有效地结合到橡胶颗粒上。因此，优选透析法。
透析法是指使用无细胞蛋白质合成用反应溶液作为内部透析液和通过能够传质的透析膜将内部透析溶液与外部透析液分离的装置进行蛋白质合成的方法。具体地说，例如，可以在预培养适当时间之后，将翻译模板加入到除了翻译模板之外的合成反应溶液中，然后将溶液放入合适的透析容器中作为内部反应溶液。透析容器的实例包括将透析膜附接到底部的容器(例如，透析杯12,000，购自Daiichi Kagaku)和透析管(例如，12,000，购自Sanko Junyaku Co.,Ltd.)。所使用的透析膜的分子量截留值为10,000道尔顿或更高，优选约12,000道尔顿。
使用的外部透析溶液是含有氨基酸的缓冲液。当反应速度下降时，通过用新鲜溶液代替外部透析溶液可以提高透析效率。根据所使用的蛋白质合成***适当选择反应温度和时间。例如，在使用小麦衍生的胚芽提取物的***的情况下，反应通常可以在10℃至40℃，优选18℃至30℃，更优选20℃至26℃下进行10分钟至48小时，优选10分钟至30小时，更优选10分钟至24小时。
由于编码包含在无细胞蛋白质合成溶液中的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA容易分解，所以可以在蛋白质合成反应期间适当添加mRNA以使蛋白质合成更有效率。因此，在第一发明的另一个合适的实施方案中，在蛋白质合成反应期间另外加入编码CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的mRNA。
mRNA的添加时间，添加数，添加量和其他条件没有特别限定，可以适当选择。
在第一发明的制造方法中，收集橡胶颗粒的步骤可以任选地在将由编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码用于Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白质的基因表达的蛋白质在体外与橡胶颗粒结合之后进行。
橡胶颗粒收集步骤可以通过可以收集橡胶颗粒的任何方法进行。它可以通过用于收集橡胶颗粒的常规方法进行。具体实例包括使用离心的方法。当通过离心方法收集橡胶颗粒时，可以适当地选择离心力，离心时间和离心温度，以便能够收集橡胶颗粒。例如，离心时的离心力优选为15,000×g以上，更优选为20,000×g以上，进一步优选为25,000×g以上。此外，由于离心力增加过大，不会产生相对应的高的分离效果，所以离心力的上限优选为50,000×g以下，更优选为45,000×g以下。离心时间优选为20分钟以上，更优选为30分钟以上，进一步优选为40分钟以上。另外，由于离心时间增加过长，也不会产生对应高的分离效果，所以离心时间的上限优选为120分钟以下，更优选为90分钟以下。
从保持与橡胶颗粒结合的CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的活性的观点出发，离心温度优选为0℃～10℃，更优选为2℃～8℃，特别优选为4℃。
例如，当进行无细胞蛋白质合成时，橡胶颗粒和无细胞蛋白质合成溶液分别通过离心分离成上层和下层。然后可以除去作为下层的无细胞蛋白质合成溶液以收集与CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合的橡胶颗粒。收集的橡胶颗粒可以重悬浮在具有中性pH值的适当的缓冲液中用于储存。
通过橡胶颗粒收集步骤收集的橡胶颗粒可以以与通常的天然橡胶相同的方式使用，而不需要进一步的特殊处理。
此外，通过使橡胶颗粒进行以下固化步骤，可以回收通过第一发明的制造聚类异戊二烯的方法制造的聚类异戊二烯。
固化步骤中的固化方法没有特别限定，例子包括向乙烯，甲醇，丙酮等不溶解聚类异戊二烯(天然橡胶)的溶剂中添加橡胶颗粒的方法；以及向橡胶颗粒添加酸的方法。橡胶(天然橡胶)可以通过固化步骤从橡胶颗粒中以固体回收。所得橡胶(天然橡胶)可以在使用前根据需要进行干燥。
如上所述，根据第一发明，橡胶颗粒的橡胶合成活性可以通过由编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒体外结合而增加。因此，可以在反应容器(例如试管，工厂)中更有效地生产橡胶(聚类异戊二烯的一个实例)。
因此，第一发明的另一方面涉及一种合成聚类异戊二烯的方法，其包括将编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质与由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质在体外，例如在反应容器(例如试管或工厂)中与橡胶颗粒结合的步骤。
将由编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白质的基因表达的蛋白质体外结合到橡胶颗粒上的步骤如上所述。
在本文中，术语“聚类异戊二烯”是由异戊二烯单元(C5H8)组成的聚合物的总称。聚类异戊二烯的实例包括二倍半萜(C25)，三萜烯(C30)，四萜烯(C40)，天然橡胶和其它聚合物。本文中，术语“类异戊二烯”是指具有异戊二烯单元(C5H8)的化合物，并且在概念上包括聚类异戊二烯。
(橡胶制品的制造方法)
第一发明的橡胶制品的制造方法包括以下步骤：将通过第一发明的聚类异戊二烯的制造方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；由混炼物形成生胶产品；并硫化生胶制品。
橡胶制品没有特别限制，只要它是可以由橡胶，优选天然橡胶制成的橡胶制品，并且实例包括充气轮胎，橡胶辊，橡胶挡板，手套和医用橡胶管。
当橡胶制品是充气轮胎时，或者换句话说，当第一发明的橡胶制品的制造方法是第一发明的充气轮胎的制造方法时，生胶制品形成步骤对应于由混炼物制造生胎的步骤，并且硫化步骤对应于硫化生胎的步骤。因此，第一发明的充气轮胎的制造方法包括以下步骤：将通过制备聚类异戊二烯的方法制备的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物；由混炼物制造生胎；并对生胎进行硫化。
<混炼步骤>
在混炼步骤中，将通过聚类异戊二烯的制备方法生产的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物。
添加剂没有特别限定，可以使用在橡胶制品的制造中使用的添加剂。例如，在橡胶制品为充气轮胎的情况下，添加剂的实例包括除聚类异戊二烯以外的橡胶成分，碳黑，二氧化硅，碳酸钙，氧化铝，粘土，滑石等增强填料，硅烷偶联剂，氧化锌，硬脂酸，加工助剂，各种抗氧化剂，软化剂如油，蜡，硫化剂如硫和硫化促进剂。
混炼步骤中的混炼可以使用开式辊磨机，班伯里密炼机，内部混合机或其他橡胶混炼机进行。
<生胶制品形成步骤(在轮胎的情况下为生胎制造步骤)>
在生胶制品形成步骤中，由混炼步骤中得到的混炼物形成生胶制品(轮胎的情况下为生胎)。
生胶制品的形成方法没有特别限制，可以适当地使用常用于形成生胶制品的方法。例如，在橡胶制品是充气轮胎的情况下，混炼步骤中得到的混炼物可以根据轮胎部件的形状挤出，然后以通常的方式在轮胎成型机上形成，并与其他轮胎部件组装构建生胎(未硫化轮胎)。
<硫化步骤>
在硫化步骤中，将生胶制品形成步骤中得到的生胶制品硫化，得到橡胶制品。
对生胶制品进行硫化的方法没有特别限制，可以适当地使用硫化生胶制品的方法。例如，在橡胶制品是充气轮胎的情况下，可以通过在硫化机中进行加热和压制来硫化生胶制品形成步骤中得到的生胎(未硫化轮胎)，得到充气轮胎。
(第二发明)
(载体)
第二发明的载体含有核苷酸序列，在该核苷酸序列中，编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因，或编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因两者，与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接。通过将这种载体引入植物进行转化，编码载体中参与聚类异戊二烯生物合成的蛋白质的基因，可以在乳管中特异性表达，从而增加植物中的顺式-类异戊二烯或聚类异戊二烯产量。这可能是因为如果为了提高乳胶生产率而引入的外源基因的表达在除了乳管之外的位点被促进，对植物的代谢或胶乳生产施加一定的负荷，从而引起不利影响。
本说明书中，“具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子”是指当所需基因与启动子功能性连接并引入到植物时，启动子具有控制基因表达的活性，使得所需基因在乳管中特异性地表达。术语“乳管特异性基因表达”是指基因基本上仅在乳管中表达，在植物中除了乳管之外的位点没有或几乎没有基因的表达。此外，“基因与启动子功能性连接”是指基因序列连接于启动子的下游，使得该基因由启动子控制。
第二发明的载体可以通过以常规技术将如下核苷酸序列***到通常称为植物转化载体的载体中来制备：具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子的核苷酸序列；和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因的核苷酸序列，或编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因两者的核苷酸序列。可用于制备本发明载体的载体的实例包括pBI载体，诸如pGA482、pGAH和pBIG的二元载体，中间质粒如pLGV23Neo，pNCAT和pMON200，以及含有GATEWAY试剂盒(cassette)的pH35GS。
只要第二发明的载体包含：具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子的核苷酸序列；和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因的核苷酸序列，或编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体的基因NgBR)家族蛋白的基因两者的核苷酸序列，其还可以含有其他核苷酸序列。通常，除了这些核苷酸序列之外，载体还含有源自载体的序列，并且还含有限制酶识别序列，间隔序列，标记基因序列，报告基因序列或其它序列。
标记基因的实例包括耐药基因，如卡那霉素(kanamycin)抗性基因，潮霉素(hygromycin)抗性基因和博来霉素(bleomycin)抗性基因。引入报告基因以确定植物中的表达位点，实例包括荧光素酶基因，β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)。
编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因的来源没有特别限制。它们可以衍生自微生物，动物或植物，优选植物，更优选上述任何一种植物，还更优选选自橡胶树属，苦苣菜属，蒲东英属和银胶菊属的植物中的至少一种。其中进一步优选衍生自选自巴西橡胶树，苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草中的至少一种植物,特别优选巴西橡胶树。最优选地，它们都来源于巴西橡胶树。在另一个合适的实施方案中，编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因衍生自相同的物种。
第二发明中使用的编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因，编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白，CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的基因如上文第一发明所述。
只要第二发明的载体含有具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子的核苷酸序列；和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因的核苷酸序列，或编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因两者的核苷酸序列，其还可以含有编码其他蛋白质的基因的核苷酸序列。
编码其他蛋白质的基因的实例包括如上述第一发明描述的那些。
具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子优选为选自编码橡胶延伸因子(REF)的基因的启动子，编码小橡胶颗粒蛋白质(SRPP)的基因的启动子，编码Hevein2.1(HEV2.1)的基因的启动子和编码MYC1转录因子(MYC1)的基因的启动子。
其中，橡胶延伸因子(REF)是指在产胶植物例如巴西橡胶树的胶乳中与橡胶颗粒结合的橡胶颗粒相关蛋白质，并有助于橡胶粒子的稳定化。
小橡胶颗粒蛋白(SRPP)是指在产胶植物例如巴西橡胶树的胶乳中与橡胶颗粒结合的橡胶颗粒相关蛋白质。
Hevein 2.1(HEV2.1)是指在产胶植物例如巴西橡胶树的乳管细胞中高度表达的蛋白质。该蛋白质参与橡胶颗粒的凝结，并具有抗真菌活性。
MYC1转录因子(MYC1)是指在产胶植物如巴西橡胶树的胶乳中高度表达的转录因子，并且参与茉莉酸信号传导(jasmonic acid signaling)。术语“转录因子”是指具有增加或减少，优选增加基因转录活性的蛋白质。换句话说，本文中的MYC1是具有增加或减少，优选增加编码参与茉莉酸信号传导的蛋白质中至少一种蛋白质的基因的转录的活性(转录因子活性)的蛋白质。
(编码橡胶延伸因子(REF)的基因的启动子)
编码REF的基因的启动子的来源没有特别限制，但是启动子优选来自上述任何一种植物，更优选选自橡胶树属，苦苣菜属，蒲公英属和银胶菊属的植物中的至少一种。其中，启动子进一步优选选自巴西橡胶树，苦苣菜，灰白银胶菊，和橡胶草中的至少一种植物,特别优选巴西橡胶树。
编码REF的基因的启动子优选以下DNA[A1]～[A3]中的任一种：
[A1]具有由SEQ ID NO：9表示的核苷酸序列的DNA；
[A2]在严格条件下与具有核苷酸序列与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列互补的DNA杂交的DNA，其具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性；和
[A3]具有与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列至少60％序列同一性的核苷酸序列且具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的DNA。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
如上述严格条件下能够杂交的DNA一样，已知具有与原始核苷酸序列具有一定序列同一性的核苷酸序列的启动子也可具有启动子活性。为了保持启动子活性，与SEQ IDNO：9表示的核苷酸序列的序列同一性为至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，更优选至少98％，特别优选至少99％。
(编码SRPP基因的启动子)
编码SRPP的基因的启动子的来源没有特别限制，但是启动子优选来自上述任何一种植物，更优选选自橡胶树属，苦苣菜属，蒲公英属和银胶菊属的植物中的至少一种。其中，启动子进一步优选选自巴西橡胶树，苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草的至少一种植物,特别优选巴西橡胶树。
编码SRPP的基因的启动子优选为以下DNA[B1]～[B3]中的任一种：
[B1]具有由SEQ ID NO：10表示的核苷酸序列的DNA；
[B2]在严格条件下与具有核苷酸序列与SEQ ID NO：10表示的核苷酸序列互补的DNA杂交的DNA，其具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性；和
[B3]具有与SEQ ID NO：10表示的核苷酸序列至少60％序列同一性的核苷酸序列，并具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的DNA。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
如上述严格条件下能够杂交的DNA一样，已知具有与原始核苷酸序列具有一定序列同一性的核苷酸序列的启动子也可具有启动子活性。为了保持启动子活性，与SEQ IDNO：10表示的核苷酸序列的序列同一性为至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，更优选至少98％，特别优选至少99％。
(编码HEV2.1的基因的启动子)
编码HEV2.1的基因的启动子的来源没有特别限制，但是启动子优选来自上述任何植物，更优选选自橡胶树属，苦苣菜属，蒲公英属和银胶菊属的植物中的至少一种。其中，启动子进一步优选选自巴西橡胶树，苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草的至少一种植物,特别优选巴西橡胶树。
编码HEV2.1的基因的启动子优选以下DNA[C1]～[C3]中的任一种：
[C1]具有由SEQ ID NO：11表示的核苷酸序列的DNA；
[C2]在严格条件下与具有核苷酸序列与SEQ ID NO：11所示核苷酸序列互补的DNA杂交的DNA，其具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性；和
[C3]具有与SEQ ID NO：11表示的核苷酸序列至少60％序列同一性的核苷酸序列，且具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的DNA。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
如上述严格条件下能够杂交的DNA一样，已知具有与原始核苷酸序列具有一定序列同一性的核苷酸序列的启动子也可具有启动子活性。为了保持启动子活性，与SEQ IDNO：11表示的核苷酸序列的序列同一性为至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，更优选至少98％，特别优选至少99％。
(编码MYC1的基因的启动子)
编码MYC1的基因的启动子的来源没有特别限制，但是启动子优选来自上述任何一种植物，更优选选自橡胶树属，苦苣菜属，蒲公英属和银胶菊属的植物中的至少一种。其中，启动子进一步优选选自巴西橡胶树，苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草的至少一种植物,特别优选巴西橡胶树。
编码MYC1的基因的启动子优选以下DNA[D1]至[D3]中的任一种：
[D1]具有由SEQ ID NO：12表示的核苷酸序列的DNA；
[D2]在严格条件下与具有核苷酸序列与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列互补的DNA杂交的DNA，其具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性；和
[D3]具有与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列至少60％序列同一性的核苷酸序列，且具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的DNA。
如本文所用，术语“杂交”如上所述。此外，严格条件如上所述。
如上述严格条件下能够杂交的DNA一样，已知具有与原始核苷酸序列具有一定序列同一性的核苷酸序列的启动子也可具有启动子活性。为了维持启动子活性，与SEQ IDNO：12表示的核苷酸序列的序列同一性为至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，更优选至少98％，特别优选至少99％。
在严格条件下与上述DNA杂交的DNA或与上述DNA具有至少60％序列同一性的DNA是否具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性，可以通过常规技术来确定，例如使用β-半乳糖苷酶，荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)和其他蛋白质基因作为报告基因的报告物测定。
可以使用常规技术来鉴定启动子的核苷酸序列。例如，通过十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法从生长的植物中提取基因组DNA，然后基于启动子的已知核苷酸序列设计特异性引物和随机引物，并且包括该启动子的基因通过使用提取的基因组DNA作为模板的TAIL(热不对称交错)-PCR来扩增，以鉴定核苷酸序列。
第二发明的载体(载体含有核苷酸序列，在该核苷酸序列中，编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因或编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因这两者功能上连接到具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子上)可以被引入到植物中以产生转基因植物，该转基因植物被转变成在乳管中特异性地表达参与聚类异戊二烯生物合成的特定蛋白质。在转基因植物中，由于涉及聚类异戊二烯生物合成的特定蛋白质的乳管特异性表达，新表达的蛋白质具有的特定功能例如酶活性，在具有引入第二发明的载体的植物的乳管中得到了增强，由此增强一部分聚类异戊二烯生物合成途径。因此，可以增加植物中的顺式-类异戊二烯或聚类异戊二烯的产量。
此外，本发明人首次发现橡胶颗粒的橡胶合成是通过将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒体外结合来活化的。基于这一发现，预期可以通过在植物中共表达CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白来增加橡胶合成活性。因此，预期在聚类异戊二烯生产中使用转基因植物工程改造以共表达CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白导致进一步增加的聚类异戊二烯产量。
因此，当转基因植物通过向植物中引入含有其中编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接的核苷酸序列的载体时，优选还使用含有其中编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接的核苷酸序列的载体。在这种情况下，CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白在转基因植物中被共表达，所述转基因植物通过向植物中引入含有其中编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接的核苷酸序列的载体来产生；以及通过向植物中引入含有其中编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接的核苷酸序列的载体和含有其中编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接的核苷酸序列的载体这两者来产生。因此，CPT家族蛋白的活性预计将稳定和增加。因此，预期被工程化改造成共表达CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的转基因植物持续显示增加的橡胶合成活性，并且在聚类异戊二烯生产中使用这种转基因植物可更适合地导致聚类异戊二烯产量的增加。
含有其中编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因与具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子功能性连接的核苷酸序列的载体是指其中编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因的核苷酸序列连接在具有具有驱动乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子的下游的载体，使得该基因由启动子控制。这样的载体可以如用于第二发明的载体所述地来制备。
下面简要解释制备转基因植物的方法，尽管这样的转基因植物可以通过常规方法制备。
要引入第二发明的载体以产生转基因植物的植物没有特别限制，但是其中优选地是产胶植物，因为特别是当CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白在能够生物合成聚类异戊二烯的植物中表达时，可以预期得到改善的聚类异戊二烯生产率和增加的聚类异戊二烯产量。在其他产胶植物中，植物更优选为选自巴西橡胶树，苦苣菜,灰白银胶菊,和橡胶草中的至少一种，特别优选巴西橡胶树。
可以通过将DNA引入植物细胞的任何方法将第二发明的载体引入植物(包括植物细胞，例如愈伤组织，培养细胞，原生质球和原生质体)中。实例包括使用农杆菌(Agrobacterium)的方法(JP S59-140885A，JP S60-70080A，WO94/00977)，电穿孔(JP S60-251887A)和使用粒子枪(基因枪)的方法(JP 2606856B，JP 2517813B)。其中，转基因植物(转基因植物细胞)优选通过使用农杆菌的方法(Agrobacterium method)将第二发明的载体引入植物而制备。
此外，顺式类异戊二烯或聚类异戊二烯生产可以例如通过任何上述DNA引入方法，将第二发明的载体引入到例如生物体(例如微生物，酵母，动物细胞或昆虫细胞)或其一部分，器官，组织，培养细胞，原生质球或原生质体中来进行。
转基因植物(转基因植物细胞)可以通过上述或其它方法生产。转基因植物在概念上不仅包括通过上述方法产生的转基因植物细胞，还包括它们的所有后代或克隆，以及甚至通过这些细胞传代得到的后代植物。一旦获得引入了第二发明载体的转基因植物细胞，可以通过有性或无性繁殖，组织培养，细胞培养，细胞融合或其它技术由转基因植物细胞产生后代或克隆。此外，转基因植物细胞或其后代或克隆可用于获得生殖材料(例如种子，果实，插条，块茎，块根，芽，不定芽，不定胚，愈伤组织，原生质体)，其然后可以用于大规模生产转基因植物。
由转基因植物细胞再生植物(转基因植物)的技术是已知的；例如，Doi等人公开了用于桉树(eucalyptus)的技术(JP H11-127025A)，Fujimura等人公开了用于水稻的技术(Fujimura等,(1995),Plant Tissue Culture Lett.,第2卷:第74-页)，Shillito等公开了用于玉米的技术(Shillito等,(1989),Bio/Technology,第7卷:第581-页)，Visser等人公开了用于马铃薯的技术(Visser等,(1989),Theor.Appl.Genet.,第78卷:第589-页)和Akama等人公开了拟南芥的技术(Akama等,(1992),Plant Cell Rep.,第12卷:第7-页)。本领域技术人员可以根据这些文献由转基因植物细胞再生植物。
靶蛋白基因是否在再生植物中表达可以通过公知的方法来确定。例如，可以使用蛋白质印迹分析来评估靶蛋白的表达。
可以由转基因植物获得种子，例如如下：将转基因植物植于合适的培养基中，移植到盆中的含水土壤中，并在适当的培养条件下生长，以便最终产生种子，然后收集。此外，植物可以由种子生长，例如如下：由如上所述的转基因植物获得的种子播种在含水土壤中，并在合适的培养条件下生长成植物。
根据第二发明，通过将第二发明的载体引入植物中，在载体中编码参与聚类异戊二烯生物合成的蛋白质的基因，特别优选编码CPT家族蛋白的基因和编码NgBR家族蛋白的基因，在乳管中特异性地表达，从而增强植物中的顺式-类异戊二烯或聚类异戊二烯的产量。具体地说，顺式-类异戊二烯或聚类异戊二烯的生产可以通过如下方式进行：培养例如如上所述产生的转基因植物细胞，由转基因植物细胞获得的愈伤组织，或在合适的培养基中从愈伤组织中分化的细胞，或生长例如由转基因植物细胞再生的转基因植物，或在适当培养条件下由从这些转基因植物收集的种子生长的植物，。
因此，第二发明的另一方面涉及通过将第二发明的载体引入植物来增强植物中的顺式-类异戊二烯产量的方法。此外，第二发明的另一方面涉及通过将第二发明的载体引入植物来增强植物中的聚类异戊二烯产量的方法。
(橡胶制品的制造方法)
第二发明的橡胶制品的制造方法包括以下步骤：将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，其中转基因植物通过将第二发明的载体引入植物而制备得到；由混炼物形成生胶制品；并硫化生胶制品。
橡胶制品如上文第一发明所述。
当橡胶制品是充气轮胎时，或者换句话说，当第二发明的橡胶制品的制造方法是第二发明的充气轮胎的制造方法时，生胶制品形成步骤对应于由混炼物制造生胎的步骤，并且硫化步骤对应于硫化生胎的步骤。因此，第二发明的充气轮胎的制造方法包括以下步骤：将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，其中转基因植物通过将第二发明的载体引入植物而制备；由混炼物制造生胎；并对生胎进行硫化。
<混炼步骤>
在混炼步骤中，将通过转基因植物(通过将第二发明的载体引入植物而制得)产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物。
通过转基因植物(通过将第二发明的载体引入植物而制得)产生的聚类异戊二烯可以通过从转基因植物中收获胶乳，并对收获的胶乳进行下面的固化步骤来获得。
从转基因植物收获胶乳的方法没有特别限制，可以使用普通的收获方法。例如，可以通过收集从植物树干的切口中渗出的乳液(汲取)或从转基因植物的切割的根或其他部分渗出的乳液或通过粉碎切割的组织并用有机溶剂萃取来收获胶乳。
<固化步骤>
对收获的胶乳进行固化步骤。固化方法没有特别限定，实例包括向不溶解聚类异戊二烯(天然橡胶)的溶剂例如乙醇，甲醇或丙酮中添加胶乳的方法；以及向胶乳中添加酸的方法。可以通过固化步骤从胶乳中以固体形式回收橡胶(天然橡胶)。所得橡胶(天然橡胶)可以在使用前根据需要进行干燥。
添加剂没有特别限定，可以使用在橡胶制品的制造中使用的添加剂。例如，在橡胶制品为充气轮胎的情况下，添加剂的实例包括，除了由胶乳得到的橡胶以外的橡胶组分，增强填料如碳黑，二氧化硅，碳酸钙，氧化铝，粘土，滑石，硅烷偶联剂，氧化锌，硬脂酸，加工助剂，各种抗氧化剂，软化剂如油，蜡，硫化剂如硫和硫化促进剂。
混炼步骤中的混炼可以使用开式辊磨机，班伯里密炼机，内部混合机或其他橡胶混炼机进行。
<生胶制品形成步骤(在轮胎的情况下生胎制造步骤)>
生胶制品形成步骤如上文第一发明所述。
<硫化步骤>
硫化步骤如上文第一发明所述。
实施例
参照实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
(实施例1)
[从橡胶树胶乳(Hevea latex)中提取总RNA]
通过热酚法从巴西橡胶树的胶乳中提取总RNA。向6mL胶乳中加入6mL的100mM乙酸钠缓冲液和1mL 10％SDS溶液，然后加入在65℃预热的12mL水饱和苯酚。将混合物在65℃下培育5分钟，在涡旋混合器中搅拌，并在室温下以7,000rpm离心10分钟。离心后，将上清液转移到新试管中，加入12mL苯酚：氯仿(1:1)溶液，并将混合物振荡搅拌2分钟。搅拌后，将所得混合物在室温下以7,000rpm再次离心10分钟，将上清液转移至新试管中，加入12mL氯仿：异戊醇(24:1)溶液，混合物振荡搅拌两分钟。搅拌后，将所得混合物在室温下以7,000rpm再次离心10分钟，将上清液转移到新试管中，加入1.2mL 3M乙酸钠溶液和13mL异丙醇，并将混合物在涡旋混合器中搅拌。将所得混合物在-20℃下培育30分钟以沉淀总RNA。将培育的混合物在4℃以15,000rpm离心10分钟，除去上清液以收集总RNA沉淀物。收集的总RNA用70％乙醇洗涤两次，并溶于无RNA酶的水中。
[由总RNA合成cDNA]
由收集的总RNA合成cDNA。使用PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒(Takara BioInc.)按照该手册进行cDNA合成。
[由cDNA获得CPT和NgBR基因]
将制备的第1链cDNA用作模板以获得CPT和NgBR基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物1：5'-tttggatccgatggaattatacaacggtgagagg-3'
引物2：5'-tttgcggccgcttattttaagtattccttatgtttctcc-3'
使用以下引物获得NgBR基因。
引物3：5'-tttctcgagatggatttgaaacctggagctg-3'
引物4：5'-tttctcgagtcatgtaccataattttgctgcac-3'
如上所述制备CPT基因(HRT1)和NgBR基因(HRTBP)。对基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。HRT1的核苷酸序列由SEQ ID NO：1给出。HRT1的氨基酸序列由SEQID NO：2给出。HRTBP的核苷酸序列由SEQ ID NO：3给出。HRTBP的氨基酸序列由SEQ ID NO：4给出。
[载体(Vector)构建]
将获得的DNA片段进行dA加入，然后使用pGEM-T Easy载体***(Promega)***pGEM-TEasy载体中以制备pGEM-HRT1和pGEM-HRTBP。
[大肠杆菌的转化]
用制备的载体转化大肠杆菌DH5α，将转化体在含有氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基上培养，并通过蓝/白筛选选择携带引入靶基因的大肠杆菌细胞。
[质粒提取]
用含有靶基因的质粒转化的大肠杆菌细胞在LB液体培养基上在37℃下培养过夜。培养后，收集细胞，收集质粒。使用FastGene Plasmid迷你试剂盒(Nippon Genetics Co.，Ltd.)进行质粒收集。
通过序列分析确认***质粒的收集基因的核苷酸序列中没有突变。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
将上述[载体构建]得到的pGEM-HRT1用限制性酶Bam HI和Not I处理，并***到已经用限制酶Bam HI和Not I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-HRT1。
类似地，用限制酶Xho I处理pGEM-HRTBP，并将其***已经用限制酶Xho I类似地处理的pEU-E01-MCS-TEV-His-C1无细胞表达载体中以制备pEU-C1-HRTBP。
[大肠杆菌的转化]
用制备的载体转化大肠杆菌DH5，将转化体在含有氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基上培养，并通过菌落PCR选择携带引入靶基因的大肠杆菌细胞。
[质粒提取]
用含有靶基因的质粒转化的大肠杆菌细胞在LB液体培养基上在37℃下培养过夜。培养后，收集细胞，收集质粒。使用FastGene Plasmid迷你试剂盒(Nippon Genetics Co.，Ltd.)进行质粒收集。
[橡胶颗粒的制备]
橡胶颗粒通过五级离心由橡胶树胶乳制备。向900mL的橡胶树胶乳中加入100mL含有20mM二硫苏糖醇(DTT)的1M Tris缓冲液(pH7.5)以制备胶乳溶液。将胶乳溶液以下列不同速度分阶段离心：1,000×g，2,000×g，8,000×g，20,000×g，50,000×g。每个阶段的离心在4℃进行45分钟。在50,000×g离心后留下的橡胶颗粒层中加入3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基]-丙磺酸盐(CHAPS)，终浓度为0.1～2.0×CMC(0.1～2.0倍临界胶束浓度CMC)，以洗涤橡胶颗粒。洗涤后，通过超速离心(40,000×g，4℃，45分钟)收集橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
将以下量的物质加入到透析杯(MWCO 12000，Bio-Teck)中。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案制备总量为60μL的反应溶液。向反应溶液中加入1-2mg橡胶颗粒。另外将650μL的SUB-AMIX加入到2号PP容器(Maruemu容器)中。
将透析杯放置在2号PP容器中，并在26℃开始蛋白质合成反应。在反应开始后，进行两次mRNA的添加和外部透析溶液(SUB-AMIX)的置换。反应进行24小时。图3示出了透析过程的示意图。
[反应橡胶颗粒的收集]
将透析杯中的溶液转移到新的1.5μL管中，通过超速离心(40,000×g，4℃，45分钟)收集反应的橡胶颗粒，并重新悬浮在等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性如下测量。
首先，将50mM Tris-HCl(pH7.5)，2mM DTT，5mM MgCl2，15μM法呢基二磷酸酯(FPP)，100μM 1-14C异戊烯基二磷酸酯([1-14C]IPP，比活性5Ci/mol)和10μL橡胶颗粒溶液混合以制备反应溶液(总共100μL)，然后在30℃下反应16小时。
反应后，向溶液中加入200μL饱和NaCl，混合物用1mL二***萃取，以萃取异戊烯醇等。接着，用1mL盐水饱和的BuOH从水相中萃取聚类异戊二烯基二磷酸酯，然后用1mL甲苯/己烷(1:1)从水相中进一步提取超长链的聚类异戊二烯(天然橡胶)，然后测定放射性。使用液体闪烁计数器通过14C计数测定各相的放射性。较高的放射性(dpm)表明较高的天然橡胶产量和较高的橡胶合成活性。
结果如表1所示。
[合成的超长链多聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
如上所述合成的超长链多聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布在以下条件下通过放射HPLC测定。图4(a)显示了结果。
HPLC***：GILSON的产品
柱子：TSK保护柱MP(XL)，得自Tosoh Corporation，TSK gel Multipore HXL-M(双柱)
柱温：40℃
溶剂：得自Merck的THF
流速：1mL/min
UV检测：215nm
RI检测：Ramona Star(Raytest GmbH)
(比较例1)
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。使用无细胞表达载体pEU-E01-His-TEV-MCS-N2作为模板，按照WEPRO7240H表达试剂盒的方案进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应的橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果如表1所示。
(比较例2)
按照与实施例1相同的方法，但是使用上述实施例1的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的pEU-C1-HRTBP作为无细胞蛋白质合成的模板，并且收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性如实施例1中那样测量。
结果如表1所示。
(实施例2)
(莴苣Lactuca sativa的CPT和NgBR基因的合成)
通过BLAST公开的公共数据库，使用GenScript Japan的基因合成服务合成从起始密码子到终止密码子的区域来产生莴苣的CPT基因(LsCPT3)和NgBR基因(LsCPTL2)。为了克隆到后面描述的用于无细胞蛋白质合成的载体中，将Xho I和Kpn I位点分别加入到LsCPT3的5'和3'末端，并将EcoRV和XhoI位点分别加入到LsCPTL2的5'和3'末端。
如上所述制备CPT基因(LsCPT3)和NgBR基因(LsCPTL2)。对基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。LsCPT3的核苷酸序列由SEQ ID NO：13给出。LsCPT3的氨基酸序列由SEQ ID NO：14给出。LsCPTL2的核苷酸序列由SEQ ID NO：15给出。LsCPTL2的氨基酸序列由SEQ ID NO：16给出。
[载体构建]
将获得的DNA片段***pUC57中以制备pUC57-LsCPT3和pUC57-LsCPTL2。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制性酶Xho I和Kpn I处理上述[载体构建]中得到的pUC57-LsCPT3，并***到已经用限制酶Xho I和Kpn I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-LsCPT3。
类似地，用限制酶EcoRV和XhoI处理pUC57-LsCPTL2，并***到已经用限制酶EcoRV和Xho I类似地处理的pEU-E01-MCS-TEV-His-C1无细胞表达载体中，制备pEU-C1-LsCPTL2。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应的橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1中那样测量所收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。表1显示结果。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
如上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(a)表示结果。
(实施例3)
[从拟南芥中提取总RNA]
通过热酚法从拟南芥中提取总RNA。将用液氮冷冻的幼苗用研钵研磨。向其中加入400μL水饱和苯酚(80℃)和400μL的RNA提取缓冲液(80℃，100mM LiCl，100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA和1％SDS)，然后旋涡30秒。向其中加入400μL氯仿/异戊醇(24:1)，然后旋涡30秒。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟，并收集上层相。将上层相与500μL的4M LiCl混合，然后在-80℃下放置1小时。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟，除去上清液，得到沉淀物，然后将其溶解于400μL的DEPC处理过的水中。将溶液与880μL乙醇和40μL的3M NaOAc混合。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟，除去上清液，得到沉淀物，然后用300μL的70％乙醇洗涤。将混合物在4℃和15,000rpm下离心5分钟，除去上清液，得到沉淀物，然后将其溶解在30μL的DEPC处理过的水中。为了从提取的总RNA中除去任何基因组DNA污染物，使用DNase I(脱氧核糖核酸酶I)(Takara Bio Inc.)或DNase I重组体，无RNA酶(Roche)进行DNA酶处理。在任一情况下，在制造商推荐的条件下制备50μL反应溶液，然后在37℃下温育30分钟。反应后，将溶液与350μL的经DEPC处理的水和400μL苯酚混合，并在室温和15,000rpm下离心15分钟。收集上层相，并与880μL乙醇和40μL的3M NaOAc混合。将混合物在4℃和15,000rpm下离心15分钟，除去上清液，得到沉淀物，然后用300μL的70％乙醇洗涤。将混合物在4℃和15,000rpm下离心，除去上清液，得到沉淀物，然后将其溶解在50μL的经DEPC处理的水中。
[由总RNA合成cDNA]
按照与实施例1相同的方法进行。
[由cDNA获得CPT和NgBR基因]
将制备的第1链cDNA用作模板以获得CPT和NgBR基因。使用KOD-plus-Neo(ToyoboCo.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，55℃至60℃下15秒，68℃下30秒构成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物5：5'-ctaggatccgagatgaataccctagaag-3'
引物6：5'-aacggatccaactatctaatcgagc-3'
使用以下引物获得NgBR基因。
引物7：5'-cgggatccatggattcgaatcaatcgatgcggctcctc-3'
引物8：5'-gcggatccaattgggaacagtagtggctgcactgactc-3'
[载体构建]
如上所述制备CPT基因(AtCPT8)和NgBR基因(AtLEW1)。用限制性酶BamH I处理基因，并***已经用限制酶BamH I类似处理的pBluescript IISK(-)中，以制备pBS-AtCPT8和pBS-AtLEW1。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
对质粒中的基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。AtCPT8的核苷酸序列由SEQ ID NO：21给出。AtCPT8的氨基酸序列由SEQ ID NO：22给出。AtLEW1的核苷酸序列由SEQ ID NO：23给出。AtLEW1的氨基酸序列由SEQ ID NO：24给出。
将获得的pBS-AtCPT8和pBS-AtLEW1用作模板以获得CPT和NgBR基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，55℃至60℃下15秒，68℃下30秒组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物23：5'-tatcccgggatgaatacc-3'
引物24：5'-tgaactagtctaatcgagcttttt-3'
使用以下引物获得NgBR基因。
引物25：5'-acccgggatggattcg-3'
引物26：5'-cgcggactagtttaagttccatag-3'
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制性酶Xma I和Spe I处理如上所述获得的基因，并***到已经用限制酶Xma I和和Spe I类似处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-AtCPT8和pEU-His-N2-AtLEW1。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应的橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100M Tris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1中那样测量所收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。表1显示结果。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
如上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定，图4(a)表示结果。
[表1]
结合蛋白质 放射性(dpm)
比较例1 无 7500
比较例2 HRTBP 5800
实施例1 HRT1+HRTBP 15500
实施例2 LsCPT3+LsCPTL2 17500
实施例3 AtCPT8+AtLEW1 12000
表1显示，通过将CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合，与将这些蛋白质单独与橡胶颗粒结合时相比，橡胶颗粒的橡胶合成活性显著增加。此外，在NgBR与橡胶颗粒单独结合的比较例2中，橡胶合成活性低于没有结合蛋白质的比较例1。从这些结果可以看出，CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的组合具有大于它们单独作用之和的协同效应。因此，显著提高橡胶颗粒的橡胶合成活性的效果只能通过CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白的特定组合来实现，这是即使本领域技术人员也无法预测的。
图4(a)显示实施例1～3中合成的天然橡胶在基本相同的GPC洗脱时间处具有峰值，表明合成的天然橡胶具有相当的分子量分布模式。在图4中，峰值高度不能用于比较活性，因为它们在样本之间没有标准化。
(实施例4)
[由cDNA获得REF基因]
使用实施例1的[由总RNA合成cDNA]中制备的第1链cDNA作为模板，得到REF基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得REF基因。
引物9：5'-tttctcgagatggctgaagacgaagac-3'
引物10：5'-tttggatcctcaattctctccataaaac-3'
如上所述制备REF基因。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。REF的核苷酸序列由SEQ ID NO：27给出。REF的氨基酸序列由SEQ ID NO：28给出。
[载体构建]
将得到的DNA片段进行dA加入，然后使用pGEM-T Easy载体***(Promega)***pGEM-TEasy载体中以制备pGEM-REF。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
遵循与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
将上述〔载体构建〕中得到的pGEM-REF用限制酶XhoⅠ和BamHⅠ处理，并***到已经用限制酶Xho I和Bam HI类似处理的pEU-E01-MCS-TEV-His-C1无细胞表达载体中，制备pEU-C1-REF。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-C1-REF和在实施例1中[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-His-N2-HRT1和pEU-C1-HRTBP作为模板，进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
(实施例5)
[由cDNA获得CPT基因]
使用实施例1的[由总RNA合成cDNA]中制备的第1链cDNA作为模板，得到CPT基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物11：5'-tttggatccgatggaattatacaacggtgagagg-3'
引物12：5'-tttgcggccgcttattttaagtattccttatgtttctcc-3
如上所述制备CPT基因(HRT2)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。HRT2的核苷酸序列由SEQ ID NO：31给出。HRT2的氨基酸序列由SEQ ID NO：32给出。
[载体构建]
将得到的DNA片段进行dA加入，然后使用pGEM-T Easy载体***(Promega)***pGEM-TEasy载体中，以制备pGEM-HRT2。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制酶Bam HI和Not I处理上述[载体构建]中获得的pGEM-HRT2，并***到已经用限制酶Bam HI和Not I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-HRT2。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-His-N2-HRT2和实施例1的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体pEU-C1-HRTBP，和实施例4的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-C1-REF作为模板，进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
(实施例6)
[由cDNA获得CPT基因]
使用实施例1的[由总RNA合成cDNA]中制备的第1链cDNA作为模板，得到CPT基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物13：5'-atacccgggatggaaatatatac-3'
引物14：5'-actcccgggttattttaaatattc-3'
如上所述制备CPT基因(CPT3)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。CPT3的核苷酸序列由SEQ ID NO：35给出。CPT3的氨基酸序列由SEQ ID NO：36给出。
[载体构建]
将得到的DNA片段进行dA加入，然后使用pGEM-T Easy载体***(Promega)***pGEM-TEasy载体中，以制备pGEM-CPT3。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
将上述〔载体构建〕中得到的pGEM-CPT3用限制酶XmaI处理，并***到已经用限制酶XmaI类似处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-CPT3。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-His-N2-CPT3，实施例1中[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体pEU-C1-HRTBP，和实施例4的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-C1-REF作为模板，进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
(实施例7)
[由cDNA获得CPT基因]
使用实施例1的[由总RNA合成cDNA]中制备的第1链cDNA作为模板，得到CPT基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
使用以下引物获得CPT基因。
引物15：5'-tatcccgggatggaaata-3'
引物16：5'-atacccgggttacaactgc-3'
如上所述制备CPT基因(CPT5)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。CPT5的核苷酸序列由SEQ ID NO：40给出。CPT5的氨基酸序列由SEQ ID NO：41给出。
[载体构建]
将得到的DNA片段进行dA加入，然后使用pGEM-T Easy载体***(Promega)***pGEM-TEasy载体中以制备pGEM-CPT5。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制酶XmaI处理上述[载体构建]中得到的pGEM-CPT5，***到用限制酶Xma I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-CPT5。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-His-N2-CPT5，实施例1的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体pEU-C1-HRTBP，和实施例4的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中得到的载体pEU-C1-REF作为模板，进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
(参考例1)
[短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)的CPT基因的合成]
通过BLAST公开的公共数据库，使用GenScript Japan的基因合成服务，通过合成起始密码子到终止密码子的区域，产生了短角蒲公英的CPT基因(TbCPT1)。为了克隆到后面描述的用于无细胞蛋白质合成的载体中，将Xho I和Kpn I位点分别加入到TbCPT1的5'和3'末端。
如上所述制备CPT基因(TbCPT1)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。TbCPT1的核苷酸序列由SEQ ID NO：42给出。TbCPT1的氨基酸序列由SEQ ID NO：43给出。
[载体构建]
将获得的DNA片段***pUC57中以制备pUC57-TbCPT1。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
将上述〔载体构建〕中得到的pUC57-TbCPT1用限制酶Xho I和Kpn I处理，并***到已经用限制酶Xho I和Kpn I类似处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-TbCPT1。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(b)显示结果。图4(b)显示参考例1中合成的天然橡胶在和实施例1～3中合成的天然橡胶基本相同的GPC洗脱时间处具有峰，表明合成天然橡胶具有相当的分子量分布图。
这些结果强烈地表明，通过额外地将NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合，使得TbCPT1蛋白质和NgBR家族蛋白质与橡胶颗粒结合，稳定和增加在橡胶颗粒上的TbCPT1蛋白质的活性，从而增加橡胶颗粒的橡胶合成活性。
(参考例2)
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。使用在实施例5的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体pEU-His-N2-HRT2作为模板，按照WEPRO7240H表达试剂盒的方案进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(b)表示结果。图4(b)表示参考例2中合成的天然橡胶和实施例1～3中合成的天然橡胶在基本相同的GPC洗脱时间处具有峰，表明合成天然橡胶具有相当的分子量分布图。
这些结果强烈地表明，其中NgBR家族蛋白和REF额外地与橡胶颗粒结合的实施例5中合成的天然橡胶也具有相当的分子量分布图。
(参考例3)
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用实施例6的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体pEU-His-N2-CPT3作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(b)表示结果。图4(b)显示参考例3中合成的天然橡胶和实施例1～3中合成的天然橡胶在基本相同的GPC洗脱时间处具有峰，表明合成天然橡胶具有相当的分子量分布图。
这些结果强烈地表明，其中NgBR家族蛋白和REF额外地与橡胶颗粒结合的实施例6中合成的天然橡胶也具有相当的分子量分布图。
(参考例4)
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。使用在实施例7的[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体pEU-His-N2-CPT5作为模板，按照WEPRO7240H表达试剂盒的方案进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
如实施例1那样测量收集的反应橡胶颗粒的橡胶合成活性。
结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(b)表示结果。图4(b)显示参考实施例4中合成的天然橡胶与实施例1至3中合成的天然橡胶在基本相同的GPC洗脱时间处具有峰，表明合成的天然橡胶具有相当的分子量分布图。
这些结果强烈地表明，其中NgBR家族蛋白和REF额外地与橡胶颗粒结合的实施例7中合成的天然橡胶，也具有相当的分子量分布图。
(参考例5)
[人(Homo sapiens)的CPT基因的合成]
通过BLAST公开的公共数据库，使用GenScript Japan的基因合成服务，合成从起始密码子到终止密码子的区域来产生Homo sapiens的CPT基因(HDS)。为了克隆到后述的用于无细胞蛋白质合成的载体中，将Xma I和Spe I位点分别加入到HDS的5'和3'末端。
如上所述制备CPT基因(HDS)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。HDS的核苷酸序列由SEQ ID NO：64给出。HDS的氨基酸序列由SEQ ID NO：50给出。
[载体构建]
将获得的DNA片段***pUC57中以制备pUC57-HDS。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制酶Xma I和Spe I处理上述[载体构建]中得到的pUC57-HDS，并***到已经用限制酶Xma I和Spe I类似地处理的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-HDS。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
除了将反应时间从16小时变更为4小时以外，与实施例1同样地测定所收集的反应性橡胶颗粒的橡胶合成活性。结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
如上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(c)表示结果。图4(c)显示参考例5中合成的天然橡胶与实施例1～3中合成的天然橡胶在基本相同的GPC洗脱时间处具有峰，表明合成天然橡胶具有相当的分子量分布图。
这些结果强烈地表明，通过额外地将NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合使得HDS蛋白质和NgBR家族蛋白两者都与橡胶颗粒结合，稳定和增加橡胶颗粒上的HDS蛋白质的活性，从而增加橡胶颗粒的橡胶合成活性。
(参考例6)
[酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的CPT基因的合成]
通过BLAST公开的公共数据库，使用GenScript Japan的基因合成服务合成从起始密码子到终止密码子的区域来产生酵母(酿酒酵母)的CPT基因(SRT1)。为了克隆到后述的用于无细胞蛋白质合成的载体中，将Xma I和Spe I位点分别加入到SRT1的5'和3'末端。
如上所述制备CPT基因(SRT1)。对该基因进行测序以鉴定全长核苷酸序列和氨基酸序列。SRT1的核苷酸序列由SEQ ID NO：63给出。SRT1的氨基酸序列由SEQ ID NO：47给出。
[载体构建]
将获得的DNA片段***pUC57中以制备pUC57-SRT1。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]
用限制酶XmaⅠ和SpeⅠ处理上述[Vector构建]得到的pUC57-SRT1，并***到已经用限制酶Xma I和Spe I类似地处理过的pEU-E01-His-TEV-MCS-N2无细胞表达载体中，制备pEU-His-N2-SRT1。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[橡胶颗粒的制备]
按照与实施例1相同的方法进行。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤1：mRNA转录反应)]
使用WEPRO7240H表达试剂盒(CellFree Sciences Co.，Ltd.)进行无细胞蛋白质合成。根据WEPRO7240H表达试剂盒的方案，使用上述[用于无细胞蛋白质合成的载体的制备]中获得的载体作为模板进行mRNA转录反应。
[mRNA的纯化]
转录反应后，通过乙醇沉淀纯化得到的mRNA。
[无细胞蛋白质合成反应(步骤2：通过透析进行蛋白质合成)]
遵循与实施例1相同的方法，但使用上述mRNA。
[反应橡胶颗粒的收集]
如实施例1收集反应橡胶颗粒，并重新悬浮于等量的含有2mM二硫苏糖醇(DTT)的100MTris缓冲液(pH7.5)中。
[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]
除了将反应时间从16小时变更为4小时以外，与实施例1同样地测定所收集的反应性橡胶颗粒的橡胶合成活性。结果证实，合成了天然橡胶，并且所收集的反应橡胶颗粒具有橡胶合成活性。
[合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布的测定)
如上述[反应橡胶颗粒的橡胶合成活性的测定]中合成的超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的分子量分布如实施例1那样测定。图4(c)表示结果。图4(c)显示参考例6中合成的天然橡胶与实施例1～3中合成的天然橡胶在基本相同的GPC洗脱时间处具有峰，表明合成天然橡胶具有相当的分子量分布图。
这些结果强烈地表明，通过额外地将NgBR家族蛋白与橡胶颗粒结合，使得SRT1蛋白和NgBR家族蛋白两者都与橡胶颗粒结合，稳定和增加橡胶颗粒上的SRT1蛋白的活性，从而增加橡胶颗粒的橡胶合成活性。
<引入酵母的CPT家族蛋白的橡胶合成活性>
(参考例7)
[用于酵母表达的基因的获取]
使用实施例1和5中制备的pGEM-HRT1和pGEM-HRT2作为模板和下述引物进行PCR从而产生用于克隆到pJR1133酵母表达载体中的HRT1和HRT2基因，所述HRT1和HRT2基因在5'和3'末端包含BamHI限制酶位点。
以下引物用于HRT1和HRT2。
引物17：5'-ttaggatccatggaattatacaacgg-3'
引物18：5'-aacggatccttttaagtattccttatg-3'
此外，用限制酶Bam HI处理实施例3中获得的pBS-AtCPT8，以在5'和3'末端产生含有BamHI限制酶位点的AtCPT8基因。
此外，使用实施例1和3中制备的pGEM-HRTBP和pBS-AtLEW1作为模板和下述引物进行PCR，以产生分别克隆到pGK415和pGK425酵母表达载体中的在5'和3'末端含有Xho I限制酶位点的HRTBP基因，以及在5'末端含有SalI限制酶位点并在3'末端含有BamHI限制酶位点的AtLEW1基因。使用KOD-plus-Neo(Toyobo Co.，Ltd.)按照说明书进行PCR。PCR反应涉及35个循环，每个循环由98℃下10秒，58℃下30秒和68℃下1分钟组成。
以下引物用于HRTBP。
引物19：5'-tttctcgagatggatttgaaacctggagctg-3'
引物20：5'-tttctcgagtcatgtaccataattttgctgcac-3'
以下引物用于AtLEW1。
引物21：5'-gtcgacatggattcgaatcaatcg-3'
引物22：5'-ggatccttaagttccatagttttgg-3'
[载体构建]
将获得的DNA片段进行dA加入，然后使用pGEM-T Easy载体***(Promega)***pGEM-TEasy载体中以制备pGEM-HRT1(用于pJR1133)，pGEM-HRT2(用于pJR1133)，pGEM-AtCPT8(用于pJR1133)，pGEM-HRTBP(用于pGK425)和pGEM-AtLEW1(用于pGK425)。
[大肠杆菌的转化]
遵循与实施例1相同的方法，但使用制备的载体。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[酵母表达载体的制备]
将上述[载体构建]中得到的pGEM-CPT系列用限制酶Bam HI处理，并***到已经用限制酶BamHI类似地进行处理的pJR1133酵母表达载体中以制备pJR1133-HRT1，pJR1133-HRT2，和pJR1133-AtCPT8。
另外，用限制酶Xho I处理上述[载体构建]中得到的pGEM-NgBR系列，并***到用限制酶SalI类似地处理的pGK425酵母表达载体中，制备pGK425-HRTBP和pGK425-AtLEW1。
[大肠杆菌的转化]
用制备的载体转化大肠杆菌DH5α，并将每个转化体在含有氨苄青霉素(ampicillin)的LB培养基上培养。
[质粒提取]
按照与实施例1相同的方法进行。
[酵母的转化]
用制备的质粒的以下组合转化酵母SNH23-7D(MAT-αrer2-2mf-1::ADE2mf-2::TRP1bar1::HIS3ade2trp1his3leu2ura3lys2)。
(1)pJR1133-HRT1和pGK425-HRTBP
(2)pJR1133-HRT2和pGK425-HRTBP
(3)pJR1133-AtCPT8和pGK425-AtLEW1
将转化的酵母在尿嘧啶(用于pJR1133选择)和无亮氨酸(用于pGK425选择)的SD琼脂培养基上培养以产生转化体。
[酶的表达]
将上述获得的每种转化酵母加入到50mL SC(+赖氨酸Lys)培养基中，然后在23℃和180rpm下振荡培养。达到OD546＝0.8时，将45mL的细胞培养物收集在50mL取样管中，并以5,000×g离心10分钟。除去上清液后，将残余物在-80℃下冷冻保存。
SC(+Lys)培养基的组成如下。
硫酸铵：5.0g
酵母氮碱w/o氨基酸：1.7g
赖氨酸HCl：30mg
葡萄糖：20克
灭菌水：最高达1升
[粗制酶溶液的制备]
将每个冷冻保存的样品在冰上融化，悬浮于100μL酵解酶缓冲液中，并在23℃下放置15分钟。将混合物离心以除去上清液。向其中加入300μL含有2mg/mL酵解酶100T的酵解酶缓冲液，然后在30℃下进行酶反应40分钟，将细胞转化成原生质球。将混合物离心以除去上清液，悬浮于300μL酵解酶缓冲液中。将混合物离心以除去上清液，将细胞悬浮在破碎缓冲液(breakage buffer)中，然后进行三次30秒涡旋混合的循环，然后在冰上冷却30秒，使用0.5mm玻璃珠破坏细胞。将混合物在300×g下离心5分钟以除去未破裂的细胞。将收集的上清液以17,400×g离心以分离上清液和沉淀物。将沉淀物悬浮在破碎缓冲液中。将悬浮液用作粗制酶溶液，其是不溶性级分。酵解酶缓冲液和破碎缓冲液的组成如下所述。
酵解酶缓冲液：
Tris-HCl(pH7.5)50mM
MgCl2 10mM
山梨糖醇1M
DTT 1×
破碎缓冲液：
Tris-HCl(pH8.0)100mM
NaCl 150mM
DTT 1mM
蛋白酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque Inc.)1×
[橡胶合成活性的测定(反相TLC(聚异戊二烯二磷酸酯)的反应产物的分析))]
每个收集的粗制酶溶液中的橡胶合成活性如下测量。
首先，将25mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，25mMβ-巯基乙醇，20mM KF，4mM MgCl2，10μM法呢基二磷酸酯(FPP)，50μM 1-14C异戊烯基二磷酸酯([1-14C]IPP)，特异性活性60Ci/mol)和50μg粗制酶溶液混合以制备反应溶液(总共100μL)，然后在30℃下反应20小时。
通过加入200μL饱和盐水终止反应。将反应溶液与1mL二***混合并涡旋。将混合物以15,000rpm离心1分钟，将上层相(***相)收集在单独的管中。向水相中加入1mL水饱和的丁醇。将混合物搅拌，随后以15,000rpm离心1分钟以收集上层相(丁醇相)，由此提取酶反应产物。
丁醇相用水洗涤。随后，使用离心蒸发器除去溶剂以浓缩反应产物。浓缩的反应产物通过在37℃下与下列组合物反应12小时而去磷酸化，得到相应的聚异戊二烯醇。
反应组合物(总计100mL)：
乙酸盐缓冲液(pH 5.6)40mM
Triton X-100 0.1％(v/v)
甲醇40％(v/v)
丁醇相(反应产物)20％(v/v)
马铃薯酸性磷酸酶(Roche)10U
通过加入120μL的5M NaOH，停止反应，同时在37℃下进行水解30分钟。向反应溶液中加入0.7mL戊烷，并将混合物搅拌以将聚异戊二烯醇萃取到戊烷相中。在15,000rpm下进行离心1分钟以收集上层相(戊烷相)。使用反相TLC板(LKC-18，Whatman)展开产物。所用的展开溶剂是丙酮和水的混合物(丙酮：水＝39:1)。原点(origin)和溶剂前沿(solventfront)用含有14C标记的放射性物质的油墨标记，使用Typhoon FLA 7000(GE HealthcareJapan Corporation)进行放射自显影。通过比较放射性反应产物与参考物质的点的位置来分析产物的链长。
结果证实，在所有使用任何质粒(1)至(3)的情况下，合成了具有约90个碳原子的异戊二烯聚合物。
<引入大肠杆菌的CPT家族蛋白的橡胶合成活性>
(参考例8)
[大肠杆菌的转化]
使用在实施例1,3和5中分别获得的pGEM-HRT1，pBS-AtCPT8和pGEM-HRT2以及分别在实施例1和3中获得的pGEM-HRTBP和pBS-AtLEW1。将这些基因各自***pCOLADuet1载体中。用具有下列组合的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)。
(1)HRT1-HRTBP
(2)HRT2-HRTBP
(3)AtCPT8-AtLEW1
[大肠杆菌中橡胶合成活性的测定]
如参考例7中那样测量橡胶合成活性，但使用在上述[大肠杆菌的转化]中转化的大肠杆菌。结果表明，在使用任何质粒(1)至(3)的所有情况下，反应产物太少而无法检测。
在如参考例7和8中那样将来源于巴西橡胶树或拟南芥的CPT家族蛋白(HRT1，HRT2，AtCPT8)引入大肠杆菌中的情况中，未检测到反应产物。接下来，在将CPT家族蛋白引入酵母中的情况下，可以确认链长为约90个碳原子的异戊二烯聚合物的合成。
相反，如实施例1～7和参考例1,5和6中那样，CPT族蛋白中的任一种与橡胶颗粒结合的情况下，橡胶合成活性测定证实了超长链聚类异戊二烯(天然橡胶)的合成。换句话说，天然橡胶不仅可以通过将橡胶颗粒与来自产胶植物并被认为在乳管中表达的CPT家族蛋白(HRT1，HRT2，CPT3，CPT5，LsCPT3，TbCPT1)结合来合成，而且还可以通过结合来自不是产胶植物的拟南芥的AtCPT8，源自酵母的SRT1或源自人的HDS来合成。
这些结果表明，引入基因的宿主，或换句话说，表达CPT家族蛋白的环境对于橡胶合成活性比CPT家族蛋白的起源或类型更为重要。
基于上述，本发明人假定了以下机理。
也就是说，假设由CPT家族蛋白合成的产物的链长取决于合成产物积聚的位置的疏水性和空间。
具体地说，在诸如大肠杆菌等原核生物中，CPT家族蛋白显示出产生不可检测的反应产物的活性，或者即使它们显示合成产物的活性，该产品的链仅延伸到CPT家族蛋白的疏水性裂缝结构内的可接收长度。
在诸如酵母的真核生物中，由CPT家族蛋白合成的产物从CPT家族蛋白的疏水性裂缝结构转移到细胞的脂质双层中，例如转移到内质网管腔中，并且积聚在其环境为疏水性但是其空间不是非常大的脂质双层中，因此产品具有有限的链长度(上述具有大约90个碳原子的链长的异戊二烯聚合物可能以这种方式合成)。
同样在拟南芥等非产胶植物中，与酵母类似，由CPT家族蛋白合成的产物积聚在其空间不大的细胞的脂质双层中，因此认为合成产物也具有有限的链长度。
相比之下，当CPT家族蛋白与橡胶颗粒结合时，由CPT家族蛋白合成的产物聚集在其环境是疏水的并且其空间远大于细胞的脂质双层的橡胶颗粒中，如图1所示。因此，产物的链长度在这样的疏水环境中充分地延伸，几乎没有空间限制，从而可以合成超长链的聚类异戊二烯(天然橡胶)。
因此，强烈表明了通过将任何CPT家族蛋白(而不管蛋白质的来源，类型和其他因素)与NgBR家族蛋白一起结合到橡胶颗粒，可以提高橡胶颗粒的橡胶合成活性，从而达到本发明的效果。
<CPT家族蛋白的保存区域的计算机评估>
对图5所示来自各种生物体的CPT家族蛋白进行多个序列比对，以搜索高度保存的序列(保存区域)。图5显示了保存区域周围的比对结果。
使用称为Genetyx Ver.11的软件进行多个序列比对。
在图5中，UDP焦磷酸合成酶(大肠杆菌CPT)对应于SEQ ID NO：45所示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的7～125位；
UDP(藤黄微球菌(Micrococcus luteus)B-P 26CPT)对应于由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的11至129位；
SRT1(酵母CPT)对应于由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的57至175位；
AtCPT5(拟南芥CPT5)对应于由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的61至179位；
AtCPT8(拟南芥CPT8)对应于由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的25至142位；
DDPS(烟草樟子松(Nicotiana sylvestris)CPT)对应于由SEQ ID NO：48表示的烟草的DDPS的24至140位；
HbCPT1(巴西橡胶树CPT)对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的23至139位；
HbCPT2(巴西橡胶树CPT)对应于由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的23至139位；
HbCPT3(巴西橡胶树CPT)对应于由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的23至139位；
HbCPT4(巴西橡胶树CPT)对应于由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的24至140位；
HbCPT5(巴西橡胶树CPT)对应于由SEQ ID NO：41表示的巴西橡胶树CPT5的23至139位；
LsCPT3(莴苣(Lactuca sativa)CPT)对应于由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的40至156位；
TbCPT1(短角蒲公英CPT)对应于SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的40至154位；
DDPS(小鼠CPT)对应于由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的16至132位；和
HDS(人类CPT)对应于由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的16至132位。
根据文献例如Shota Endo等,Biochimica et Biophysica Acta,第1625期(2003),291-295页和Masahiro Fujihashi等,PNAS,第98卷,第8期(2001),4337-4342页可知,图5中方框A(对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的41至49位)和方框B(对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的81至97位)是来自各种生物体的CPT家族蛋白的高度保存区域的一部分。特别地，认为在对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的41位的位置上保存的天冬氨酸残基(图5的(1))，在对应于由SEQ IDNO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的42位的位置上的甘氨酸残基(图5(2))，在对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的45位的位置上保存的精氨酸残基(图5(3))，和在对应于来自巴西橡胶树的HRT1的89位的位置处保存的天冬酰胺残基(图5中的(4))是用于CPT家族蛋白的酶反应的必需氨基酸，使得在各自的位置具有这些氨基酸的蛋白质具有CPT家族蛋白的功能。
从图5可以如下理解。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的41至49位的方框A中的保存区域对应于：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的25至33位；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的29至37位；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的75至83位；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的79至87位；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的43至51位；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的42至50位；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的41至49位；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的41至49位；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的42至50位；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的41至49位；
由SEQ ID NO：14表示来自莴苣的LsCPT3的58至66位；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的58～66位；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的34至42位；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的34至42位。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的81至97位的方框B中的保存区域对应于：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的65～81位；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的69至85位；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的115～131位；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的119至135位；
由SEQ ID NO：22所示的来自拟南芥的AtCPT8的84至100位；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的82至98位；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的81至97位；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的81至97位；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的82至98位；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的81至97位；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的98至114位；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的98到114位；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的74至90位；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的74至90位。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的41位的天冬氨酸残基(1)对应于：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的25位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的29位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的75位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的79位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的43位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的42位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的41位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的41位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的42位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的41位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的58位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的58位处的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的34位处的天冬氨酸残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的34位处的天冬氨酸残基。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的42位处的甘氨酸残基(2)对应于：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的26位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合酶(UPS)的30位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的76位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的80位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的44位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的43位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的42位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的42位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的43位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的42位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：14所示的来自莴苣的LsCPT3的59位处的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1在59位的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的35位处的甘氨酸残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的35位处的甘氨酸残基。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的45位的精氨酸残基(3)对应于：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)在29位的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的33位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的79位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的83位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的47位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的46位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的45位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的45位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4在46位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的45位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的62位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的62位处的精氨酸残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的38位处的精氨酸残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的38位处的精氨酸残基。
对应于由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列中的89位处的天冬酰胺残基(4)对应于：
由SEQ ID NO：45表示的来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的73位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：46表示的来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的77位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：47表示的来自酵母的SRT1的123位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：44表示的来自拟南芥的AtCPT5的127位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：22表示的来自拟南芥的AtCPT8的92位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：48表示的来自烟草的DDPS的90位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：32表示的来自巴西橡胶树的HRT2的89位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：36表示的来自巴西橡胶树的CPT3的89位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：37表示的来自巴西橡胶树的CPT4的90位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：41表示的来自巴西橡胶树的CPT5的89位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：14表示的来自莴苣的LsCPT3的106位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：43表示的来自短角蒲公英的TbCPT1的106位处的天冬酰胺残基；
由SEQ ID NO：49表示的来自小鼠的DDPS的82位处的天冬酰胺残基；和
由SEQ ID NO：50表示的来自人的HDS的82位处的天冬酰胺残基。
(序列表自由文本)
SEQ ID NO：1：编码来自巴西橡胶树的HRT1的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：2：来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：编码来自巴西橡胶树的HRTBP的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：4：来自巴西橡胶树的HRTBP的氨基酸序列
SEQ ID NO：5：引物1
SEQ ID NO：6：引物2
SEQ ID NO：7：引物3
SEQ ID NO：8：引物4
SEQ ID NO：9：编码来自巴西橡胶树的橡胶延伸因子的基因的启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：10：编码来自巴西橡胶树的小橡胶颗粒蛋白质的基因的启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：11：编码来自巴西橡胶树的Hevien 2.1的基因的启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：12：编码来自巴西橡胶树的MYC1转录因子的基因的启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：13：编码来自莴苣的LsCPT3的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：14：来自莴苣的LsCPT3的氨基酸序列
SEQ ID NO：15：编码来自莴苣的LsCPTL2的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：16：来自莴苣的LsCPTL2的氨基酸序列
SEQ ID NO：17：引物5
SEQ ID NO：18：引物6
SEQ ID NO：19：引物7
SEQ ID NO：20：引物8
SEQ ID NO：21：编码来自拟南芥的AtCPT8的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：22：来自拟南芥的AtCPT8的氨基酸序列
SEQ ID NO：23：编码来自拟南芥的AtLEW1的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：24：来自拟南芥的AtLEW1的氨基酸序列
SEQ ID NO：25：引物9
SEQ ID NO：26：引物10
SEQ ID NO：27：编码来自巴西橡胶树的REF的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：28：来自巴西橡胶树的REF的氨基酸序列
SEQ ID NO：29：引物11
SEQ ID NO：30：引物12
SEQ ID NO：31：编码来自巴西橡胶树的HRT2的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：32：来自巴西橡胶树的HRT2的氨基酸序列
SEQ ID NO：33：引物13
SEQ ID NO：34：引物14
SEQ ID NO：35：编码来自巴西橡胶树的CPT3的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：36：来自巴西橡胶树的CPT3的氨基酸序列
SEQ ID NO：37：来自巴西橡胶树的CPT4的氨基酸序列
SEQ ID NO：38：引物15
SEQ ID NO：39：引物16
SEQ ID NO：40：编码来自巴西橡胶树的CPT5的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：41：来自巴西橡胶树的CPT5的氨基酸序列
SEQ ID NO：42：编码来自短角蒲公英的TbCPT1的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：43：来自短角蒲公英的TbCPT1的氨基酸序列
SEQ ID NO：44：来自拟南芥的AtCPT5的氨基酸序列
SEQ ID NO：45：来自大肠杆菌的十一异戊二烯基焦磷酸合酶(UPPS)的氨基酸序列
SEQ ID NO：46：来自微球菌的十一异戊二烯基二磷酸合成酶(UPS)的氨基酸序列
SEQ ID NO：47：来自酵母的SRT1的氨基酸序列
SEQ ID NO：48：来自烟草的DDPS的氨基酸序列
SEQ ID NO：49：来自小鼠的DDPS的氨基酸序列
SEQ ID NO：50：来自人的HDS的氨基酸序列
SEQ ID NO：51：来自巴西橡胶树的HRT1的41至49位处的氨基酸序列
SEQ ID NO：52：来自巴西橡胶树的HRT1的81至97位处的氨基酸序列
SEQ ID NO：53：引物17
SEQ ID NO：54：引物18
SEQ ID NO：55：引物19
SEQ ID NO：56：引物20
SEQ ID NO：57：引物21
SEQ ID NO：58：引物22
SEQ ID NO：59：引物23
SEQ ID NO：60：引物24
SEQ ID NO：61：引物25
SEQ ID NO：62：引物26
SEQ ID NO：63：编码来自酵母的SRT1的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO：64：编码来自人的HDS的基因的核苷酸序列
序列表
<110> 住友橡胶工业株式会社
国立大学法人东北大学
<120> 聚类异戊二烯、载体、转基因植物的制造方法，充气轮胎的制造方法及橡胶制品的制造方法
<130> SR2366WO
<140> PCT/JP2016/069172
<141> 2016-06-28
<150> JP 2015-131024
<151> 2015-06-30
<150> JP 2016-054541
<151> 2016-03-17
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 1
atggaattat acaacggtga gaggccaagt gtgttcagac ttttagggaa gtatatgaga 60
aaagggttat atagcatcct aacccagggt cccatcccta ctcatattgc cttcatattg 120
gatggaaaca ggaggtttgc taagaagcat aaactgccag aaggaggtgg tcataaggct 180
ggatttttag ctcttctgaa cgtactaact tattgctatg agttaggagt gaaatatgcg 240
actatctatg cctttagcat cgataatttt cgaaggaaac ctcatgaggt tcagtacgta 300
atggatctaa tgctggagaa gattgaaggg atgatcatgg aagaaagtat catcaatgca 360
tatgatattt gcgtacgttt tgtgggtaac ctgaagcttt taagtgagcc agtcaagacc 420
gcagcagata agattatgag ggctactgcc aacaattcca aatgtgtgct tctcattgct 480
gtatgctata cttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc tgaattgaac 540
tccaatgaag tttgtaacaa tcaagaattg gaggaggcaa atgcaactgg aagcggtact 600
gtgattcaaa ttgagaacat ggagtcgtat tctggaataa aacttgtaga ccttgagaaa 660
aacacctaca taaatcctta tcctgatgtt ctgattcgaa cttctgggga gacccgtctg 720
agcaactact tactttggca gactactaat tgcatactgt attctcctca tgcactgtgg 780
ccagagattg gtcttcgaca cgtggtgtgg gcagtaatta acttccaacg tcattattct 840
tacttggaga aacataagga atacttaaaa taa 873
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 2
Met Glu Leu Tyr Asn Gly Glu Arg Pro Ser Val Phe Arg Leu Leu Gly
1 5 10 15
Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Thr His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly Gly His Lys Ala Gly Phe Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Asn Val Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Lys Pro His Glu
85 90 95
Val Gln Tyr Val Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Gly Met Ile
100 105 110
Met Glu Glu Ser Ile Ile Asn Ala Tyr Asp Ile Cys Val Arg Phe Val
115 120 125
Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Pro Val Lys Thr Ala Ala Asp Lys
130 135 140
Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Lys Cys Val Leu Leu Ile Ala
145 150 155 160
Val Cys Tyr Thr Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser
165 170 175
Ser Glu Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gln Glu Leu Glu Glu
180 185 190
Ala Asn Ala Thr Gly Ser Gly Thr Val Ile Gln Ile Glu Asn Met Glu
195 200 205
Ser Tyr Ser Gly Ile Lys Leu Val Asp Leu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile
210 215 220
Asn Pro Tyr Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Thr Arg Leu
225 230 235 240
Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Ser Pro
245 250 255
His Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg His Val Val Trp Ala Val
260 265 270
Ile Asn Cys Gln Arg His Tyr Ser Tyr Leu Glu Lys His Lys Glu Tyr
275 280 285
Leu Lys
290
<210> 3
<211> 774
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 3
atggatttga aacctggagc tggagggcag agagttaatc gattagtgga tccgattagt 60
tatcattttc ttcaatttct gtggcgtact ctacatcttc ttgtcagctt atggtacctt 120
caagttagta tggtccaaat gatcgaaggc tttctaatct ctagtggact tgtgaaacgc 180
tatggagccc tcgatattga caaggtccgg taccttgcca ttgtggtaga tagtgaagaa 240
gcttaccaaa tttctaaagt tattcagctt ttgaaatggg tggaagatat gggtgtgaaa 300
catttatgcc tctatgattc aaaaggagtt ctcaagacaa acaagaaaac catcatggag 360
agtttgaaca atgctatgcc atttgaggaa gcagttgaaa aagatgtttt actggaccag 420
aaacagatga ctgtggaatt tgcttccagc tccgatggaa aggaagcaat aaccagggca 480
gctaacgtac tctttatgaa gtatttgaag tatgctaaaa ctggtgtagg aaaggaagaa 540
ccatgcttta cagaagatca aatggatgag gcactaaaag ctataggtta caaagggccg 600
gaacctgact tgctattaat ttatggacct gttagatgcc atctaggttt ctcaccgtgg 660
agacttcgat atactgagat ggtgcatatg ggacccttga ggtacatgaa cctcggttca 720
ctaaaaaagg ccattcacag gttcacaaca gtgcagcaaa attatggtac atga 774
<210> 4
<211> 257
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 4
Met Asp Leu Lys Pro Gly Ala Gly Gly Gln Arg Val Asn Arg Leu Val
1 5 10 15
Asp Pro Ile Ser Tyr His Phe Leu Gln Phe Leu Trp Arg Thr Leu His
20 25 30
Leu Leu Val Ser Leu Trp Tyr Leu Gln Val Ser Met Val Gln Met Ile
35 40 45
Glu Gly Phe Leu Ile Ser Ser Gly Leu Val Lys Arg Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Ile Asp Lys Val Arg Tyr Leu Ala Ile Val Val Asp Ser Glu Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Gln Ile Ser Lys Val Ile Gln Leu Leu Lys Trp Val Glu Asp
85 90 95
Met Gly Val Lys His Leu Cys Leu Tyr Asp Ser Lys Gly Val Leu Lys
100 105 110
Thr Asn Lys Lys Thr Ile Met Glu Ser Leu Asn Asn Ala Met Pro Phe
115 120 125
Glu Glu Ala Val Glu Lys Asp Val Leu Leu Asp Gln Lys Gln Met Thr
130 135 140
Val Glu Phe Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Glu Ala Ile Thr Arg Ala
145 150 155 160
Ala Asn Val Leu Phe Met Lys Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Thr Gly Val
165 170 175
Gly Lys Glu Glu Pro Cys Phe Thr Glu Asp Gln Met Asp Glu Ala Leu
180 185 190
Lys Ala Ile Gly Tyr Lys Gly Pro Glu Pro Asp Leu Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Gly Pro Val Arg Cys His Leu Gly Phe Ser Pro Trp Arg Leu Arg Tyr
210 215 220
Thr Glu Met Val His Met Gly Pro Leu Arg Tyr Met Asn Leu Gly Ser
225 230 235 240
Leu Lys Lys Ala Ile His Arg Phe Thr Thr Val Gln Gln Asn Tyr Gly
245 250 255
Thr
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-1
<400> 5
tttggatccg atggaattat acaacggtga gagg 34
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-2
<400> 6
tttgcggccg cttattttaa gtattcctta tgtttctcc 39
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-3
<400> 7
tttctcgaga tggatttgaa acctggagct g 31
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-4
<400> 8
tttctcgagt catgtaccat aattttgctg cac 33
<210> 9
<211> 1650
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 9
gtagtcacag cataagttgg agcaaacaca aaactacagg cctcccaggt tttaaaaaaa 60
aaaaaaaact tttctacgca taaattttcc aagaaaaata tttttgagga ataatttatt 120
tttattgttc tgttaaaatc tgaaaataaa gaaaaattac ttcctaatgg ttcaaggaaa 180
aaataataat tttatttttg tttataatat tatgaaaata tttaaattat aaaactttaa 240
tttttatttt tttattgtga aatgtataaa aaatacataa aataataaaa ttgtgtttta 300
gccatcctgg ctgttgaggc cgcaaggccc gcaagcagta gccggtaaag gaaaaaccag 360
gggcaatatt tttgcagggt tttttttttt ttttttcttt aaaagtaaag aacgtatgta 420
tgagtcttaa agatagtaat tttaatagag tctttgatct tatataattc tcacacattt 480
ttacaatctg atgtggaatc ctaaagtact aactcgtgtc tatgcccatc actcgcaaac 540
ttcaatcagg atcacatcat ggactctcat tttttctttg ttttcactta agtgattaat 600
tttctttttg tcaaaggtaa agaatataca cacatattag aaacaggatt agataattat 660
aaaaaaagga taattttaat gaaattttta attctatata attcattcac acgtactttc 720
accgcttaat atgtgatatg aaggaattta gccctaattt ggttaagaat taatataaat 780
taaaattata ttgtattaga ttaaattaaa ataaaaatat taaattaatt tttttagaaa 840
aattaaaatt gatcttgaac caaactcaaa taaagttaat ttgatccctt catttttttt 900
ttattttaat gaaaatttaa attgagatct tgtaattttg gaagccattt aaatattatc 960
gatttgctaa taattatgct gaatgtaatt taatggtaaa gaaaataaat aataaaaaag 1020
atacatttaa tttaatttaa tttatatatt tttttatttc aaaaaaattt aaaaaggaac 1080
agattgttaa atctttattt ttttaattaa attaaattta attgagtctc aaatataata 1140
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atttaatttt ttaaaaacaa agactaactt atttttttat aatttattaa gaaaatcatg 1320
aaaatcccca ttctaaatcg acttctggaa ctgggatgat gcgtttgctt tgcgatactc 1380
catgtgcttt acttacccca taaggatcat gcgcgaatca cgatagaacc aatacaacag 1440
caacacgttt acacgctcct tttcttaaca gctggcctgc cattcccacg aatttccatc 1500
tataagtaga gaggtttggt tttagcatca aaccataatc ggttgatagc ctccatcagc 1560
gttttcagaa aggcgggttt cttttttgaa acttaagcga ctgcgttttg aattttgatc 1620
ttccattttt gcaaaaggaa atcttcgatt 1650
<210> 10
<211> 919
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 10
aaccgtccac caatctttga gttccagtga gtcatctact ggttgcttga cagatccatc 60
aataaaacca tatttctttt tggcccgtaa tgcagtcagc atagctcgcg cccattcttc 120
gtaattctcg cccttcaact gaacttgggt aatcaagtta tctgggttgt cattcgaatt 180
cagtgtttaa gaactaaaag ttttcttccc tgatccagaa ctctcatttt tcttttcatc 240
aaccatggct ctgataccat gtaaaaaaac taagaaattt tggaataaga attcttatct 300
ttattgcccc agaaataaaa tatatatata aaaaaattac agctaacaaa taggtcccta 360
atcaagctaa actaccaaaa ttgtatcaaa gtcatacaac aaaaggtaaa aacagatatg 420
cacacaaaaa ttcctaaaca aatgccctaa ataaatacaa aataagtgac agctaacagc 480
tgcatttcca ataattaatt taactaataa aatttataat cttaaaaata attttaatat 540
tattgaatta aaatttataa ataaaattaa cactgttaaa attaaaagaa aattattaag 600
atttgaattt ttaagcggtt atttaatttt gaaaaacaag gctaactttt ttttttatat 660
aatttactaa aaaattcatg aatgaaaaaa aaaaatccat aagtaaactt accccatacg 720
ggttatgcac gctaaaccaa taaaacagaa acacgtttat acactcgttt tcatttccat 780
ctataaatag agagatttgt ttttagtttt aaaccataat cagttgatag cttccacagt 840
gttttccgaa aggcaaatct tttttcaaac ttcagcgact gcgttttgaa tttgtgattt 900
ttaaaggaaa ttttcaatt 919
<210> 11
<211> 1680
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 11
ggctacctta ttgggaacta ccaatttgtg gattgtggtg attgaattaa ctaataagca 60
actgaatgtt aatttccaga ataagaaaac ttgctgattg taatctcaag ttctagagtg 120
aaaataaaga taattatata aaatatatgg aaattattat cctagaggaa attttatttt 180
tttttaaatt aataaaattt ttgtaattaa aaattttacg aaaaaaaatc taataaaata 240
aatttatgta aaattacttt attttttata ataaaataat tacattatgt atgaaactaa 300
gtaatcatag aatatatata tatattattt agtttatgtg tcaaatataa tagattaata 360
ttttctttat tatttttcaa aataattttc atgtcaaccc aattaaataa atatccaact 420
aatttttttt ttaaatattt ttatttcaca gagaataatt tgtatataaa aaataatttt 480
cataaaaata ttttttatta tttaatttta acattaatta atggtacgtg ttcatattat 540
atatgaataa tatttttata ttttaataaa attatcaaag ttgagaaaat gatttgctct 600
tttaagttct ctcttaaaaa agaaagtcat ttttcttaaa aataatttaa tttctctttg 660
actaaaatat tttttgttaa ttattttttt aatactccaa acacaaaaaa tgtgaaaaaa 720
aaaatatttt ccacgacaca aacaaacaga attttagcca atcaattagc gcaattttca 780
actcccccgc ctcctaaagg ctggactggt gttgttcctg gaggctgata tcctaagcag 840
gtttctggat ttgcactgat tccatgatgg ttgaggcaag agggtatttc taatgagttt 900
ttatttagcc ctcttggttg ttgcctgcca ctggaaatca ccatggaaac atatatgaag 960
tcaaatgaca atttttattt tttaaatttt ctgagagtga ggaaatgaat aagaagaatt 1020
tgttattttt ctttaaagtc gtgttacttt tacataatat attaagtcaa atttatcgac 1080
tcagtgaaaa taatttatat tttataaata agaaaaatct tgttatataa tttaatataa 1140
attttatatc tttttttttt caaggaaata aattttatat cttgatgata agatagagat 1200
aagatcgagt taacccttgc gttaattgga tgtttaaatg cttaatgcat ggctaaggaa 1260
attaatgtct aaaataacag aaatgagaaa aataaatgaa gggtgaaaaa taaataaaac 1320
ctggccctat gctctatatt ggggatggag tgggagccac ctaatgtgtc agtgttcatc 1380
ttcgaacaac gactcgattc aaagcacacc catgaagccg cttcacatca tccctttgaa 1440
actttccacc ctaatcagct atcacacgat ctactttcca atctcatcaa cgctccaaat 1500
ctcaccacca ttcagtccac tttcacttcc tccttgtcct aatcatcttt aatccatcgg 1560
ggtattatgg taattacatg atcaagtctc tctgctataa ataaagccaa gtgagcttag 1620
ctcatcatca catcatttgc ataccagaaa atcaagaatt gggaagaaat gggaagagtt 1680
<210> 12
<211> 1610
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 12
taccagctat gattcacctc tagtgatatt gattttatta aaaattaagg caatgatgaa 60
tttctttttg aaaaaatcat ttaagattca agagggagat acagtgatgt cgttattttt 120
taattttatg taagtaaaat tcgtcaatca ttcatcaaag ttaactgcgt gctaaataat 180
ttaaaaatta ttgtttttta tttttgaaaa ttataataaa attcatttgt tttaataatt 240
aggttcttag tttataattt ttttatttta aatttaagta tttatgatta attctgattt 300
aatttctgat aattttaaaa ttaaaattat ttgattctta caaattttta acaatcattg 360
ttttagacca atctcaaagt aaatgtttca cacgttacaa gggtgcaaaa tgattggacg 420
gtgacagaaa cagtaaatat tatgaattta attgttgcca tgggctgcta aattcaaagg 480
gtcatcatta cgtgattctc gatttacgaa aaaaaaaaag tattttcata tatatatgta 540
tatacacaca cacatcatgc aaaatattta gttaataatt ttccaaaatt aaaacttttt 600
tttatagcat acaattaaaa tgttaaattc aattaaaaaa gtgaaaataa aaatataatt 660
ttttacataa aaaatataaa ttttatataa ttattagtga gaatatatat tactagattt 720
aaaatatact gaataaccac tcgcttttta attggttata gtgattaatt aagaattttt 780
tttatctaaa tttattaagt gatccaacaa attttgaact attatataag tttataaaat 840
tttgattctc cattctacat ttttaaattt tcatttttta tattatgaaa atatatacat 900
aaaaaaatta attaaactag agttaattgt cagaatgaat ctctagtaaa attttctctg 960
attaaaaaat aaatttcata aattatccca ctaaactttt gtcatgtgat catgtcccca 1020
ataaaatttg attttattat aattggcaac tcgatgtcta acctgcgagt aattatacac 1080
catccccatg atacctccat gatttcaagt gtcaaagtat gttttaatga gaaattatta 1140
ggttaactca atgtatatac attatttttt ataattatgt gaaattaatt ctcataatta 1200
tataggacac atacttcgtc cacttatttt ttagaaaaaa agcattattt tttagcactt 1260
tcaatgtaac taataattaa cggtttttaa catgtaagta taattgaata ttataaaacg 1320
cattaataca tatatatgca tgattcttgt taatttacca ttctacgtag aatattccat 1380
atagaatcaa tgctttatta tataataatt tctgctacat aataagaggc tttcatttcc 1440
tttgtcttta aataacccca agtctcactt gtaaaccaac gtcgctcatt tatccctctt 1500
accctgtccc tctccaactc tcaaactttc tggaattcca tagattgtgg aaactctcta 1560
gctaaaccaa aaaacagaaa agaacataca aaattgaaat actaaggtgc 1610
<210> 13
<211> 889
<212> DNA
<213> 莴苣(Lactuca sativa)
<400> 13
atggaattgg atccaatcat tgcaacggac acctcgctga aacaagcgga agacgaaaga 60
tcaaatggta cgatcagcaa gctccttgga ggcgtaaacc acaccttaag aaaactcata 120
tttcgtgtca tttcttcacg cccgattcca gaacacatcg ccttcatcct cgacggaaac 180
cgaaggtttg ccaagaaatg gaagctcacg gaaggtgcag gtcacaaagc cggttttttc 240
gcactcatgg cagtcctaaa atactgctac gagataggag ttaagtatgt caccatctat 300
gcattcagcc tcgacaattt caatcgacgc cctgatgaag tccaatacgt aatggatttg 360
atgcaagaaa agatcgaagg gtttctaaat gaacttactc ttataaacca atatggcgtt 420
agagtcttgt ttattggcga tctcgatagg ttatatgaac ccgtaaggat tgctgctgag 480
aaggccatgg aagccaccgc taagaactca cgcacatatc tcctagtatg tgttgcatac 540
acttcttccc atgaaatccc acgagcaatc cacgaagctt gtcaagaaaa aagtgaggct 600
aatagcatac gtgtcatgaa tagtgacata aatcatggtg gtcaatcggt gatcaaagtg 660
gtggatcttg agaagcatat gtacatggga gtggctccgg atcctgatat tctagtgagg 720
agctccggcg agacaaggtt aagcaacttt ctgttgtggc aaaccaccaa ctctttcttg 780
tattccccga aagctttgtg gccagagatg ggattctggc aggtggtttg ggggatcttg 840
gagtttcaga acaactatca gtactatgag aagaagaaga agcaggctt 889
<210> 14
<211> 296
<212> PRT
<213> 莴苣(Lactuca sativa)
<400> 14
Met Glu Leu Asp Pro Ile Ile Ala Thr Asp Thr Ser Leu Lys Gln Ala
1 5 10 15
Glu Asp Glu Arg Ser Asn Gly Thr Ile Ser Lys Leu Leu Gly Gly Val
20 25 30
Asn His Thr Leu Arg Lys Leu Ile Phe Arg Val Ile Ser Ser Arg Pro
35 40 45
Ile Pro Glu His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala
50 55 60
Lys Lys Trp Lys Leu Thr Glu Gly Ala Gly His Lys Ala Gly Phe Phe
65 70 75 80
Ala Leu Met Ala Val Leu Lys Tyr Cys Tyr Glu Ile Gly Val Lys Tyr
85 90 95
Val Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Leu Asp Asn Phe Asn Arg Arg Pro Asp
100 105 110
Glu Val Gln Tyr Val Met Asp Leu Met Gln Glu Lys Ile Glu Gly Phe
115 120 125
Leu Asn Glu Leu Thr Leu Ile Asn Gln Tyr Gly Val Arg Val Leu Phe
130 135 140
Ile Gly Asp Leu Asp Arg Leu Tyr Glu Pro Val Arg Ile Ala Ala Glu
145 150 155 160
Lys Ala Met Glu Ala Thr Ala Lys Asn Ser Arg Thr Tyr Leu Leu Val
165 170 175
Cys Val Ala Tyr Thr Ser Ser His Glu Ile Pro Arg Ala Ile His Glu
180 185 190
Ala Cys Gln Glu Lys Ser Glu Ala Asn Ser Ile Arg Val Met Asn Ser
195 200 205
Asp Ile Asn His Gly Gly Gln Ser Val Ile Lys Val Val Asp Leu Glu
210 215 220
Lys His Met Tyr Met Gly Val Ala Pro Asp Pro Asp Ile Leu Val Arg
225 230 235 240
Ser Ser Gly Glu Thr Arg Leu Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Thr Thr
245 250 255
Asn Ser Phe Leu Tyr Ser Pro Lys Ala Leu Trp Pro Glu Met Gly Phe
260 265 270
Trp Gln Val Val Trp Gly Ile Leu Glu Phe Gln Asn Asn Tyr Gln Tyr
275 280 285
Tyr Glu Lys Lys Lys Lys Gln Ala
290 295
<210> 15
<211> 732
<212> DNA
<213> 莴苣(Lactuca sativa)
<400> 15
atggatctcg taggtggacc ccagaagatt ttacacaaaa tctcactgaa tgatcacatg 60
atacttctgt tgctgtggca cattcttcat ttaattgttc aagtcatata ctttgtttgg 120
gagaagatgc gtgcaattga aagctatctt atagcaaatg gaattgtcaa aacatatgaa 180
gatctgaatt tagacagagt gaagtatctt ggaattgtgg tggatagtga tgaagctcgt 240
gaaacctcaa aagttattga acttttggag tggatttcag atattggtgt gaaaaaggtc 300
tgcctttatg acagagaagg agtgttgaag aagtccaagg aactgttcat ggagaaattt 360
gattctatgg agaattcaga aactaatcaa aaaaggaaaa tggattttga atttgtttca 420
atcgttgatg gaaaagaaac agttgctaaa gcagcgaatc tgctatataa aaagtattat 480
tctgatccaa attcagaaaa accattcttt actgaaacct atttgaccga agcacttagg 540
atcctaggtt ctaatgagcc ggatcctgat cttatactga tttatgggcc cacaaggtgc 600
caccttggtt ttccagcatg gcgtattcgt tatacagaga tggtacacat gggatcattg 660
aagaacaaga agtttggttt gattttgaaa gccatcaaca aatacaccaa ggtgaagcag 720
aactacggtt ct 732
<210> 16
<211> 244
<212> PRT
<213> 莴苣(Lactuca sativa)
<400> 16
Met Asp Leu Val Gly Gly Pro Gln Lys Ile Leu His Lys Ile Ser Leu
1 5 10 15
Asn Asp His Met Ile Leu Leu Leu Leu Trp His Ile Leu His Leu Ile
20 25 30
Val Gln Val Ile Tyr Phe Val Trp Glu Lys Met Arg Ala Ile Glu Ser
35 40 45
Tyr Leu Ile Ala Asn Gly Ile Val Lys Thr Tyr Glu Asp Leu Asn Leu
50 55 60
Asp Arg Val Lys Tyr Leu Gly Ile Val Val Asp Ser Asp Glu Ala Arg
65 70 75 80
Glu Thr Ser Lys Val Ile Glu Leu Leu Glu Trp Ile Ser Asp Ile Gly
85 90 95
Val Lys Lys Val Cys Leu Tyr Asp Arg Glu Gly Val Leu Lys Lys Ser
100 105 110
Lys Glu Leu Phe Met Glu Lys Phe Asp Ser Met Glu Asn Ser Glu Thr
115 120 125
Asn Gln Lys Arg Lys Met Asp Phe Glu Phe Val Ser Ile Val Asp Gly
130 135 140
Lys Glu Thr Val Ala Lys Ala Ala Asn Leu Leu Tyr Lys Lys Tyr Tyr
145 150 155 160
Ser Asp Pro Asn Ser Glu Lys Pro Phe Phe Thr Glu Thr Tyr Leu Thr
165 170 175
Glu Ala Leu Arg Ile Leu Gly Ser Asn Glu Pro Asp Pro Asp Leu Ile
180 185 190
Leu Ile Tyr Gly Pro Thr Arg Cys His Leu Gly Phe Pro Ala Trp Arg
195 200 205
Ile Arg Tyr Thr Glu Met Val His Met Gly Ser Leu Lys Asn Lys Lys
210 215 220
Phe Gly Leu Ile Leu Lys Ala Ile Asn Lys Tyr Thr Lys Val Lys Gln
225 230 235 240
Asn Tyr Gly Ser
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-5
<400> 17
ctaggatccg agatgaatac cctagaag 28
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-6
<400> 18
aacggatcca actatctaat cgagc 25
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-7
<400> 19
cgggatccat ggattcgaat caatcgatgc ggctcctc 38
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-8
<400> 20
gcggatccaa ttgggaacag tagtggctgc actgactc 38
<210> 21
<211> 1029
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 21
aacaaagtgt gttcttaaat tatcttctct gataaccaaa aaagccctat tttccgagat 60
gaatacccta gaagaagtag atgaatccac tcatatcttc aacgctttga tgagtctaat 120
gaggaaattt ttgttcagag ttctatgcgt cggtccaatc cctactaaca tttcattcat 180
catggatgga aaccgcaggt tcgctaagaa acacaatctt ataggcctag atgcaggaca 240
tagagctggt ttcatatccg tgaaatatat tcttcaatac tgcaaagaga ttggtgtacc 300
gtacgtcaca ctccacgcgt ttggtatgga taatttcaag agaggacctg aagaagtcaa 360
gtgtgtgatg gatctaatgc ttgagaaagt cgagctcgcg atcgatcaag ctgtatcagg 420
gaatatgaac ggcgtgagaa taatctttgc cggtgatttg gattcgttaa acgagcattt 480
tagagctgcg acaaagaaac tgatggagct tacggaggag aatagagatc tgattgtggt 540
ggtttgcgtt gcttacagca caagtctcga gattgttcac gctgttcgaa aatcttgtgt 600
tagaaaatgt acgaatggag atgatcttgt acttttggag ttgagtgatg ttgaagagtg 660
tatgtataca tcgattgtgc cggttccgga tcttgtgata agaaccggag gaggagatcg 720
gctgagtaac ttcatgacgt ggcaaacttc gaggtctctt cttcacagaa cggaggctct 780
ttggccggag ttagggctct ggcatttggt ttgggcaatt cttaaattcc aaagaatgca 840
agattacttg acgaagaaga aaaagctcga ttagatagtt tctaaagtta aaccctgcag 900
gaaagaactt ttaactcttt attacgttta atttacgtgt ttctatgact ggaaacgaga 960
aagctcacaa gcaaatcttt tttattatgt attggatccg tataacaaac acgaatatac 1020
aaaacatcg 1029
<210> 22
<211> 271
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 22
Met Asn Thr Leu Glu Glu Val Asp Glu Ser Thr His Ile Phe Asn Ala
1 5 10 15
Leu Met Ser Leu Met Arg Lys Phe Leu Phe Arg Val Leu Cys Val Gly
20 25 30
Pro Ile Pro Thr Asn Ile Ser Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Phe
35 40 45
Ala Lys Lys His Asn Leu Ile Gly Leu Asp Ala Gly His Arg Ala Gly
50 55 60
Phe Ile Ser Val Lys Tyr Ile Leu Gln Tyr Cys Lys Glu Ile Gly Val
65 70 75 80
Pro Tyr Val Thr Leu His Ala Phe Gly Met Asp Asn Phe Lys Arg Gly
85 90 95
Pro Glu Glu Val Lys Cys Val Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Val Glu
100 105 110
Leu Ala Ile Asp Gln Ala Val Ser Gly Asn Met Asn Gly Val Arg Ile
115 120 125
Ile Phe Ala Gly Asp Leu Asp Ser Leu Asn Glu His Phe Arg Ala Ala
130 135 140
Thr Lys Lys Leu Met Glu Leu Thr Glu Glu Asn Arg Asp Leu Ile Val
145 150 155 160
Val Val Cys Val Ala Tyr Ser Thr Ser Leu Glu Ile Val His Ala Val
165 170 175
Arg Lys Ser Cys Val Arg Lys Cys Thr Asn Gly Asp Asp Leu Val Leu
180 185 190
Leu Glu Leu Ser Asp Val Glu Glu Cys Met Tyr Thr Ser Ile Val Pro
195 200 205
Val Pro Asp Leu Val Ile Arg Thr Gly Gly Gly Asp Arg Leu Ser Asn
210 215 220
Phe Met Thr Trp Gln Thr Ser Arg Ser Leu Leu His Arg Thr Glu Ala
225 230 235 240
Leu Trp Pro Glu Leu Gly Leu Trp His Leu Val Trp Ala Ile Leu Lys
245 250 255
Phe Gln Arg Met Gln Asp Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Lys Leu Asp
260 265 270
<210> 23
<211> 1248
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 23
gatcttcaaa agtgtctcac tttttctaac ctcgcctcca aagattcttc cttttccgat 60
tccgatgaaa aggaattttg ggttttagga aagttcgatt ggttggtttg gaaacatctc 120
cctaacacac gcagcaaaca ctttcgttgt ttacggagac agtcactttt tgtatatatg 180
gattcgaatc aatcgatgcg gctcctcagt gcttggattg gtcaaattgg tgatcttggt 240
cttaatttgc tatggcgttt tatacacatt gttgtgagct tatggtacat tgtctctggc 300
atatttgagg caatagaaag ctatgccata acgttaggat tgaataaaaa gtacggttcc 360
atcgatcttg agaaactccg gtgtctagct gttgtagtgg acatcgaagc agctcaagat 420
gttgccaatg ttgttgagct tttgcaatgg ctaaccacca ttggggttaa acaagttggt 480
ctatttgact ctcaaggttt attgaagaaa tccaaggatt tgatccttga aaccgttcca 540
ggttccatgt tgttagagga gattgaaaag gatgttgcgc ctgacggaaa gcgcattgca 600
ttagaattca tttcatcttc agacaataaa gaagctgtta tgaaagcagc caacatactt 660
cttcagagat acttgaaatc cagccatcct gaggacgaca aaggggaaga cttttttaca 720
gagtctcatt tgaatgacgc attaagagtt gttggtgaga atgtgcatgt acccgatctg 780
ttactggttt atggacctat aaggagccac ctcggtttcc ctgcttggag acttcgatac 840
actgagatag tacatatggg aactttgaag tatatgagat atggttccct tttgaaggca 900
attcacaagt tcacaggagt ccaccaaaac tatggaactt aacggtgact agagagcaga 960
gtttcagaga tcgatttttg gtttgtgatt cacatatttg caatgaattc taaaggagag 1020
attattggag agcttttgag tcagtgcagc cactactgtt cccaatttcc ggcaattcta 1080
tgtaccaaag caacatatgc attggcattg tataggatta agtagtaaca agctggacct 1140
aaccaatccg gtttttccat aaagttccgg tttgcttggt tatcgtgtgt aaacaaaaat 1200
agaacacaac tttcagattt ttcagtaaaa aaataaacag tttagttt 1248
<210> 24
<211> 254
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 24
Met Asp Ser Asn Gln Ser Met Arg Leu Leu Ser Ala Trp Ile Gly Gln
1 5 10 15
Ile Gly Asp Leu Gly Leu Asn Leu Leu Trp Arg Phe Ile His Ile Val
20 25 30
Val Ser Leu Trp Tyr Ile Val Ser Gly Ile Phe Glu Ala Ile Glu Ser
35 40 45
Tyr Ala Ile Thr Leu Gly Leu Asn Lys Lys Tyr Gly Ser Ile Asp Leu
50 55 60
Glu Lys Leu Arg Cys Leu Ala Val Val Val Asp Ile Glu Ala Ala Gln
65 70 75 80
Asp Val Ala Asn Val Val Glu Leu Leu Gln Trp Leu Thr Thr Ile Gly
85 90 95
Val Lys Gln Val Gly Leu Phe Asp Ser Gln Gly Leu Leu Lys Lys Ser
100 105 110
Lys Asp Leu Ile Leu Glu Thr Val Pro Gly Ser Met Leu Leu Glu Glu
115 120 125
Ile Glu Lys Asp Val Ala Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ala Leu Glu Phe
130 135 140
Ile Ser Ser Ser Asp Asn Lys Glu Ala Val Met Lys Ala Ala Asn Ile
145 150 155 160
Leu Leu Gln Arg Tyr Leu Lys Ser Ser His Pro Glu Asp Asp Lys Gly
165 170 175
Glu Asp Phe Phe Thr Glu Ser His Leu Asn Asp Ala Leu Arg Val Val
180 185 190
Gly Glu Asn Val His Val Pro Asp Leu Leu Leu Val Tyr Gly Pro Ile
195 200 205
Arg Ser His Leu Gly Phe Pro Ala Trp Arg Leu Arg Tyr Thr Glu Ile
210 215 220
Val His Met Gly Thr Leu Lys Tyr Met Arg Tyr Gly Ser Leu Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ile His Lys Phe Thr Gly Val His Gln Asn Tyr Gly Thr
245 250
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-9
<400> 25
tttctcgaga tggctgaaga cgaagac 27
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-10
<400> 26
tttggatcct caattctctc cataaaac 28
<210> 27
<211> 417
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 27
atggctgaag acgaagacaa ccaacaaggg cagggggagg ggttaaaata tttgggtttt 60
gtgcaagacg cggcaactta tgctgtgact accttctcaa acgtctatct ttttgccaaa 120
gacaaatctg gtccactgca gcctggtgtc gatatcattg agggtccggt gaagaacgtg 180
gctgtacctc tctataatag gttcagttat attcccaatg gagctctcaa gtttgtagac 240
agcacggttg ttgcatctgt cactattata gatcgctctc ttcccccaat tgtcaaggac 300
gcatctatcc aagttgtttc agcaattcga gctgccccag aagctgctcg ttctctggct 360
tcttctttgc ctgggcagac caagatactt gctaaggtgt tttatggaga gaattga 417
<210> 28
<211> 138
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 28
Met Ala Glu Asp Glu Asp Asn Gln Gln Gly Gln Gly Glu Gly Leu Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Phe Val Gln Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Val Thr Thr Phe
20 25 30
Ser Asn Val Tyr Leu Phe Ala Lys Asp Lys Ser Gly Pro Leu Gln Pro
35 40 45
Gly Val Asp Ile Ile Glu Gly Pro Val Lys Asn Val Ala Val Pro Leu
50 55 60
Tyr Asn Arg Phe Ser Tyr Ile Pro Asn Gly Ala Leu Lys Phe Val Asp
65 70 75 80
Ser Thr Val Val Ala Ser Val Thr Ile Ile Asp Arg Ser Leu Pro Pro
85 90 95
Ile Val Lys Asp Ala Ser Ile Gln Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Ala
100 105 110
Pro Glu Ala Ala Arg Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Gly Gln Thr Lys
115 120 125
Ile Leu Ala Lys Val Phe Tyr Gly Glu Asn
130 135
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-11
<400> 29
tttggatccg atggaattat acaacggtga gagg 34
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-12
<400> 30
tttgcggccg cttattttaa gtattcctta tgtttctcc 39
<210> 31
<211> 855
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 31
atggaattat acaacggtga gaggccaagt gtgttcagac ttttagggaa gtatatgaga 60
aaagggttat atagcatcct aacccagggt cccatcccta ctcatattgc cttcatattg 120
gatggaaacg ggaggtttgc taagaagcat aaactgccag aaggaggtgg tcataaggct 180
ggatttttag ctcttctgaa cgtactaact tattgctatg agttaggagt gaaatatgcg 240
actatctatg cctttagcat cgataatttt cgaaggaaac ctcatgaggt tcagtacgta 300
atgaatctaa tgctggagaa gattgaaggg atgatcatgg aagaaagtat catcaatgca 360
tatgatattt gcgtgcgttt tgttggtaat ctgaagcttt tagatgagcc actcaagacc 420
gcagcagata agataatgag ggctactgcc aaaaattcca aatttgtgct tctccttgct 480
gtatgctaca cttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc taaggataaa 540
ttgaaatccg atgaaatttg caacgatgga aacggagatt gtgtgattaa aattgaggag 600
atggagccat attctgaaat aaaacttgta gagcttgaga gaaacactta cataaatcct 660
tatcctgatg tcttgattcg aacttctggg gagacccgtc tgagcaacta cctactttgg 720
cagactacta attgcatact gtattctcct catgcactgt ggccagagat tggtcttcga 780
cacgtggtgt gggcagtaat taactgccaa cgtcattatt cttacttgga gaaacataag 840
gaatacttaa aataa 855
<210> 32
<211> 284
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 32
Met Glu Leu Tyr Asn Gly Glu Arg Pro Ser Val Phe Arg Leu Leu Gly
1 5 10 15
Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Thr His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Gly Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly Gly His Lys Ala Gly Phe Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Asn Val Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Lys Pro His Glu
85 90 95
Val Gln Tyr Val Met Asn Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Gly Met Ile
100 105 110
Met Glu Glu Ser Ile Ile Asn Ala Tyr Asp Ile Cys Val Arg Phe Val
115 120 125
Gly Asn Leu Lys Leu Leu Asp Glu Pro Leu Lys Thr Ala Ala Asp Lys
130 135 140
Ile Met Arg Ala Thr Ala Lys Asn Ser Lys Phe Val Leu Leu Leu Ala
145 150 155 160
Val Cys Tyr Thr Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser
165 170 175
Ser Lys Asp Lys Leu Lys Ser Asp Glu Ile Cys Asn Asp Gly Asn Gly
180 185 190
Asp Cys Val Ile Lys Ile Glu Glu Met Glu Pro Tyr Ser Glu Ile Lys
195 200 205
Leu Val Glu Leu Glu Arg Asn Thr Tyr Ile Asn Pro Tyr Pro Asp Val
210 215 220
Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Thr Arg Leu Ser Asn Tyr Leu Leu Trp
225 230 235 240
Gln Thr Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Ser Pro His Ala Leu Trp Pro Glu
245 250 255
Ile Gly Leu Arg His Val Val Trp Ala Val Ile Asn Cys Gln Arg His
260 265 270
Tyr Ser Tyr Leu Glu Lys His Lys Glu Tyr Leu Lys
275 280
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-13
<400> 33
atacccggga tggaaatata tac 23
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-14
<400> 34
actcccgggt tattttaaat attc 24
<210> 35
<211> 891
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 35
atggaaatat atacgggtca gaggccaagt gtgtttaaac tttttgggaa atttatgaga 60
aaagggttat atcgcatcct aacccaaggt cccattccta ctcatcttgc cttcatattg 120
gatggaaacc ggaggtttgc taagaagcat aaaatgaacg aagcagaagg ttataaggca 180
ggatatttag ctcttctgaa aacactaact tattgctatg agttgggagt gaggtacgta 240
accatttatg cctttagcat tgataatttt cgaaggcaac ctcaggaggt tcagtgcgta 300
atgaatctta tgatggagaa gattgaagag attattgtgg aagaaagtat catgaatgca 360
tatgatgttg gcgtacgtat tgtgggtaac ctgaagcttt tagatgagcc aatcaggatc 420
gcagcagaaa aaattatgag ggctactgcc aataattcca ggtttgtgct tctcattgct 480
gtagcctata gttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc taaagacaaa 540
ttgaactcca atgaagtttg caacaatggg attgaagctg aacaagaatt taaggaggca 600
aacggaactg gaaacagtgt gattccagtt cagaagacgg agtcatattc tggaataaat 660
cttgcagacc ttgagaaaaa cacctacgta aatcctcatc ctgatgtctt gattcgaact 720
tctgggttga gccgtctaag taactaccta ctttggcaga ctagtaattg catactgtat 780
tctccttttg cactgtggcc agagattggt ctcaggcact tggtatggac agtaatgaac 840
ttccaacgtc atcattctta tttggagaag cataaggaat atttaaaata a 891
<210> 36
<211> 296
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 36
Met Glu Ile Tyr Thr Gly Gln Arg Pro Ser Val Phe Lys Leu Phe Gly
1 5 10 15
Lys Phe Met Arg Lys Gly Leu Tyr Arg Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Thr His Leu Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys His Lys Met Asn Glu Ala Glu Gly Tyr Lys Ala Gly Tyr Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Lys Thr Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Arg Tyr Val
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Gln Pro Gln Glu
85 90 95
Val Gln Cys Val Met Asn Leu Met Met Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile
100 105 110
Val Glu Glu Ser Ile Met Asn Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Ile Val
115 120 125
Gly Asn Leu Lys Leu Leu Asp Glu Pro Ile Arg Ile Ala Ala Glu Lys
130 135 140
Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Arg Phe Val Leu Leu Ile Ala
145 150 155 160
Ile Ala Tyr Ser Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser
165 170 175
Ser Lys Asp Lys Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gly Ile Glu
180 185 190
Ala Glu Gln Glu Phe Lys Glu Ala Asn Gly Thr Gly Asn Ser Val Ile
195 200 205
Pro Val Gln Lys Thr Glu Ser Tyr Ser Gly Ile Asn Leu Val Asp Leu
210 215 220
Glu Lys Asn Thr Tyr Val Asn Pro Tyr Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr
225 230 235 240
Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Ser Asn
245 250 255
Cys Ile Leu Tyr Ser Pro Phe Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Gly
260 265 270
His Leu Val Trp Thr Val Met Asp Phe Gln Arg His His Ser Tyr Leu
275 280 285
Lys Lys His Lys Glu Tyr Leu Lys
290 295
<210> 37
<211> 373
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 37
Met Glu Lys His Ser Ser Ser Arg Val Ser Glu Leu Phe Gly Asn Leu
1 5 10 15
Gly Ser Phe Ile Arg Ile Cys Ile Phe Arg Val Leu Ser Met Gly Pro
20 25 30
Ile Pro Asn His Phe Ala Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Tyr Ala
35 40 45
Lys Lys Glu Asn Met Lys Lys Gly Ala Gly His Arg Ala Gly Phe Leu
50 55 60
Ala Leu Ile Ser Ile Leu Lys Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr
65 70 75 80
Val Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile His Asn Phe Lys Arg Ser Pro Asp
85 90 95
Glu Val Lys Asp Leu Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Asp Leu
100 105 110
Leu Arg Asp Glu Ser Ile Val Asn Gln Tyr Gly Ile Arg Val Tyr Phe
115 120 125
Ile Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Thr Val Arg Ile Ala Ala Glu
130 135 140
Lys Val Met Lys Ala Thr Ala Lys Asn Thr Asn Cys Thr Leu Leu Ile
145 150 155 160
Cys Val Ala Tyr Thr Ser Arg Asp Glu Ile Val His Ala Val Gln Val
165 170 175
Ser Cys Lys Asn Lys Gln Glu Glu Ile Gln Pro Leu Ser Phe Cys Lys
180 185 190
Ala Asn Asn Asp Ala Ile Glu Glu Val Glu Asp Asn Lys Lys Val Asn
195 200 205
Gly Val Ile Pro Phe Val Phe Leu Glu Ser Gln Lys Asp Glu Ala Gly
210 215 220
Lys Ser Gln Ala Thr Met Ala Ser Val Thr Cys Ser Cys Leu Ala Arg
225 230 235 240
Gly Val Glu Gly Gly Gly Asn Lys Asn Ser Met Val Val Arg Ala Val
245 250 255
Arg Gly Ser Tyr Glu Asp Lys Trp Asp Asn Cys Gln Ala Met Met Glu
260 265 270
Asn Arg Thr Gly Asn Gly Val Thr Ser Ser Glu Glu Ser Glu Asn Leu
275 280 285
Gln Gly Glu Cys Ser Ile Ile Lys Leu Val Asp Ile Glu Lys Gln Met
290 295 300
Tyr Met Ala Val Ala Pro Glu Pro Asp Ile Leu Ile Arg Ser Ser Gly
305 310 315 320
Glu Ser Arg Leu Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Thr Ser Glu Cys Gln
325 330 335
Leu Tyr Ser Pro Asp Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Trp His Leu
340 345 350
Val Trp Ala Val Leu Asn Phe Gln Arg Asn His Ala Tyr Leu Glu Lys
355 360 365
Lys Lys His Gln Leu
370
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-15
<400> 38
tatcccggga tggaaata 18
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-16
<400> 39
atacccgggt tacaactgc 19
<210> 40
<211> 1107
<212> DNA
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 40
atggaaatat ttgaggctgg taggccaagc gtgcttgcaa gtttggggag atttatcaga 60
aaatgcatat ttcgcattct atcaataggt cccatcccaa gtcatgttgc cttcataatg 120
gatggaaacc ggaggtttgc taagaaggag aaactggaag aaggatctgg tcacagggct 180
ggatctttag ctctaatgtc cacgcttaag tactgctatg agttgggagt gaagtatgtg 240
actatatatg ccttcagcat tgataatttt agaaggcgac ctgatgaggt tcagctcata 300
atggatctaa tactggagaa gattgagggg ctgctcaggg acgaaaatgt tgtcaatgca 360
tatggcatca gagtacgatt tgtaggtacc ttgaagcttc taagtgagcc agtcagggtc 420
gcagcagaaa aagtcgccag ggctagtgcc aagaatacca agtttgtgct tgtcatttgt 480
atagcctatt cttcaactga tgagattgtg catgctgttc aagaatcttg taaatataaa 540
ttgaacaaaa ttgagccatc taactccaac agggcttgca atgatgcgaa tgaacaagta 600
gaagaaaatg gtaagaagat agatagtacc atcacacatg gtgttcaaga atcctgcaaa 660
gatgaaacag ataaatctcg cacaataaac gcaaagccaa tgtataatgg tgtgaccaaa 720
gaagctggag ggactgacaa tgctaatact gtgatagtaa attccatcgg agacaagtgg 780
gatgatgctc acgaactggg ggcaactaga actggcaatg gtgtgatttc agtagaagaa 840
attgataaga tgctgtcaca ttctagcata aagttggtag acattgagaa aaaattgcac 900
atggctgtag cccctgatcc tgatatcttg gttcgaactt ctggagagag ccgtctgagc 960
aacttcctac tttggcagac tagtaactgt tcactgtatt ctccaaaggc actgtggccg 1020
gagattggcc tacgccactt ggtgtgggca gtaataacct tccaacgtaa tcattcttat 1080
ttggagaaga aaaagaagca gttgtaa 1107
<210> 41
<211> 368
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 41
Met Glu Ile Phe Glu Ala Gly Arg Pro Ser Val Leu Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Arg Phe Ile Arg Lys Cys Ile Phe Arg Ile Leu Ser Ile Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Ser His Val Ala Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys Glu Lys Leu Glu Glu Gly Ser Gly His Arg Ala Gly Ser Leu Ala
50 55 60
Leu Met Ser Thr Leu Lys Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr Val
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Arg Pro Asp Glu
85 90 95
Val Gln Leu Ile Met Asp Leu Ile Leu Glu Lys Ile Glu Gly Leu Leu
100 105 110
Arg Asp Glu Asn Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Arg Val Arg Phe Val
115 120 125
Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ser Glu Pro Val Arg Val Ala Ala Glu Lys
130 135 140
Val Ala Arg Ala Ser Ala Lys Asn Thr Lys Phe Val Leu Val Ile Cys
145 150 155 160
Ile Ala Tyr Ser Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Gln Glu Ser
165 170 175
Cys Lys Tyr Lys Leu Asn Lys Ile Glu Pro Ser Asn Ser Asn Arg Ala
180 185 190
Cys Asn Asp Ala Asn Glu Gln Val Glu Glu Asn Gly Lys Lys Ile Asp
195 200 205
Ser Thr Ile Thr His Gly Val Gln Glu Ser Cys Lys Asp Glu Thr Asp
210 215 220
Lys Ser Arg Thr Ile Asn Ala Lys Pro Met Tyr Asn Gly Val Thr Lys
225 230 235 240
Glu Ala Gly Gly Thr Asp Asn Ala Asn Thr Val Ile Val Asn Ser Ile
245 250 255
Gly Asp Lys Trp Asp Asp Ala His Glu Leu Gly Ala Thr Arg Thr Gly
260 265 270
Asn Gly Val Ile Ser Val Glu Glu Ile Asp Lys Met Leu Ser His Ser
275 280 285
Ser Ile Lys Leu Val Asp Ile Glu Lys Lys Leu His Met Ala Val Ala
290 295 300
Pro Asp Pro Asp Ile Leu Val Arg Thr Ser Gly Glu Ser Arg Leu Ser
305 310 315 320
Asn Phe Leu Leu Trp Gln Thr Ser Asn Cys Ser Leu Tyr Ser Pro Lys
325 330 335
Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg His Leu Val Trp Ala Val Ile
340 345 350
Thr Phe Gln Arg Asn His Ser Tyr Leu Glu Lys Lys Lys Lys Gln Leu
355 360 365
<210> 42
<211> 927
<212> DNA
<213> 短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)
<400> 42
atgcaagtga atccaatcat tactacagat agttcactga aactagtgga agaagaaaga 60
tcaaatggta ggatcggcaa tttcttagga ggcttaaacg ccaccttaag aaaactcgtg 120
tttcgtgtca ttgcttctcg ccctatccca gaacacatcg ccttcatcct cgatggaaac 180
cgaaggttcg ccaggaaatg gaacctcaca gaaggcacag gccacaaaac cggcttccta 240
gcactcatgt cggtcctcaa atactgctac gagatcggag tcaagtacgt caccatctac 300
gccttcagcc tcgacaattt caatcgacgc cctgatgaag tccaatacgt catggatttg 360
atgcaagaca agatcgaagg ctttctgaaa gaagttagta ttataaacca atatggcgtt 420
agagtcttgt tcatcggtga tctcgatagg ttatatgagc ccgtaaggat tgctgctgag 480
aaggccatgg aagccaccgc taaaaattca accacgtatc tcctcgtatg tgttgcttac 540
acttcttccc atgaaatccc acgtgccatc cacgaagctt gtgaagaaaa gagtggcgcc 600
atggccaata gcatacgggt catgaacgga aacgggtttt tcaatggaaa tggatatacc 660
aacgtgaatc atggaagtca ggcggtgatc aaagtggtgg atcttgataa gcatatgtac 720
atgggggtgg caccggatcc tgatatttta gtacggagct ccggcgagac aaggctgagc 780
aactttctgc tgtggcaaac caccaactgt ttgttgtatt ccccgaaagc tttgtggccg 840
gagatggggt tctggcaggt ggtttgggga atcttggagt ttcagaacaa ttataattac 900
ttggagaaga agaagaagca ggcataa 927
<210> 43
<211> 308
<212> PRT
<213> 短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)
<400> 43
Met Gln Val Asn Pro Ile Ile Thr Thr Asp Ser Ser Leu Lys Leu Val
1 5 10 15
Glu Glu Glu Arg Ser Asn Gly Arg Ile Gly Asn Phe Leu Gly Gly Leu
20 25 30
Asn Ala Thr Leu Arg Lys Leu Val Phe Arg Val Ile Ala Ser Arg Pro
35 40 45
Ile Pro Glu His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala
50 55 60
Arg Lys Trp Asn Leu Thr Glu Gly Thr Gly His Lys Thr Gly Phe Leu
65 70 75 80
Ala Leu Met Ser Val Leu Lys Tyr Cys Tyr Glu Ile Gly Val Lys Tyr
85 90 95
Val Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Leu Asp Asn Phe Asn Arg Arg Pro Asp
100 105 110
Glu Val Gln Tyr Val Met Asp Leu Met Gln Asp Lys Ile Glu Gly Phe
115 120 125
Leu Lys Glu Val Ser Ile Ile Asn Gln Tyr Gly Val Arg Val Leu Phe
130 135 140
Ile Gly Asp Leu Asp Arg Leu Tyr Glu Pro Val Arg Ile Ala Ala Glu
145 150 155 160
Lys Ala Met Glu Ala Thr Ala Lys Asn Ser Thr Thr Tyr Leu Leu Val
165 170 175
Cys Val Ala Tyr Thr Ser Ser His Glu Ile Pro Arg Ala Ile His Glu
180 185 190
Ala Cys Glu Glu Lys Ser Gly Ala Met Ala Asn Ser Ile Arg Val Met
195 200 205
Asn Gly Asn Gly Phe Phe Asn Gly Asn Gly Tyr Thr Asn Val Asn His
210 215 220
Gly Ser Gln Ala Val Ile Lys Val Val Asp Leu Asp Lys His Met Tyr
225 230 235 240
Met Gly Val Ala Pro Asp Pro Asp Ile Leu Val Arg Ser Ser Gly Glu
245 250 255
Thr Arg Leu Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Thr Thr Asn Cys Leu Leu
260 265 270
Tyr Ser Pro Lys Ala Leu Trp Pro Glu Met Gly Phe Trp Gln Val Val
275 280 285
Trp Gly Ile Leu Glu Phe Gln Asn Asn Tyr Asn Tyr Leu Glu Lys Lys
290 295 300
Lys Lys Gln Ala
305
<210> 44
<211> 302
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 44
Met Leu Ser Ile Leu Ser Ser Leu Leu Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ile
1 5 10 15
Ile Ser Cys Phe Phe Ile Thr Ser His Phe Trp Phe Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Lys Ile Leu Gly Phe Ile Lys Ile Thr Ser Ser Arg Asp Asp Tyr
35 40 45
Asp Asn Glu Gln Arg Asp Glu Gly Thr Tyr Val Val Gly Val Glu Glu
50 55 60
Leu Gln Arg Glu Leu Met Pro Arg His Val Ala Val Ile Met Asp Gly
65 70 75 80
Asn Arg Arg Trp Ala Lys Arg Ala Gly Leu Leu Thr Ser Gln Gly His
85 90 95
Glu Ala Gly Ala Lys Arg Leu Ile Glu Phe Ser Glu Leu Cys Phe Lys
100 105 110
Leu Gly Ile His Thr Val Ser Ala Phe Ala Phe Ser Thr Glu Asn Trp
115 120 125
Gly Arg His Lys Ile Glu Val Lys Cys Leu Met Ser Leu Ile Gln His
130 135 140
Tyr Leu Lys Ser Lys Ile Gln Tyr Phe Gln Arg Glu Glu Thr Arg Val
145 150 155 160
Ser Val Ile Gly Asn Leu Thr Lys Ile Pro Glu Ser Leu Leu Arg Thr
165 170 175
Val Gln Glu Ile Glu Glu Ala Thr Arg Ser Tyr Lys Lys Lys His Leu
180 185 190
Ile Leu Ala Ile Asp Tyr Ser Gly Arg Leu Asp Ile Leu Arg Ala Cys
195 200 205
Lys Ser Ile Val Lys Lys Ser Glu Lys Gly Leu Ile Arg Glu Glu Asp
210 215 220
Val Asp Glu Ala Leu Ile Glu Arg Glu Leu Leu Thr Asn Cys Thr Glu
225 230 235 240
Phe Pro Ser Pro Asp Leu Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Gln Arg Ile
245 250 255
Ser Asn Phe Phe Leu Trp Gln Leu Ala Tyr Thr Glu Leu Phe Phe Ser
260 265 270
Pro Val Leu Trp Pro Asp Phe Asp Lys Asp Lys Leu Leu Glu Ala Leu
275 280 285
Val Ser Tyr Gln Arg Arg Glu Arg Arg Phe Gly Cys Arg Val
290 295 300
<210> 45
<211> 252
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 45
Met Leu Ser Ala Thr Gln Pro Leu Ser Glu Lys Leu Pro Ala His Gly
1 5 10 15
Cys Arg His Val Ala Ile Ile Met Asp Gly Asn Gly Arg Trp Ala Lys
20 25 30
Lys Gln Gly Lys Ile Arg Ala Phe Gly His Lys Ala Gly Ala Lys Ser
35 40 45
Val Arg Arg Ala Val Ser Phe Ala Ala Asn Asn Gly Ile Glu Ala Leu
50 55 60
Thr Leu Tyr Ala Phe Ser Ser Glu Asn Trp Asn Arg Pro Ala Gln Glu
65 70 75 80
Val Ser Ala Leu Met Glu Leu Phe Val Trp Ala Leu Asp Ser Glu Val
85 90 95
Lys Ser Leu His Arg His Asn Val Arg Leu Arg Ile Ile Gly Asp Thr
100 105 110
Ser Arg Phe Asn Ser Arg Leu Gln Glu Arg Ile Arg Lys Ser Glu Ala
115 120 125
Leu Thr Ala Gly Asn Ser Gly Leu Thr Leu Asn Ile Ala Ala Asn Tyr
130 135 140
Gly Gly Arg Trp Asp Ile Val Gln Gly Val Arg Gln Leu Ala Glu Lys
145 150 155 160
Val Gln Gln Gly Asn Leu Gln Pro Asp Gln Ile Asp Glu Glu Met Leu
165 170 175
Asn Gln His Val Cys Met His Glu Leu Ala Pro Val Asp Leu Val Ile
180 185 190
Arg Thr Gly Gly Glu His Arg Ile Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Ile
195 200 205
Ala Tyr Ala Glu Leu Tyr Phe Thr Asp Val Leu Trp Pro Asp Phe Asp
210 215 220
Glu Gln Asp Phe Lys Gly Ala Leu Asn Ala Phe Ala Asn Arg Glu Arg
225 230 235 240
Arg Phe Gly Gly Thr Glu Pro Gly Asp Glu Thr Ala
245 250
<210> 46
<211> 249
<212> PRT
<213> 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)
<400> 46
Met Phe Pro Ile Lys Lys Arg Lys Ala Ile Lys Asn Asn Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ala Ala Gln Ile Pro Lys His Ile Ala Ile Ile Met Asp Gly Asn Gly
20 25 30
Arg Trp Ala Lys Gln Lys Lys Met Pro Arg Ile Lys Gly His Tyr Glu
35 40 45
Gly Met Gln Thr Val Lys Lys Ile Thr Arg Tyr Ala Ser Asp Leu Gly
50 55 60
Val Lys Tyr Leu Thr Leu Tyr Ala Phe Ser Thr Glu Asn Trp Ser Arg
65 70 75 80
Pro Lys Asp Glu Val Asn Tyr Leu Met Lys Leu Pro Gly Asp Phe Leu
85 90 95
Asn Thr Phe Leu Pro Glu Leu Ile Glu Lys Asn Val Lys Val Glu Thr
100 105 110
Ile Gly Phe Ile Asp Asp Leu Pro Asp His Thr Lys Lys Ala Val Leu
115 120 125
Glu Ala Lys Glu Lys Thr Lys His Asn Thr Gly Leu Thr Leu Val Phe
130 135 140
Ala Leu Asn Tyr Gly Gly Arg Lys Glu Ile Ile Ser Ala Val Gln Leu
145 150 155 160
Ile Ala Glu Arg Tyr Lys Ser Gly Glu Ile Ser Leu Asp Glu Ile Ser
165 170 175
Glu Thr His Phe Asn Glu Tyr Leu Phe Thr Ala Asn Met Pro Asp Pro
180 185 190
Glu Leu Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Glu Arg Leu Ser Asn Phe Leu
195 200 205
Ile Trp Gln Cys Ser Tyr Ser Glu Phe Val Phe Ile Asp Glu Phe Trp
210 215 220
Pro Asp Phe Asn Glu Glu Ser Leu Ala Gln Cys Ile Ser Ile Tyr Gln
225 230 235 240
Asn Arg His Arg Arg Phe Gly Gly Leu
245
<210> 47
<211> 343
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 47
Met Lys Met Pro Ser Ile Ile Gln Ile Gln Phe Val Ala Leu Lys Arg
1 5 10 15
Leu Leu Val Glu Thr Lys Glu Gln Met Cys Phe Ala Val Lys Ser Ile
20 25 30
Phe Gln Arg Val Phe Ala Trp Val Met Ser Leu Ser Leu Phe Ser Trp
35 40 45
Phe Tyr Val Asn Leu Gln Asn Ile Leu Ile Lys Ala Leu Arg Val Gly
50 55 60
Pro Val Pro Glu His Val Ser Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Ala Lys Ser Arg Arg Leu Pro Val Lys Lys Gly His Glu Ala Gly Gly
85 90 95
Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Tyr Ile Cys Lys Arg Leu Gly Val Lys
100 105 110
Cys Val Ser Ala Tyr Ala Phe Ser Ile Glu Asn Phe Asn Arg Pro Lys
115 120 125
Glu Glu Val Asp Thr Leu Met Asn Leu Phe Thr Val Lys Leu Asp Glu
130 135 140
Phe Ala Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys Asp Pro Leu Tyr Gly Ser Lys
145 150 155 160
Ile Arg Ile Val Gly Asp Gln Ser Leu Leu Ser Pro Glu Met Arg Lys
165 170 175
Lys Ile Lys Lys Val Glu Glu Ile Thr Gln Asp Gly Asp Asp Phe Thr
180 185 190
Leu Phe Ile Cys Phe Pro Tyr Thr Ser Arg Asn Asp Met Leu His Thr
195 200 205
Ile Arg Asp Ser Val Glu Asp His Leu Glu Asn Lys Ser Pro Arg Ile
210 215 220
Asn Ile Arg Lys Phe Thr Asn Lys Met Tyr Met Gly Phe His Ser Asn
225 230 235 240
Lys Cys Glu Leu Leu Ile Arg Thr Ser Gly His Arg Arg Leu Ser Asp
245 250 255
Tyr Met Leu Trp Gln Val His Glu Asn Ala Thr Ile Glu Phe Ser Asp
260 265 270
Thr Leu Trp Pro Asn Phe Ser Phe Phe Ala Met Tyr Leu Met Ile Leu
275 280 285
Lys Trp Ser Phe Phe Ser Thr Ile Gln Lys Tyr Asn Glu Lys Asn His
290 295 300
Ser Leu Phe Glu Lys Ile His Glu Ser Val Pro Ser Ile Phe Lys Lys
305 310 315 320
Lys Lys Thr Ala Met Ser Leu Tyr Asn Phe Pro Asn Pro Pro Ile Ser
325 330 335
Val Ser Val Thr Gly Asp Glu
340
<210> 48
<211> 286
<212> PRT
<213> 烟草樟子松(Nicotiana sylvestris)
<400> 48
Met Leu Lys Ser Met Asp Gly Leu Ala Glu Lys Leu Phe Trp Ser Ser
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Met Leu Lys Pro Leu Phe Arg Ile Leu Ser Val Gly Pro
20 25 30
Ile Pro Asn His Val Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Tyr Ala
35 40 45
Lys Lys Arg Asn Met Ala Val Ser Asn Gly Tyr Arg Ala Gly Phe Met
50 55 60
Ala Ile Met Ser Met Leu Lys Tyr Cys Tyr Val Leu Gly Val Lys Tyr
65 70 75 80
Met Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Lys Arg Arg Pro Glu
85 90 95
Glu Val Gln Tyr Leu Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Gly Leu
100 105 110
Leu His Lys Glu Ser Val Val Asn Gln Tyr Gly Val Arg Val His Phe
115 120 125
Val Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Pro Val Arg Val Ala Ala Glu
130 135 140
Lys Ala Met Gln Ala Thr Ala Asn Asn Thr Asn Ser Thr Leu Leu Ile
145 150 155 160
Cys Val Ala Tyr Ser Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Gln Ser
165 170 175
Ser Cys Gln Glu Lys Trp Asn Glu Ile Gln Glu Leu Asn Ala Asn Gln
180 185 190
Pro Gln Asn Val Glu Val Thr Lys Glu Ile Gln Glu Leu Asn Gln Ile
195 200 205
Ile Gln Leu Val Asp Ile Glu Arg His Met Tyr Met Arg Leu Ala His
210 215 220
Asn Pro Asp Met Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Thr Arg Leu Ser Asn
225 230 235 240
Phe Leu Leu Trp Gln Thr Thr Asn Cys Leu Leu Tyr Ser Pro Lys Val
245 250 255
Leu Phe Pro Glu Ile Gly Leu Arg His Leu Ile Trp Ala Val Leu His
260 265 270
Phe Gln Arg Leu Tyr Pro His Leu Glu Lys Arg Lys Gln Leu
275 280 285
<210> 49
<211> 333
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 49
Met Ser Trp Ile Lys Glu Gly Glu Leu Ser Leu Trp Glu Arg Phe Cys
1 5 10 15
Ala Asn Ile Ile Lys Ala Gly Pro Val Pro Lys His Ile Ala Phe Ile
20 25 30
Met Asp Gly Asn Arg Arg Tyr Ala Lys Lys Cys Gln Val Glu Arg Gln
35 40 45
Glu Gly His Thr Gln Gly Phe Asn Lys Leu Ala Glu Thr Leu Arg Trp
50 55 60
Cys Leu Asn Leu Gly Ile Leu Glu Val Thr Val Tyr Ala Phe Ser Ile
65 70 75 80
Glu Asn Phe Lys Arg Ser Lys Ser Glu Val Asp Gly Leu Leu Asp Leu
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Cys Leu Met Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gln
100 105 110
Lys His Gly Val Cys Ile Arg Val Leu Gly Asp Leu His Leu Leu Pro
115 120 125
Leu Asp Leu Gln Glu Lys Ile Ala His Ala Ile Gln Ala Thr Lys Asn
130 135 140
Tyr Asn Lys Cys Phe Leu Asn Val Cys Phe Ala Tyr Thr Ser Arg His
145 150 155 160
Glu Ile Ala Asn Ala Val Arg Glu Met Ala Trp Gly Val Glu Gln Gly
165 170 175
Leu Leu Glu Pro Ser Asp Val Ser Glu Ser Leu Leu Asp Lys Cys Leu
180 185 190
Tyr Ser Asn His Ser Pro His Pro Asp Ile Leu Ile Arg Thr Ser Gly
195 200 205
Glu Val Arg Leu Ser Asp Phe Leu Leu Trp Gln Thr Ser His Ser Cys
210 215 220
Leu Val Phe Gln Pro Val Leu Trp Pro Glu Tyr Thr Phe Trp Asn Leu
225 230 235 240
Cys Glu Ala Ile Leu Gln Phe Gln Arg Asn His Gly Ala Leu Gln Lys
245 250 255
Ala Arg Asp Met Tyr Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Gln Leu Glu Arg
260 265 270
Asp Gln Ala Ala Val Thr Glu Gln Leu Leu Arg Glu Gly Leu Gln Ala
275 280 285
Ser Gly Asp Ala Gln Leu Arg Arg Thr Arg Leu His Lys Leu Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Glu Glu Arg Val Gln Gly Phe Leu Lys Ala Leu Glu Leu Lys
305 310 315 320
Arg Ala Asn Trp Leu Ala Leu Trp Gly Thr Ala Ser Ala
325 330
<210> 50
<211> 333
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Met Ser Trp Ile Lys Glu Gly Glu Leu Ser Leu Trp Glu Arg Phe Cys
1 5 10 15
Ala Asn Ile Ile Lys Ala Gly Pro Met Pro Lys His Ile Ala Phe Ile
20 25 30
Met Asp Gly Asn Arg Arg Tyr Ala Lys Lys Cys Gln Val Glu Arg Gln
35 40 45
Glu Gly His Ser Gln Gly Phe Asn Lys Leu Ala Glu Thr Leu Arg Trp
50 55 60
Cys Leu Asn Leu Gly Ile Leu Glu Val Thr Val Tyr Ala Phe Ser Ile
65 70 75 80
Glu Asn Phe Lys Arg Ser Lys Ser Glu Val Asp Gly Leu Met Asp Leu
85 90 95
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Arg Leu Met Glu Glu Lys Glu Lys Leu Gln
100 105 110
Lys His Gly Val Cys Ile Arg Val Leu Gly Asp Leu His Leu Leu Pro
115 120 125
Leu Asp Leu Gln Glu Leu Ile Ala Gln Ala Val Gln Ala Thr Lys Asn
130 135 140
Tyr Asn Lys Cys Phe Leu Asn Val Cys Phe Ala Tyr Thr Ser Arg His
145 150 155 160
Glu Ile Ser Asn Ala Val Arg Glu Met Ala Trp Gly Val Glu Gln Gly
165 170 175
Leu Leu Asp Pro Ser Asp Ile Ser Glu Ser Leu Leu Asp Lys Cys Leu
180 185 190
Tyr Thr Asn Arg Ser Pro His Pro Asp Ile Leu Ile Arg Thr Ser Gly
195 200 205
Glu Val Arg Leu Ser Asp Phe Leu Leu Trp Gln Thr Ser His Ser Cys
210 215 220
Leu Val Phe Gln Pro Val Leu Trp Pro Glu Tyr Thr Phe Trp Asn Leu
225 230 235 240
Phe Glu Ala Ile Leu Gln Phe Gln Met Asn His Ser Val Leu Gln Lys
245 250 255
Ala Arg Asp Met Tyr Ala Glu Glu Arg Lys Arg Gln Gln Leu Glu Arg
260 265 270
Asp Gln Ala Thr Val Thr Glu Gln Leu Leu Arg Glu Gly Leu Gln Ala
275 280 285
Ser Gly Asp Ala Gln Leu Arg Arg Thr Arg Leu His Lys Leu Ser Ala
290 295 300
Arg Arg Glu Glu Arg Val Gln Gly Phe Leu Gln Ala Leu Glu Leu Lys
305 310 315 320
Arg Ala Asp Trp Leu Ala Arg Leu Gly Thr Ala Ser Ala
325 330
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 51
Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys Lys
1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)
<400> 52
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Lys Pro His Glu
1 5 10 15
Val
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-17
<400> 53
ttaggatcca tggaattata caacgg 26
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-18
<400> 54
aacggatcct tttaagtatt ccttatg 27
<210> 55
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-19
<400> 55
tttctcgaga tggatttgaa acctggagct g 31
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-20
<400> 56
tttctcgagt catgtaccat aattttgctg cac 33
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-21
<400> 57
gtcgacatgg attcgaatca atcg 24
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-22
<400> 58
ggatccttaa gttccatagt tttgg 25
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-23
<400> 59
tatcccggga tgaatacc 18
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-24
<400> 60
tgaactagtc taatcgagct ttttc 25
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-25
<400> 61
acccgggatg gattcg 16
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物-26
<400> 62
cgcggactag tttaagttcc atag 24
<210> 63
<211> 1032
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 63
atgaaaatgc ccagtattat tcagattcag tttgtagccc taaaaaggct tttggtagaa 60
accaaagaac agatgtgctt cgcagtgaaa agtatatttc agagagtatt tgcgtgggtt 120
atgtcattaa gcttgttttc atggttttat gtaaatcttc agaatatttt gataaaagca 180
ttaagggtag ggccagtgcc tgaacatgtc tcctttatca tggatggtaa ccggagatat 240
gccaagtcaa gaaggctacc agtaaaaaaa ggccatgaag ctggtgggtt aacgttacta 300
acactactgt atatctgcaa aagattgggt gtaaaatgtg tttccgccta tgcattttct 360
attgaaaatt ttaatagacc aaaagaagaa gtagatacgc taatgaattt gtttacggta 420
aagcttgatg aattcgcaaa aagagccaag gactataagg atcccttata cggatctaaa 480
ataagaatag taggtgatca atctttacta tctccagaaa tgagaaaaaa aattaaaaaa 540
gtggaagaaa tcacacagga tggagacgat ttcactttat ttatatgttt tccttacact 600
tcaagaaatg atatgttaca tactattcgt gattcagttg aagaccattt ggaaaataaa 660
tcaccaagga ttaatataag aaaatttact aataaaatgt acatgggttt ccattccaat 720
aaatgtgaat tattaatcag aacaagtggg cataggaggc tctcagacta tatgctatgg 780
caagtacatg aaaatgccac cattgaattt agtgatacgt tgtggccaaa ttttagcttc 840
tttgctatgt acctgatgat tctcaaatgg tccttctttt ccaccattca aaaatataat 900
gagaagaatc actcattgtt tgaaaaaata catgaaagcg ttccttcaat atttaaaaaa 960
aagaaaacag ctatgtcttt gtacaacttt ccaaaccccc ccatttcagt ttcggttaca 1020
ggagatgaat aa 1032
<210> 64
<211> 1037
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
ggaaaagatc tatgtcatgg atcaaggaag gagagctgtc actttgggag cggttctgtg 60
ccaacatcat aaaggcaggc ccaatgccga aacacattgc attcataatg gacgggaacc 120
gtcgctatgc caagaagtgc caggtggagc ggcaggaagg ccactcacag ggcttcaaca 180
agctagctga gactctgcgg tggtgtttga acctgggcat cctagaggtg acagtctacg 240
cattcagcat tgagaacttc aaacgctcca agagtgaggt agacgggctt atggatctgg 300
cccggcagaa gttcagccgc ttgatggaag aaaaggagaa actgcagaag catggggtgt 360
gtatccgggt cctgggcgat ctgcacttgt tgcccttgga tctccaggag ctgattgcac 420
aagctgtaca ggccacgaag aactacaaca agtgtttcct gaatgtctgt tttgcataca 480
catcccgtca tgagatcagc aatgctgtga gagagatggc ctggggggtg gagcaaggcc 540
tgttggatcc cagtgatatc tctgagtctc tgcttgataa gtgcctctat accaaccgct 600
ctcctcatcc tgacatcttg atacggactt ctggagaagt gcggctgagt gacttcttgc 660
tatggcagac ctctcactcc tgcctggtgt tccaacccgt tctgtggcca gagtatacat 720
tttggaacct cttcgaggcc atcctgcagt tccagatgaa ccatagcgtg cttcagaagg 780
cccgagacat gtatgcagag gagcggaaga ggcagcagct ggagagggac caggctacag 840
tgacagagca gctgctgcga gaggggctcc aagccagtgg ggacgcccag ctccgaagga 900
cacgcttgca caaactctcg gccagacggg aagagcgagt ccaaggcttc ctgcaggcct 960
tggaactcaa gcgagctgac tggctggccc gtctgggcac tgcatcagcc tgaatgaggc 1020
tgtcgacctg ccacttt 1037
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种生产聚类异戊二烯的方法，该方法包括将编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒在体外结合的步骤。
2.根据权利要求1所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白质含有：
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第41位或相应位置的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第42位或相应位置的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第45位或相应位置的精氨酸残基；和
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第89位或相应位置的天冬酰胺残基。
3.根据权利要求1或2所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白在由SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第41至49位或相应位置处含有以下氨基酸序列(A)：
DGNX1RX2AKK (A)
其中X1和X2彼此相同或不同，并且各自代表任何氨基酸残基，或
具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(A)的X1和X2以外的7个氨基酸残基中的至少5个相同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第81至97位或相应位置处含有以下氨基酸序列(B)：
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV (B)
其中X11～X19彼此相同或不同，各自表示任何氨基酸残基，或
具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(B)的X11～X19以外的8个氨基酸残基中的至少5个相同。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，选自编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因中的至少一种源自植物。
6.根据权利要求5所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，选自编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因中的至少一种源自巴西橡胶树。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，结合步骤包括在橡胶颗粒和含有编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的mRNA和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成，从而使CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合到橡胶颗粒上。
8.根据权利要求7所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，无细胞蛋白质合成溶液含有胚芽提取物。
9.根据权利要求8所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，胚芽提取物衍生自小麦。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，橡胶颗粒以5至50g/L的浓度存在于无细胞蛋白质合成溶液中。
11.一种充气轮胎的制造方法，所述方法包括以下步骤：
通过权利要求1至10中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法制造聚类异戊二烯；
将聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；
由混炼物制造生胎；
对生胎进行硫化。
12.一种橡胶制品的制造方法，所述方法包括以下步骤：
通过权利要求1至10中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法制造聚类异戊二烯；
将聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；
由混炼物形成生胶制品；
对生胶制品进行硫化。
13.一种载体，其包括：
启动子，具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性；和
编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。
14.一种载体，其包括：
启动子，具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性；以及
编码与启动子功能性连接的顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。
15.根据权利要求13或14所述的载体，其中，具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子为选自编码橡胶延伸因子(REF)的基因的启动子、编码小橡胶颗粒蛋白质(SRPP)的基因的启动子、编码Hevein 2.1(HEV2.1)的基因的启动子和编码MYC1转录因子(MYC1)的基因的启动子的至少一种。
16.一种转基因植物，其中，引入有权利要求13至15中任一项所述的载体。
17.一种方法，用于通过将权利要求13至15中任一项所述的载体引入植物中来增强植物中聚类异戊二烯产量。
18.一种充气轮胎的制造方法，所述方法包括以下步骤：
将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，所述转基因植物通过将权利要求13至15中任一项所述的载体引入到植物中而制得；
由混炼物制造生胎；
对生胎进行硫化。
19.一种橡胶制品的制造方法，所述方法包括以下步骤：
将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，所述转基因植物通过将权利要求13至15中任一项所述的载体引入到植物中而制得；
由混炼物形成生胶制品；
对生胶制品进行硫化。

Claims (19)

1.一种生产聚类异戊二烯的方法，该方法包括将编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因表达的蛋白质和由编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因表达的蛋白质与橡胶颗粒在体外结合的步骤。
2.根据权利要求1所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白质含有：
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第41位或相应位置的天冬氨酸残基；
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第42位或相应位置的甘氨酸残基；
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第45位或相应位置的精氨酸残基；和
由SEQ ID NO：2表示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第89位或相应位置的天冬酰胺残基。
3.根据权利要求1或2所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白在由SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第41至49位或相应位置处含有以下氨基酸序列(A)：
DGNX1RX2AKK (A)
其中X1和X2彼此相同或不同，并且各自代表任何氨基酸残基，或
具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(A)的X1和X2以外的7个氨基酸残基中的至少5个相同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白在SEQ ID NO：2所示的来自巴西橡胶树的HRT1的氨基酸序列的第81至97位或相应位置处含有以下氨基酸序列(B)：
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV (B)
其中X11～X19彼此相同或不同，各自表示任何氨基酸残基，或
具有序列同一性的氨基酸序列，所述序列同一性使所述氨基酸序列与氨基酸序列(B)的X11～X19以外的8个氨基酸残基中的至少5个相同。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，选自编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因中的至少一种源自植物。
6.根据权利要求5所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，选自编码顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因中的至少一种源自巴西橡胶树。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，结合步骤包括在橡胶颗粒和含有编码顺式-异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的mRNA和编码Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的mRNA的无细胞蛋白质合成溶液的存在下进行蛋白质合成，从而使CPT家族蛋白和NgBR家族蛋白结合到橡胶颗粒上。
8.根据权利要求7所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，无细胞蛋白质合成溶液含有胚芽提取物。
9.根据权利要求8所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，胚芽提取物衍生自小麦。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法，其中，橡胶颗粒以5至50g/L的浓度存在于无细胞蛋白质合成溶液中。
11.一种充气轮胎的制造方法，所述方法包括以下步骤：
将通过权利要求1至10中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；
由混炼物制造生胎；
对生胎进行硫化。
12.一种橡胶制品的制造方法，所述方法包括以下步骤：
将通过权利要求1至10中任一项所述的生产聚类异戊二烯的方法制造的聚类异戊二烯与添加剂混炼，得到混炼物；
由混炼物形成生胶制品；
对生胶制品进行硫化。
13.一种载体，其包括：
启动子，具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性；和
编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。
14.一种载体，其包括：
启动子，具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性；以及
编码与启动子功能性连接的顺式异戊烯基转移酶(CPT)家族蛋白的基因和编码与启动子功能性连接的Nogo-B受体(NgBR)家族蛋白的基因。
15.根据权利要求13或14所述的载体，其中，具有促进乳管特异性基因表达的启动子活性的启动子为选自编码橡胶延伸因子(REF)的基因的启动子、编码小橡胶颗粒蛋白质(SRPP)的基因的启动子、编码Hevein 2.1(HEV2.1)的基因的启动子和编码MYC1转录因子(MYC1)的基因的启动子的至少一种。
16.一种转基因植物，其中，引入有权利要求13至15中任一项所述的载体。
17.一种方法，用于通过将权利要求13至15中任一项所述的载体引入植物中来增强植物中聚类异戊二烯产量。
18.一种充气轮胎的制造方法，所述方法包括以下步骤：
将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，所述转基因植物通过将权利要求13至15中任一项所述的载体引入到植物中而制得；
由混炼物制造生胎；
对生胎进行硫化。
19.一种橡胶制品的制造方法，所述方法包括以下步骤：
将由转基因植物产生的聚类异戊二烯与添加剂混炼以获得混炼物，所述转基因植物通过将权利要求13至15中任一项所述的载体引入到植物中而制得；
由混炼物形成生胶制品；
对生胶制品进行硫化。
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