JP6586693B2 - ポリイソプレノイドの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ポリイソプレノイドの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。従来、パラゴムノキにエテフォンやジャスモン酸メチルを塗布することで、乳管形成の誘導を引き起こし、天然ゴムの増産を行ってきた。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれている。

天然ゴムは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本単位とし、シス−１，４−ポリイソプレン構造をとっており、天然ゴムの生合成にはその構造からシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）が関係していると考えられている。例えば、パラゴムノキでは複数のＣＰＴの存在が確認されており、Ｈｅｖｅａ Ｒｕｂｂｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ＨＲＴ１）、Ｈｅｖｅａ Ｒｕｂｂｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２（ＨＲＴ２）などが知られている（例えば、非特許文献１、２参照。）。また、タンポポの一種であるゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）ではＣＰＴの発現量を抑えることにより、ゴムの合成量が低下することが知られている（例えば、非特許文献３参照。）。

また、これまでに天然ゴムの生合成に関わるタンパク質の研究として、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）が注目されてきた（例えば、非特許文献４、５参照。）。しかしながら、これらのタンパク質とＣＰＴとの関係は解明されていない。
他方、ヒトＣＰＴにおけるドリコール生合成において、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）が関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献６参照。）。

また、パラゴムノキから天然ゴムを増産するための方法が検討されているが、パラゴムノキでのゴム合成機構は解明されていないため、既知経路であるモノマー（イソペンテニル二リン酸）合成経路（メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）及び非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路））の遺伝子を発現させ、増強させた遺伝子組換えパラゴムノキが提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特表２００５−５００８４０号公報

Ｒａｈａｍａｎ他、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１３年、第１４巻 Ａｓａｗａｔｒｅｒａｔａｎａｋｕｌ他、ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第２７０巻、４６７１〜４６８０ページ Ｐｏｓｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１５８巻、１４０６〜１４１７ページ Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄ他、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１２年、第７巻 Ｐｒｉｙａ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００７年、第２６巻、１８３３〜１８３８ページ Ｋ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ他、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１１年、第３０巻、２４９０〜２５００ページ

上述のように、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源の開発やパラゴムノキにおける天然ゴムの生産効率の改善が望まれているが、現状、天然ゴムの生合成機構、特にその調節機構には未解明の部分が多く、天然ゴムの大幅な増産のためにはまだまだ多くの工夫の余地がある。

また、上述のように、パラゴムノキから天然ゴムを増産するための方法が検討されているが、パラゴムノキにエテフォンやジャスモン酸メチルなどの薬剤を投与する場合には、継続的に投与し続ける必要があるが、薬剤の長期的な投与はパラゴムノキに悪影響を与えることがあることが知られている。例えば、パラゴムノキの幹に対してエテフォンを長期的に塗布し続けると樹皮割れが生じやすくなることが知られている。

そして、上述のように、モノマー（イソペンテニル二リン酸）合成経路（メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）及び非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路））の遺伝子を発現させ、増強させても、モノマーの原料であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）は天然ゴムの原料以外にも使われるため、ＩＰＰの増産が天然ゴムの増産につながらないおそれがある。
このように、現状、天然ゴムの生合成機構、特にその調節機構には未解明の部分が多く、天然ゴムの大幅な増産のためにはまだまだ多くの工夫の余地がある。

そのような中で、上記課題を解決するための一つのアプローチとして、天然ゴムの生合成においてＣＰＴの活性の安定化及び増強を図ることにより天然ゴムの増産を目指す方法が考えられる。

本発明は、前記課題を解決し、生体外で、ゴム粒子のゴム合成活性を増強させ、天然ゴムの増産を可能にする、ポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。

本発明はまた、前記課題を解決し、ゴム合成活性を増強させた形質転換植物を作出し、天然ゴムの増産を可能にする、ポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法に関する。以降、この発明を本発明の第１の発明とし、第１の本発明とも称する。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、植物由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、パラゴムノキ由来であることが好ましい。

上記結合工程は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液は、胚芽抽出物を含むことが好ましい。

上記胚芽抽出物は、小麦由来であることが好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５〜５０ｇ／Ｌであることが好ましい。

第１の本発明はまた、上記第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

第１の本発明はまた、上記第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

本発明はまた、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させた形質転換植物を作出し、該形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造することを特徴とするポリイソプレノイドの製造方法に関する。以降、この発明を本発明の第２の発明とし、第２の本発明とも称する。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、植物由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、パラゴムノキ由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

上記Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、以下の［３］又は［４］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［３］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

上記Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、以下の［５］又は［６］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［５］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ

第２の本発明はまた、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させた形質転換植物に関する。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、植物由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種は、パラゴムノキ由来であることが好ましい。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

上記Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、以下の［３］又は［４］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［３］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

上記Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、以下の［５］又は［６］に記載のＤＮＡであることが好ましい。
［５］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ

第２の本発明はまた、上記第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

第２の本発明はまた、上記第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

第１の本発明によれば、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法であるので、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させることで、ＣＰＴファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されることが予想される。その結果、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴムを生産することが可能となる。

第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。

第１の本発明のゴム製品の製造方法は、第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。

第２の本発明によれば、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させた形質転換植物を作出し、該形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造することを特徴とするポリイソプレノイドの製造方法であるので、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質が共発現することから、ＣＰＴファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されることが予想される。結果、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を共発現させた形質転換植物は、ゴム合成活性が継続的に増強し、該形質転換植物を用いて、ポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることが期待される。

第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。

第２の本発明のゴム製品の製造方法は、第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。

ＣＰＴ、ＮｇＢＲ、及びＲＥＦがゴム粒子上でゴム合成を行っている様子を示す推測図である。 ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。 実施例において透析法を行っている様子を示す概略図である。

本明細書においては、第１の本発明と第２の本発明を合わせて本発明ともいう。まず、第１の本発明について説明し、続いて第２の本発明について説明する。
（第１の本発明）
第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法は、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含む。
本発明者らは、生体外で、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成が活性化することを初めて見出した。なお、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の組み合わせが直接的にゴム合成に関与していることは本発明者らが今回初めて見出したことである。ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質は、図１に示すようにゴム粒子上に配置され、ゴム合成を行っているものと推測される。図１には、一例として、ＣＰＴファミリー蛋白質としてＣＰＴが、ＮｇＢＲファミリー蛋白質としてＮｇＢＲが、ＲＥＦファミリー蛋白質としてＲＥＦが描かれており、基質のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）がＣＰＴにより重合され、ゴム粒子中に天然ゴムが合成される様子が模式的に示されている。
したがって、第１の本発明の製造方法のように、生体外で（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内で）、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴムを生産することができる。
なお、第１の本発明の製造方法は、上記結合工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、第１の本発明において、ゴム粒子に結合するＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、ＲＥＦファミリー蛋白質の量は特に限定されない。

ここで、本明細書において、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質が結合するとは、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している蛋白質とＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、ＲＥＦファミリー蛋白質が複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。

上記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシ、インドゴムノキなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。

また、上記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＲＰ）を用いてもよいし、粒子径の大きいＬａｒｇｅ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＲＰ）を用いてもよい。

上記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、５００〜１５００×ｇでの遠心分離処理、１７００〜２５００×ｇでの遠心分離処理、７０００〜９０００×ｇでの遠心分離処理、１５０００〜２５０００×ｇでの遠心分離処理、４００００〜６００００×ｇでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

上記結合工程においては、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。最も好ましくはいずれもパラゴムノキ由来であることである。

上記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。

なお、本明細書において、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。具体的には、例えば、植物では、図２に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によってポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ＣＰＴファミリー蛋白質は、図２中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ＣＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、Ｃｉｓ ＩＰＰＳ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００４７５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。上記ＣＰＴファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＣＰＴ（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＣＰＴ３〜５）、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ１〜９、レタス由来のＣＰＴ１〜３、ロシアンタンポポ由来のＣＰＴ１〜３、大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）などが挙げられる。
ここで、本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）を有する化合物を意味する。また、ｃｉｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えば、ｃｉｓ−ファルネシル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴムなどが挙げられる。
また、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質は、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側でＣＰＴファミリー蛋白質又は他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質であり、ＣＰＴファミリー蛋白質を膜上に保持することにより機能を補助する。上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の特徴としては、Ｎ末端側に膜貫通ドメインを有し、Ｃ末端側にＣｉｓ ＩＰＰＳ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有することである。上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＮｇＢＲ（ＨＲＴＢＰ）、シロイヌナズナ由来のＬＥＷ１、レタス由来のＬｓＣＰＴＬ１〜２、タンポポ由来のＴｂＲＴＡなどが挙げられる。
Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産出植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことであり、ゴム粒子が安定化するのに寄与する。上記ＲＥＦファミリー蛋白質の特徴としては、ＲＥＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｐｆａｍ０５７５５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。上記ＲＥＦファミリー蛋白質としては、ＲＥＦ、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）などが挙げられる。

上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質

なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜４４個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２９個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質

なお、上記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。

上記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［４］が挙げられる。
［４］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［５］も挙げられる。
［５］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質

なお、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜５２個のアミノ酸、更に好ましくは１〜３９個のアミノ酸、更により好ましくは１〜２６個のアミノ酸、特に好ましくは１〜１３個のアミノ酸、最も好ましくは１〜６個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［６］も挙げられる。
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質

なお、上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、アミノ酸配列を同定し、Ｃｉｓ ＩＰＰＳ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。

上記ＲＥＦファミリー蛋白質の具体例としては、下記［７］が挙げられる。
［７］配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＲＥＦファミリー蛋白質の具体例としては、下記［８］も挙げられる。
［８］配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質

なお、上記ＲＥＦファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜２８個のアミノ酸、更に好ましくは１〜２１個のアミノ酸、更により好ましくは１〜１４個のアミノ酸、特に好ましくは１〜７個のアミノ酸、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸、より最も好ましくは１個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ＲＥＦファミリー蛋白質の具体例としては、下記［９］も挙げられる。
［９］配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質

なお、上記ＲＥＦファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号６で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

上記ＲＥＦファミリー蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、アミノ酸配列を同定し、ＲＥＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｐｆａｍ０５７５５）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。

上記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ***ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ***ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

上記ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［３］又は［４］が挙げられる。
［３］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＤＮＡをアミノ酸配列に翻訳した際に、Ｃｉｓ ＩＰＰＳ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。

上記ＲＥＦファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［５］又は［６］が挙げられる。
［５］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号５で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、ＲＥＦファミリー蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＤＮＡをアミノ酸配列に翻訳した際に、ＲＥＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｐｆａｍ０５７５５）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。

また、上記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。

なお、上記結合工程においては、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。

上記その他の蛋白質の由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記その他の蛋白質としては、何ら制限されずいかなる蛋白質であってもよいが、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させる観点からは、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であることが好ましい。なお、ゴム粒子上に存在する蛋白質は、大きくゴム粒子の膜表面に結合する蛋白質であってもよいし、ゴム粒子の膜に挿入されるように結合する蛋白質であってもよいし、上記膜に結合している蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。

上記ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質としては、例えば、β−１，３−グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。

上記結合工程は、生体外で、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させる方法などが挙げられる。

上記結合工程としては、中でも、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて（より具体的には、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を得ることが好ましい。
なお、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造されるため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していないのに対して、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。このことから、蛋白質が結合していないリポソームなどに比べて、既に蛋白質が結合しており、蛋白質で覆われた状態にあるゴム粒子に更に蛋白質を結合させるのは困難であることが予想される。また、ゴム粒子に既に結合している蛋白質が無細胞蛋白合成を阻害することも懸念される。以上のような点から、ゴム粒子共存下での無細胞蛋白合成は実現が困難であると考えられてきた。このような状況下、本発明者らは、これまでに試みられていなかった、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行ったところ、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を製造することができることを見出した。

上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて行われる蛋白質合成は、いわゆる、無細胞蛋白合成法を用いたＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の合成であり、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を合成でき、当該無細胞蛋白合成法をゴム粒子の共存下で行うことにより、合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をｎａｔｉｖｅ状態でゴム粒子に結合することが可能となる。

ここで、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下、蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の各蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している蛋白質と複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。

上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型である。
上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡの由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されないが、例えば、ゴム産生植物のラテックスからホットフェノール法などによりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、ＲＥＦファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を元に作製したプライマーを用いてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、ＲＥＦファミリー蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を取得して、該ＤＮＡ断片を元に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことにより調製することができる。

上記無細胞蛋白合成溶液は、上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む限り、その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡとしては、翻訳されてその他の蛋白質を発現することができるものを用いることができる。なお、その他の蛋白質としては、上述したものと同様のものを挙げることができる。

第１の本発明における結合工程においては、ゴム粒子の共存下でＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成が行われることが好ましいが、当該無細胞蛋白合成は、上記無細胞蛋白合成溶液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。用いられる無細胞蛋白合成系としては、通常用いられる無細胞蛋白質合成手段を採用することができる。例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＳ５００（Ｒｏｓｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９−５６４（２０００）、特開２０００−２３６８９６号公報、特開２００２−１２５６９３号公報、特開２００２−２０４６８９号公報に従って調製された小麦胚芽抽出液及びその無細胞蛋白質合成系（特開２００２−２０４６８９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４６５２−１４６５７（２００２））を使用することができる。中でも、胚芽抽出物を用いる系が好ましい。すなわち、上記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含むこともまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。

上記胚芽抽出物の由来は特に限定されないが、翻訳効率の観点からは、植物の蛋白質を無細胞蛋白合成法で合成する場合には植物由来の胚芽抽出物を用いることが好ましい。特に好ましくは小麦由来の胚芽抽出物を用いることである。すなわち、上記胚芽抽出物が小麦由来であることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。

上記胚芽抽出物の調製方法としては特に制限されず、通常の胚芽抽出物調製方法を採用することができるが、例えば、特開２００５−２１８３５７号公報に記載された方法を採用すればよい。

上記無細胞蛋白合成溶液は、更にサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩（以降、単に「活性増強物質」とも称する。）を含むことが好ましい。該活性増強物質を含有することにより、蛋白質合成活性を更に増強させることができる。

上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、例えば、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−３’,５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、８−ブロモアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ブロモｃＡＭＰ）及びその塩、８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（クロロフェニルチオｃＡＭＰ）及びその塩、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルｃＡＭＰ）及びその塩、アデノシン−２’,５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−２’,５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩等が挙げられる。

上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば特に制限されないが、中でも好ましいものとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。

上記活性増強物質としては、中でも、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

上記活性増強物質は、あらかじめ上記無細胞蛋白合成溶液に加えておいてもよいが、当該溶液中で不安定である場合には、無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成反応を行う際に加えるのが好ましい。

上記活性増強物質の添加量としては、上記無細胞蛋白合成溶液による蛋白質合成反応が活性化（増加）しうる濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常０．１ミリモル／リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは０．２ミリモル／リットル、より好ましくは０．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８ミリモル／リットルである。他方、濃度の上限は、好ましくは２４ミリモル／リットル、より好ましくは６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは３．２ミリモル／リットルである。

上記活性増強物質を上記無細胞蛋白合成溶液に加える際の無細胞蛋白合成溶液の温度としては特に限定されないが、０〜３０℃が好ましく、１０〜２６℃がより好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液は、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）に加え、蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むものであり、このような無細胞蛋白合成溶液を用いることにより無細胞蛋白合成反応系とすることができる。
なお、上記特開２００５−２１８３５７号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてｔＲＮＡを追加すればよい。

第１の本発明における結合工程は、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うことが好ましいものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、上記無細胞蛋白合成溶液にゴム粒子を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５〜５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対してゴム粒子を５〜５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成されたＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。上記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは１０〜４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５〜３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５〜３０ｇ／Ｌである。

また、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜ゴム粒子を追加していってもよい。ゴム粒子を上記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３〜４８時間（好ましくは３〜３０時間、より好ましくは３〜２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とが共存するようにしておくことが好ましい。

上記ゴム粒子は、第１の本発明における結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）前処理等の特段の処理を行う必要はない。ただし、ゴム粒子上に存在する蛋白質の内、第１の本発明の方法により結合させたいＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の割合を高めるために、予め界面活性剤によりゴム粒子から蛋白質を除去してもよい。このように、第１の本発明において用いられるゴム粒子が、第１の本発明における結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）、界面活性剤で洗浄されたものであることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。

上記界面活性剤としては特に限定されず、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの中でも、膜上の蛋白質の変性作用が小さい点で、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好適に用いられ、両性界面活性剤が特に好適に用いられる。すなわち、上記界面活性剤が、両性界面活性剤であることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンエーテル系、ポリオキシアルキレンエステル系、多価アルコール脂肪酸エステル系、糖脂肪酸エステル系、アルキルポリグリコシド系、ポリオキシアルキレンポリグルコシド系の非イオン性界面活性剤や、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。

上記ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリオールアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンモノ、ジ、又はトリスチリルフェニルエーテル等が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適に使用される。なお、前記ポリオールとしては、炭素数２〜１２の多価アルコールが好ましく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、スクロース、ペンタエリトリトール、ソルビタン等が挙げられる。

上記ポリオキシアルキレンエステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルロジン酸エステル等が挙げられる。
上記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数２〜１２の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等）も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
上記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
上記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。

これら非イオン性界面活性剤におけるアルキル基としては、例えば、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和のアルキル基が挙げられる。また、ポリオキシアルキレン基としては、炭素数２〜４のアルキレン基を有するものが挙げられ、例えば、酸化エチレンの付加モル数が１〜５０モル程度のものが挙げられる。また、前記脂肪酸としては、例えば、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和の脂肪酸が挙げられる。

上記非イオン性界面活性剤としては、中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で、かつ蛋白質の変性作用が小さい状態で、適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、ポリオキシエチレンエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）が特に好ましい。

上記両性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム塩基／スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）タイプ、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に可溶）、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に不溶）、四級アンモニウム塩基／カルボキシル基タイプなどの両性イオン界面活性剤が挙げられる。なお、前記の酸基は塩であってもよい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に＋と−の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数（ｐＫａ）が、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましい。

上記両性界面活性剤としては、具体的には、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナミドプロピル）−コラミド、ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸｛Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）−３−１４｝、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸等のアンモニウムスルホベタイン類、ｎ−オクチルホスホコリン、ｎ−ノニルホスホコリン、ｎ−デシルホスホコリン、ｎ−ドデシルホスホコリン、ｎ−テトラデシルホスホコリン、ｎ−ヘキサデシルホスホコリン等のホスホコリン類、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類が挙げられる。これらの中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で適度に蛋白質を除去できるという理由から、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）が特に好ましい。

上記界面活性剤の処理濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の３倍以内であることが好ましい。臨界ミセル濃度の３倍を超える濃度の界面活性剤で処理するとゴム粒子の膜安定性が低下するおそれがある。より好ましくは２．５倍以内であり、更に好ましくは２．０倍以内である。また下限としては、０．０５倍以上であることが好ましく、０．１倍以上であることがより好ましく、０．３倍以上であることが更に好ましい。

上記無細胞蛋白合成における蛋白質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。

中でも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中でゴム粒子が分散してしまい、合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をゴム粒子に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるがゴム粒子は透過しないため、ゴム粒子の分散を防ぐことができ、効率的にゴム粒子に合成されるＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。

なお、上記透析法とは、上記無細胞蛋白合成における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。

上記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２０〜２６℃で、１０分〜４８時間（好ましくは１０分〜３０時間、より好ましくは１０分〜２４時間）行うことができる。

また、上記無細胞蛋白合成溶液に含まれるＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、上記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、上記蛋白質合成反応中に、上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
なお、上記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。

第１の本発明の製造方法においては、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を行った後、必要に応じてゴム粒子を回収する工程を行ってもよい。

上記ゴム粒子回収工程は、ゴム粒子を回収することができればその手法は特に制限されず、ゴム粒子を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離によりゴム粒子を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度はゴム粒子を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合したＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

例えば、上記無細胞蛋白合成を行った場合には、上記遠心分離処理を行うと、ゴム粒子が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させたゴム粒子を回収することができる。回収したゴム粒子はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。

なお、ゴム粒子に結合させたＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質は、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であるため、上記ゴム粒子回収工程を行った後に回収されたゴム粒子は更なる特別な処理を経ずに通常の天然ゴムと同様に用いることができる。

更に、第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドは、上記ゴム粒子を以下の固化工程に供することで回収することができる。

上記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒にゴム粒子を添加する方法やゴム粒子に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ゴム粒子からゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

このように、第１の本発明によれば、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、これにより、より効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でゴム（ポリイソプレノイドの１種）を生産することが可能となる。
すなわち、ポリイソプレノイドを合成する方法であって、該方法は、生体外（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内）で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドを合成する方法もまた、第１の本発明の１つである。
なお、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程については、上述したとおりである。

なお、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばセスタテルペン（Ｃ_２５）、トリテルペン（Ｃ_３０）、テトラテルペン（Ｃ_４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。

（ゴム製品の製造方法）
第１の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第１の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第１の本発明のゴム製品の製造方法が第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜混練工程＞
混練工程では、上記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。

添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記ポリイソプレノイド以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。

混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。

＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。

（第２の本発明）
第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法は、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させた形質転換植物を作出し、該形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造することを特徴とする。
本発明者らは、生体外で、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成が活性化することを初めて見出した。このことから、植物体内でＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を共発現させると、ゴム合成活性が増強することが予想される。したがって、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を共発現させた形質転換植物を用いて、ポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることが期待できる。

なお、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＲＥＦファミリー蛋白質をコードする遺伝子をそれぞれ単独で植物に導入して形質転換植物を作出しても、該形質転換植物のゴム合成活性は向上するとも考えられる。しかしながら、この３種類の遺伝子を共発現させることでより相乗的な効果が得られると考えられる。例えば、ＣＰＴファミリー蛋白質を単独で発現させてもＮｇＢＲファミリー蛋白質の発現量が少なければ、ＣＰＴファミリー蛋白質はゴム粒子に結合できず機能できないおそれがある。また、ＮｇＢＲファミリー蛋白質を単独で発現させても合成酵素であるＣＰＴファミリー蛋白質の発現量が少なければ、ゴム合成活性は充分に向上しないおそれがある。これに対して、ＣＰＴファミリー蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質とを共発現させることでゴム合成活性の増強につながり、更にＲＥＦファミリー蛋白質を発現させることで、ＣＰＴファミリー蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質との共発現によってゴム合成活性が増強されるであろうゴム粒子を安定した状態で、植物体内に蓄積できるようになると考えられる。このことから、植物体内でＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を共発現させることで、ゴム合成活性が顕著に増強すると予想される。

第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法は、特定の遺伝子の導入された形質転換植物を用いて行われることから、従来のように薬剤を投与するのとは違い、一度遺伝子導入されてしまえば、生物が本来持っている機構により遺伝子導入の効果が発揮されるため、その後継続的な処理を行わなくても継続的な効果が期待できる。

上記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。最も好ましくはいずれもパラゴムノキ由来であることである。また、いずれの由来であっても、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードする遺伝子が導入される植物由来であることが好ましい。

なお、第２の本発明におけるシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、ＲＥＦファミリー蛋白質については、上述の第１の本発明で述べたとおりである。

第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法においては、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入する限り、更にその他の蛋白質をコードする遺伝子が導入されてもよい。

上記その他の蛋白質をコードする遺伝子としては、第１の本発明において上述したものと同様のものが挙げられる。

シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現するように形質転換された植物（形質転換植物）を作出することができる。当該形質転換植物では、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質が共発現することとなるため、ＣＰＴファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されると予想される。その結果、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を共発現させた形質転換植物は、ゴム合成活性が継続的に増強し、該形質転換植物を用いて、ポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量を好適に増大できるものと期待される。

次に、上記ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現するように形質転換された植物（形質転換植物）の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換植物は従来公知の方法により作製することができる。

上記形質転換植物の作製方法として、具体的には、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に、配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ及び配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡ及び配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入し、組換え体ＤＮＡを作製する。そして、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主植物細胞に導入することにより、形質転換植物細胞を得ることができる。あるいは、プロモーターの下流に配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入された発現ベクター、プロモーターの下流に配列番号３で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入された発現ベクター、及び、プロモーターの下流に配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素等を用いて挿入された発現ベクターを用いて組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを該発現ベクターに適合した宿主植物細胞に導入することにより、形質転換植物細胞を得ることもできる。

上記組換え体ＤＮＡが導入される植物（宿主植物細胞）としては、特に限定されないが、中でも、ポリイソプレノイドを生合成できる植物でＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させることにより、ポリイソプレノイドの生産性の向上、ポリイソプレノイドの製造量の増大が特に期待できることから、上記植物としては、ゴム産生植物が好ましく、上記宿主植物細胞としてはゴム産生植物の植物細胞が好ましい。このように、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が導入される植物が、ポリイソプレノイド産生植物であることもまた、第２の本発明の好適な実施形態の１つである。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種のゴム産生植物であることがより好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキであることである。

上記発現ベクターとしては、上記宿主植物細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、上記組換え体ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを使用できる。

上記発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクター、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。

上記プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、タバコモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。

なお、イソプレノイド化合物が生合成される組織、例えば乳管に特異的に発現するプロモーターを持った発現ベクターを使用することが好ましい。イソプレノイドが生合成される組織に特異的に発現させることにより、植物の生長遅延などの弊害を抑制することが出来る。

上記組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。

以上の方法等により、上記形質転換植物（形質転換植物細胞）が得られる。なお、上記形質転換植物は、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。

形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）， Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２）， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。

再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。

上記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。

第２の本発明では、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲＥＦファミリー蛋白質をコードする遺伝子が導入された形質転換植物を使用してポリイソプレノイドの製造を行うことにより、ポリイソプレノイドの生産性を向上できることが期待される。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、ポリイソプレノイドを製造することができる。

なお、第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法において製造されたポリイソプレノイドは、上記形質転換植物からラテックスを採取し、採取したラテックスを以下の固化工程に供することにより得ることができる。

上記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり（タッピング）、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。

上記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド（天然ゴム）を溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴム（天然ゴム）を固形分として回収できる。得られたゴム（天然ゴム）は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

このように、第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法において作出される形質転換植物もまた、第２の本発明の１つである。第２の本発明の形質転換植物は、導入された蛋白質によりＣＰＴファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されるものと予想され、ゴム合成活性が継続的に増強し、該形質転換植物を用いてポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量を増大できることが期待される。
なお、第２の本発明の形質転換植物における、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、これら遺伝子が導入される植物については、いずれも上述したものと同様である。

（ゴム製品の製造方法）
第２の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、第１の本発明において上述したものと同様である。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第２の本発明のゴム製品の製造方法が第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記第２の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜混練工程＞
混練工程は、第１の本発明において上述した工程と同様である。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程は、第１の本発明において上述した工程と同様である。

＜加硫工程＞
加硫工程は、第１の本発明において上述した工程と同様である。

実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

（実施例１）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、−２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。

〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒa）の説明書に従って行った。

〔ｃＤＮＡからＣＰＴ、ＮｇＢＲ、及びＲＥＦ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ、ＮｇＢＲ、及びＲＥＦ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’− ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３’
プライマー２：５’− ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ−３’
を使用した。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’− ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ −３’
プライマー４：５’− ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ −３’
を使用した。
ＲＥＦ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー５：５’− ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｔｇａａｇａｃｇａａｇａｃ −３’
プライマー６：５’− ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｔｃｃａｔａａａａｃ −３’
を使用した。

上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ１）、ＮｇＢＲ遺伝子（ＨＲＴＢＰ）、及びＲＥＦ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号１に示した。ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号２に示した。また、ＨＲＴＢＰの塩基配列を配列番号３に示した。ＨＲＴＢＰのアミノ酸配列を配列番号４に示した。また、ＲＥＦの塩基配列を配列番号５に示した。ＲＥＦのアミノ酸配列を配列番号６に示した。

〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１、ｐＧＥＭ−ＨＲＴＢＰ、及びｐＧＥＭ−ＲＥＦを作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。

〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＨＲＴ１を制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を作製した。
同様に、ｐＧＥＭ−ＨＲＴＢＰを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ−ＴＥＶ−Ｈｉｓ−Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ−Ｃ１−ＨＲＴＢＰを作製した。
更に、ｐＧＥＭ−ＲＥＦを制限酵素Ｘｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで処理したのち、同様にＸｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ−ＴＥＶ−Ｈｉｓ−Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ−Ｃ１−ＲＥＦを作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。

〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１〜２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１〜２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
透析カップ（ＭＷＣＯ １２０００）（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ社製）中に、以下の量をそれぞれ添加した。ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って全量６０μＬで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を１〜２ｍｇ添加した。さらに、ＰＰ容器Ｎｏ．２（マルエム容器）にＳＵＢ−ＡＭＩＸ ６５０μＬを添加した。
透析カップをＰＰ容器Ｎｏ．２にはめ、２６℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から２度のｍＲＮＡの追加と透析外液（ＳＵＢ−ＡＭＩＸ）の交換を行った。反応は２４時間行った。透析法を行っている様子の概略図を図３に示す。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
透析カップの溶液を新しい１．５μＬチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５μＭ ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、１００μＭ １−１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１−１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）、１０μＬ ゴム粒子溶液を混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ １００μＬ）を調製し、３０℃で１６時間反応させた。
反応後、飽和ＮａＣｌを２００μＬ加え、１ｍＬのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を１ｍＬの食塩水飽和ＢｕＯＨで抽出し、その後さらに、水相の超長鎖ポリイソプレノイド（天然ゴム）を１ｍＬのトルエン／ヘキサン（１：１）で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで１４Ｃのカウントを計測した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、天然ゴムが多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
結果を表１に示す。

（比較例１）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。

（比較例２）
無細胞蛋白合成において、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｃ１−ＲＥＦを鋳型に用いた以外は実施例１と同様にして行い、回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。

（比較例３）
無細胞蛋白合成において、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｃ１−ＨＲＴＢＰを鋳型に用いた以外は実施例１と同様にして行い、回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。

（比較例４）
無細胞蛋白合成において、実施例１の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を鋳型に用いた以外は実施例１と同様にして行い、回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。

表１より、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させることにより、それぞれを単独でゴム粒子に結合された場合に比べて、ゴム粒子のゴム合成能力を顕著に増強させることができることが分かる。更に、ゴム粒子にＲＥＦを単独で結合させた比較例２、及び、ゴム粒子にＮｇＢＲを単独で結合させた比較例３では、何も結合させなかった比較例１に比べてゴム合成活性が抑制されているように、ＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、ＲＥＦファミリー蛋白質の組合せによる効果は、それぞれの単独の効果を足し合わせた以上の相乗効果といえ、ＣＰＴファミリー蛋白質とＮｇＢＲファミリー蛋白質とＲＥＦファミリー蛋白質という特定の組合せとすることによって初めてゴム粒子のゴム合成能力を顕著に増強することができるという効果は、当業者であっても予測することのできない効果である。

（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：パラゴムノキ由来のＨＲＴＢＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のＨＲＴＢＰのアミノ酸配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のＲＥＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６：パラゴムノキ由来のＲＥＦのアミノ酸配列
配列番号７：プライマー１
配列番号８：プライマー２
配列番号９：プライマー３
配列番号１０：プライマー４
配列番号１１：プライマー５
配列番号１２：プライマー６

Claims (21)

1. 生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法。
2. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、植物由来である請求項１記載のポリイソプレノイドの製造方法。
3. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、パラゴムノキ由来である請求項２記載のポリイソプレノイドの製造方法。
4. 前記結合工程が、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を結合させる工程である請求項１〜３のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
5. 前記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含む請求項４記載のポリイソプレノイドの製造方法。
6. 前記胚芽抽出物が、小麦由来である請求項５記載のポリイソプレノイドの製造方法。
7. 前記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が、５〜５０ｇ／Ｌである請求項４〜６のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
8. シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させた形質転換植物を作出し、該形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造することを特徴とするポリイソプレノイドの製造方法。
9. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、植物由来である請求項８記載のポリイソプレノイドの製造方法。
10. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、パラゴムノキ由来である請求項９記載のポリイソプレノイドの製造方法。
11. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡである請求項８〜１０のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
    ［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［２］配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
12. 前記Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［３］又は［４］に記載のＤＮＡである請求項８〜１１のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
    ［３］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［４］配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
13. 前記Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［５］又は［６］に記載のＤＮＡである請求項８〜１２のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
    ［５］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［６］配列番号５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
14. シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入することにより、該植物においてＣＰＴファミリー蛋白質、ＮｇＢＲファミリー蛋白質、及びＲＥＦファミリー蛋白質を発現させた形質転換植物。
15. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、植物由来である請求項１４記載の形質転換植物。
16. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が、パラゴムノキ由来である請求項１５記載の形質転換植物。
17. 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［１］又は［２］に記載のＤＮＡである請求項１４〜１６のいずれかに記載の形質転換植物。
    ［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［２］配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
18. 前記Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［３］又は［４］に記載のＤＮＡである請求項１４〜１７のいずれかに記載の形質転換植物。
    ［３］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［４］配列番号３で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
19. 前記Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、以下の［５］又は［６］に記載のＤＮＡである請求項１４〜１８のいずれかに記載の形質転換植物。
    ［５］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［６］配列番号５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするＤＮＡ
20. 請求項１〜１３のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、前記ポリイソプレノイドと添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
21. 請求項１〜１３のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造するポリイソプレノイド製造工程、前記ポリイソプレノイドと添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。

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