CN107708810B - 半胱氨酸工程化抗体的结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新颖细胞结合剂‑细胞毒性剂结合物，其中所述细胞结合剂(CBA)经由工程化Cys，诸如重链CH3结构域中对应于抗体CBA上的EU/OU编号位置442(或C442)处的工程化Cys共价连接于所述细胞毒性剂。本发明还提供制备本发明的所述结合物的方法。本发明进一步提供适用于使用本发明的所述结合物在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症的组合物和方法。

Description

半胱氨酸工程化抗体的结合物
相关申请的参考
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2015年6月29日提交的美国临时申请62/186,254和2016年5月18日提交的美国临时申请62/338,245在提交日时的权益。以上参考的申请各自的全部内容以引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明总体上涉及半胱氨酸工程化抗体的结合物。本发明还涉及使用此类结合物来治疗诸如癌症等疾病的方法。
发明背景
抗体-细胞毒性剂结合物(或“抗体-药物结合物(ADC)”)和细胞结合剂-药物结合物为新兴的对一系列癌症具有功效的一类强力抗肿瘤剂。细胞结合剂-药物结合物(诸如ADC)通常由三种不同要素组成：细胞结合剂(例如，抗体)；接头；以及细胞毒性部分。依照惯例，细胞毒性药物部分共价连接于抗体上的赖氨酸，从而产生为携带连接在抗体分子上不同位置处的不同数量的药物的ADC的异质混合物。
发明概要
本发明提供位点特异性抗体-细胞毒性剂结合物，其中所述细胞毒性剂共价连接于抗体上的一个或多个半胱氨酸残基。具体而言，所述半胱氨酸残基位于根据EU/OU编号的重链的位置442处。本发明的位点特异性抗体-细胞毒性剂结合物具有意外改进的耐受性，同时维持类似效能，从而产生相较于赖氨酸连接的结合物(摘要#645，AACR年会，2015年4月18-22日)更高的治疗指数(最大耐受剂量与最小有效剂量的比率)。
因此，本发明的一个方面提供一种由下式表示的抗体-细胞毒性剂结合物：
Figure BDA0001530936520000021
或其药学上可接受的盐，其中：
Ab为在抗体的重链的位置442处(EU/OU编号)具有半胱氨酸残基的抗体，并且经由所述半胱氨酸残基的硫醇基S442共价连接于连接部分JCB’；
D为共价连接于接头L的细胞毒性剂，所述接头共价连接于JCB’；并且
w为1或2。
在某些实施方案中，w为2。或者，w为1。
在某些实施方案中，位置442处的半胱氨酸残基是重组引入所述Ab中。
在某些实施方案中，JCB’为
Figure BDA0001530936520000022
Figure BDA0001530936520000023
Figure BDA0001530936520000031
其中
s1为共价连接于半胱氨酸残基的位点，并且s2为共价连接于基团L的位点；并且
Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基，优选地，Ra、Rb、Rc以及Re各自为H。
在某些实施方案中，JCB’为
Figure BDA0001530936520000032
在某些实施方案中，-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000033
其中：
s3为共价连接于JCB’的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
E为-(CR10R11)q-、环烷基或环烷基烷基；
Z不存在、为-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-(CH2CH2O)p-、-NR9-C(＝O)-(CH2CH2O)p-、-(OCH2CH2)p-C(＝O)NR9-或-(OCH2CH2)p-NR9-C(＝O)-；
p为1至24的整数；
Q为H、带电荷取代基或可电离基团；
R9、R10、R11、R12以及R13在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；并且
q和r在每次出现时独立地为0与10之间的整数。
在某些实施方案中，E为-(CR10R11)q-。
在某些实施方案中，E为
Figure BDA0001530936520000041
在某些实施方案中，Z为-C(＝O)-NR9-或-NR9-C(＝O)-；在某些实施方案中，R9为-H。
在某些实施方案中，Q为：
i)H；
ii)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR14R15或其药学上可接受的盐；或
iii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；
Z’为任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；优选地，Z’为任选取代的亚烷基；
R14、R15以及R16各自独立地为任选取代的烷基；并且
X-为药学上可接受的阴离子。
在某些实施方案中，Q为H或-SO3M，其中M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，R9、R10、R11、R12以及R13皆为H；并且q和r各自独立地为1与6之间的整数。
在某些实施方案中，-JCB’-L-由以下结构式中的任一个表示：
Figure BDA0001530936520000051
以及
Figure BDA0001530936520000052
其中M为H+或药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000053
其中：
s3为共价连接于JCB’的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
R19至R22在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
m和n各自独立地为0与10之间的整数；
Rh为H或任选取代的烷基；
P为任选取代的亚烷基、-(CH2-CH2-O)j-(其中氧原子连接于-(C＝O)-基团，所述基团连接于P)、氨基酸残基或含有2至20个氨基酸残基的肽；并且
j为1至24的整数。
在某些实施方案中，R19、R20、R21以及R22各自为H；并且m和n各自独立地为1与6之间的整数。
在某些实施方案中，P为氨基酸残基或含有2至10个氨基酸残基的肽；优选地，P为含有2至5个氨基酸残基的肽。
在某些实施方案中，各氨基酸残基为独立地选自以下的氨基酸的残基：天然存在的氨基酸、合成氨基酸、氨基酸类似物以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸模拟物。
在某些实施方案中，各氨基酸残基为独立地选自由以下组成的群组的氨基酸的残基；组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、N-甲基-组氨酸、N-甲基-丙氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-精氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-天冬酰胺、N-甲基-赖氨酸、N-甲基-天冬氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-半胱氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-谷氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-谷氨酰胺、N-甲基-色氨酸、N-甲基-甘氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-脯氨酸、N-甲基-丝氨酸、N-甲基-酪氨酸、羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、硒代半胱氨酸、O-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍、瓜氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸磺酸、半胱氨酸亚磺酸、3-氨基丙氨酸、3-二甲基氨基丙氨酸、2-氨基-4-(二甲基氨基)丁酸、2，4-二氨基丁酸、2-氨基-6-(二甲基氨基)己酸、2-氨基-5-(二甲基氨基)戊酸以及β-丙氨酸，各自独立地为L或D异构物。优选地，各氨基酸残基为独立选择的甘氨酸或丙氨酸的残基。
在某些实施方案中，P为可由蛋白酶裂解的肽。
在某些实施方案中，P选自由以下组成的群组：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：14)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：15)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：16)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala和D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Val-Ala以及β-Ala-Gly-Gly-Gly。举例来说，P可为Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Val-Ala或β-Ala-Gly-Gly-Gly。
在某些实施方案中，-JCB’-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000071
在某些实施方案中，-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000072
其中：
s3为共价连接于JCB’的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
R23和R24在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
m’为0与10之间的整数；并且
Rh’为H或任选取代的烷基。
在某些实施方案中，R23与R24均为H；并且m’为1与6之间的整数。
在某些实施方案中，Rh’为H。
在某些实施方案中，-JCB’-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000081
在某些实施方案中，D为苯并二氮杂卓化合物，诸如吲哚啉并苯并二氮杂卓化合物。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000082
Figure BDA0001530936520000091
或其药学上可接受的盐，其中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000092
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X选自-H或胺保护基；并且Y选自-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、-SO3M、-SO2M或-OSO3M，其中M为-H或阳离子；
R为-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc，其中n为1至24的整数，并且Rc为具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；
R’和R”各自独立地选自-H、-OH、-OR、-NRRg’、-COR、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的具有1至6个选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环、PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc，并且Rg’为-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc；
X’选自由以下组成的群组：-H、-OH、取代或未取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、苯基以及胺保护基；
Y’选自由以下组成的群组：-H、氧代基团(即，Y’与其所连接的碳原子一起形成-C(＝O)-基团)、取代或未取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
A和A’选自-O-和-S-；
W’不存在或选自-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)-、-N(C(＝O)Re)-、-S-或-CH2-S-、-CH2NRe-；
Rx不存在或选自具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基；
Re为-H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk为-H、具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基，任选携带仲氨基(例如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
G选自-CH-或-N-；并且
R6为-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000101
在某些实施方案中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000102
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-OH或-SO3M；
M为-H或药学上可接受的阳离子；
X’与Y’均为-H；
A与A’均为-O-；
R6为-OMe；并且
Rx为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基。在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000111
Figure BDA0001530936520000121
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000123
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，Y为-SO3M，并且M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000122
Figure BDA0001530936520000131
或其药学上可接受的盐，其中：
L’、L”以及L”’中的一个由下式表示：
-Z1-P1-Z2-Rx1-C(＝O)-(A’)，或
-N(Re)-Rx1-C(＝O)-(D’)；
并且另外两个各自独立地选自-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR、-NR’R”、-NO2、-NR’COR”、-SR、-SOR’、-SO2R’、-SO3H、-OSO3H、-SO2NR’R”、氰基、叠氮基、-COR’、-OCOR’以及-OCONR’R”；
Z1和Z2中的一个为-C(＝O)-，而另一个为-NR5-；
P1为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸残基的肽；
Rx1为任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
Re为-H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk为-H、具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基，任选携带仲氨基(例如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000141
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H或具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基，而当它为单键时，X1为-H或胺保护部分；并且Y1为选自以下的离去基团：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R”、-NR’R”、-NR’COR”、-NR’NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环、由-NR’(C＝NH)NR’R”表示的胍、氨基酸或由-NRCOP’表示的肽、-SR、-SOR’、卤素、氰基、叠氮基、-OSO3H(或其盐)、亚硫酸根(-SO3H或-SO2H或其盐)、偏亚硫酸氢根(H2S2O5或其盐)、单-、二-、三-以及四-硫代磷酸根(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或其盐)、硫代磷酸酯(R1O)2PS(OR1)、R1S-、R1SO、R1SO2、R1SO3、硫代硫酸根(HS2O3或其盐)、连二亚硫酸根(HS2O4或其盐)、二硫代磷酸根(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其盐)、羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或其盐)以及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -或其盐)或其混合物，其中Ri为具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基并且用至少一个选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H以及-PO3H的取代基取代；Ri可进一步任选用本文所描述的烷基的取代基取代；Rj为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基；Rk’为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、芳基、杂环基或杂芳基；
P’为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸残基的肽，
R在每次出现时独立地选自由以下组成的群组：-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
R’和R”各自独立地选自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2、-COR、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc以及任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
Rc为-H或任选取代的具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；
n为1至24的整数；
X1’选自-H、胺保护基、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环以及任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
Y1’选自-H、氧代基团(即，Y1’与其所连接的碳原子一起形成-C(＝O)-基团)、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、任选取代的6至18元芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环、任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’各自独立地选自由以下组成的群组：-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR、-NR’R”、-NO2、-NCO、-NR’COR”、-SR、-SOR’、-SO2R’、-SO3 -H、-OSO3H、-SO2NR’R”、氰基、叠氮基、-COR’、-OCOR’以及-OCONR’R”；
R6为-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；
G为-CH-或-N-；
A和A’相同或不同，并且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5以及-CRR’N(R5)-；并且
R5在每次出现时独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000161
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，L’、L”以及L”’中的一个由式(A’)或(D’)表示，并且其余为-H、具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基、卤素、-OH、(C1-C6)烷氧基或-NO2。
在某些实施方案中，L’由式(A’)表示；并且L”与L”’均为-H。
在某些实施方案中，L’由式(D’)表示；并且L”与L”’均为-H。
在某些实施方案中，Rx1为任选用卤素、-OH、-SO3H、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基取代的具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基或带电荷取代基或可电离基团Q。
在某些实施方案中，L’由下式表示：
-NR5-P1-C(＝O)-(CRaRb)s-C(＝O)-(B1’)；
-NR5-P1-C(＝O)-Cy-(CRaRb)s1，-C(＝O)-(B2’)；
-C(＝O)-P1-NR5-(CRaRb)s-C(＝O)-(C1’)，或
-C(＝O)-P1-NR5-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)-(C2’)
其中：
Ra和Rb在每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或带电荷取代基或可电离基团Q；
s为1至6的整数；
s1’为0或1至6的整数；并且
Cy为任选用卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代(C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基。
在某些实施方案中，Ra与Rb均为H；式(B2’)和(C2’)中的Cy为环己烷；并且R5为H或Me。
在某些实施方案中，s1’为0或1。
在某些实施方案中，所述带电荷取代基或可电离基团Q为i)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12或其药学上可接受的盐；或ii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’为任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地为任选取代的烷基；并且X-为药学上可接受的阴离子。
在某些实施方案中，Q为-SO3H或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，P1为含有2至10个氨基酸残基的肽。举例来说，P1可为含有2至5个氨基酸残基的肽，诸如Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Va1-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met或Met-Ala。在某些实施方案中，P1为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在某些实施方案中，N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000181
表示双键。
在某些实施方案中，N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000182
表示单键，X1为-H或胺保护基；并且Y1选自-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环、-SO3M、-SO2M以及-OSO3M，其中M为H+或药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，Y1选自-SO3M、-OH、-OMe、-OEt或-NHOH。
在某些实施方案中，Y1为-SO3M或-OH，其中M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，X1’选自由以下组成的群组：-H、-OH、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基以及苯基。
在某些实施方案中，X1’为-H、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或苯基。优选地，X1’为-H、-OH或-Me。在某些实施方案中，X1’为-H。
在某些实施方案中，Y1’选自由以下组成的群组：-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基。在某些实施方案中，Y1’为-H、氧代基团、(C1-C3)烷基或卤代(C1-C3)烷基。在某些实施方案中，Y1’为-H或氧代。在某些实施方案中，Y1’为-H。
在某些实施方案中，A和A’相同或不同，并且选自-O-、-S-、-NR5-以及氧代-(C=O)-。在某些实施方案中，A和A’相同或不同，并且选自-O-和-S-。在某些实施方案中，A和A’为-O-。
在某些实施方案中，R6为-OMe。
在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’独立地为-H、卤素、-NO2、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H。
在某些实施方案中，R、R’、R”以及R5各自独立地为-H或(C1-C3)烷基。
在某些实施方案中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000192
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H；而当它为单键时，X1为-H，并且Y1为-OH或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H；
R6为-OMe；
X1’与Y1’均为-H；
A和A’为-O-；并且
M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000191
Figure BDA0001530936520000201
Figure BDA0001530936520000211
其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000212
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子；M为H+或其药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，结合物由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000221
Figure BDA0001530936520000231
Figure BDA0001530936520000241
Figure BDA0001530936520000251
Figure BDA0001530936520000261
Figure BDA0001530936520000271
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000273
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，当存在时M为H+、Na+或K+。
本发明的另一个方面提供一种由以下结构式表示的化合物：
D-L-JCB，
或其药学上可接受的盐，其中：
D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000272
Figure BDA0001530936520000281
或其药学上可接受的盐，其中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000282
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X选自-H或胺保护基；并且Y选自-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、-SO3M、-SO2M或-OSO3M，其中M为-H或阳离子；
R为-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc，其中n为1至24的整数，并且Rc为具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；
R’和R”各自独立地选自-H、-OH、-OR、-NRRg’、-COR、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的具有1至6个选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环、PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc，并且Rg’为-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc；
X’选自由以下组成的群组：-H、-OH、取代或未取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、苯基以及胺保护基；
Y’选自由以下组成的群组：-H、氧代基团、取代或未取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
A和A’选自-O-和-S-；
W’不存在或选自-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)-、-N(C(＝O)Re)-、-S-或-CH2-S-、-CH2NRe-；
Rx不存在或选自具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基；
Re为-H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk为-H、具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基，任选携带仲氨基(例如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
G选自-CH-或-N-；
R6为-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；
-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000291
其中：
s3为共价连接于JCB的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
E为-(CR10R11)q-、环烷基或环烷基烷基；
Z不存在、为-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-(CH2CH2O)p-、-NR9-C(＝O)-(CH2CH2O)p-、-(OCH2CH2)p-C(＝O)NR9-或-(OCH2CH2)p-NR9-C(＝O)-；
p为1至1000的整数；
Q为H、带电荷取代基或可电离基团；
R9、R10、R11、R12以及R13在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
q和r在每次出现时独立地为0与10之间的整数；并且
JCB为
Figure BDA0001530936520000301
X’-CRbRc-C(＝O)-、X’-CRbRc-C(＝O)-NRe-、
Figure BDA0001530936520000302
Figure BDA0001530936520000303
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000311
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，Ra、Rb、Rc以及Re各自为H。
在某些实施方案中，JCB为
Figure BDA0001530936520000312
在某些实施方案中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000314
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H；Y为-OH或-SO3M；
M为-H或药学上可接受的阳离子(例如，Na+)；
X’与Y’均为-H；
A与A’均为-O-；
R6为-OMe；并且
Rx为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000313
Figure BDA0001530936520000321
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，Y为-SO3M；并且M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，E为-(CR10R11)q-。
在某些实施方案中，E为
Figure BDA0001530936520000331
在某些实施方案中，Z为-C(＝O)-NR9-或-NR9-C(＝O)-。在某些实施方案中，R9为-H。
在某些实施方案中，Q为：
i)H；
ii)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR14R15或其药学上可接受的盐；或
iii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；
Z’为任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；
R14、R15以及R16各自独立地为任选取代的烷基；并且
X-为药学上可接受的阴离子。
在某0实施方案中，Z’为任选取代的亚烷基。
在某些实施方案中，Q为H或-SO3M，其中M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，R9、R10、R11、R12以及R13皆为H；并且q和r各自独立地为1与6之间的整数。
在某些实施方案中，-L-JCB由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000332
Figure BDA0001530936520000341
其中M为H+或药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，所述化合物由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000342
Figure BDA0001530936520000351
Figure BDA0001530936520000361
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000362
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。
本发明的另一个方面提供一种由以下结构式表示的化合物：
D-L-JCB，
或其药学上可接受的盐，其中：
D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000371
或其药学上可接受的盐，其中：
L’、L”以及L”’中的一个由下式表示：
-Z1-P1-Z2-Rx1-C(＝O)-(A’)，或
-N(Re)-Rx1-C(＝O)-(D’)；
并且另外两个各自独立地选自-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR、-NR’R”、-NO2、-NR’COR”、-SR、-SOR’、-SO2R’、-SO3H、-OSO3H、-SO2NR’R”、氰基、叠氮基、-COR’、-OCOR’以及-OCONR’R”；
Z1和Z2中的一个为-C(＝O)-，而另一个为-NR5-；
P1为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸残基的肽；
Rx1为任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
Re为-H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk为-H、具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基，任选携带仲氨基(例如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000381
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H或具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基，而当它为单键时，X1为-H或胺保护部分；并且Y1为选自以下的离去基团：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R”、-NR’R”、-NR’COR”、-NR’NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环、由-NR’(C＝NH)NR’R”表示的胍、氨基酸或由-NRCOP’表示的肽、-SR、-SOR’、卤素、氰基、叠氮基、-OSO3H(或其盐)、亚硫酸根(-SO3H或-SO2H或其盐)、偏亚硫酸氢根(H2S2O5或其盐)、单-、二-、三-以及四-硫代磷酸根(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或其盐)、硫代磷酸酯(R1O)2PS(OR1)、R1S-、R1SO、R1SO2、R1SO3、硫代硫酸根(HS2O3或其盐)、连二亚硫酸根(HS2O4或其盐)、二硫代磷酸根(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其盐)、羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或其盐)以及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -或其盐)或其混合物，其中Ri为具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基并且用至少一个选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H以及-PO3H的取代基取代；R1可进一步任选用本文所描述的烷基的取代基取代；Rj为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基；Rk’为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、芳基、杂环基或杂芳基；
P’为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸残基的肽，
R在每次出现时独立地选自由以下组成的群组：-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
R’和R”各自独立地选自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2、-COR、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc以及任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
Rc为-H或任选取代的具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；
n为1至24的整数；
X1’选自-H、胺保护基、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环以及任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
Y1’选自-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、任选取代的6至18元芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环、任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’各自独立地选自由以下组成的群组：-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR、-NR’R”、-NO2、-NCO、-NR’COR”、-SR、-SOR’、-SO2R’、-SO3 -H、-OSO3H、-SO2NR’R”、氰基、叠氮基、-COR’、-OCOR’以及-OCONR’R”；
R6为-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；
G为-CH-或-N-；
A和A’相同或不同，并且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5以及-CRR’N(R5)-；并且
R5在每次出现时独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基；
-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000401
其中：
s3为共价连接于JCB’的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
R23和R24在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
m’为0与10之间的整数；
Rh’为H或任选取代的烷基；并且
JCB为
Figure BDA0001530936520000411
X’-CRbRc-C(＝O)-、X’-CRbRc-C(＝O)-NRe-、
Figure BDA0001530936520000412
Figure BDA0001530936520000413
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000414
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，Ra、Rb、Rc以及Re各自为H。
在某些实施方案中，JCB为
Figure BDA0001530936520000415
在某些实施方案中，L’、L”以及L”’中的一个由式(A’)或(D’)表示，并且其余为-H、具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基、卤素、-OH、(C1-C6)烷氧基或-NO2。
在某些实施方案中，L’由式(A’)表示；并且L”与L”’均为-H。
在某些实施方案中，L’由式(D’)表示；并且L”与L”’均为-H。
在某些实施方案中，Rx1为任选用卤素、-OH、-SO3H、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基取代的具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基或带电荷取代基或可电离基团Q。
在某些实施方案中，L’由下式表示：
-NR5-P1-C(＝O)-(CRaRb)s-C(＝O)-(B1’)；
-NR5-P1-C(＝O)-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)-(B2’)；
-C(＝O)-P1-NR5-(CRaRb)s-C(＝O)-(C1’)，或
-C(＝O)-P1-NR5-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)-(C2’)
其中：
Ra和Rb在每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或带电荷取代基或可电离基团Q；
s为1至6的整数；
s1’为0或1至6的整数；并且
Cy为任选用卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代(C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基。
在某些实施方案中，Ra与Rb均为H；式(B2’)和(C2’)的Cy为环己烷；并且R5为H或Me。
在某些实施方案中，s1’为0或1。
在某些实施方案中，所述带电荷取代基或可电离基团Q为i)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12或其药学上可接受的盐；或ii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’为任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地为任选取代的烷基；并且X-为药学上可接受的阴离子。
在某些实施方案中，Q为-SO3H或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，P1为含有2至10个氨基酸残基的肽。举例来说，P1可为含有2至5个氨基酸残基的肽，诸如Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：14)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：15)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：16)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met以及Met-Ala。在某些实施方案中，P1为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala以及D-Ala-D-Ala。
在某些实施方案中，N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000431
表示双键。
在某些实施方案中，N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000432
表示单键，X1为-H或胺保护基；并且Y1选自-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环、-SO3M、-SO2M以及-OSO3M，其中M为H+或药学上可接受的阳离子。在某些实施方案中，Y1选自-SO3M、-OH、-OMe、-OEt或-NHOH。在某些实施方案中，Y1为-SO3M或-OH，并且M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，X1’选自由以下组成的群组：-H、-OH、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基以及苯基。在某些实施方案中，X1’为-H、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或苯基。在某些实施方案中，X1’为-H、-OH或-Me。在某些实施方案中，X1’为-H。
在某些实施方案中，Y1’选自由以下组成的群组：-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基。在某些实施方案中，Y1’为-H、氧代基团、(C1-C3)烷基或卤代(C1-C3)烷基。在某些实施方案中，Y1’为-H或氧代。在某些实施方案中，Y1’为-H。
在某些实施方案中，A和A’相同或不同，并且选自-O-、-S-、-NR5-以及氧代-(C＝O)-。在某些实施方案中，A和A’相同或不同，并且选自-O-和-S-。在某些实施方案中，A和A’为-O-。
在某些实施方案中，R6为-OMe。
在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’独立地为-H、卤素、-NO2、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基。在某些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H。
在某些实施方案中，R、R’、R”以及R5各自独立地为-H或(C1-C3)烷基。
在某些实施方案中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000441
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H，而当它为单键时，X1为-H，并且Y为-OH或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H；
R6为-OMe；
X1’与Y1’均为-H；
A和A’为-O-；并且
M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000451
Figure BDA0001530936520000461
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000473
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，R23与R24均为H；并且m’为1与6之间的整数。在某些实施方案中，Rh’为H。
在某些实施方案中，-L-JCB由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000471
在某些实施方案中，所述化合物由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000472
Figure BDA0001530936520000481
其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000482
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。
在某些实施方案中，M为H+、Na+或K+。
本发明的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的结合物和药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面提供一种在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症、自体免疫性病症、破坏性骨病症、感染性疾病、病毒疾病、纤维化疾病、神经退化性病症、胰腺炎或肾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的结合物和任选的第二治疗剂。
在某些实施方案中，所述方法抑制异常细胞生长或治疗增生性病症。在某些实施方案中，所述增生性病症为癌症，诸如血液***癌症或实体肿瘤。示例性血液***癌症包括白血病和淋巴瘤。白血病可为急性骨髓性白血病(AML)、诸如急性B淋巴母细胞性白血病(B-ALL)等急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。实体肿瘤可为黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、卵巢癌、子宫内膜癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、***癌或子***。
应了解，除非明确声明或不适当，否则本文描述的任一实施方案(包括仅在本发明的一个方面而未在其他方面下描述的实施方案，并且包括仅在实施例中出现的实施方案)可与任何一个或多个其他实施方案组合。
附图简述
图1A示出了去糖基化结合物huMOV19-C442-Mal-CX1-1-DM1的LC-MS，发现根据UV-Vis所述结合物具有平均2mol DM1/mol抗体；根据SEC所述结合物具有99.3％单体；并且根据HISEP柱上的HPLC所述结合物不具有可检测的未结合的DM1。
图1B示出了去糖基化结合物huMOV19-C442-Mal-SPDB-DM4的LC-MS，发现根据UV-Vis所述结合物具有平均2mol DM4/mol抗体；根据SEC所述结合物具有99.5％单体；并且根据HISEP柱上的HPLC所述结合物具有0.8％未结合的DM4。
图1C示出了去糖基化结合物huMOV19-C442-D5的LC-MS，发现根据UV/Vis所述结合物具有平均2mol D5/mol抗体；根据SEC所述结合物具有94.6％单体；并且根据SEC/反相HPLC所述结合物具有0.8％未结合的D5。
图1D示出了去糖基化结合物huMOV19-C442-D4的LC-MS，发现根据UV-Vis所述结合物具有平均2mol D4/mol抗体；并且根据SEC所述结合物具有93.6％单体。
图1E示出了去糖基化结合物huCD123-6Gv1.1S2-C442-D7的LC-MS，发现根据UV-Vis所述结合物具有平均2mol D7/mol抗体；根据SEC所述结合物具有97.2％单体；并且根据SEC/反相HPLC所述结合物具有1.9％未结合的D7。
图1F示出了去糖基化结合物huCD123-6Gv4.7-C442-D5的LC-MS，发现根据UV-Vis所述结合物具有平均2mol D5/mol抗体；并且根据SEC所述结合物具有94.8％单体。
图1G示出了去糖基化结合物huCD123-6Gv4.7-C442-D4的LC-MS，发现根据UV-Vis所述结合物具有平均1.8mol D4/mol抗体；并且根据SEC所述结合物具有97.4％单体。
图2示出了Cys连接的结合物对表达由所述结合物的抗体识别的抗原(即，CD123)的多种靶细胞系(例如，AML细胞系EOL-1、B-ALL细胞系KOPN-8以及CML细胞系MOLM-1)具有至少如Lys连接的结合物一样的活性。连接空心方块和空心圆圈的数据曲线表示分别针对连接实心方块和实心圆圈的曲线的具有过量未结合竞争抗体(即chCD123-6)的对照。
图3A、3B以及3C显示Cys连接的结合物对表达由所述结合物的抗体(即，M9346A或Mov19)识别的抗原(即，FRα)的多种靶细胞系(例如，分别KB细胞、T47D细胞以及KB细胞)具有至少如Lys连接的结合物一样的活性。指定为“+B”的数据曲线为具有过量未结合竞争抗体(即，未结合M9346A抗体)的对应对照。
图4A和4B显示Cys连接的huMOV19-C442-D5结合物和Lys连接的huMOV19-D2结合物在300.19细胞中具有几乎相同的旁观者杀伤效能。
图5展示Cys连接的huMOV19-C442-D5结合物和Lys连接的huMOV19-D2结合物在NCI-H2110NSCLC异种移植物模型中具有类似活性，与结合物类型(例如，Lys-键联相较于Cys-键联)无关。在异种移植物肿瘤之后接受所指示剂量的单次静脉内注射对应ADC的所有小鼠达到约100mm3大小。
图6示出了在28天内CD1小鼠中的huMOV19-C442-D5ADC的药代动力学。
图7A示出了用200μg/kg CysMab位点特异性huMOV19-C442-D5治疗的雌性CD-1小鼠的个别体重变化百分比。图7B示出了用250μg/kg CysMab位点特异性huMOV19-C442-D5治疗的雌性CD-1小鼠的个别体重变化百分比。图7C示出了用100μg/kg Lys-连接的huMOV19-D2治疗的雌性CD-1小鼠的个别体重变化百分比。图7D示出了用媒介物对照或175、200或250μg/kg位点特异性huMOV19-C442-D5结合物治疗的雌性CD-1小鼠的个别体重变化百分比。
图8显示huCD123-6Gv4.7抗体经由Cys-键联结合至D4和D5化合物仅中度影响所述结合物的结合亲和力。
详细说明
现将详细参照本发明的某些实施方案，所述实施方案的实例以所附结构和结构式予以说明。尽管将结合所列举的实施方案描述本发明，但应了解，它们不旨在将本发明局限于所述实施方案。相反，本发明旨在涵盖可包括在由权利要求所界定的本发明范围内的所有替代型式、修改型式以及等效型式。本领域技术人员将认识到可用于实践本发明的与本文所描述的那些类似或相当的许多方法和材料。
应了解，除非明确声明或不适当，否则可将本文所描述的任一实施方案，包括在本发明不同方面(例如化合物、化合物-接头分子、结合物、组合物、制备和使用方法)和本说明书不同部分(包括仅在实施例中描述的实施方案)下所描述的那些与本发明一个或多个其他实施方案组合。实施方案组合不限于经由多个独立权利要求所申请的那些特定组合。
定义
如本文中所用，“烷基”或“直链或分支链烷基”是指具有1至20个碳原子的饱和直链或分支链单价烃基。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、3，3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基等。优选地，烷基具有1至10个碳原子。更优选地，烷基具有1至4个碳原子。
“烯基”或“直链或分支链烯基”是指具有2至20个碳原子以及至少一个不饱和位点(即碳-碳双键)的直链或分支链单价烃基，其中烯基包括具有“顺式”和“反式”定向或者“E”和“Z”定向的基团。实例包括(但不限于)乙烯基(ethylenyl/vinyl)(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。优选地，烯基具有2至10个碳原子。更优选地，烷基具有2至4个碳原子。
“炔基”或“直链或分支链炔基”是指具有2至20个碳原子与至少一个不饱和位点(即碳-碳三键)的直链或分支链单价烃基。实例包括(但不限于)乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基等。优选地，炔基具有2至10个碳原子。更优选地，炔基具有2至4个碳原子。
术语“环状烷基”和“环烷基”可互换使用。它们是是指单价饱和碳环基团。优选地，环状烷基为3至7元单环基团。更优选地，环状烷基为环己基。
术语“环烷基烷基”是指用环烷基取代的上述烷基。
术语“环状烯基”是指在环结构中具有至少一个双键的碳环基团。
术语“环状炔基”是指在环结构中具有至少一个三键的碳环基团。
“芳基”意指通过从母体芳族环***的单一碳原子移除一个氢原子所得到的具有6至18个碳原子的单价芳族烃基。一些芳基在示例性结构中以“Ar”表示。芳基包括包含芳族环与饱和、部分不饱和环或芳族碳环或杂环稠合的双环基团。典型芳基包括(但不限于)衍生自苯(苯基)、取代苯、萘、蒽、茚基、茚满基、1，2-二氢萘、1，2，3，4-四氢萘基等的基团。优选地，芳基为苯基。
术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”以及“杂环(heterocyclic ring)”在本文中可互换使用并且是指具有3至18个环原子的饱和或部分不饱和(即在环内具有一个或多个双键和/或三键)碳环基团，其中至少一个环原子为选自氮、氧、磷以及硫的杂原子，其余环原子为C，其中一个或多个环原子任选独立地用下文所描述的一个或多个取代基取代。杂环可为具有3至7个环成元(2至6个碳原子和1至4个选自N、O、P以及S的杂原子)的单环或具有7至10个环成元(4至9个碳原子和1至6个选自N、O、P以及S的杂原子)的双环，例如：双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]***。Paquette，Leo A.；“Principles of Modern HeterocyclicChemistry”(W.A.Benjamin，New York，1968)，特别是第1、3、4、6、7以及9章；“TheChemistry ofHeterocyclicCompounds，A series of Monographs”(John Wiley&Sons，NewYork，1950出版)，特别是第13、14、16、19以及28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中描述了杂环。“杂环基”还包括杂环基团与饱和、部分不饱和环或芳族碳环或杂环稠合的基团。杂环的实例包括(但不限于)吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫吗啉基、氧硫杂环己烷基(thioxanyl)、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂环庚烷基、二氮杂卓基、硫氮杂环庚烷基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1，3-二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二硫杂环己烷基、二硫杂环戊烷基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑啶基咪唑啉基、咪唑啶基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基以及氮杂双环[2.2.2]己基。螺环部分也被包括在此定义的范围内。环原子用氧代(＝O)部分取代的杂环基团的实例为嘧啶酮基和1，1-二氧代-硫吗啉基。
如本文所用，“5或6元含氮杂环”是指具有5或6个环原子与至少一个氮环原子的杂环。它可任选进一步包含1至3个选自O、N以及S的杂原子。
术语“杂芳基”是指具有5或6元环的单价芳族基团，并且包括具有5至18个原子并且含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的稠环***(其中至少一个为芳族的)。杂芳基的实例为吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、***基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基(cinnolinyl)、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、***基、噻二唑基、呋呫基、苯并呋呫基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基以及呋喃并吡啶基。
可能时，杂环或杂芳基可为碳(碳连接)或氮(氮连接)附接的。例如并且不限于，碳键合的杂环或杂芳基是在吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮杂环丙烷的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位；喹啉的2、3、4、5、6、7或8位；或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位键合。
例如并且不限于，氮键合杂环或杂芳基是在氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、呲咯、呲咯烷、2-呲咯啉、3-呲咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；吗啉的4位；以及咔唑或或O-咔啉的9位键合。
杂芳基或杂环基中存在的杂原子包括氧化形式，诸如NO、SO以及SO2。
术语“卤基”或“卤素”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用，术语“卤烷基”是指用一个或多个如本文所定义的卤基取代的如本文所定义的烷基。卤烷基可为单卤烷基、二卤烷基或多卤烷基。单卤烷基可具有一个氟基、氯基、溴基或碘基取代基。二卤烷基或多卤烷基可用两个或两个以上相同卤原子或不同卤基的组合取代。卤烷基的实例包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基以及二氯丙基。
本文所用的“烷氧基”是指烷基-O-，其中烷基在本文上文中有定义。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
上述烷基、卤烷基、烷氧基、烯基、炔基、环状烷基、环状烯基、环状炔基、碳环基、芳基、杂环基以及杂芳基可任选用一个或多个(例如2、3、4、5、6或更多个)取代基取代。
如果取代基被描述为“取代的”，那么非氢取代基代替所述取代基的碳、氧、硫或氮上的氢取代基。因此，例如取代烷基取代基为至少一个非氢取代基代替烷基取代基上的氢取代基的烷基取代基。为便于说明，单氟烷基为用氟取代基取代的烷基，并且二氟烷基为用两个氟取代基取代的烷基。应认识到，如果在取代基上存在超过一个取代，那么每一非氢取代基可为相同或不同的(除非另作规定)。
如果取代基被描述为“任选取代的”，那么所述取代基可为(1)未取代的或(2)取代的。如果取代基的碳被描述为任选取代基清单中的一个或多个取代，那么所述碳上的一个或多个氢(在存在的氢原子数情况下)可单独和/或一起用独立选择的任选取代基替代。如果取代基的氮被描述为任选取代基清单中的一个或多个取代，那么所述氮上的一个或多个氢(在存在的氢原子数情况下)可各自用独立选择的任选取代基替代。一个示例性取代基可被描述为-NR’R”，其中R’和R”连同其所连接的氮原子一起可形成杂环。由R’和R”连同其所连接的氮原子一起形成的杂环可为部分或完全饱和的。在一个实施方案中，杂环由3至7个原子组成。在另一实施方案中，杂环选自由以下组成的群组：吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、异噁唑基、吡啶基以及噻唑基。
本说明书使用的术语“取代基”和“基团(radical/group)”可互换。
如果一组取代基统一被描述为任选取代基清单中的一个或多个取代，那么所述组可包括：(1)不可取代的取代基、(2)未由任选的取代基取代的可取代取代基和/或(3)用一个或多个任选取代基取代的可取代取代基。
如果取代基被描述为任选用至多特定数量的非氢取代基取代，那么所述取代基可为(1)未取代的；或(2)用至多所述特定数量的非氢取代基或取代基上至多最大数量的可取代位置取代，以数量较少者为准。因此，例如，如果取代基被描述为任选用至多3个非氢取代基取代的杂芳基，那么具有少于3个可取代位置的任何杂芳基将任选用至多仅所述杂芳基所具有的可取代位置的数量的非氢取代基取代。在非限制性实例中，所述取代基可选自具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；芳基、杂芳基、杂环基、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR100、NR101R102、-NO2、-NR101COR102、-SR100、以-SOR101表示的亚砜、以-SO2R101表示的砜、磺酸根-SO3M、硫酸根-OSO3M、以-SO2NR101R102表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR101、-OCOR101、-OCONR101R102以及聚乙二醇单元(-OCH2CH2)nR101，其中M为H或阳离子(诸如Na+或K+)；R101、R102以及R103各独立选自H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n-R104(其中n为1至24的整数)、具有6至10个碳原子的芳基、具有3至10个碳原子的杂环以及具有5至10个碳原子的杂芳基；并且R104为H或具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基，其中以R100、R101、R102、R103以及R104表示的基团中的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基以及杂环基任选用一个或多个(例如2、3、4、5、6或更多)独立选自以下基团的取代基取代：卤素、-OH、-CN、-NO2以及未取代的具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基。优选地，任选取代的上述烷基、烯基、炔基、环状烷基、环状烯基、环状炔基、碳环基、芳基、杂环基以及杂芳基的取代基包括卤素、-CN、-NR102R103、-CF3、-OR101、芳基、杂芳基、杂环基、-SR101、-SOR101、-SO2R101以及-SO3M。
基团中的碳原子数在本文中可通过前缀“Cx-xx”或“Cx-Cxx”来指定，其中x和xx为整数。例如，“C1-4烷基”或“C1-C4烷基”为具有1至4个碳原子的烷基。
术语“化合物”或“细胞毒性化合物”、“细胞毒性二聚体”以及“细胞毒性二聚体化合物”可互换使用。它们意在包括结构或结构式或任何衍生物已经公开于本发明或者结构或结构式或任何衍生物以引用的方式并入的化合物。所述术语还包括本发明中公开的所有结构式的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物、盐(例如药学上可接受的盐)以及前药和前药的盐。所述术语还包括前述任一种的任何溶剂化物、水合物以及多形物。在本申请中所述的本发明某些方面中有关“立体异构体”、“几何异构体”、“互变异构体”、“溶剂化物”、“代谢物”、“盐”、“前药”、“前药盐”、“结合物”、“结合物盐”、“溶剂化物”、“水合物”或“多形物”的具体陈述不应解释为意欲术语“化合物”的使用未用这些其他形式陈述的本发明其他方面中省略这些形式。
如本文中所用，术语“结合物”是指连接到细胞结合剂的本文所述化合物或其衍生物。
如本文中所用，术语“可连接至细胞结合剂”是指本文所述化合物或其衍生物包含至少一个适于将这些化合物或其衍生物键合至细胞结合剂的连接基团或其前体。
术语既定基团的“前体”是指可通过任何脱保护、化学改性或偶联反应产生所述基团的任何基团。
术语“手性”是指分子具有与镜像搭配物不可重叠的性质，而术语“非手性”是指分子可重叠于其镜像搭配物上。
术语“立体异构体”是指具有相同化学构成和连接性但原子的空间定向不同，无法通过围绕单键旋转而相互转化的化合物。
“非镜像异构物”是指具有两个或更多个手性中心并且分子不互为镜像的立体异构物。非镜像异构物具有不同物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质以及反应性。非镜像异构物混合物可借助诸如结晶法、电泳法以及色谱法等高拆分度分析程序进行分离。
“镜像异构物”是指化合物的两个互为不可重叠镜像的立体异构物。
本文中使用的立体化学定义和规则大体上遵循S.P.Parker编，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；以及Eliel，E.和Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds，”John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。本发明化合物可含有不对称或手性中心，并且因此以不同立体异构形式存在。预期本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非镜像异构物、镜像异构物以及阻转异构物，以及其混合物(诸如外消旋混合物)，均形成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们能够使平面偏振光的平面旋转。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子围绕其手性中心的绝对构型。使用前缀d和I或(+)和(-)来表示化合物旋转平面偏振光的符号，其中(-)或1意指所述化合物为左旋的。前缀为(+)或d的化合物为右旋化合物。对于既定化学结构，这些立体异构物为相同的，除了它们互为镜像。特定立体异构物也可称为镜像异构物，并且这些异构物的混合物常被称为镜像异构混合物。镜像异构物的50：50混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，其可在化学反应或过程中不存在立体选择性或立体特异性时出现。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种镜像异构物质的缺乏光学活性的等摩尔混合物。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可经由低能屏障相互转化的结构异构体。举例来说，质子互变异构体(也称为质子异变的互变异构体)包括经由质子迁移发生的相互转化，诸如酮基-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价态互变异构体包括通过一些键合电子的重排发生的相互转化。
本发明的前药的一种优选形式包括包含在化合物/结合物的亚胺键与亚胺反应性试剂之间形成的加合物的本发明的化合物(具有或不具有任何接头基团)和结合物。本发明前药的另一优选形式包括诸如式(I)-(IV)等化合物，其中当N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000591
表示单键时，X为H或胺保护基，并且所述化合物变为前药。本发明的前药可含有本文所述前药形式中的一种或两种(例如含有在化合物/结合物的亚胺键与亚胺反应性试剂之间形成的加合物，和/或当X为-H时含有Y离去基团)。
术语“亚胺反应性试剂”是指能够与亚胺基团反应的试剂。亚胺反应性试剂的实例包括(但不限于)亚硫酸盐(H2SO3、H2SO2或者HSO3 -、SO3 2-或HSO2 -与阳离子形成的盐)、偏亚硫酸氢盐(H2S2O5或S2O5 2-与阳离子形成的盐)、单、二、三以及四-硫代磷酸盐(PO3SH3、PO2S2H3、POS3H3、PS4H3或PO3S3-、PO2S2 3-、POS3 3-或PS4 3-与阳离子形成的盐)、硫代磷酸酯((R1O)2PS(OR1)、RiSH、RiSOH、RiSO2H、RiSO3H)、各种胺(羟基胺(例如NH2OH)、肼(例如NH2NH2)、NH2O-R1、R1’NH-R1、NH2-R1)、NH2-CO-NH2、NH2-C(＝S)-NH2、硫代硫酸盐(H2S2O3或S2O3 2-与阳离子形成的盐)、连二亚硫酸盐(H2S2O4或S2O4 2-与阳离子形成的盐)、二硫代磷酸盐(P(＝S)(ORk)(SH)(OH)或其与阳离子形成的盐)、羟肟酸(RkC(＝O)NHOH或与阳离子形成的盐)、酰肼(RkCONHNH2)、甲醛次硫酸盐(HOCH2SO2H或HOCH2SO2 -与阳离子形成的盐，诸如HOCH2SO2 -Na+)、糖化核苷酸(诸如GDP-甘露糖)、氟达拉滨(fludarabine)或其混合物，其中Ri和Ri’各独立地为具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基并且用至少一个选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H以及-PO3H的取代基取代；Ri和Ri’可进一步任选用本文所描述的烷基的取代基取代；Rj为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基；并且Rk为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基，芳基、杂环基或杂芳基(优选地，Rk为具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；更优选地，Rk为甲基、乙基或丙基)。优选地，所述阳离子为一价阳离子，诸如Na+或K+。优选地，亚胺反应性试剂选自亚硫酸盐、羟基胺、脲以及肼。更优选地，亚胺反应性试剂为NaHSO3或KHSO3。
如本文所用，“苯并二氮杂卓”化合物为具有苯并二氮杂卓核心结构的化合物。苯并二氮杂卓核心可用一个或多个环结构取代和/或与一个或多个环结构稠合。它还包括具有通过接头连接的两个苯并二氮杂卓核心的化合物。作为苯并二氮杂卓核心的一部分的亚胺官能团(-C＝N-)可被还原。
如本文所用，“吲哚啉并苯并二氮杂卓”(IBD)化合物为具有吲哚啉并苯并二氮杂卓核心结构的化合物。吲哚啉并苯并二氮杂卓可为取代的。它还包括具有通过接头连接的两个吲哚啉并苯并二氮杂卓核心的化合物。作为吲哚啉并苯并二氮杂卓核心的一部分的亚胺官能团(-C＝N-)可被还原。
如本文中所用，短语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括(但不限于)硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐(saccharate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐“甲磺酸盐”、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、帕莫酸盐(pamoate)(即1，1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘酸盐))、碱金属(例如钠和钾)盐、碱土金属(例如镁)盐以及铵盐。药学上可接受的盐可涉及包括另一分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他平衡离子。所述平衡离子可为使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐的结构中可具有一个以上带电原子。多个带电原子为药学上可接受的盐的一部分的情形可具有多个平衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个平衡离子。
如果本发明化合物为碱，那么可通过本领域中可用的任何适合方法来制备所需药学上可接受的盐，例如用诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸等无机酸或用诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)(诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羟基酸(诸如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、芳族酸(诸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(诸如对甲苯磺酸或乙烷磺酸)等有机酸处理游离碱。
如果本发明的化合物为酸，那么可通过任何适合的方法来制备所需药学上可接受的盐，例如用诸如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等无机或有机碱处理游离酸。适合的盐的说明性实例包括(但不限于)衍生自氨基酸(诸如甘氨酸和精氨酸)、氨、伯胺、仲胺以及叔胺以及环状胺(诸如哌啶、吗啉以及哌嗪)的有机盐，以及衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝以及锂的无机盐。
如本文所用，术语“溶剂化物”意指进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的量的溶剂(诸如水、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸以及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇等)的化合物。化合物的溶剂化物或水合物易于通过将至少1摩尔当量羟基溶剂(诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水)添加至化合物中以引起亚胺部分的溶剂化或水合作用来制备。
术语“异常细胞生长”与“增生性病症”在本申请中可互换使用。除非另作指示，否则如本文中所用，“异常细胞生长”是指细胞生长与正常调控机制无关(例如丧失接触抑制作用)。这包括例如以下各物的异常生长：(1)通过表达突变的酪氨酸激酶或过度表达受体酪氨酸激酶而增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)发生异常酪氨酸激酶活化的其他增生性疾病的良性和恶性细胞；(3)由受体酪氨酸激酶增殖的任何肿瘤；(4)由异常丝氨酸/酥氨酸激酶活化引起的增殖的任何肿瘤；以及(5)发生异常丝氨酸/酥氨酸激酶活化的其他增生性疾病的良性和恶性细胞。
术语“癌症”和“癌症的”是指或描述通常以不受调控的细胞生长为特征的哺乳动物生理病况。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞和/或良性或癌前期细胞。
“治疗剂”涵盖诸如抗体、肽、蛋白质、酶等生物试剂或化学治疗剂。治疗剂还涵盖细胞结合剂(CBA)与化学化合物的免疫结合物，诸如抗体-药物结合物(ADC)。结合物中的药物可为细胞毒性剂，诸如本文所描述的细胞毒性剂。
“化学治疗剂”为适用于治疗癌症的化合物。
“代谢物”或“分解代谢产物”为由特定化合物、其衍生物或其结合物或其盐在体内代谢或分解代谢产生的产物。可使用本领域中已知的常规技术鉴别化合物、其衍生物或其结合物的代谢物，并且可使用诸如本文所描述的测试来确定其活性。可例如由施用的化合物的氧化、羟基化、还原、水解、胺化、脱胺、酯化、脱酯、酶促裂解等产生这些产物。因此，本发明包括通过包含使本发明化合物、其衍生物或其结合物与哺乳动物接触一段足以产生其代谢产物的时间段的方法而制备的本发明化合物、其衍生物或其结合物的代谢物(包括化合物、其衍生物或其结合物)。
短语“药学上可接受的”表示物质或组合物必须与构成调配物的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物在化学上和/或毒理学上相容。
术语“保护基”或“保护部分”是指常用于在化合物、其衍生物或其结合物上的其他官能团反应时阻断或保护特定官能团的取代基。举例来说，“胺保护基”或“氨基保护部分”为连接至氨基以阻断或保护化合物中的氨基官能团的取代基。这些基团为本领域中熟知的(参看例如P.Wuts和T.Greene，2007，Protective Groups in Organic Synthesis，第7章，J.Wiley&Sons，NJ)并且例证为氨基甲酸酯，诸如氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯、FMOC、取代氨基甲酸乙基酯、通过1，6-β-消除反应裂解(也称为“自消耗(self immolative)”)的氨基甲酸酯；脲；酰胺；肽；烷基以及芳基衍生物。适合的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)以及9-芴基亚甲基氧基羰基(Fmoc)。有关保护基和其应用的一般描述，参看P.G.M.Wuts&T.W.Greene，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley&Sons，New York，2007。
术语“离去基团”是指具有在取代或置换期间离去的带电或不带电部分的基因。这些离去基团为本领域中熟知的，并且包括(但不限于)卤素、酯、烷氧基、羟基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、甲磺酸酯基、腈、叠氮基、氨基甲酸酯基、二硫化物、硫酯、硫醚以及重氮化合物。
术语“双官能交联剂”、“双官能接头”或“交联剂”是指具有两个反应性基团的改性剂，所述两个反应性基团中一个能够与细胞结合剂反应，而另一个与细胞毒性化合物反应，以将两个部分连接在一起。这些双官能交联剂为本领域中熟知的(参看例如Isalm和Dentin Bioconjugation第5章，第218-363页，Groves Dictionaries Inc.New York，1999)。举例来说，能够经由硫醚键键联的双官能交联剂包括用以引入马来酰亚胺基的N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(SMCC)或用以引入碘代乙酰基的N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)。将马来酰亚胺基或卤代乙酰基引入细胞结合剂上的其他双官能交联剂为本领域中熟知的(参看美国专利申请2008/0050310、20050169933，可从Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117，Rockland，IL 61105，USA获得)并且包括(但不限于)双-马来酰亚胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、5-马来酰亚胺基戊酸NHS、HBVS、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其为SMCC(LC-SMCC)的“长链”类似物)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酰肼或盐酸盐(MPBH)、3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)、碘代乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺)己酸酯(SMPH)、琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代双-马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1，4-双-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1，4双马来酰亚胺基-2，3-二羟基丁烷(BMDB)、双-马来酰亚胺基己烷(BMH)、双-马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酰基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)以及4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMPB)。
异双官能交联剂为具有两个不同反应性基团的双官能交联剂。还可使用含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS基团)和羰基反应性肼基的异双官能交联剂来将本文所描述的细胞毒性化合物与细胞结合剂(例如抗体)连接。所述市售异双官能交联剂的实例包括琥珀酰亚胺基6-肼基烟酰胺丙酮腙(SANH)、4-肼基对苯二甲酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐(SHTH)以及琥珀酰亚胺基烟酸肼盐酸盐(sHNH)。还可使用带有肼的本发明的苯并二氮杂卓衍生物来制备带有酸不稳定键联的结合物。可用的双官能交联剂的实例包括琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯甲酸酯(SFB)和琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯氧基乙酸酯(SFPA)。
能够经由二硫键将细胞结合剂与细胞毒性化合物键联的双官能交联剂为本领域中已知的并且包括用以引入二硫吡啶基的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。可用以引入二硫基团的其他双官能交联剂为本领域中已知的并且公开于：美国专利6,913,748、6,716,821以及US专利公布20090274713和20100129314中，所有这些专利皆以引用方式并入本文中。或者，还可使用引入硫醇基的交联剂，诸如2-亚胺基硫杂环戊烷、高半胱氨酸硫内酯或S-乙酰基琥珀酸酐。
如本文所定义，“接头”、“接头部分”或“连接基团”是指将两个基团(诸如细胞结合剂与细胞毒性化合物)连接在一起的部分。通常，接头在连接其所连接的两个基团的条件下大体上呈惰性。双官能交联剂可包含两个反应性基团，在接头部分每一端各一个，以致一个反应性基团可首先与细胞毒性化合物反应以提供带有连接部分和第二反应性基团的化合物，所述第二反应性基团然后可与细胞结合剂反应。或者，双官能交联剂的一端可首先与细胞结合剂反应以提供带有接头部分和第二反应性基团的细胞结合剂，所述第二反应性基团然后可与细胞毒性化合物反应。连接部分可含有允许细胞毒性部分在特定位点释放的化学键。适合的化学键为本领域中熟知的并且包括二硫键、硫醚键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键以及酯酶不稳定键(参看例如美国专利5,208,020；5,475,092；6,441,163；6,716,821；6,913,748；7,276,497；7,276,499；7,368,565；7,388,026以及7,414,073)。优选为二硫键、硫醚键以及肽酶不稳定键。可用于本发明中的其他接头包括不可裂解的接头，诸如美国公布号20050169933中详细描述的那些接头；或带电接头或亲水性接头，所述接头在US 2009/0274713、US 2010/01293140以及WO2009/134976中有描述，各案以引用的方式清楚地并入本文中。
在一个实施方案中，一端连接有反应性基团(诸如反应性酯)的连接基团选自以下各基团：-O(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-O(CR20R21)m(CR26＝CR27)m，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-O(CR20R21)m(炔基)n，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-O(CR20R21)m(哌嗪基)t，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-O(CR20R21)m(吡咯基)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-O(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-S(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-S(CR20R21)m(CR26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(C R40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-S(CR20R21)m(炔基)n’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-S(CR20R21)m(哌嗪基)t，(CR22R23)n(OCH2C H2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-S(CR20R21)m(吡咯基)t’(CR22R23)n(OC H2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-S(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”，Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(CR2]＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(炔基1)n，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q-(CO)t X”、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(哌嗪基)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(吡咯基)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q -(CO)tX”、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(CR26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(炔基)n，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(哌嗪基)t，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(CR29＝N-NR30)n”(CR26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”、-(CR20R21)m(CR29＝N-NR30)n”(炔基)n，(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q -(CO)tX”，-(CR20R21)m(CR29＝N-NR30)n”A”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”，
其中：
m、n、p、q、m’、n’、t’为1至10的整数，或任选为0；
t、m”、n”以及p”为0或1；
X”选自OR36、SR37、NR38R39，其中R36、R37、R38、R39为H，或具有1至20个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基及或聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n；R37任选为硫醇保护基，当t＝1时，COX”形成选自以下各物的反应性酯：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯、N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯、对硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯以及其衍生物，其中所述衍生物有助于酰胺键形成；
Y”不存在，或选自O、S、S-S或NR32，其中R32具有上文关于R所给出的相同的定义；或
当Y”不为S-S并且t＝0时，X”选自马来酰亚胺基、卤代乙酰基或SR37，其中R37具有与上文相同的定义；
A”为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸单元的多肽；
R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26以及R27相同或不同，并且为-H或具有1至5个碳原子的直链或分支链烷基；
R29与R30相同或不同，并且为-H或具有1至5个碳原子的烷基；
R33为-H或具有1至12个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元R-(OCH2CH2)n-，或R33为-COR34、-CSR34、-SOR34或-SO2R34，其中R34为H或具有1至20个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基，或聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n；并且
R40和R41中的一个任选为带负电或带正电的官能团，而另一个为H或具有1至4个碳原子的烷基、烯基、炔基。
上述连接基团中的任一个可存在于任一本发明化合物、药物-接头化合物或结合物中，包括代替本文所描述的任一结构式的连接基团。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸由NH2-C(Raa’Raa)-C(＝O)OH表示，其中Raa和Raa’各自独立地为H；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；芳基；杂芳基；或杂环基；或Raa和N末端氮原子可一起形成杂环(例如，如脯氨酸中)。术语“氨基酸残基”是指当将一个氢原子从氨基酸的胺和/或羧基端移除时得到的相应残基，诸如-NH-C(Raa’Raa)-C(＝O)O-。
术语“阳离子”是指带正电的离子。阳离子可为一价(例如Na+、K+等)、二价(例如Ca2 +、Mg2+等)或多价(例如Al3+等)的。优选地，阳离子为一价的。
术语“治疗有效量”意指在受试者体内引起所需生物反应的活性化合物或结合物的量。所述反应包括减轻所治疗疾病或病症的症状；预防、抑制或延迟疾病症状或疾病本身的复发；与不存在所述治疗的情形相比增加受试者的寿命；或预防、抑制或延迟疾病症状或疾病本身的发展。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其依据本文所提供的详细公开内容。可通过细胞培养和实验动物中的标准医药学程序来确定化合物或结合物的毒性和治疗功效。本发明化合物或结合物或要施用给受试者的其他治疗剂的有效量将取决于多发性骨髓瘤的阶段、类别和状态，以及受试者的特征，诸如一般健康状况、年龄、性别、体重以及耐药性。本发明化合物或结合物或要施用的其他治疗剂的有效量还取决于施用途径和剂型。可个别调整剂量和间隔以提供足以维持所需治疗效果的活性化合物的血浆水平。
术语“半胱氨酸工程化抗体”包括具有至少一个通常不存在于抗体轻链或重链的既定残基处的Cys的抗体。可例如通过标准重组技术(例如，通过用Cys的编码序列置换靶残基处的非Cys残基的编码序列)而引入所述Cys(也可称为“工程化Cys”)。在某些实施方案中，本发明的Cys工程化抗体在重链中具有工程化Cys。在某些实施方案中，所述工程化Cys位于或接近重链的CH3结构域。在某些实施方案中，所述工程化Cys在重链的残基442处(EU/OU编号)。
如本文所用，根据EU索引对本文所描述的所有抗体氨基酸残基进行编号，Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunologicalInterest，第5版，NIH公布号91-3242，1991(EU/OU编号，完整内容以引用的方式并入本文中)。常见同型称为G1、G2、G4等。
以下某些实例是指各种人源化抗CD123抗体，在此简要描述了这些抗体的命名法。一类huCD123-6抗体是通过从鼠类抗CD123抗体muCD123-6的重链和轻链移植6个CDR而人源化。在那些抗体中，字母“G”之后紧接克隆名称(即，huCD123-6)，克隆名称之后进而为指定人类轻链和重链可变区序列的来源的版本号。因此huCD123-6Gv4.6是指基于将来自相应muCDR123-6抗体的6个CDR区移植(“G”)到人类轻链可变区Gv4和重链可变区Gv6上的人源化CD123抗体。类似地，-Gv4.7包含人类轻链可变区Gv4和重链可变区Gv7。
另一类huCD123-6抗体是通过表面重整而人源化。具有表面重整重链序列huCD123-6rhv1.1和表面重整轻链序列huCD123-6rlv1.0的表面重整抗体为huCD123-6Rv1.1。
当任一抗CD123抗体包含如上文所描述的工程化Cys残基时，所述抗体可包含名称CysMab或C442，诸如huCD123-6Gv4.7-C442。C442残基可经由C442残基的游离硫醇基与细胞毒性药物/细胞毒性剂结合，诸如通过与细胞毒性药物的硫醇反应剂(例如，马来酰亚胺基)反应。具有硫醇反应性基团-D4-D7-的这些细胞毒性药物和其合成的代表性列表描述于实施例1中且列于下表中。以下还列出了额外的相关化合物D1、D2、DGN462以及D3(其分别与D4、D5、D6以及D7具有相同核心结构，但不具有硫醇反应性基团)。D1-D3以及DGN462由于缺乏马来酰亚胺基硫醇反应性基团而不能连接至C442。
Figure BDA0001530936520000701
Figure BDA0001530936520000711
本发明的抗体与D4-D7之间经由游离硫醇基的结合物简单地列出了抗体和连接的细胞毒性药物的名称。举例来说，huCD123-6Gv4.7-C442-D5为化合物D5与huCD123-6Gv4.7经由C442硫醇基的结合物，并且huMov19-C442-D5为化合物D5与huMov19抗体经由C442硫醇基的结合物。在某些实施方案中，诸如D1等化合物要求额外的接头(例如，磺基-SPDB接头或sSPDB)结合至抗体，诸如结合至Lys侧链氨基。以下示出了Lys连接的结合物huCD123-6Gv4.7-磺基-SPDB-D1(或huCD123-6Gv4.7-磺基-SPDB-D1)的结构。
Figure BDA0001530936520000721
应注意，某些CD123抗体在此类抗体或其免疫结合物的名称中具有“S2”和/或“S3”，它们不应与化学式中表示连接位点或共价键形成的“s2”或“s3”名称混淆。
本发明的结合物和化合物
在第一方面中，本发明提供细胞结合剂-细胞毒性剂结合物，其中所述细胞结合剂(CBA)经由位于CBA上的硫醇(-SH)基团共价连接至细胞毒性剂。在某些实施方案中，游离硫醇基在抗体的重链CH3区中的工程化Cys残基上，在所述重链的EU/OU编号位置442处(或简称C442)。
因此在一个实施方案中，本发明的抗体-细胞毒性剂结合物包含具有半胱氨酸残基(例如，在重链的EU/OU编号位置442处)和细胞毒性剂的抗体，其中所述抗体经由半胱氨酸残基(例如，C442)共价连接至细胞毒性剂。所述结合物由下式表示：
Figure BDA0001530936520000722
其中：
Ab为在重链的位置442处(EU/OU编号)具有半胱氨酸残基的抗体；
S442表示来自共价连接至JCB’基团的抗体的重链的位置442处的半胱氨酸残基的硫醇基；
JCB’为连接半胱氨酸残基与基团L的连接部分；
L为连接细胞毒性剂与JCB’部分的接头；
D为共价连接至基团L的细胞毒性剂；并且
w为1或2。
在一个实施方案中，位置442处的半胱氨酸残基是重组引入所述Ab中。
在第二方面中，本发明提供一种细胞毒性剂-接头化合物，所述化合物能够与本发明的具有游离半胱氨酸残基的抗体反应以形成本发明的结合物。
在一个实施方案中，本发明的细胞毒性剂-接头化合物由以下结构式表示：
D-L-JCB(II)，
其中：
JCB为能够与本文所描述的抗体形成共价键的连接基团；
L为连接由D表示的细胞毒性剂与JCB基团的接头；并且
D为共价连接至基团L的细胞毒性剂。
在一个实施方案中，JCB为硫醇反应性基团。
以下描述本发明的第一方面和第二方面的某些实施方案和特定实施方案。
在第1实施方案中，对于本发明的第一方面中的式(I)结合物，JCB’为
Figure BDA0001530936520000741
其中s1为共价连接至抗体的半胱氨酸残基的位点，并且s2为共价连接至基团L的位点；并且Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；并且剩余变量如以上针对式(I)所描述。在一个特定实施方案中，Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或C1-3烷基。在另一特定实施方案中，Ra、Rb、Rc以及Re皆为H。
此外在第1实施方案中，对于本发明的第二方面中的式(II)化合物，JCB为
Figure BDA0001530936520000742
X’-CRbRc-C(＝O)-、X’-CRbRc-C(＝O)-NRe-、
Figure BDA0001530936520000743
Figure BDA0001530936520000744
Figure BDA0001530936520000745
Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；并且剩余变量如以上针对式(II)所描述。
在第2实施方案中，对于本发明的第一方面中的式(I)结合物，JCB’为
Figure BDA0001530936520000751
Figure BDA0001530936520000752
其中s1为共价连接至抗体的半胱氨酸残基的位点，并且s2为共价连接至基团L的位点；并且Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；并且剩余变量如以上针对第1实施方案中的式(I)所描述。在一个特定实施方案中，Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或C1-3烷基。在另一特定实施方案中，Ra、Rb、Rc以及Re皆为H。
此外在第2实施方案中，对于本发明的第二方面中的式(II)化合物，JCB为
Figure BDA0001530936520000753
X’-CRbRc-C(＝O)-、X’-CRbRc-C(＝O)-NRe-、
Figure BDA0001530936520000754
Figure BDA0001530936520000755
Figure BDA0001530936520000756
Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；并且剩余变量如以上针对第1实施方案中的式(II)所描述。
在第3实施方案中，对于本发明的第一方面中的式(I)结合物，JCB’为
Figure BDA0001530936520000757
并且剩余变量如以上针对式(I)所描述。
此外在第3实施方案中，对于本发明的第二方面中的式(II)化合物，JCB’为
Figure BDA0001530936520000761
并且剩余变量如以上针对式(II)所描述。
在第4实施方案中，对于本发明第一方面的式(I)结合物和本发明第二方面的式(II)化合物，-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000762
其中：
s3为共价连接于JCB’基团的位点，并且s4为共价连接于基团D的位点；
E为-(CR10R11)q-、环烷基或环烷基烷基；
Z不存在、为-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(＝O)-NR9-、-NR9-C(＝O)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-NR9-(CH2CH2O)p-、-NR9-C(＝O)-(CH2CH2O)p-、-(OCH2CH2)p-C(＝O)NR9-或-(OCH2CH2)p-NR9-C(＝O)-；
p为1至24的整数；
Q为H、带电荷取代基或可电离基团；
R9、R10、R11、R12以及R13在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；并且
q和r在每次出现时独立地为0与10之间的整数。
式(I)或式(II)中的剩余变量如以上在第一实施方案、第1、第2或第3实施方案或其中所描述的任何其他特定实施方案所描述。
在一个特定实施方案中，q和r独立地为1至6，更具体地说为1至3的整数。
在另一特定实施方案中，R9、R10、R11、R12以及R13在每次出现时独立地为H或C1-3烷基。更具体地说，R9、R10、R11、R12以及R13皆为H。
在另一特定实施方案中，p为2至14的整数。更具体地说，p为2至8、2至6或2至4的整数。
在一特定实施方案中，E为-(CR10R11)q-；并且式(L1)中的剩余变量如以上在第4实施方案中所描述。
在另一特定实施方案中，E为
Figure BDA0001530936520000771
并且式(L1)中的剩余变量如以上在第4实施方案中所描述。
在又另一特定实施方案中，Z为-C(＝O)-NR9-或-NR9-C(＝O)-；并且式(L1)中的剩余变量如以上在第4实施方案或以上所描述的任何其他特定实施方案中所描述。甚至更具体地说，R9为H或Me。或者，R9为H。
在又另一特定实施方案中，Q为i)H；ii)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR14R15或-Z’-NR14R15或其药学上可接受的盐；或iii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’为任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地为任选取代的烷基；并且X-为药学上可接受的阴离子；并且式(L1)中的剩余变量如以上在第4实施方案或以上所描述的任何其他特定实施方案中所描述。在一个实施方案中，Z’为任选取代的亚烷基。在又另一实施方案中，Z’为C1-3亚烷基(例如，-CH2)；并且R14至R16各自独立地为C1-4烷基。
在又另一特定实施方案中，Q为H或-SO3M，其中M为药学上可接受的阳离子(例如，H+、Na+或K+)；并且式(L1)中的剩余变量如以上在第4实施方案或以上所描述任何其他特定实施方案中所描述。
在第5实施方案中，对于本发明第一方面的式(I)结合物，-JCB’-L-由以下结构式中的任一个表示：
Figure BDA0001530936520000781
其中q和r各自独立地为1至6的整数；M为药学上可接受的阳离子；并且剩余变量如以上针对式(I)所描述。更具体地说，q和r各自独立地为1至3的整数。在另一更特定实施方案中，M为H+、Na+或K+。
此外，在第5实施方案中，对于本发明第二方面的式(II)化合物，JCB-L-由以下结构式中的任一个表示：
Figure BDA0001530936520000782
其中q和r各自独立地为1至6的整数；M为药学上可接受的阳离子；并且剩余变量如以上针对式(II)所描述。更具体地说，q和r各自独立地为1至3的整数。在另一更特定实施方案中，M为H+、Na+或K+。
在第6实施方案中，对于第一方面中的式(I)结合物，-JCB’-L-由以下结构式中的任一个表示：
Figure BDA0001530936520000783
Figure BDA0001530936520000791
其中M为药学上可接受的阳离子并且剩余变量如以上针对式(I)所描述。更具体地说，M为H+、Na+或K+。
此外，在第6实施方案中，对于第二方面中的式(I)化合物，JCB-L-由以下结构式中的任一个表示：
Figure BDA0001530936520000792
其中M为药学上可接受的阳离子并且剩余变量如以上针对式(II)所描述。更具体地说，M为H+、Na+或K+。
在第7特定实施方案中，对于第一个方面中的式(I)结合物和第二方面中的式(II)化合物，-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000793
其中：
s3为共价连接于JCB’基团的位点，并且s4为共价连接于基团D的位点；
R19至R22在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
m和n各自独立地为0与10之间的整数；
Rh为H或任选取代的烷基；
P为任选取代的亚烷基、-(CH2-CH2-O)j-、-(O-CH2-CH2)j-、氨基酸残基或含有2-20个氨基酸残基的肽；并且
j为1至24的整数；
并且剩余变量如以上针对式(I)或式(II)、第1、第2或第3实施方案或其中所描述的任何其他特定实施方案所描述。
在第8实施方案中，对于式(L2)，R19、R20、R21以及R22各自为H或C1-3烷基；m和n各自独立地为1与6之间的整数；并且剩余变量如以上在第7实施方案中所描述。更具体地说，R19、R20、R21以及R22皆为H。甚至更具体地说，R19、R20、R21以及R22皆为H；并且m和n各自独立地为1与3之间的整数。
在第9特定实施方案中，对于式(L2)，P为氨基酸残基或含有2至10个氨基酸残基的肽；并且剩余变量如以上在第7或第8实施方案中所描述。更具体地说，P为含有2至5个氨基酸残基的肽。
在一个实施方案中，各氨基酸残基为独立地选自以下的氨基酸的残基：天然存在的氨基酸、合成氨基酸、氨基酸类似物以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸模拟物。
在另一实施方案中，各氨基酸残基为独立地选自由以下组成的群组的氨基酸的残基；组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、N-甲基-组氨酸、N-甲基-丙氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-精氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-天冬酰胺、N-甲基-赖氨酸、N-甲基-天冬氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-半胱氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-谷氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-谷氨酰胺、N-甲基-色氨酸、N-甲基-甘氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-脯氨酸、N-甲基-丝氨酸、N-甲基-酪氨酸、羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、硒代半胱氨酸、O-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍、瓜氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸磺酸、半胱氨酸亚磺酸、3-氨基丙氨酸、3-二甲基氨基丙氨酸、2-氨基-4-(二甲基氨基)丁酸、2，4-二氨基丁酸、2-氨基-6-(二甲基氨基)己酸、2-氨基-5-(二甲基氨基)戊酸以及β-丙氨酸，各自独立地为L或D异构物。更具体地说，各氨基酸残基为独立选择的甘氨酸或丙氨酸的残基。
在另一实施方案中，P为可由蛋白酶裂解的肽。更具体地说，P为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。或者，P为可由溶酶体蛋白酶裂解的肽。
在又另一实施方案中，P选自由以下组成的群组：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQID NO：14)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：15)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ IDNO：16)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala和D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Val-Ala以及β-Ala-Gly-Gly-Gly。更具体地说，P为Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Val-Ala或β-Ala-Gly-Gly-Gly。
在第10实施方案中，对于第一方面中的式(I)结合物，-JCB’-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000811
并且剩余变量如以上针对式(I)所描述。
此外，在第10实施方案中，对于第二方面中的式(II)化合物，JCB-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000821
并且剩余变量如以上针对式(II)所描述。
在第11实施方案中，对于式(I)结合物和式(II)化合物，-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000822
其中：
s3为共价连接于JCB’的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
R23和R24在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
m’为0与10之间的整数；并且
Rh’为H或任选取代的烷基；
并且剩余变量如以上针对式(I)或式(II)、第1、第2或第3实施方案或其中所描述的任何特定实施方案所描述。
在一个特定实施方案中，m’为1至6的整数。甚至更具体地说，m’为1至3的整数。
在另一特定实施方案中，R23和R24在每次出现时独立地为H或C1-3烷基。甚至更具体地说，R23与R24均为H。
在另一特定实施方案中，Rh’为H或C1-3烷基。更具体地说，Rh’为H。
在另一特定实施方案中，R23与R24均为H；m’为1至6的整数。甚至更具体地说，m’为1至3的整数。
在第12实施方案中，对于第一方面中的式(I)结合物，-JCB’-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000831
并且剩余变量如以上针对式(I)所描述。
此外，在第12实施方案中，对于第二方面中的式(II)化合物，JCB-L-由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000832
并且剩余变量如以上针对式(II)所描述。
在另一实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，由D表示的细胞毒性剂为美登素(maytansinoid)；并且剩余变量如针对式(I)或(II)、以上所描述的第1-第12实施方案中的任一个或其中所描述的任何其他特定实施方案所描述。
在另一实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，由D表示的细胞毒性剂为苯并二氮杂卓；并且剩余变量如针对式(I)或(II)、以上所描述的第1-第12实施方案中的任一个或其中所描述的任何其他特定实施方案所描述。
在第13实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，D为由以下结构式表示的美登素：
Figure BDA0001530936520000841
其中：
RM、RM’以及RM”在每次出现时独立地为H或任选取代的烷基；
R1’、R2’、R3’以及R4’在每次出现时独立地为H、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
i为0与15之间的整数；
并且剩余变量如以上针对式(I)或式(II)、以上所描述的第1-第10实施方案中的任一个或其中所描述的任何特定实施方案所描述。
更具体地说，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000842
其中i为1或2；并且R1’和R2’各自独立地为H或C1-3烷基；并且剩余变量如在第13实施方案中所描述。
在第14特定实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，D为由以下结构式表示的美登素：
Figure BDA0001530936520000851
并且剩余变量如以上针对式(I)或式(II)、以上所描述的第1-第10实施方案中的任一个或其中所描述的任何特定实施方案所描述。
在第15实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000852
Figure BDA0001530936520000861
或其药学上可接受的盐，其中：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000862
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X选自-H或胺保护基(优选X为-H)；并且Y选自-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、-SO3M、-SO2M或-OSO3M，其中M为-H或阳离子(如Na+或K+)；
R为-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc，其中n为1至24的整数，并且Rc为具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；
R’和R”各自独立地选自-H、-OH、-OR、-NRRg’、-COR、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的具有1至6个选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环、PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc，并且Rg’为-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或PEG基团-(CH2CH2O)n-Rc；
X’选自由以下组成的群组：-H、-OH、取代或未取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、苯基以及胺保护基；
Y’选自由以下组成的群组：-H、氧代基团、取代或未取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
A和A’选自-O-和-S-；
W’不存在或选自-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(＝O)-、-N(C(＝O)Re)-、-S-或-CH2-S-、-CH2NRe-；
Rx不存在或选自具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基；
Re为-H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rw为-H、具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基，任选携带仲氨基(例如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环(诸如哌啶或吗啉)，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
G选自-CH-或-N-；并且
R6为-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；
并且剩余变量如以上针对式(I)或式(II)、第1-第10实施方案中的任一个或其中所描述的任何特定实施方案所描述。
在一个特定实施方案中，D由以上式(IBD1)表示，或其药学上可接受的盐。
在另一特定实施方案中，对于式(IBD1)-(IBD6)：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000882
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-OH或-SO3M；
M为-H或药学上可接受的阳离子(例如，Na+)；
X’与Y’均为-H；
A与A’均为-O-；
R6为-OMe；并且
Rx为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基。
在第16实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000881
Figure BDA0001530936520000891
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000892
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-OH或-SO3M；并且剩余变量如以上针对式(I)或(II)、第1-第10实施方案中的任一个或其中所描述的任何特定实施方案所描述。
在一个特定实施方案中，对于以上式(IBD7)-(IBD10)和(IBD7a)以及(IBD9a)，Y为-SO3M；并且M为H+、Na+或K+。
在第17实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000901
Figure BDA0001530936520000911
或其药学上可接受的盐，其中：
L’、L”以及L”’中的一个由下式表示：
-Z1-P1-Z2-Rx1-C(＝O)-(A’)，或
-N(Re)-Rx1-C(＝O)-(D’)；
而另外两个各自独立地选自-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR、-NR’R”、-NO2、-NR’COR”、-SR、-SOR’、-SO2R’、-SO3H、-OSO3H、-SO2NR’R”、氰基、叠氮基、-COR’、-OCOR’以及-OCONR’R”；
Z1和Z2中的一个为-C(＝O)-，而另一个为-NR5-；
P1为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸残基的肽；
Rx1为任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
Re为-H、具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk为-H、具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基，任选携带仲氨基(例如，-NHR101)或叔氨基(-NR101R102)或5或6元含氮杂环(诸如哌啶或吗啉)，其中R101和R102各自独立地为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000912
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H或具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基，而当它为单键时，X1为-H或胺保护部分；并且Y1为选自以下的离去基团：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R”、-NR’R”、-NR’COR”、-NR’NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环(例如，经由氮原子连接的哌啶、四氢吡咯、吡唑、吗啉等)、由-NR’(C＝NH)NR’R”表示的胍、氨基酸或由-NRCOP’表示的肽、-SR、-SOR’、卤素、氰基、叠氮基、-OSO3H(或其盐)、亚硫酸根(-SO3H或-SO2H或其盐)、偏亚硫酸氢根(H2S2O5或其盐)、单-、二-、三-以及四-硫代磷酸根(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2或其盐)、硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3、硫代硫酸根(HS2O3或其盐)、连二亚硫酸根(HS2O4或其盐)、二硫代磷酸根(P(＝S)(ORk’)(S)(OH)或其盐)、羟肟酸(Rk’C(＝O)NOH或其盐)以及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -或其盐)或其混合物，其中Ri为具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基并且用至少一个选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H以及-PO3H的取代基取代；Ri可进一步任选用本文所描述的烷基的取代基取代；Rj为具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基；Rk’为具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、芳基、杂环基或杂芳基；
P’为氨基酸残基或含有2与20个氨基酸残基的肽，
R在每次出现时独立地选自由以下组成的群组：-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的含有一或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
R’和R”各自独立地选自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2、-COR、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc以及任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
Rc为-H或任选取代的具有1至4个碳原子的直链或分支链烷基；
n为1至24的整数；
X1’选自-H、胺保护基、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、任选取代的具有6至18个碳原子的芳基、任选取代的含有一或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环以及任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N以及P的杂原子的3至18元杂环；
Y1’选自-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、任选取代的6至18元芳基、任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧以及硫的杂原子的5至18元杂芳基环、任选取代的具有1至6个杂原子的3至18元杂环；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’各自独立地选自由以下组成的群组：-H、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc、卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、-OR、-NR’R”、-NO2、-NCO、-NR’COR”、-SR、-SOR’、-SO2R’、-SO3 -H、-OSO3H、-SO2NR’R”、氰基、叠氮基、-COR’、-OCOR’以及-OCONR’R”；
R6为-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；
G为-CH-或-N-；
A和A’相同或不同，并且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5以及-CRR’N(R5)-；并且
R5在每次出现时独立地为-H或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或分支链烷基；
并且剩余变量如针对式(I)或(II)、第1、第2、第3、第11或第12特定实施方案或其中所描述的任何其他特定实施方案所描述。
在一个更特定实施方案中，D由式(IBD11)表示。
在另一更特定实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，L’、L”以及L”’中的一个由式(A’)或(D’)表示，并且其余为-H、具有1至6个碳原子的直链或分支链烷基、卤素、-OH、(C1-C6)烷氧基或-NO2。
在另一更特定实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，L’由式(A’)表示；并且L”与L”’均为-H。
在另一更特定实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，L’由式(D’)表示；并且L”与L”’均为-H。
在另一更特定实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，Rx1为任选用卤素、-OH、-SO3H、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基取代的具有1至6个碳原子的直链、分支链或环状烷基或带电荷取代基或可电离基团Q。
在第18特定实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，L’由下式表示：
-NR5-P1-C(＝O)-(CRaRb)s-C(＝O)-(B1’)；
-NR5-P1-C(＝O)-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)-(B2’)；
-C(＝O)-P1-NR5-(CRaRb)s-C(＝O)-(C1’)，或
-C(＝O)-P1-NR5-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)-(C2’)
其中：
Ra和Rb在每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或带电荷取代基或可电离基团Q；
s为1至6的整数；
s1’为0或1至6的整数；并且
Cy为任选用卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代(C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基；
并且剩余变量如以上在第17特定实施方案或其中所描述的任何其他特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，Ra与Rb均为H；式(B2’)和(C2’)中的Cy为环己烷；并且R5为H或Me。甚至更具体地说，s1’为0或1。
在第19实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，P1为含有2至10个氨基酸残基的肽；并且剩余变量如在第17或第18特定实施方案中所描述。
在一个特定实施方案中，P1为含有2至5个氨基酸残基的肽。
在另一特定实施方案中，P1为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：14)、3-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQID NO：15)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：16)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met或Met-Ala。甚至更具体地说，P为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第20实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000952
表示双键；并且剩余变量如以上在第17、第18或第19实施方案中所描述。
在第21实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000951
表示单键，X1为-H或胺保护基；并且Y1为-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环、-SO3M、-SO2M或-OSO3M，其中M为H+或药学上可接受的阳离子；并且剩余变量如以上在第17、第18或第19实施方案中所描述。具体地说，Y1选自-SO3M、-OH、-OMe、-OEt或-NHOH。更具体地说，Y1为-SO3M或-OH，其中M为H+、Na+或K+。
在某些实施方案中，式(IBD11)-(IBD16)，X1’选自由以下组成的群组：-H、-OH、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基以及苯基；并且剩余变量如以上在第17、第18、第19、第20或第21特定实施方案中所描述。更具体地说，X1’为-H、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或苯基。在另一更特定实施方案中，X1’为-H、-OH或-Me。甚至更具体地说，X1’为-H。
在某些实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，Y1’选自由以下组成的群组：-H、氧代基团、任选取代的具有1至10个碳原子的直链、分支链或环状烷基、烯基或炔基；并且剩余变量如以上在第17、第18、第19、第20或第21特定实施方案中所描述。更具体地说，Y1’为-H、氧代基团、(C1-C3)烷基或卤代(C1-C3)烷基。在另一更特定实施方案中，Y1’为-H或氧代。甚至更具体地说，Y1’为-H。
在某些实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，A和A’相同或不同，并且为-O-、-S-、-NR5-或氧代-(C＝O)-；并且剩余变量如以上在第17、第18、第19、第20或第21特定实施方案中所描述。更具体地说，A和A’相同或不同，并且为-O-和-S-。甚至更具体地说，A和A’为-O-。
在某些实施方案中，对于式(IBDl1)-(IBD16)，R6为-OMe；并且剩余变量如以上在第17、第18、第19、第20或第21实施方案中所描述。
在某些实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’各自独立地为-H、卤素、-NO2、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基；并且剩余变量为所描述的s。更具体地说，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H。
在某些实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)，R、R’、R”以及R5各自独立地为-H或(C1-C3)烷基；并且剩余变量如以上在第17、第18、第19、第20或第21实施方案中所描述。
在第22实施方案中，对于式(IBD11)-(IBD16)：
N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000972
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H；而当它为单键时，X1为-H，并且Y1为-OH或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H；
R6为-OMe；
X1’与Y1’均为-H；
A和A’为-O-；并且
M为H+、Na+或K+；并且剩余变量如以上在第17、第18、第19、第20或第21特定实施方案中所描述。更具体地说，R、R’、R”以及R5各自独立地为-H或(C1-C3)烷基。甚至更具体地说，R、R’、R”以及R5皆为H。
在第23实施方案中，对于式(I)结合物或式(II)化合物，D由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000971
Figure BDA0001530936520000981
Figure BDA0001530936520000991
其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520000993
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；M为H+或其药学上可接受的阳离子；并且剩余变量如以上在第17实施方案中所描述。
在第24实施方案中，对于式(I)结合物，所述结合物由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520000992
Figure BDA0001530936520001001
Figure BDA0001530936520001011
Figure BDA0001530936520001021
Figure BDA0001530936520001031
Figure BDA0001530936520001041
Figure BDA0001530936520001051
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520001053
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。更具体地说，M为H+、Na+或K+。
此外在第24实施方案中，对于式(II)化合物，所述化合物由以下结构式表示：
Figure BDA0001530936520001052
Figure BDA0001530936520001061
Figure BDA0001530936520001071
或其药学上可接受的盐，其中N与C之间的双线
Figure BDA0001530936520001072
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X不存在并且Y为-H，而当它为单键时，X为-H，并且Y为-SO3M；并且M为H+或其药学上可接受的阳离子。
在第25实施方案中，对于在第一实施方案或第1-第24实施方案中的任一个中所描述的结合物，w为2。或者，w为1。
在某些实施方案中，在以上任何实施方案中，所描述的带电荷取代基或可电离基团Q为i)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12或其药学上可接受的盐；或ii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’为任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地为任选取代的烷基；并且X-为药学上可接受的阴离子。更具体地说，Q为-SO3H或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明的结合物中的抗体为具有工程化半胱氨酸残基(例如，在重链的EU/OU编号位置442处)的抗体。工程化Cys残基可位于抗体的一个或两个重链或抗体的一个或两个轻链上或其抗原结合部分或其组合上。在一个实施方案中，所述Cys残基位于抗体重链的EU/OU编号位置442处。在某一实施方案中，所述抗体为如本文所描述的半胱氨酸工程化抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、表面重整抗体或人类抗体。
在其他实施方案中，细胞结合剂为特异性结合于靶细胞的抗体、单链抗体、抗体片段；特异性结合于靶细胞的单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体片段(或“抗原结合部分”)；特异性结合于靶细胞的嵌合抗体、嵌合抗体片段(或“抗原结合部分”)；特异性结合于靶细胞的结构域抗体(例如，sdAb)或结构域抗体片段。
在某些实施方案中，细胞结合剂为人源化抗体、人源化单链抗体或人源化抗体片段(或“抗原结合部分”)。在一个特定实施方案中，人源化抗体为美国专利号7,342,110和7,557,189中描述的huMy9-6或另一相关抗体。在另一特定实施方案中，人源化抗体为在美国专利号8,557,966中描述的抗叶酸受体抗体。在又另一实施方案中，人源化抗体为2015年6月29日提交的标题为“ANTI-CD123ANTIBODIES AND CONJUGATES AND DERIVATIVESTHEREOF”的美国临时申请号62/186,161中所描述的抗CD123抗体。所有这些申请的教示皆以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，细胞结合剂为表面重整抗体、表面重整单链抗体、表面重整抗体片段(或“抗原结合部分”)或双特异性抗体。
本发明的又另一方面提供一种重组抗体，所述重组抗体包含源自本文所述的主题重组抗体重链(HC)、轻链(LC)或其抗原结合部分中的任一个的重链、轻链或其抗原结合部分的成熟加工序列。
举例来说，重组抗体可为或可包含scFv-Fc、Fcab、mAb2、小模块免疫药物(SMIP)、Genmab/单抗体或duobody、迷你抗体、IgGΔCH2、DVD-Ig、先体(probody)、胞内抗体(intrabody)或多特异性抗体。
Figure BDA0001530936520001091
为双特异性修饰的IgG1抗体异二聚体。IgG1铰链区通常包括(i)稳定铰链区，所述稳定铰链区含有CPPC序列并且不允许体内Fab臂交换，以及(ii)IgG4样CH3结构域，所述IgG4样CH3结构域被修饰为包含F405L和K409R残基，这使其允许体内Fab臂交换。(参见，例如WO2008119353和WO2011131746)。
在某些实施方案中，重组抗体可包含重链、轻链或其抗原结合部分的1、2、3或4个成熟加工序列，它们各自源自本文所描述的主题重组抗体重链(HC)、轻链(LC)或其抗原结合部分中的任一个的。
在某些实施方案中，重组抗体可为异二聚抗体，所述异二聚抗体包含第一重链多肽和第二重链多肽，其中所述第一重链多肽的Fc区和所述第二重链多肽的Fc区在介面处相遇，并且所述第二重链多肽的Fc区的介面包含隆凸，所述隆凸可定位于所述第一重链多肽的Fc区的介面中的凹穴中。在某些实施方案中，用于促进双特异性抗体中的重链的特异性配对的杵入臼技术可基于例如Genentech/Roche的CrossMab技术进一步改进，例如，通过交换CH1和κ恒定区以进一步减少或消除轻链错配。
或者，在完全双特异性抗体的开发中，还可使用LC异二聚体实现类似结果，诸如完全补充多种其他生物制品方法的Zymeworks AZYMETRICTM异二聚IgG1轻链平台技术，包括常见轻链、结构域抗体以及单链形式。
在某些实施方案中，第二重链多肽的Fc区已相对于模板/原始多肽有所改变以编码隆凸，或第一重链多肽的Fc区已相对于模板/原始多肽有所改变以编码凹穴或两者。
在某些实施方案中，隆凸和凹穴各自包含天然存在的氨基酸残基。
在某些实施方案中，通过用具有比原始残基更大侧链体积的输入残基置换模板/原始多肽的介面的原始残基来产生第二重链多肽的包含隆凸的Fc区。
在某些实施方案中，通过包括以下步骤的方法来产生第二重链多肽的包含隆凸的Fc区，在所述步骤中用编码具有比原始残基更大侧链体积的输入残基的核酸置换编码所述多肽介面的原始残基的核酸。
在某些实施方案中，所述抗体包括双特异性、多特异性以及单特异性抗体变体，所述抗体变体包含抗原结合区和重链恒定结构域，其中重链恒定结构域被修饰成包含EU/OU编号的位置442处的Cys。
在某些实施方案中，所述抗体可结合至靶细胞上的配体，诸如细胞表面配体，包括细胞表面受体。
特定示例性抗原或配体可包括肾素；生长激素(例如，人类生长激素和牛生长激素)；生长激素释放因子；副甲状腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子(例如因子vmc、因子IX、组织因子以及温韦伯氏因子(von Willebrandsfactor)；抗凝血因子(例如蛋白质C)；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化物(例如，尿激酶、人类尿或组织型纤溶酶原活化物)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(即，调控活化正常T细胞表达和分泌的因子)；人类巨噬细胞炎性蛋白-1-α；血清白蛋白(人类血清白蛋白)；苗勒管抑制物(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白(β-内酰胺酶)；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(例如，CTLA-4)；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子(例如骨源性神经营养因子、神经营养素-3、-4、-5或-6)；神经生长因子(例如NGF-β)；血小板源性生长因子；成纤维细胞生长因子(例如，aFGF和bFGF)；成纤维细胞生长因子受体2、表皮生长因子；转化生长因子(例如TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4以及TGF-β5)；类胰岛素生长因子-I和-II；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；类胰岛素生长因子结合蛋白、黑素转铁蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLRl、间皮素、畸胎瘤衍生生长因子槲皮素、αvβ6、整合素、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体；IRTA1；IRTA2；IRTA3；IRTA4；IRTA5；CD蛋白(例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138以及CD152)；一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体(参见美国公布号2008/0171040或美国公布号2008/0305044，这些专利公布以全文引用的方式并入本文中)；红细胞生成素；骨生成诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白；干扰素(例如，干扰素-α、-β以及-γ)；集落刺激因子(例如，M-CSF、GM-CSF以及G-CSF；白介素(例如IL-1至IL-10)；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原(例如，HIV包膜的一部分)；转运蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；整合素(例如，CD11a、CD11b、CDl1c、CD18、ICAM、VLA-4以及VCAM)；肿瘤相关抗原(例如，HER2、HER3以及HER4受体)；内皮素；c-Met；c-kit；1GF1R；PSGR；NGEP；PSMA；PSCA；TMEFF2；LGR5；B7H4；以及上文所列多肽中的任一种的片段。
在一个实施方案中，细胞结合剂为抗叶酸受体抗体。更具体地说，抗叶酸受体抗体为特异性结合人类叶酸受体1的人源化抗体，其中所述抗体包含：(a)重链CDR1，所述重链CDR1包含GYFMN(SEQ ID NO：1)；重链CDR2，所述重链CDR2包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO：2)；以及重链CDR3，所述重链CDR3包含YDGSRAMDY(SEQ ID NO：3)；以及(b)轻链CDR1，所述轻链CDR1包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQID NO：4)；轻链CDR2，所述轻链CDR2包含RASNLEA(SEQ ID NO：5)；以及轻链CDR3，所述轻链CDR3包含QQSREYPYT(SEQ ID NO：6)；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。优选地，重链CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO：7)。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为特异性结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含具有以下氨基酸序列的重链：QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWI GRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLCLSPG(SEQ IDNO：8)。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为特异性结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含具有以下氨基酸序列的轻链：DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：9)；或DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO：10)。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为特异性结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：8的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的轻链。优选地，所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：8的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链(huMov19)。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含工程化Cys残基(例如，C442)和与以下序列至少约90％、95％、99％或100％同一的重链可变结构域：QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFM[NWVKQSPGQSLEWI GRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：11)；以及与以下序列至少约90％、95％、99％或100％同一的轻链可变结构域：DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：12)；或DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：13)。
在一个特定实施方案中，人源化抗体为在美国专利号7，342，110和7，557，189中描述的huMy9-6或另一相关抗体。在另一特定实施方案中，人源化抗体为在美国专利号8，577，966中描述的抗叶酸受体抗体(例如，huMov19)。在某些实施方案中，人源化抗体为在美国专利号8，765，917中描述的抗CD37抗体(例如，抗CD37-3)。在某些实施方案中，人源化抗体为在美国专利号8,790，649中描述的抗EGFR抗体。在另一实施方案中，抗体为抗EGFR抗体。在一个实施方案中，抗EGFR抗体为非拮抗剂抗体，包括例如在以引用的方式并入本文中的WO2012058592中描述的抗体。在另一实施方案中，抗EGFR抗体为非功能性抗体，例如，人源化ML66。更具体地说，抗EGFR抗体为huML66。
在一个实施方案中，抗体为抗CD123抗体，诸如如2015年6月29日提交的标题为“ANTI-CD123ANTIBODIES AND CONJUGATES ANDDERIVATIVES THEREOF”的美国临时申请号62/186,161(全部内容，包括所有序列和图式并入本文中)中所描述的人源化huCD123抗体。
制备本发明结合物的方法
可通过使具有一个或多个游离半胱氨酸的抗体与具有本文所描述的硫醇反应性基团的化合物反应来制备上述免疫结合物(例如，式(I)免疫结合物或第1至第25实施方案中的任一个或其中所描述的任何特定实施方案的免疫结合物)。
在一个实施方案中，具有硫醇反应性基团的化合物由式(II)或第1至第25实施方案中的任一个或其中所描述的任何特定实施方案的化合物表示。
在某些实施方案中，在CBA与具有硫醇反应性基团的反应中使用有机溶剂来溶解所述化合物。示例性有机溶剂包括但不限于，二甲基乙酰胺(DMA)、丙二醇等。在一个实施方案中，CBA与所述化合物的反应是在DMA和丙二醇存在下进行。
组合物和使用方法
本发明包括一种组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含本文所描述的新颖苯并二氮杂卓化合物(例如吲哚啉并苯并二氮杂卓或噁唑啶并苯并二氮杂卓)、其衍生物或其结合物(和/或其溶剂化物、水合物和/或盐)以及载体(药学上可接受的载体)。本发明还包括一种组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含本文所描述的新颖苯并二氮杂卓化合物、其衍生物或其结合物(和/或其溶剂化物、水合物和/或盐)以及载体(药学上可接受的载体)，进一步包含第二治疗剂。可使用本发明组合物在哺乳动物(例如人类)中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症。本发明包括一种在哺乳动物(例如人类)中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的单独或与第二治疗剂组合的治疗剂或组合物，诸如本文所描述的新颖苯并二氮杂卓化合物(例如吲哚啉并苯并二氮杂卓或噁唑啶并苯并二氮杂卓)、其衍生物或其结合物(和/或其溶剂化物和盐)或其组合物。
在一个实施方案中，增生性病症为癌症。癌症可包括血液***癌症或实体肿瘤。更具体地说，癌症为白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML))、诸如急性B淋巴母细胞性白血病(B-ALL)等急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或淋巴瘤、黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、卵巢癌、子宫内膜癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、***癌以及子***。
本发明还提供治疗方法，所述治疗方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的上述任一结合物。
类似地，本发明提供一种用于诱导所选细胞群体的细胞死亡的方法，所述方法包括使靶细胞或含靶细胞的组织与有效量的细胞毒性剂接触，所述细胞毒性剂包含本发明细胞毒性化合物-细胞结合剂中的任一种(例如连接至细胞结合剂的吲哚啉并苯并二氮杂卓或噁唑啶并苯并二氮杂卓二聚体)、其盐或溶剂化物。靶细胞为细胞结合剂可结合的细胞。
必要时，可将其他活性剂(诸如其他抗肿瘤剂)与所述结合物一起施用。
适合的药学上可接受的载体、稀释剂以及赋形剂为熟知的并且可由本领域技术人员依据临床状况许可来确定。适合的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)杜贝卡氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco’s phosphate buffered saline)，pH为约7.4，含有约1mg/mL至25mg/mL人类血清白蛋白或不含人类血清白蛋白；(2)0.9％生理盐水(0.9％w/v NaCl)；以及(3)5％(w/v)右旋糖；并且还可含有抗氧化剂，诸如色胺；以及稳定剂，诸如吐温(Tween20)。
可在体外、体内或离体实践诱导所选细胞群体的细胞死亡的方法。
体外使用的实例包括在自体骨髓移植到同一患者中前对其进行处理以杀死患病或恶性细胞；在骨髓移植之前对其进行处理以便杀死胜任T细胞(competent T cell)并且预防移植物抗宿主疾病(GVHD)；对细胞培养物进行处理以杀死除不表达靶抗原的所需变体外的所有细胞；或杀死表达非所需抗原的变体。非临床体外使用的条件可由本领域技术人员轻易确定。
临床离体使用的实例为在癌症治疗或自体免疫疾病治疗中在自体移植之前从骨髓移除肿瘤细胞或淋巴细胞，或在移植前从自体或异体骨髓或组织移除T细胞和其他淋巴细胞以预防GVHD。可如下进行治疗。从患者或其他个体收集骨髓，并且然后在约37℃下，在加有浓度在约10μM至1 pM范围内的本发明细胞毒性剂的含血清培养基中孵育约30分钟至约48小时。有关孵育浓度和时间(即剂量)的确切条件可由本领域技术人员轻易确定。在孵育后，用含血清培养基洗涤骨髓细胞，并且根据已知方法经静脉内回输给患者。在骨髓收集与经处理细胞回输时间之间患者接受其他治疗(诸如根治性化疗或全身照射疗程)的情况下，使用标准医疗设备将处理过的骨髓细胞冷冻储存于液氮中。
对于临床体内使用，将以测试过无菌性和内毒素水平的溶液或冻干粉形式提供本发明的细胞毒性剂。有关施用途径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床方案可由本领域技术人员根据临床状况许可来确定。
可根据诱导所选细胞群体中的细胞死亡的体内或离体方法治疗的医学病况的实例包括任一类型的恶性疾病，包括例如癌症；自体免疫疾病，诸如***性狼疮、类风湿性关节炎以及多发性硬化；移植物排斥，诸如肾移植物排斥、肝移植物排斥、肺移植物排斥、心脏移植物排斥以及骨髓移植物排斥；移植物抗宿主疾病；病毒感染，诸如CMV感染、HIV感染、AIDS等；以及寄生虫感染，诸如贾第虫病(giardiasis)、阿米巴病(amoebiasis)、血吸虫病，以及如由本领域技术人员确定的其他疾病。
有关施用途径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床方案可由本领域技术人员根据临床状况许可来确定。
癌症疗法以及其剂量、施用途径和推荐用法为本领域中已知的，并且在诸如Physician′s Desk Reference(PDR)等文献中已有描述。PDR公开了已用于治疗各种癌症的药剂的剂量。治疗有效的上述这些化疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病程度以及本领域中的熟练医师所熟悉的其他因素，并且可由医师确定。PDR的内容以全文引用的方式清楚地并入本文中。本领域技术人员可使用以下参数中的一个或多个来评述PDR，以确定可根据本发明教示使用的化疗剂和结合物的给药方案和剂量。这些参数包括：
●综合指标
●制造商所提供
●产品(根据公司的或加商标的药物名称)
●类目索引
●通用/化学指数(非商标常用药物名称)
●药物的彩色图像
●符合FDA标记的产品信息
●化学信息
●功能/作用
●适应症和禁忌
●试验研究、副作用、警告
实施例
实施例1.用于抗体结合的接头-效应物试剂的制备
可在括号中用缩写来提到以下溶剂、试剂、保护基、部分以及其他名称。
Figure BDA0001530936520001181
Figure BDA0001530936520001191
A.N-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-11-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11，12，12a，13-四氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a，13-二氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-13，13-二甲基-2，5，8-三氧杂-14，15-二硫杂-11-氮杂十九烷-19-酰胺，化合物D6的合成
Figure BDA0001530936520001192
向游离硫醇6a(40mg，0.042mmol)和NHS 4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(35mg，80％纯度，0.085mmol)于无水二氯甲烷(0.5mL)中的溶液中添加无水二异丙基乙胺(0.015mL，0.085mmol)并且在室温下搅拌16小时。将反应混合物用饱和氯化铵淬灭并且用二氯甲烷稀释。将所获得的混合物在分液漏斗中分离。将有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下汽提。将残余物通过半制备型逆相HPLC(C18柱，CH3CN/H2O)纯化。将包含纯产物的级分合并，冷冻并且冻干，得到所需NHS酯，6b(29.7mg，60％产率)。LCMS＝9.1分钟(15分钟方法)。MS(m/z)：1157.3(M+1)+。
Figure BDA0001530936520001193
向NHS酯，6b(12.3mg，0.011mmol)和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(2.0mg，0.011mmol)于无水二氯甲烷(0.3mL)中的溶液中添加DIPEA(0.0022mL，0.013mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后将其在减压下汽提。将残余物通过半制备型逆相HPLC(C18柱，CH3CN/H2O)纯化。将包含纯产物的级分合并，冷冻并且冻干，得到所需马来酰亚胺，化合物D6(10mg，80％产率)。LCMS＝8.3分钟(15分钟方法)。MS(m/z)：1181.8(M+1)+。
B.N1-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11，12，12a，13-四氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a，13-二氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)己二酰胺，化合物D5的合成
Figure BDA0001530936520001201
在室温下将NHS酯5a(8.2mg，7.6μmol)和1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮盐酸盐(2.2mg，0.011mmol)溶解于无水二氯甲烷(305μL)中。添加DIPEA(2.66μL，0.015mmol)并且将反应物搅拌3.5小时。将反应混合物浓缩并且通过RPHPLC(C18柱，CH3CN/H2O，梯度，35％至55％)纯化。将所需产物级分冷冻并且冻干，得到呈固体白色粉末状的马来酰亚胺，化合物D5(5.3mg，58％产率)。LCMS＝5.11分钟(8分钟方法)。MS(m/z)：1100.6(M+1)+。
C.1-((2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-((5-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11，12，12a，13-四氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a，13-二氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-2-甲基-5-氧代戊-2-基)二硫烷基)-1-氧代丁烷-2-磺酸，化合物D4的合成
Figure BDA0001530936520001211
在氮气下在室温下向游离硫醇，4a(88mg，0.105mmol)和1-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1-氧代-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁烷-2-磺酸(64.0mg，0.158mmol)于无水二氯甲烷(2.10mL)中的悬浮液中添加DIPEA(55.0μL，0.315mmol)。将混合物搅拌16小时并且然后添加1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮盐酸盐(55.6mg，0.315mmol)、无水二氯甲烷(1.0mL)以及DIPEA(0.055mL，0.315mmol)。将混合物在室温下再搅拌5小时，在其之后在真空中浓缩反应物。将所得残余物通过RP-HPLC(C18柱，CH3CN/H2O)纯化。将含有所需产物的级分冷冻并且冻干，得到呈白色固体状的马来酰亚胺，化合物D4(20mg，16％产率)。LCMS＝4.92分钟(8分钟方法)。MS(m/z)：1158.6(M+1)+。
D.N-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-11-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11，12，12a，13-四氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a，13-二氢-6H-苯并[5，6][1，4]二氮杂卓并[1，2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-2，5，8-三氧杂-11-氮杂十五烷-15-酰胺，化合物D7的合成
Figure BDA0001530936520001212
在氮气下向NHS酯，7a(5mg，4.82μmol)和1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮盐酸盐(1.7mg，9.64μmol)于无水二氯甲烷(200μL)中的溶液中添加DIPEA(1.512μL，8.68μmol)。将混合物在室温下搅拌4小时并且然后在真空中浓缩。将所得残余物通过RP-HPLC(C18柱，CH3CN/H2O)纯化。将含有所需产物的级分冷冻并且冻干，得到马来酰亚胺，化合物D7(3.5mg，68％产率)。LCMS＝4.61分钟(15分钟方法)。MS(m/z)：1062.8(M+1)+。
实施例2.抗体结合至示例性接头-效应物试剂
抗体试剂
使用标准分子克隆程序，将编码先前描述的人源化MOV19抗体(huMOV19，以引用的方式并入本文中的美国专利号8,557,966)的重链的表达载体诱变，使得所表达的蛋白质在重链CH3结构域的EU/OU编号位置442处包含半胱氨酸残基。使用人类IgG1抗体的现有程序，在哺乳动物细胞中表达huMOV19-HC-C442IgG1变体(或简称huMOV19-C442)并且从哺乳动物细胞纯化。使用类似程序来克隆、表达并且纯化携带相同半胱氨酸442突变的huCD123-6G抗体的多个变体(例如，huCD123-6Gv1.1-C442和huCD123-6Gv4.7-C442)。2015年6月29日提交的标题为“ANTI-CD123ANTIBODIES AND CONJUGATES AND DERIVATIVES THEREOF”的美国临时申请号62/186，161中详细描述了这些huCD123-6抗体，所述临时申请的全部内容(包括所有蛋白质和核酸序列以及图式)以引用的方式并入本文中。
A.huMOV19-C442-Mal-CX1-1-DM1
使用标准蛋白质化学程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基(在重链CH3区的C442位置处)的huMOV19-C442抗体。向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH 6.0中的溶液中添加N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和8摩尔当量的Mal-CX1-1-DM1(参见WO2014/134486)作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mMEDTA pH 6.0中的10％v/v DMA的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行过夜。
Figure BDA0001530936520001231
在以上所示C442残基的游离硫醇基与Mal-CX1-1-DM1的马来酰亚胺基(Mal)基团之间形成共价键之后，使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至10mM琥珀酸酯、250mM甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22μm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有平均2mol DM1/mol抗体；根据SEC具有99.3％单体；并且根据HISEP柱上的HPLC所述结合物不具有可检测的未结合的DM1。图1A中示出了去糖基化结合物的LC-MS。
B.huMOV19-C442-Mal-SPDB-DM4
使用标准程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基(在重链CH3区的C442位置处)的huMOV19抗体。向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH 6.0中的溶液中添加N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和6摩尔当量的Mal-SPDB-DM4(参见WO2014/134483)作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mM EDTA pH6.0中的10％v/v DMA的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行过夜。
Figure BDA0001530936520001232
使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至10mM琥珀酸酯、250mM甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22μm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有2mol DM4/mol抗体；根据SEC具有99.5％单体；并且根据HISEP柱上的HPLC具有0.8％未结合的DM4。图1B中示出了去糖基化结合物的LC-MS。
C.huMOV19-C442-D5
使用标准程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基(在重链CH3区的C442位置处)的huMOV19抗体。向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH 6.0中的溶液中添加N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、丙二醇以及8摩尔当量的化合物D5作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mM EDTA pH 6.0中的2％v/v DMA和38％v/v丙二醇的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行24小时。
使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％蔗糖、0.01％吐温-20、50μM亚硫酸氢钠pH 6.2配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22lμm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有平均2mol D5/mol抗体；根据SEC具有94.6％单体；并且根据SEC/逆相HPLC具有0.8％未结合的D5。图1C中示出了去糖基化结合物的LC-MS。
D.huMOV19-C442-D4
使用标准程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基(在重链CH3区的C442位置处)的huMOV19抗体。向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH 6.0中的溶液中添加N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、丙二醇以及6摩尔当量的D4作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mM EDTA pH 6.0中的2％v/v DMA和38％v/v丙二醇的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行24小时。
使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％蔗糖、0.01％吐温-20、50μM亚硫酸氢钠pH 6.2配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22μm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有平均2mol D4/mol抗体；根据SEC具有92.1％单体；并且根据SEC/逆相HPLC具有0.3％未结合的D4。图1D中示出了去糖基化抗体的LC-MS。
E.huCD123-6Gv1.1S2-C442-D7
使用标准程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基(在重链CH3区的C442位置处)(和重链上的工程化N末端Ser)的huCD123抗体。向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH 6.0中的溶液中添加N，，N-二甲基乙酰胺(DMA)、丙二醇以及10摩尔当量的化合物D7作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mMEDTA pH 6.0中的2％v/v DMA和38％v/v丙二醇的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行24小时。
使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％蔗糖、0.01％吐温-20、50μM亚硫酸氢钠pH 6.2配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22μm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有2mol D7/mol抗体；根据SEC具有97.2％单体；并且根据SEC/逆相HPLC具有1.9％未结合的D7。图1E中示出了去糖基化结合物的LC-MS。
F.huCD123-6Gv4.7-C442-D5/huCD123-6Gv4.6-C442-D5
使用标准程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基的huCD123抗体(huCD123-6Gv4.7-C442或huCD123-6Gv4.6-C442)。两种huCD123抗体均在重链CH3区中的EU/OU编号位置442处具有工程化Cys残基，并且仅在距离重链N-末端第2个残基处不同(即，对于huCD123-6Gv4.7-C442为Val；而对于huCD123-6Gv4.6-C442则为Phe)。
向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH6.0中的溶液中添加N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、丙二醇以及10摩尔当量的化合物D5作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mM EDTA pH 6.0中的2％v/v DMA和38％v/v丙二醇的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行24小时。
使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％蔗糖、0.01％吐温-20、50μM亚硫酸氢钠pH 6.2配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22μm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有平均2mol D5/mol抗体；并且根据SEC具有94.8％单体。图1F中示出了去糖基化结合物的LC-MS。
G.huCD123-6Gv4.7-C442-D4/huCD123-6Gv4.6-C442-D4
使用标准程序制备携带呈还原状态的两个不成对半胱氨酸残基的huCD123抗体(huCD123-6Gv4.7-C442和huCD123-6Gv4.6-C442，参见上文)。
向此中间体于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mM N，N，N’，N’-乙二胺四乙酸(EDTA)pH6.0中的溶液中添加N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、丙二醇以及5摩尔当量的化合物D4作为于DMA中的储备溶液，得到具有于PBS 5mMEDTA pH6.0中的2％v/v DMA和38％v/v丙二醇的最终溶剂组成的反应混合物。使反应在25℃下进行6小时。
使用Sephadex G25脱盐柱将结合物纯化至20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％蔗糖、0.01％吐温-20、50μM亚硫酸氢钠pH 6.2配制缓冲液中，通过穿过具有10kDa分子量截断值的膜超滤而浓缩，并且经0.22μm注射器过滤器过滤。然后用相同缓冲液使用具有10kDa分子量截断值的膜将结合物透析。
通过UV-Vis发现所述结合物具有1.8mol D4/mol抗体；并且根据SEC具有97.4％单体。图1G中示出了去糖基化结合物的LC-MS。
图8显示huCD123-6Gv4.7抗体经由Cys-键联结合至D4和D5化合物仅轻微影响所述结合物的结合亲和力。
实施例3.huCD123-6Rv1.1-C442-D5对表达CD123的细胞的体外效能
使用体外细胞毒性分析比较huCD123-6Rv1.1-C442-D5与含有相同抗体和有效负荷的赖氨酸连接结合物(huCD123-6Rv1.1-D2)杀死在细胞表面上表达CD123的细胞的能力。
对于嵌合抗CD123抗体(chCD123)，对鼠类CD123抗体的证实过的可变区氨基酸序列进行密码子优化，合成并且通过Blue Heron生物技术与人类抗体恒定区框内克隆，以分别使用用于重链和轻链的人类IgG1和κ恒定序列构建CD123抗体的嵌合型式。
在如由细胞供应商(ATCC或DSMZ)所建议的培养基中培养所述细胞系。将于100μL培养基中的2,000至10,000个细胞添加至平底96孔板的各孔中。为阻断细胞表面的Fc受体，将培养基补充100nM chKTI抗体(相同同型的抗体)。使用3倍稀释系列将结合物稀释到培养基中，并且每孔添加100μL。为确定CD123非依赖性细胞毒性的贡献，在添加测试结合物之前将CD123阻断抗体(100nM chCD123-6抗体)添加至一些孔。在各分析板中包括含有细胞和培养基但缺乏结合物的阴性对照孔以及仅含培养基的孔。对于各数据点一式三份进行分析。将板在37℃下在加湿6％CO2孵育箱中孵育4至7天。然后使用基于WST-8的细胞计数试剂盒-8(DojindoMolecular Technologies，Inc.，Rockville，MD)测定各孔中活细胞的相对数目。通过首先针对培养基背景吸光度进行校正并且然后将各值除以对照孔(未处理细胞)中的值的平均值来计算各孔中的表观细胞存活分数。将细胞存活分数针对结合物浓度绘制成半对数曲线。
数据显示对多种细胞系huCD123-6Rv1.1-C442-D5结合物至少具有与赖氨酸连接的huCD123-6Rv1.1-D2结合物一样的活性。图2中示出了使用AML细胞系EOL-1、B-ALL细胞系KOPN-8以及CML细胞系MOLM-1的细胞毒性分析的若干实例。
两种结合物均以剂量依赖性方式杀死细胞，其中对于EOL-1细胞、KOPN-8细胞以及MOLM-1细胞IC50值分别为大约0.002nM、0.005nM以及0.02nM。杀死为CD123依赖性的，因为当CD123抗原由未结合的chCD123-6抗体阻断时所述结合物对所述细胞的毒性至少低100倍。
实施例3a huCD123-6Rv1.1-C442-D5’对表达CD123的细胞的体外效能
根据实施例2中所描述的类似程序制备D5’(一种DNA交联剂)的huCD123结合物。针对各种AML祖细胞测试所得结合物的体外效能。中值IC50值在皮摩尔范围内。
实施例4.huMOV19-C442结合物对FRα+细胞系的体外效能
使用体外细胞毒性分析比较huMOV19-C442-D5和huMOV19-C442-D4与含有相同抗体和有效负荷的赖氨酸连接结合物(huMOV19-D2和huMOV19-磺基-SPDB-D1)杀死在细胞表面上表达叶酸受体α(FRα)的细胞的能力。在如由细胞供应商(ATCC或DSMZ)所建议的培养基中培养所述细胞系。向平底96孔板的各孔中添加于100μL培养基中的1,000-2,000个细胞。使用3倍稀释系列将结合物稀释到培养基中，并且每孔添加100μL。为确定FRα非依赖性细胞毒性的贡献，在添加结合物之前(“阻断”或“+B”)将一些孔中的细胞与2μM huMOV19抗体一起孵育。在各分析板中包括含有细胞和培养基但缺乏结合物的对照孔以及仅含培养基的孔。对于各数据点一式三份进行分析。将板在37℃下在加湿6％CO2孵育箱中孵育5至6天。然后使用根据制造商方案(Life Technologies)的阿尔玛蓝试剂(Alamar Blue reagent)抑或基于WST-8的细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular Technologies，Inc.，Rockville，MD)来测定各孔中活细胞的相对数目。通过首先针对培养基背景吸光度进行校正并且然后将各值除以对照孔(未处理细胞)中的值的平均值来计算各孔中的表观细胞存活分数。将细胞存活分数针对结合物浓度绘制成半对数曲线。
对多种细胞系，Cys连接的huMOV19-C442-D5结合物至少具有与Lys连接的huMOV19-D2结合物一样的活性。图3A和3B中示出了使用子***KB细胞系和转移性乳腺癌T47D细胞系的细胞毒性分析的两个实施例。两种结合物均以剂量依赖性方式杀死细胞，其中对于KB IC5o值为大约0.007-0.01 nM，而对于T47D则为0.01-0.02nM(以摩尔抗体计)。杀死为FRα依赖性的，因为当FRα抗原由未结合的huMOV19抗体阻断时所述结合物对所述细胞的毒性至少低100倍。
类似地，将huMOV19-C442-D4结合物对KB细胞进行测试并且发现至少与赖氨酸连接的huMOV19-磺基-SPDB-D1结合物一样的活性。图3C中示出了示例性细胞毒性分析。两种结合物均以剂量依赖性方式杀死细胞，其中IC50值大约为0.009-0.01 nM。杀死为FRα依赖性的，因为当FRα抗原由未结合的huMOV19抗体阻断时所述结合物对所述细胞的毒性至少低100倍。
实施例5.旁观者活性
将约50μL/孔的结合物(Cys连接的huMOV19-C442-D5结合物或Lys连接的huMOV19-D2结合物)各自在补充有热灭活10％FBS(Life Technologies)、0.1mg/mL健他霉素(gentamycin)(Life Technologies)以及βME(Life Technologies)的RPMI-1640(LifeTechnologies)中在96孔板(Falcon，圆底)中以1×10-10M和4×10-10M浓度一式六份进行稀释。在血球计上对两种300.19细胞(小鼠)表达重组FOLR1(FR1#14)或无表达载体(亲本)进行计数。将50μL/mL的每孔1000个FR1#14细胞添加至含有结合物或仅培养基的孔中，将50μL/mL的每孔2000个亲本细胞添加至含有结合物或仅培养基的孔中，并且将FRI#14与亲本细胞两者一起添加至含有结合物或仅培养基的孔中。将所有板在具有5％CO2的37℃孵育箱中孵育4天。总体积为每孔150μL。在孵育之后，通过每孔添加75μLCell Titer Glo(Promega)并且使其显影30分钟来分析细胞活力。在光度计上读取发光并且从所有值中扣除仅含有培养基的孔中的背景。使用Graph Pad Prism绘制各细胞处理的平均值的柱状图。
如在图4A和4B中所示，Cys连接的huMOV19-C442-D5结合物和Lys连接的huMOV19-D2结合物显示对邻近抗原阴性细胞的有效旁观者杀伤。
实施例6.huMOV19-C442-D5于NCI-H2110小鼠异种移植物模型中的体内功效
在所建立的非小细胞肺癌(NSCLC)的皮下异种移植物模型中评估huMOV19-C442-D5的抗肿瘤活性。
将SCID小鼠(24只动物)用皮下注射至小鼠右侧腹中的NCI-H2110人类NSCLC细胞(每只动物1×107个细胞)接种。当肿瘤达到约100mm3大小时(在肿瘤细胞接种后6天)，将小鼠各自基于肿瘤体积随机分成每组6只动物的处理组，并且根据下表用单次静脉内注射的huMOV19-D2或huMOV19-C442-D5处理，各自两个剂量。
1.媒介物对照
2.huMOV19-D2(Lys-连接的)2.7μg/kg静脉内，单次
3.huMOV19-D2(Lys-连接的)8.9μg/kg静脉内，单次
4.huMOV19-C442-D52.6μg/kg静脉内，单次
5.huMOV19-C442-D58.7μg/kg静脉内，单次
基于D2或D5浓度给予剂量。在较高剂量下，所有ADC皆针对NCI-H2110异种移植物具相同程度的高度活性(平均T/C＝1％-2％，第22天)，在6只动物中6只完全消退。在较低剂量下，两种ADC均具类似程度的活性，其中huMOV19-D2产生平均T/C＝32％(第22天)，而huMOV19-C442-D5产生平均T/C＝39％(第22天)。
参见下表中总结的结果。还参见图5。
Figure BDA0001530936520001311
所述结果证实，所测试的所有结合物在NCI-H2110NSCLC异种移植物模型中皆具类似活性，与结合物类型或结合位点无关。
实施例7.小鼠中huMOV19-C442-D5的药代动力学
在雌性CD1小鼠中评估huMOV19-C442-D5的药代动力学。大约7周龄的雌性CD1小鼠(9只动物)接受2.5mg/kg huMOV19-C442-D5的单次静脉内注射。然后在以下时间点从眶后窦收集血液：第2和30分钟；第2、4以及8小时；第1、2、3、5、7、10、14、21以及28天。以旋转方式收集样品，其中每个时间点n＝3只动物，并且在24小时内动物采样不超过两次。将血液样品离心并且将血浆倾析至聚丙烯管中，然后在-80℃下储存直到分析为止。
使用涂覆有用于捕获的山羊抗人类IgG和用于检测的连接至辣根过氧化物酶的抗人类IgG Fc的板用ELISA分析测定huMOV19抗体的血浆浓度。所述分析的定量极限为1.6ng/mL。使用涂覆有抗吲哚啉并苯并二氮杂卓化合物抗体的板用ELISA分析测定连接至人类IgG的D5的血浆浓度，并且使用如用于上述抗体分析的相同抗人类IgG Fc/辣根过氧化物酶试剂检测。此分析的LOQ为1.0ng/mL。对于各时间点，报导来自三种个别动物样品中的每一种的平均血浆浓度。
如图6中所示，所述结合物具有与未结合抗体类似的药代动力学型态。
实施例8.单次剂量huMOV19-C442-D5在雌性CD-1小鼠中的急性耐受性
从查尔斯河实验室(Charles River Laboratory)收到7周龄雌性CD-1小鼠。在到达之后在研究开始之前将小鼠圈养至少7天的驯化周期。使用每组2只小鼠，基于D5浓度在175μg/kg(图7A)或218μg/kg(图7B)huMOV19-C442-D5剂量下进行先导耐受性实验，以便测定完全MTD研究的适当剂量。
对于MTD研究，基于体重将动物随机分到各组(n＝8)中。小鼠接受单次静脉内施用媒介物对照(0.1mL/小鼠)或基于D5浓度153、175或218μg/kg huMOV19-C442-D5。用配备有27号1/2英寸针的1.0mL注射器静脉内进行药物的施用。每日测量体重持续至少一周，并且然后每周至少两次持续实验剩余部分。如下以相对于处理前体重体重的变化百分比形式表示小鼠的体重(BW)：
BW变化％＝[(BW后/BW前)-1]×100
其中“BW后”为处理后的重量，而“BW前”为处理前的起始体重。
最低点的体重损失(BWL)百分比以处理后体重的平均变化表示。如果在研究中的任一点体重下降超过初始的20％，那么杀死动物(1)。如果(2)一个或两个后肢麻痹或如果(3)动物太不适以致不能够到食物和水，也杀死小鼠。
Figure BDA0001530936520001341
Figure IDA0001530936560000011
Figure IDA0001530936560000021
Figure IDA0001530936560000031
Figure IDA0001530936560000041
Figure IDA0001530936560000051
Figure IDA0001530936560000061
Figure IDA0001530936560000071
Figure IDA0001530936560000081
Figure IDA0001530936560000091
Figure IDA0001530936560000101
Figure IDA0001530936560000111
Figure IDA0001530936560000121
Figure IDA0001530936560000131

Claims (28)

1.一种抗体-细胞毒性剂结合物，所述抗体-细胞毒性剂结合物由下式表示：
Figure FDA0003145028560000011
或其药学上可接受的盐，其中：
(i)Ab为在所述抗体的重链的EU/OU编号位置442处具有半胱氨酸残基的抗体，并且经由所述半胱氨酸残基的硫醇基S442共价连接于连接部分JCB’；
(ii)JCB’为
Figure FDA0003145028560000012
其中s1为共价连接于所述半胱氨酸残基的位点，并且s2为共价连接于所述基团L的位点；
(iii)-L-由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000013
其中：
s3为共价连接于JCB’的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
R23和R24为H；
m’为1与6之间的整数；
Rh’为H；
(iv)D为共价连接于接头L的细胞毒性剂，所述接头共价连接于JCB’，其中D由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000021
其中：
L”和L”’均为H；并且L’由以下结构式表示：
-NR5-P1-C(＝O)-(CRaRb)s-C(＝O)- (B1’)；或
-NR5-P1-C(＝O)-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)- (B2’)；
R5为–H；
P1为含有2至5个氨基酸残基的肽；
Ra和Rb在每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或为-SO3H或其药学上可接受的盐的基团Q；
s为1至6的整数；
s1’为0或1至6的整数；并且
Cy为环己烷；
G为–CH-；
N与C之间的双线
Figure FDA0003145028560000032
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H；而当它为单键时，X1为-H，并且Y1为-OH或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H；
R6为-OMe；
X1’与Y1’均为-H；
A和A’为-O-；并且
M为H+、Na+或K+；并且
(v)w为1或2。
2.如权利要求1所述的结合物，其中位置442处的所述半胱氨酸残基是重组引入所述Ab中。
3.如权利要求1所述的结合物，其中-JCB’-L-由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000031
4.如权利要求1所述的结合物，其中Ra与Rb均为H。
5.如权利要求1所述的结合物，其中s1’为0或1。
6.如权利要求1所述的结合物，其中P1为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:14)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:15)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:16)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met或Met-Ala。
7.如权利要求6所述的结合物，其中P1为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
8.如权利要求1所述的结合物，其中N与C之间的双线
Figure FDA0003145028560000042
表示双键。
9.如权利要求1所述的结合物，其中D由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000041
10.如权利要求1所述的结合物，其中所述结合物由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000051
或其药学上可接受的盐。
11.如权利要求1所述的结合物，其中w为2。
12.一种化合物，所述化合物由以下结构式表示：
D-L-JCB，
或其药学上可接受的盐，其中：
D由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000061
或其药学上可接受的盐，其中：
L”和L”’为H；并且L’由以下结构式表示：
-NR5-P1-C(＝O)-(CRaRb)s-C(＝O)- (B1’)；或
-NR5-P1-C(＝O)-Cy-(CRaRb)s1’-C(＝O)- (B2’)；
其中：
Ra和Rb在每次出现时各自独立地为-H、(C1-C3)烷基或为-SO3H或其药学上可接受的盐的基团Q；
s为1至6的整数；
s1’为0或1至6的整数；并且
Cy为环己烷；
R5为–H；
P1为含有2至5个氨基酸残基的肽；
G为–CH-；
N与C之间的双线
Figure FDA0003145028560000062
表示单键或双键，其限制条件为当它为双键时，X1不存在并且Y1为-H，而当它为单键时，X1为-H，并且Y1为-OH或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’皆为-H；
R6为-OMe；
X1’与Y1’均为-H；
A和A’为-O-；并且
M为H+、Na+或K+；
-L-由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000071
其中：
s3为共价连接于JCB的位点，并且s4为共价连接于D的位点；
R23和R24在每次出现时独立地为H；
m’为1与6之间的整数；
Rh’为H；并且
JCB为
Figure FDA0003145028560000072
13.如权利要求12所述的化合物，其中Ra与Rb均为H。
14.如权利要求12所述的化合物，其中s1’为0或1。
15.如权利要求12所述的化合物，其中P1选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:14)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:15)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:16)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met以及Met-Ala。
16.如权利要求15所述的化合物，其中P1为Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala以及D-Ala-D-Ala。
17.如权利要求12所述的化合物，其中N与C之间的双线
Figure FDA0003145028560000082
表示双键。
18.如权利要求12所述的化合物，其中D由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000081
Figure FDA0003145028560000091
或其药学上可接受的盐。
19.如权利要求12所述的化合物，其中-L-JCB由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000092
20.如权利要求12所述的化合物，其中所述化合物由以下结构式表示：
Figure FDA0003145028560000093
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至11中任一项所述的结合物和药学上可接受的载体。
22.权利要求1-11中任一项所述的结合物在制造用于在哺乳动物中治疗癌症的药物中的用途。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述癌症为血液***癌症或实体肿瘤。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述血液***癌症为白血病或淋巴瘤。
25.如权利要求23所述的用途，其中所述实体肿瘤为黑素瘤、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、***癌或子***。
26.如权利要求24所述的用途，其中所述血液***癌症为急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
27.如权利要求24所述的用途，其中所述血液***癌症为急性B淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。
28.如权利要求25所述的用途，其中所述实体肿瘤为非小细胞肺癌。
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