CN107699533A - 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌,属于遗传工程领域。是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP‑PxylA‑glmS‑P43‑GNA1为出发菌株,在基因组上整合强组成型启动子Pveg控制的磷酸酶yqaB基因,并将6‑磷酸氨基葡萄糖合酶的启动子替换为了强组成型启动子Pveg,得到了积累乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌基因工程菌BSGNY‑Pveg‑glmS‑P43‑GNA1。3L发酵罐乙酰氨基葡萄糖产量达到60.5g/L,乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖,生产强度为0.983g/L/h,实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高,并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的,属于遗传工程领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖,广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中,乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体,其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此,乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外,乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前,乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产,此方法产生的废液对环境污染较为严重,而且得到的产品易引起过敏反应,不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主,其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此,运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而,专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1)存在产量不高、产物转化率较低的缺点。因此,提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量,是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。因此,提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量,是提高乙酰氨基葡萄糖产量亟待解决的问题。目前枯草芽孢杆菌中催化乙酰氨基葡萄糖合成途径的最后一步反应,即6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的酶尚不清楚。据报道在酿酒酵母中表达来自于大肠杆菌的HAD-like家族的三个磷酸酶后对乙酰氨基葡萄糖的合成都有明显的促进作用;而以大肠杆菌作为宿主菌时只需强化6-磷酸氨基葡萄糖合酶glmS与6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因GNA1便可达到很高的乙酰氨基葡萄糖产量,很可能是因为其周质空间中存在丰富的磷酸酶可以催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。而枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,其不存在大肠杆菌那样的周质空间结构,因此推测在重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1中6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的反应可能为其合成乙酰氨基葡萄糖的限速步骤。枯草芽孢杆菌中有一些组成型启动子其表达强度不会受到环境因素的影响,其中启动子Pveg强度较强,具体参见文献GUIZIOU S等.A part toolbox to tune genetic expression inBacillus subtilis[J].Nucleic Acids Research,2016,44(15):gkw624。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌,所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqaB,并强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS。
在本发明的一种实施方式中,所述整合表达磷酸酶基因yqaB是以强组成型启动子Pveg控制磷酸酶基因yqaB表达,通过同源重组替换将其整合在基因组上。
在本发明的一种实施方式中,所述磷酸酶基因yqaB表达的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
在本发明的一种实施方式中,强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS是将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子PxylA替换为强组成型启动子Pveg。
在本发明的一种实施方式中,所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1是以枯草芽孢杆菌168为基础,基因型作如下改造得到的:ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpt aΔglcKΔpckAΔpyk::lox72,并以木糖诱导启动子PxylA调控表达glmS、在质粒上以启动子P43调控表达GNA1的重组表达。
在本发明的一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP,是申请号为201510761678.6的专利申请中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP。
在本发明的一种实施方式中,是以BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1为出发菌株,通过同源重组在基因组nagAB位点以强启动子Pveg控制磷酸酶基因yqaB表达;并将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子替换为强组成型启动子Pveg。
本发明的第二个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中,所述应用是将生产菌株活化后,以5-10%的接种量转入发酵培养基,35-38℃、500-900rpm条件下培养50-72h。
本发明的有益效果:
本发明通过过表达6-磷酸氨基葡萄糖糖合酶glmS,加强6-磷酸氨基葡萄糖糖合成的反应,细胞生长得到恢复,且乙酰氨基葡萄糖的产量及得率均有较大提高,解决了因强化反应后会竞争性的利用胞内细胞壁合成的前体物质6-磷酸氨基葡萄糖,从而导致的对细胞生长产生的不利影响。
本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖,其在3L发酵罐上产量可达到60.5g/L,同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌3L发酵乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖,生产强度为0.983/L/h,实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高,并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
附图说明
图1为不同组成型启动子对调控yqaB表达的影响;
图2为不同组成型启动子对调控glmS表达的影响。
具体实施方式
种子培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。
摇瓶发酵培养基(g/L):胰蛋白胨6,酵母粉12,(NH4)SO46,K2HPO4·3H2O 12.5,KH2PO42.5,CaCO35,微量元素10ml/L;微量元素溶液按g/L计含有:MnSO4·5H2O 1.0,CoCl2·6H2O 0.4,NaMoO4·2H2O 0.2,ZnSO4·7H2O 0.2,AlCl3·6H2O 0.1,CuCl2·H2O 0.1,H3BO40.05,含5M HCl。
上罐发酵培养基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉20,K2HPO4·3H2O 12.5,KH2PO42.5,CaCO35,微量元素10ml/L;微量元素溶液按g/L计含有:MnSO4·5H2O 1.0,CoCl2·6H2O 0.4,NaMoO4·2H2O 0.2,ZnSO4·7H2O 0.2,AlCl3·6H2O 0.1,CuCl2·H2O 0.1,H3BO40.05,含5MHCl。
乙酰氨基葡萄糖的测定方法:
高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent 1260,RID检测器,HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA),流动相:5mM H2SO4,流速0.6mL/min,柱温35℃,进样体积为10μL。
乙酰氨基葡萄糖得率的计算:
乙酰氨基葡萄糖得率(YGlcNAc/Glc)=乙酰氨基葡萄糖产量(g/L)/消耗的葡萄糖(g/L)。
实施例1:构建重组枯草芽孢杆菌BSGNY-PxylA-glmS-P43-GNA1
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)的nagAB基因的上下游序列以及磷酸酶编码基因yqaB(核苷酸序列如NCBI-Gene ID:945776),终止子λT0、强组成型启动子Pveg、以及氯霉素抗性基因的序列,构建序列如SEQ ID NO.1所示表达盒,将磷酸酶yqaB整合到基因组的nagAB位点并使用强组成型启动子Pveg进行表达。
将构建好的表达盒转化BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1(即专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP),通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证,确认得到重组枯草芽孢杆菌BSGNY-PxylA-glmS-P43-GNA1。将质粒pTSC(南京农业大学,闫新博士惠赠,NCBI accession no.EU864234)转化重组枯草芽孢杆菌BSGNY,消除氯霉素抗性。
实施例2:构建重组枯草芽孢杆菌BSGNY-Pveg-glmS-P43-GNA1
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)的glmS基因的及其上游序列,终止子λT0、强组成型启动子Pveg、以及氯霉素抗性基因的序列,构建序列如SEQ ID NO.2所示的glmS启动子替换框,将glmS原有的启动子替换为强组成型启动子Pveg。将构建好的替换框转入实施例一中的重组枯草芽孢杆菌BSGNY-PxylA-glmS-P43-GNA1,通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证,确认得到重组枯草芽孢杆菌BSGNY-Pveg-glmS-P43-GNA1。将质粒pTSC(南京农业大学,闫新博士惠赠,NCBI accession no.EU864234)转化重组枯草芽孢杆菌BSGNY-Pveg-glmS-P43-GNA1,消除氯霉素抗性。
实施例3:重组枯草芽孢杆菌BSGNY-Pveg-glmS-P43-GNA1发酵生产乙酰氨基葡萄糖
采用实施例2构建得到的重组芽孢杆菌进行3L发酵罐水平的验证,将37℃、220rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入上罐发酵培养基,于3L发酵罐、35-37℃、500-900rpm条件下培养52-72h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到60.5g/L,同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌3L发酵乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖,生产强度为0.983g/L/h(结果如表1所示),实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高,并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
表1过表达yqaB与glmS前后细胞生长和乙酰氨基葡萄糖合成情况
对照例1:采用不同组成型启动子调控yqaB的表达
由于磷酸酶yqaB的表达会对菌体生长产生一定的抑制作用,故利用实施例1的方式构建整合框,并分别使用文献GUIZIOU S等.Apart toolbox to tune geneticexpression in Bacillus subtilis[J].Nucleic Acids Research,2016,44(15):gkw624.报道的不同强度的组成型启动子PymdA、PfbaA、PlepA、PrelA调控yqaB的表达,转化枯草芽孢杆菌后通过同源重组的方式将其整合在重组枯草芽孢杆菌基因组nagAB位点,构建得到的重组芽孢杆菌进行摇瓶发酵。培养方式如下:将37℃、220rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入摇瓶发酵培养基,两小时后加入木糖进行诱导,于37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结果见图1,当启动子的强度减弱时,对细胞生长的影响也会减小,但乙酰氨基葡萄糖的产量也随之降低,所以选择较强的启动子Pveg来调控yqaB的表达。
对照例2:采用不同组成型启动子替换glmS的启动子
采用实施例2的方式构建glmS启动子的替换框,利用启动子PymdA、PfbaA、PlepA替换重组枯草芽孢杆菌BSGNY-PxylA-glmS-P43-GNA1中glmS的启动子,构建得到的重组芽孢杆菌进行摇瓶发酵。培养方式同对照例1,发酵结果如图2所示。当glmS启动子替换为Pveg时,菌体生长得到恢复,且乙酰氨基葡萄糖在摇瓶上的产量达到15.4g/L,对葡萄糖的得率为0.312g/g,而替换为启动子PymdA时产量略低于Pveg,替换为PfbaA和PlepA时产量均较对照有所降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3944
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatgatgact gcaagatttc ggcctgggcg gacgggaatc gtcagttttg taatttctgt 60
atcaatgatt ttcatggtct cttcctcaag tccgagccgg tcgtattgct tgccctgctc 120
ccagagttca agattcatga caatcgtgat tcgtttattg cttctgaccg cgccagcgcc 180
aaatagcgtc atcacattga taatgccaag gcccctgatc tcaagaaggt gctcaattaa 240
ttccggagcg tttcccacaa gagtatcctg atcctcctgc cgtatttcaa cgcaatcatc 300
ggcaacaagg cgatgccctc ttttcacaag ctctagcgct gtttcgcttt ttccgacgcc 360
gctttttcct gtgatcagca cgccgacacc atatatatcg acaagaacgc catgaattgc 420
tgtggtaggc gccagcctgc tctcaaggaa gttggttaaa cggcttgaca gtcttgtcgt 480
tttcagcggc gatctgagga caggcacccc atttttctcg gaggcgtcaa tcagctcctg 540
cgggatgggc atatctctag aaagaataat agctggtgtt acatcagtgc acagagaatc 600
cattcgctgc tttttctcct cttcaggaag ctgttcaaag aaagaaagct ctgtttttcc 660
gagaagctgc acgcgctccc tcgggtaata tgtaaaatat ccggcaattt caatacctgg 720
tcttgatagg tcactcattg taatcgggcg gttaattcct tcttctccgc tgattaattc 780
caaattgaac tgttccatta cgtcttttgt gcgaaccttt gccacgatat gttcctcctg 840
ttccgggctg ccccgagctt gctcacaata ctttcatttt atcactttcg ggcttgaacc 900
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<210> 2
<211> 3433
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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ataccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatgccat agtgactggc gatgctgtcg 1080
gaatggacga cggcaatagt tacccttatt atcaagataa gaaagaaaag gatttttcgc 1140
tacgctcaaa tcctttaaaa aaacacaaaa gaccacattt tttaatgtgg tcttttattc 1200
ttcaactaaa gcacccatta gttcaacaaa cgaaaattgg ataaagtggg atatttttaa 1260
aatatatatt tatgttacag taatattgac ttttaaaaaa ggattgattc taatgaagaa 1320
agcagacaag taagcctcct aaattcactt tagataaaaa tttaggaggc atatcaaatg 1380
aactttaata aaattgattt agacaattgg aagagaaaag agatatttaa tcattatttg 1440
aaccaacaaa cgacttttag tataaccaca gaaattgata ttagtgtttt ataccgaaac 1500
ataaaacaag aaggatataa attttaccct gcatttattt tcttagtgac aagggtgata 1560
aactcaaata cagcttttag aactggttac aatagcgacg gagagttagg ttattgggat 1620
aagttagagc cactttatac aatttttgat ggtgtatcta aaacattctc tggtatttgg 1680
actcctgtaa agaatgactt caaagagttt tatgatttat acctttctga tgtagagaaa 1740
tataatggtt cggggaaatt gtttcccaaa acacctatac ctgaaaatgc tttttctctt 1800
tctattattc catggacttc atttactggg tttaacttaa atatcaataa taatagtaat 1860
taccttctac ccattattac agcaggaaaa ttcattaata aaggtaattc aatatattta 1920
ccgctatctt tacaggtaca tcattctgtt tgtgatggtt atcatgcagg attgtttatg 1980
aactctattc aggaattgtc agataggcct aatgactggc ttttataata tgagataatg 2040
ccgactgtac tttttacagt cggttttcta acgatacatt aataggtacg aaaaagcaac 2100
tttttttgcg cttaaaacca gtcataccaa taaataactt cgtatagcat acattatacg 2160
aacggtacgg aattccgctg ataggtggta ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt 2220
tttatttttg tcaaaataat tttattgaca acgtcttatt aacgttgata taatttaaat 2280
tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta caataaatgt ggagaaaaac tagtagtgat 2340
agcgccaaaa aacatgtagg aggggacgat tgaaagtccc cttgaaattt gactttcttc 2400
gtctcctttt acaatcttag gaggaagaaa aatatgtgtg gaatcgtagg ttatatcggt 2460
cagcttgatg cgaaggaaat tttattaaaa gggttagaga agcttgagta tcgcggttat 2520
gactctgctg gtattgctgt tgccaacgaa cagggaatcc atgtgttcaa agaaaaagga 2580
cgcattgcag atcttcgtga agttgtggat gccaatgtag aagcgaaagc cggaattggg 2640
catactcgct gggcgacaca cggcgaacca agctatctga acgctcaccc gcatcaaagc 2700
gcactgggcc gctttacact tgttcacaac ggcgtgatcg agaactatgt tcagctgaag 2760
caagagtatt tgcaagatgt agagctcaaa agtgacaccg atacagaagt agtcgttcaa 2820
gtaatcgagc aattcgtcaa tggaggactt gagacagaag aagcgttccg caaaacactt 2880
acactgttaa aaggctctta tgcaattgct ttattcgata acgacaacag agaaacgatt 2940
tttgtagcga aaaacaaaag ccctctatta gtaggtcttg gagatacatt caacgtcgta 3000
gcatctgatg cgatggcgat gcttcaagta accaacgaat acgtagagct gatggataaa 3060
gaaatggtta tcgtcactga tgaccaagtt gtcatcaaaa accttgatgg tgacgtgatt 3120
acacgtgcgt cttatattgc tgagcttgat gccagtgata tcgaaaaagg cacgtaccct 3180
cactacatgt tgaaagaaac ggatgagcag cctgttgtta tgcgcaaaat catccaaacg 3240
tatcaagatg aaaacggcaa gctgtctgtg cctggcgata tcgctgccgc tgtagcggaa 3300
gcggaccgca tctatatcat tggctgcgga acaagctacc atgcaggact tgtcggtaaa 3360
caatatattg aaatgtgggc aaacgtgccg gttgaagtgc atgtagcgag tgaattctcc 3420
tacaacatgc cgc 3433
<210> 3
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Tyr Glu Arg Tyr Ala Gly Leu Ile Phe Asp Met Asp Gly Thr Ile
1 5 10 15
Leu Asp Thr Glu Pro Thr His Arg Lys Ala Trp Arg Glu Val Leu Gly
20 25 30
His Tyr Gly Leu Gln Tyr Asp Ile Gln Ala Met Ile Ala Leu Asn Gly
35 40 45
Ser Pro Thr Trp Arg Ile Ala Gln Ala Ile Ile Glu Leu Asn Gln Ala
50 55 60
Asp Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Arg Glu Lys Thr Glu Ala Val Arg
65 70 75 80
Ser Met Leu Leu Asp Ser Val Glu Pro Leu Pro Leu Val Asp Val Val
85 90 95
Lys Ser Trp His Gly Arg Arg Pro Met Ala Val Gly Thr Gly Ser Glu
100 105 110
Ser Ala Ile Ala Glu Ala Leu Leu Ala His Leu Gly Leu Arg His Tyr
115 120 125
Phe Asp Ala Val Val Ala Ala Asp His Val Lys His His Lys Pro Ala
130 135 140
Pro Asp Thr Phe Leu Leu Cys Ala Gln Arg Met Gly Val Gln Pro Thr
145 150 155 160
Gln Cys Val Val Phe Glu Asp Ala Asp Phe Gly Ile Gln Ala Ala Arg
165 170 175
Ala Ala Gly Met Asp Ala Val Asp Val Arg Leu Leu
180 185
Claims (9)
1.一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqaB,并强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS。
2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述整合表达磷酸酶基因yqaB是以强组成型启动子Pveg控制磷酸酶基因yqaB表达,通过同源重组替换将其整合在重组枯草芽孢杆菌基因组上。
3.根据权利要求2所述重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述磷酸酶基因yqaB表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS是将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子替换为强组成型启动子Pveg。
5.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1为出发菌株。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1是以枯草芽孢杆菌168为基础,基因型作如下改造得到的:ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72,并以木糖诱导启动子PxylA调控表达glmS、在质粒上以启动子P43调控GNA1的重组表达。
7.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。
9.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述应用是将生产菌株活化后,以5-10%的接种量转入发酵培养基,35-38℃、500-900rpm条件下培养50-72h。
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Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108330095A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-07-27 | 江南大学 | 一种积累n-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN108424868A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-08-21 | 江南大学 | 一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 |
CN108441461A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-08-24 | 江南大学 | 一种利用人工双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 |
CN108486025A (zh) * | 2018-04-02 | 2018-09-04 | 山东润德生物科技有限公司 | 重组枯草芽孢杆菌及应用 |
CN108504678A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-07 | 江南大学 | 一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法 |
CN108517330A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-11 | 江南大学 | 一种敲除ybbD提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖的方法 |
CN108531436A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-14 | 江南大学 | 一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用 |
CN112877272A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法 |
WO2021175759A1 (en) * | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Basf Se | Method for the production of constitutive bacterial promoters conferring low to medium expression |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104195094A (zh) * | 2014-08-01 | 2014-12-10 | 张帆 | 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
US20150376610A1 (en) * | 2014-06-30 | 2015-12-31 | Korea University Research And Business Foundation | Method for screening mutant microorganism overproducing target metabolite using synthetic suicide genetic circuit |
CN105255803A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-20 | 江南大学 | 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 |
-
2017
- 2017-10-12 CN CN201710948044.0A patent/CN107699533A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150376610A1 (en) * | 2014-06-30 | 2015-12-31 | Korea University Research And Business Foundation | Method for screening mutant microorganism overproducing target metabolite using synthetic suicide genetic circuit |
CN104195094A (zh) * | 2014-08-01 | 2014-12-10 | 张帆 | 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 |
CN105255803A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-20 | 江南大学 | 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JARA等: "The Bacillus BioBrick Box: generation and evaluation of essential genetic building blocks for standardized work with Bacillus subtilis", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL ENGINEERING》 * |
徐小芳: "乙酰氨基葡萄糖合成关键酶GlmS和Gna1的筛选及催化动力学分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)工程科技I辑》 * |
王利群等: "《生物技术》", 31 December 2010, 东南大学出版社 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108330095A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-07-27 | 江南大学 | 一种积累n-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN108330095B (zh) * | 2018-03-01 | 2020-12-29 | 江南大学 | 一种积累n-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN108424868A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-08-21 | 江南大学 | 一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 |
CN108441461A (zh) * | 2018-03-22 | 2018-08-24 | 江南大学 | 一种利用人工双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 |
CN108424868B (zh) * | 2018-03-22 | 2020-11-03 | 江南大学 | 一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 |
CN108486025A (zh) * | 2018-04-02 | 2018-09-04 | 山东润德生物科技有限公司 | 重组枯草芽孢杆菌及应用 |
WO2019191855A1 (zh) * | 2018-04-02 | 2019-10-10 | 山东润德生物科技有限公司 | 重组枯草芽孢杆菌及应用 |
CN108504678A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-07 | 江南大学 | 一种提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖产量的方法 |
CN108517330A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-11 | 江南大学 | 一种敲除ybbD提高重组枯草芽孢杆菌几丁寡糖的方法 |
CN108531436A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-14 | 江南大学 | 一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用 |
WO2021175759A1 (en) * | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Basf Se | Method for the production of constitutive bacterial promoters conferring low to medium expression |
CN112877272A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法 |
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