CN107660212A - 抗‑cd303单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及嵌合或人源化的抗CD303抗体、编码这些抗体的重链和轻链的核酸、表达所述抗体的表达载体、宿主细胞、转基因非人动物或转基因植物、及其用于治疗或预防母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)或涉及浆细胞样树突细胞的炎性疾病,尤其是自身免疫疾病的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防CD4+CD56+表型的造血***肿瘤 (hematopoietictumor)或涉及浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)的炎性疾病,特别是自身免疫性疾病,的治疗性抗体领域。本发明涉及针对 CD303抗原的五种单克隆抗体及其功能片段和衍生物、编码该抗体的重链和/或轻链的核酸、表达所述抗体的表达载体、宿主细胞、转基因非人动物或转基因植物、以及涉及所述抗体的治疗用途。
背景技术
树突细胞(在本说明书中称为“DC”)是免疫***的抗原提呈细胞 (APC)。在某些条件下,DC具有类似于神经元树突的细胞质突起。
树突细胞有两个主要功能:
·树突细胞通过将外源抗原提呈给T淋巴细胞,引发针对这些“非自身” (外源)抗原的适应性免疫应答;和
·树突细胞通过所谓的“阴性选择”过程,通过对胸腺中的T细胞进行规范来维持对“自我”的中枢耐受。
DC能够根据其接收的刺激而分化成各种亚群。DC有三种主要类型:常规DC、浆细胞样DC(称为“pDC”)和炎性DC。
常规DC在淋巴器官或外周提呈自身或非自身抗原。炎性DC可能源于血液单个核细胞,仅在炎症或感染后刺激事件中出现。
浆细胞样DC(pDC)在基础状态下是循环的、圆的、没有树突,但在活化后(通常通过病毒抗原活化)获得树突。刺激后,其产生大量I型干扰素(IFN),主要参与抗病毒反应或自身免疫性疾病。表型上,其显著特征在于以下标记物:CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+。
pDC可能是造血***肿瘤的原因,在造血***肿瘤中它们获得另外的标记物(CD56)。这称为母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)。这些肿瘤也称为CD4+CD56+造血***肿瘤。这些造血***肿瘤是罕见的 (急性白血病的1%),并且表现为与***病相关的皮肤结节或脾肿大和频繁的血细胞减少。皮肤表现之后非常快地是骨髓浸润。现在认为这些肿瘤起源的造血细胞是pDC。
目前用于这些母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤的治疗方法是基于化学疗法。虽然起初相对有效,但这种治疗的特征在于频繁和早期复发(约 9个月),中位总生存期仅为13个月左右。另一种治疗方法基于造血细胞的同种异体移植,但也不能实现长期存活。
在WO2012/080642中已经提出使用抗BDCA-2(即抗CD303)抗体通过肿瘤细胞消耗来治疗这些肿瘤。
pDC也参与(特别是通过其分泌I型IFN而参与)某些炎性疾病,特别是某些自身免疫性疾病中。
一种治疗方法是使用抗IFNα抗体。然而,这种治疗导致IFNα的全身中和,从而潜在地增加机会性感染的风险。因此,在WO01/365487和 WO2012/080642中也提出,使用抗BDCA-2(抗-CD303)抗体(特别是抗体AC144),通过去除负责局部炎症的pDC来治疗自身免疫性疾病。
然而,为了使这些治疗方法有效,需要具有允许在人体中尽可能最有效地除去pDC的合适单克隆抗体。为此,需要对CD303抗原具有高亲和力且具有使其能够在生理条件下除去pDC的效应子能力(ADCC、CDC、吞噬作用、通过Fc受体,特别是Fcγ受体III(FcγRIII,也称为CD16) 交联CD303进行的信号传导、和/或凋亡)的嵌合或人源化抗体。迄今可用的抗CD303抗体不足,因此需要具有所需性质的新抗CD303抗体。
WO2014/09339描述了由重链和轻链序列定义的人源化抗CD303抗体,特别是对CD303抗原具有最佳亲和力的抗体BIIB059。抗体BIIB059在 CHO细胞中产生,并表征了某些特性。
发明概述
在本发明的上下文中,本发明人生成了具有这样性质的五个嵌合单克隆抗体。这些嵌合抗体中的至少两个(122A2和102E9)比WO2014/09339 中描述的抗体(BIIB059)具有更强的结合人CD303抗原胞外域的能力(特别是122A2)。此外,生成并表征了源于这两个嵌合抗体的人源化抗体。这些人源化抗体可以比原始嵌合抗体以更高的生产率生产,并且在源自嵌合抗体122A2的这些人源化抗体中,某些比该原始嵌合抗体具有甚至更高的结合人CD303抗原胞外域的能力,因此也高于WO2014/09339中描述的抗体(BIIB059)的结合能力。在YB2/0细胞中产生的这些嵌合和人源化抗体也对FcγRIIIa(CD16a)具有高亲和力,即使在低抗原密度下也能诱导强的ADCC应答。这些抗体也具有CDC活性,能够抑制IFN-α和TNF-α的分泌。
因此,在第一方面,本发明涉及针对人CD303抗原(SEQ ID NO: 130)胞外域的单克隆抗体或其功能片段或衍生物,其特征在于:
a)其与至少一种选自以下的抗体竞争结合人CD303抗原:
i)重链可变区包含SEQ ID NO:43和轻链可变区包含SEQ ID NO: 48的抗体;
ii)重链可变区包含SEQ ID NO:44和轻链可变区包含SEQ ID NO: 49的抗体;
iii)重链可变区包含SEQ ID NO:45和轻链可变区包含SEQ ID NO: 50的抗体;
iv)重链可变区包含SEQ ID NO:46和轻链可变区包含SEQ ID NO: 51的抗体;
v)重链可变区包含SEQ ID NO:47和轻链可变区包含SEQ ID NO: 52的抗体;
且轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区。
本发明还涉及针对人CD303抗原(SEQ ID NO:130)胞外域的单克隆抗体或其功能片段或衍生物,其特征在于:
a)与CHO细胞中产生的针对人CD303抗原胞外域的抗体相比,其具有改善的对FcγRIIIa(CD16a)的亲和力;和
b)轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区。
本发明还涉及编码本发明抗体的重链和/或轻链、其功能片段或衍生物的核酸。
本发明还涉及包含本发明核酸的载体。
本发明还涉及包含至少一个本发明核酸或本发明载体的宿主细胞、转基因非人动物或转基因植物。
本发明还涉及根据本发明的抗体、其功能片段或衍生物用作医药产品。
根据本发明的抗体、其功能片段或衍生物可以有利地用于治疗或预防表达CD303抗原的造血***肿瘤,或用于治疗或预防炎性疾病,特别是自身免疫性疾病。
附图说明
图1.嵌合抗体122A2(A)、102E9(B)、104C12(C)、114D11(D) 和104E10(E)的表达载体和抗体BIIB059表达载体(F)的图。
图2.根据本发明的抗体的抗原结合。(A)用根据本发明的抗体以不同抗体浓度(以对数单位表示)标记的Fcγ链-CD303Jurkat细胞(表达约25,000-35,000个CD303分子/细胞)的平均荧光强度(MFI)。(B)用根据本发明的嵌合抗体以不同抗体浓度(以对数单位表示)标记的CAL-1 细胞(由BPDCN患者建立的细胞系)的平均荧光强度(MFI)。(C)用嵌合抗体122A2和102E9之一、用人源化抗体BIIB059或用无关抗体标记的CAL-1细胞(由BPDCN患者建立的细胞系,表达约3,000-6,000个CD303 分子/细胞)的平均荧光强度(MFI)。(D)用嵌合抗体122A2和102E9之一、用人源化抗体BIIB059或用无关抗体标记的CAL-1细胞(用CD303 表达载体转染并选择高表达CD303的细胞,约40,000-50,000个CD303分子/细胞)的平均荧光强度(MFI)。
图3.FcγRIIIa(CD16a)结合。(A)在竞争实验中使用藻红蛋白偶联的鼠抗CD16抗体3G8,研究了根据本发明抗体的CD16结合。抗CD16 3G8与CD16的结合(平均荧光强度值)测量为添加的根据本发明抗体的递增浓度(μg/mL)的函数。(B)在竞争实验中使用藻红蛋白偶联的鼠抗 CD16抗体3G8,研究了根据本发明的嵌合抗体ch.122A2和ch.102E9、嵌合抗体Rituxan和申请WO2014/09339中描述的人源化抗体(BIIB059) 与CD16的结合。抗CD16 3G8与CD16的结合(平均荧光强度值)测量为添加的根据本发明抗体的递增浓度(μg/mL)的函数。
图4.本发明的嵌合抗体和人源化抗体BIIB059针对Fcγ链-CD303 Jurkat细胞(A)或CAL-1细胞(B)诱导的ADCC活性。(A)由本发明嵌合抗体诱导的Fcγ链-CD303Jurkat靶细胞的ADCC裂解百分比(%裂解,如实施例2所定义),表示为抗体浓度(ng/mL,对数标度)的函数。 (B)由本发明嵌合抗体122A2和102E9以及人源化抗体BIIB059诱导的 CAL-1靶细胞的ADCC裂解百分比(%裂解,如实施例2所定义),表示为抗体浓度(ng/mL,对数标度)的函数。
图5.本发明抗体诱导的对pDC的IFN-α分泌的抑制。在10μg/mL和 0.1μg/mL本发明嵌合抗体存在下以及在无关的对照嵌合抗体存在下,由 CpG活化的纯化pDC分泌的IFN-α量(以pg/mL计)。
图6.在本发明嵌合抗体(10μg/mL)和无关对照嵌合抗体存在下,由本发明抗体诱导的对CpG活化的纯化pDC的TNF-α分泌的抑制。
图7.本发明抗体诱导的针对Fcγ链-CD303Jurkat细胞的CDC活性。由本发明嵌合抗体诱导的Fcγ链-CD303Jurkat靶细胞的CDC裂解百分比 (%裂解,如实施例2中所定义),表示为抗体浓度(ng/mL,对数标度) 的函数。
图8.空载体pCEP4(A)和人源化抗体122A2(B至H)和102E9 (I至N)的重链或轻链的表达载体的图。
图9.来自抗体102E9的人源化抗体的抗原结合。作为源自抗体102E9 的人源化抗体浓度的函数,在1.25、2.5、5、10和20ng/mL测定的450nm OD,伴有对照:单独的上清液(假模(mock))和嵌合抗体102E9。(A) 人源化抗体102E9H5、102E9H6、102E9H7、102E9H9、102E9H10和 102E9H11。(B)人源化抗体102E9H13、102E9H14和102E9H15。
图10.源自抗体102E9的人源化抗体在5ng/mL抗体下的抗原结合。比较源自102E9的人源化抗体对CD303胞外域的相对亲和力,嵌合抗体的结合为100%。表现出与嵌合抗体相似的结合的抗体(相对亲和力至少 70%)用*指出。
图11.源自抗体122A2的人源化抗体的抗原结合。作为源自抗体 122A2的人源化抗体浓度的函数,在1.75、2.5、5和10ng/mL测定的450nm OD,伴有对照:单独的上清液(假模)和嵌合抗体102E9。(A)人源化抗体122A2H5、122A2H6、122A2H9、122A2H7、122A2H10、122A2H14、 122A2H17、122A2H15,和杂合抗体122A2H3和122A2H8。(B)人源化抗体122A2H5、122A2H6、122A2H9、122A2H7、122A2H10、122A2H14、 122A2H17、122A2H13、122A2H18和122A2H11。(C)人源化杂合抗体 122A2H15和122A2H19,和抗体122A2H4、122A2H8、122A2H12、122A2H16、122A2H1、122A2H2和122A2H3。
图12.源自抗体102E9的人源化抗体在5ng/mL抗体下的抗原结合。比较源自102E9的人源化抗体对CD303胞外域的相对亲和力,嵌合抗体的结合为100%。表现出比嵌合抗体更好的结合的抗体(相对亲和力>100%) 用*表示。
图13.所选源自122A2的各种抗体以0.1μg/mL浓度(在上清液中) 对CAL-1细胞上CD303的结合:通过流式细胞仪观察平均荧光强度(MFI)。无关mAb上清液:在上清液中稀释无关mAb。hum:人源化抗体。hyb:杂合抗体。
图14.嵌合抗体122A2和源自122A2的人源化抗体对IFN-α分泌的抑制。
图15.用于在YB2/0细胞中生产的、人源化抗体122A2H5(A)、 122A2H7(B)、122A2H9(C)和122A2H10(D)的重链或轻链的表达载体图。
图16.由嵌合抗体122A2、人源化抗体122A2H9或无关抗体活化的 CD16Jurkat细胞的IL-2释放。
发明详述
抗体、功能片段或衍生物
本发明涉及针对人CD303抗原(SEQ ID NO:130)的胞外域的单克隆抗体或其功能片段或其衍生物,特征在于:
a)其与至少一个选自以下的抗体竞争结合人CD303抗原:
i)重链可变区包含SEQ ID NO:43和轻链可变区包含SEQ ID NO: 48的抗体;
ii)重链可变区包含SEQ ID NO:44和轻链可变区包含SEQ ID NO: 49的抗体;
iii)重链可变区包含SEQ ID NO:45和轻链可变区包含SEQ ID NO: 50的抗体;
iv)重链可变区包含SEQ ID NO:46和轻链可变区包含SEQ ID NO: 51的抗体;
v)重链可变区包含SEQ ID NO:47和轻链可变区包含SEQ ID NO: 52的抗体;和
b)轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区。
有利地,重链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-H(根据IMGT命名法的重链CDR),并且轻链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-L(根据IMGT命名法的轻链CDR):
i)CDR1-H家族1:SEQ ID NO:1,CDR2-H家族1:SEQ ID NO: 2,CDR3-H家族1:SEQ IDNO:3,CDR1-L家族1:SEQ ID NO:NO: 4,CDR2-L家族1:SEQ ID NO:5,CDR3-L家族1:SEQ IDNO:6;或
ii)CDR1-H家族2:SEQ ID NO:7,CDR2-H家族2:SEQ ID NO:8,CDR3-H家族2:SEQ IDNO:9,CDR1-L家族2:SEQ ID NO:10, CDR2-L家族2:SEQ ID NO:11,CDR3-L家族2:SEQ IDNO:12。下表1总结了根据本发明的两个抗体家族的CDR-IMGT氨基酸序列:
家族1 | 家族2 | |
CDR1-H | GYTFTDYS(SEQ ID NO:1) | GYTFTDXS(SEQ ID NO:7) |
CDR2-H | ISXYYGDX(SEQ ID NO:2) | INTETGXP(SEQ ID NO:8) |
CDR3-H | ARNXXXYXXXY(SEQ ID NO:3) | XRNGYYVGYYAXDY(SEQ ID NO:9) |
CDR1-L | QDIXNY(SEQ ID NO:4) | SSVXY(SEQ ID NO:10) |
CDR2-L | YTS(SEQ ID NO:5) | STS(SEQ ID NO:11) |
CDR3-L | QQGXTLPWT(SEQ ID NO:6) | QQRRSYPXT(SEQ ID NO:12) |
表1.根据IMGT命名法的根据本发明的两个抗体家族的CDR氨基酸序列。在每个序列中,X可以表示任何氨基酸。
有利地,本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-H(根据 IMGT命名法的重链CDR),并且轻链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-L(根据IMGT命名法的轻链CDR):
i)CDR1-H-122A2:SEQ ID NO:13,CDR2-H-122A2:SEQ ID NO: 14,CDR3-H-122A2:SEQ ID NO:15,CDR1-L-122A2:SEQ ID NO: 16,CDR2-L-122A2:SEQ ID NO:17,CDR3-L-122A2:SEQ ID NO: 18;
ii)CDR1-H-102E9:SEQ ID NO:19,CDR2-H-102E9:SEQ ID NO: 20,CDR3-H-102E9:SEQ ID NO:21,CDR1-L-102E9:SEQ ID NO:22, CDR2-L-102E9:SEQ ID NO:23,CDR3-L-102E9:SEQ ID NO:24;
iii)CDR1-H-104C12:SEQ ID NO:25,CDR2-H-104C12:SEQ ID NO:26,CDR3-H-104C12:SEQ ID NO:27,CDR1-L-104C12:SEQ ID NO:28,CDR2-L-104C12:SEQ ID NO:29,CDR3-L-104C12:SEQ ID NO:30;
iv)CDR1-H-114D11:SEQ ID NO:31,CDR2-H-114D11:SEQ ID NO:32,CDR3–H–114D11:SEQ ID NO:33,CDR1–L–114D11:SEQ ID NO: 34,CDR2–L–114D11:SEQ ID NO:35,CDR3–L–114D11:SEQ ID NO:36;或
v)CDR1–H–104E10:SEQ ID NO:37,CDR2–H–104E10:SEQ ID NO:38,CDR3–H–104E10:SEQ ID NO:39,CDR1–L–104E10:SEQ ID NO:40,CDR2–L–104E10:SEQ ID NO:41,CDR3–L–104E10:SEQ ID NO: 42。
有利地,本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链包含具有选自SEQ ID NO:43至47的序列或与SEQ ID NO:43至47之一具有至少80%同一性的序列的可变区。
另外或替代地,本发明抗体、其功能片段或衍生物的轻链包含具有选自SEQ IDNO:48至52的序列或与SEQ ID NO:48至52之一具有至少 80%同一性的序列的可变区。
在优选的实施方案中,本发明抗体、其功能片段或衍生物具有重链和轻链,其可变区具有以下氨基酸序列或与以下序列至少80%同一性的序列:
i)抗体122A2:重链:SEQ ID NO:43,轻链:SEQ ID NO:48,
ii)抗体102E9:重链:SEQ ID NO:44,轻链:SEQ ID NO:49,
iii)抗体104C12:重链:SEQ ID NO:45,轻链:SEQ ID NO:50,
iv)抗体114D11:重链:SEQ ID NO:46,轻链:SEQ ID NO:51,或
v)抗体104E10:重链:SEQ ID NO:47,轻链:SEQ ID NO:52。
下表2总结了根据本发明的各种抗体使用的鼠VH、JH和VL和JL 基因片段和同一性百分比。
表2.按照IMGT定义的、根据本发明的各种抗体使用的鼠VH、JH 和VL和JL片段。
下表3总结了本发明人产生的抗CD303抗体的重链和轻链CDR和可变区的氨基酸序列:
表3.根据IMGT命名法的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列,以及根据本发明抗体的VH和VL片段的氨基酸序列。
人CD303抗原是C型凝集素结构域家族4,成员C(CLEC4),也称为DLEC;HECL;BDCA2;CLECSF7;CLECSF11或PRO34150(参见 EntrezGene网站的CLEC4基因)。其是213个氨基酸的II型跨膜糖蛋白,包含没有明显信号传导基序的短细胞质结构域(氨基酸1-21)、跨膜区(氨基酸22-41)、颈结构域(氨基酸42-82)和碳水化合物识别结构域(CRD;氨基酸83-213)(Dzionek等人,2001)。编码该蛋白的mRNA序列可以在 GenBank数据库登录号AF293615.1的2002年2月14日版本中找到(SEQ ID NO:129),而氨基酸序列可以在GenBank数据库登录号AAL37036.1 的2002年2月14日版本中获得(SEQ ID NO:130)。
“抗体”或“免疫球蛋白”是指包含至少一个结合给定抗原的结构域和包含能够结合Fc受体(FcR)的Fc片段的恒定结构域的分子。在大多数哺乳动物中,如人和小鼠中,抗体由四条多肽链组成:通过可变数目的二硫键结合在一起的两条重链和两条轻链,为分子提供了柔韧性。每个轻链由恒定结构域(CL)和可变结构域(VL)组成;根据抗体的同种型,重链由可变结构域(VH)和三个或四个恒定结构域(CH1至CH3或CH1至 CH4)组成。在一些罕见的哺乳动物如骆驼和美洲驼中,抗体仅由两条重链组成,每条重链包含可变结构域(VH)和恒定区。
可变结构域参与抗原识别,而恒定结构域参与抗体的生物学、药代动力学和效应子特性。
一个抗体的可变区可以不同于另一个抗体。实际上,编码抗体重链和轻链的基因分别通过三个称为VH、DH和JH-CH的不同基因区段(对于重链)和两个称为VL和JL-CL的不同基因区段(对于轻链)的重组产生。 CH和CL区段不参与重组并分别形成重链和轻链的恒定区。VH-DH-JH 和VL-JL区段的重组分别形成重链和轻链的可变区。VH和VL区各自具有称为CDR1、CDR2和CDR3的三个高变区或互补决定区(CDR),其中CDR3位于重组区中,是最可变的。这三个CDR,特别是CDR3,存在于与抗原接触的抗体部分,因此对抗原识别非常重要。因此,保留抗体的三个CDR和重链及轻链的抗体大多保留原始抗体的抗原特异性。在一些情况中,仅保留一个CDR(特别是CDR3)的抗体也可以保留原始抗体的特异性。CDR1、CDR2和CDR3分别在对应框架区(FR)FR1、FR2和 FR3之后,框架区是在一个VH或VL区段与另一个VH或VL区段之间变化最少的。CDR3之后还跟随一个框架区FR4。
抗体的CDR通过抗体的重链和轻链氨基酸序列与本领域技术人员已知的标准相比而定义。已经提出了用于确定CDR的各种方法,根据所选择的方法,定义为CDR的抗体重链或轻链可变区氨基酸序列部分将有所不同。第一种确定方法是Kabat等人(1991)提出的方法。在该方法中,通过寻找负责抗体-抗原结合的氨基酸来定义CDR。第二种方法由IMGT 提出,其基于对高变区的确定。在该方法中,定义了独特的编号以比较可变区,而不考虑抗原受体、链类型或物种(Lefranc等人2003)。该编号提供了框架区((FR1-IMGT:位置1至26,FR2-IMGT:39至55,FR3-IMGT: 66至104,和FR4-IMGT:118至128)和互补决定区(CDR1-IMGT:位置27至38,CDR2-IMGT:位置56至65,和CDR3-IMGT:位置105至 117)的标准定义。最后,还存在称为“共同”的编号,其中具体CDR的序列对应于Kabat编号和IMGT编号之间的共同序列。在本说明书中,CDR 序列通过IMGT编号表示。特别是,通过使用http://www.imgt.org/IMGT_ vquest/share/textes/上可获得的和Brochet等人-2008中描述的IMGT/V-QUEST程序来确定CDR。
不同于可变结构域(其序列在不同抗体之间变化剧烈),恒定结构域的特征在于其氨基酸序列从一个抗体到另一个抗体非常相似、是物种和同种型特有的、任选地有少量体细胞突变。Fc片段天然地由不包括CH1结构域的重链恒定区组成,即由下铰链区和恒定结构域CH2和CH3或CH2 至CH4(依赖于同种型)组成。在人IgG1中,完整的Fc片段由从位置 226的半胱氨酸残基(C226)开始的重链C-末端部分组成,Fc片段中氨基酸残基的编号在本说明书中是EU索引的编号,其描述于Edelman等人-1969和Kabat等人-1991。其它类型免疫球蛋白的相应Fc片段可以由本领域技术人员通过序列比对容易地鉴定。
Fc片段在CH2结构域中被糖基化,在两个重链的每一个上存在与位置297的天冬酰胺残基(Asn297)结合的N-聚糖。
位于Fc中的以下结合结构域对于抗体的生物学特性是重要的:
-新生儿Fc受体(FcRn)结合结构域,其涉及抗体的药代动力学特性(体内半衰期):
不同的数据表明,位于CH2和CH3结构域界面的某些残基参与FcRn 结合。
-补体C1q蛋白结合结构域,其参与补体依赖性细胞毒性(CDC) 反应:位于CH2结构域中;
-Fc受体(FcR)结合结构域,其参与吞噬作用的反应或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)类型:位于CH2结构域中。
在本发明的上下文中,抗体的Fc片段可以是如上定义的天然的,或者可以以各种方式进行修饰,只要其包含功能性FcR(对于IgG是FcγR) 结合结构域,优选功能性FcRn结合结构域。修饰可以包括Fc片段某些部分的缺失,条件是Fc片段含有功能性FcR(对于IgG是FcγR)结合结构域,优选功能性FcRn结合结构域。修饰还可以包括能够影响抗体生物学特性的各种氨基酸取代,条件是抗体含有功能性FcR结合结构域,优选功能性FcRn结合结构域。特别地,当抗体是IgG时,其可以包含旨在增加 FcγRIIIa(CD16a)结合的突变,如WO00/42072、Shields等人–2001、 Lazar等人–2006、WO2004/029207、WO2004/063351、WO2004/074455 中所述。也可以存在用于增加FcRn结合并因此增加体内半衰期的突变,例如在Shields等人–2001、Dall’Acqua等人–2002、Hinton等人–2004、 Dall’Acqua等人–2006(a)、WO00/42072、WO02/060919、WO2010/045193 或WO2010/106180中所述。可以任选地存在其它突变,如用于降低或增加与补体蛋白的结合并因此降低或增加CDC反应的突变(参见 WO99/51642、WO2004/074455、Idusogie等人–2001、Dall’Acqua等人–2006(b)和Moore等人–2010)。
在本发明的上下文中,包含增加FcRn结合并因此增加体内半衰期的优选突变体是在其Fc片段中包含以下突变组合的突变体,如 WO2010/106180中所述:
·N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y,
·P230S/N315D/M428L/N434Y,
·E294del/T307P/N434Y,
·T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y,
·V259I/N315D/N434Y,或
·T256N/A378V/S383N/N434Y,
其中Fc片段中的氨基酸编号是Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)描述的EU索引的编号,其通过引用并入本文。“EU索引”或“Kabat的EU索引”是指人IgG1抗体的氨基酸编号。
备选地,正如没有Fc片段的抗体片段或衍生物可用于本发明上下文中,特别是用于治疗涉及pDC的炎性疾病、特别是自身免疫性疾病,本发明抗体也可以具有无效应子功能的突变Fc片段。导致不具效应子功能的突变Fc片段的突变实例是Fc片段的位置293(Del293)或294(Del294) 的单氨基酸缺失,其中Fc片段中的氨基酸编号是Kabat的EU索引编号 (WO2012/175751)。
“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指,包含具有相同且独特的抗原特异性的抗体分子的组合物。存在于组合物中的抗体分子可以在其翻译后修饰方面有所变化,特别是在其糖基化结构或其等电点方面有所变化,但是其全部由相同的重链和轻链序列编码,并因而在任何翻译后修饰之前具有相同的蛋白质序列。然而与翻译后修饰相关的某些蛋白质序列差异 (如重链C末端赖氨酸的切割、天冬酰胺残基的脱酰胺化和/或天冬氨酸残基的异构化)可以存在于组合物中的不同抗体分子之间。
基于待比较序列的整体比对,确定在本发明公开的上下文中提及的百分比同一性,即,使用本领域技术人员已知的任何算法(如Needleman和 Wunsch(1970)算法)在序列的整个长度上对序列整体进行的比对。可以使用本领域技术人员熟知的任何软件,例如Needle软件,使用等于10.0 的“空位开放”参数、等于0.5的“空位延伸”参数和“Blosum 62”矩阵来进行序列比较。Needle软件例如可以在网站ebi.ac.uk的“Align”名目下获得。
当根据本发明抗体的CDR或可变区具有的氨基酸序列与上述和序列表中的一个序列(参考序列)不是100%相同,但与一个这样的参考序列具有至少80%、优选至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%的同一性,则其相对于参考序列可以具有***、缺失或取代。在取代的情况下,优选用“等同”氨基酸(即,其结构类似于原始氨基酸并因此不可能改变抗体的生物学活性的任何氨基酸),进行取代。这样的取代的实例列于下表4中:
表4.等同氨基酸取代
根据恒定区的性质,抗体可以分为几种同种型:γ、α、μ、ε和δ恒定区分别对应于免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。有利地,存在于在本发明中用作医药产品的组合物中的单克隆抗体是IgG同种型。实际上,这种同种型显示了在最多数量的个体(人)中产生抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)活性的能力。γ恒定区包括几个亚型:γ1、γ2、γ3(这三种类型的恒定区具有结合人补体的特征)和γ4,从而产生亚型IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4。有利地,存在于在本发明中用作医药产品的组合物中的单克隆抗体是同种型IgG1或IgG3,优选IgG1。
“嵌合”抗体是指,含有源自给定物种抗体的天然可变区(轻链和重链) 以及与所述给定物种不同的物种的抗体的轻链和重链恒定区的抗体。有利地,如果用作本发明医药产品的单克隆抗体组合物包含嵌合单克隆抗体,则该嵌合单克隆抗体包含人恒定区。通过使用本领域技术人员公知的遗传重组技术,可以从非人抗体制备嵌合抗体。例如,可以通过克隆重链和轻链的重组DNA来制备嵌合抗体,所述重组DNA包含启动子和编码非人抗体可变区的序列和编码人抗体恒定区的序列。关于制备嵌合抗体的方法,可以参考例如Verhoeyen等人-1988的文献。
“人源化”抗体是指含有源自非人来源抗体的CDR的抗体,抗体分子的其它部分源自一种(或几种)人抗体。此外,可以修饰框架区(FR)的某些残基以保留结合亲和力(Jones等人-1986;Verhoeyen等人1988; Riechmann等人,1988)。根据本发明的人源化抗体可以通过本领域技术人员已知的技术制备,如CDR接枝、表面重建、超人源化、人字符串内容(humanstring content)、FR文库、引导选择、FR改组和人化技术(humaneering technology),如由Almagro等人2008综述中所总结。
除了包含上述CDR或可变区序列的五种嵌合抗体之外,本发明人还生成了源自最初获得的这五种抗CD303抗体中的两种抗体的人源化抗体。为此,对于两种抗体中的每种,生成几个突变的重链可变区序列(突变旨在使该序列与人序列更相似)和几个突变的轻链可变区序列,并且将其彼此组合成对,以尝试获得具有最强可能的人CD303抗原(SEQ IDNO: 130)结合能力(有利地是,鼠或嵌合抗体结合能力的至少70%,更有利地类似于鼠或嵌合抗体的结合能力,甚至更有利地高于鼠或嵌合抗体的结合能力)的人源化抗体。
对于抗体122A2,测试的(人源化,即突变的)重链和轻链可变区的氨基酸序列示于下表5中:
表5.测试用于抗体122A2人源化的重链和轻链可变区(人源化,即突变)的氨基酸序列。
因此人源化抗体122A2有利地选自其重链包含具有选自SEQ ID NO: 131至133的氨基酸序列的可变区的那些抗体,有利地选自其重链包含具有选自SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列的可变区的那些抗体。
人源化抗体122A2还有利地选自其轻链包含具有选自SEQ ID NO: 134至137的氨基酸序列的可变区的那些抗体,有利地选自其轻链包含具有选自SEQ ID NO:134和135的氨基酸序列的可变区的那些抗体。
由本发明人生成的各种122A2人源化抗体具有重链和轻链,所述重链和轻链包含具有下表6所示氨基酸序列的可变区。优选的122A2人源化抗体(因为它们表现出等于或高于原始嵌合抗体的抗原结合)是其重链和轻链包含具有如下氨基酸序列的可变区的那些抗体,所述氨基酸序列包含下表6中针对抗体122A2H5、122A2H9、122A2H6、122A2H10、122A2H14、 122A2H7、122A2H11和122A2H15所描述的那些氨基酸序列(下表6中粗体显示)。最优选的122A2人源化抗体是比原始嵌合抗体表现出更高抗原结合的那些抗体:122A2H5、122A2H9、122A2H6、122A2H10、122A2H14、 122A2H7,特别是122A2H5、122A2H9、122A2H7和122A2H10。
表6.源自嵌合抗体122A2的人源化抗体的VH和VL结构域中包含的氨基酸序列。对应于优选抗体(因为在ELISA中其表现出等于或高于原始嵌合抗体的抗原结合)的序列以粗体显示。
对于抗体102E9,测试的重链和轻链可变区(人源化,即突变)的氨基酸序列示于下表7中:
表7.测试用于抗体102E9人源化的重链和轻链可变区(人源化,即突变)的氨基酸序列。*氨基酸残基的位置对应于IMGT独特编号。
因此,人源化抗体102E9有利地选自其重链包含具有选自SEQ ID NO: 138至140的氨基酸序列的可变区的那些抗体,有利地选自其重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:139的可变区的那些抗体。
人源化抗体102E9还有利地选自其轻链包含具有选自SEQ ID NO: 141至143的氨基酸序列的可变区的那些抗体,有利地选自其轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:142的可变区的那些抗体。
由本发明人生成的各种102E9人源化抗体具有包含可变区的重链和轻链,所述可变区具有下表8所述的氨基酸序列。优选的102E9人源化抗体 (因为其表现出在嵌合抗体水平上的结合,与原始嵌合抗体的结合水平相似:ELISA中嵌合抗体结合的至少70%)是其重链和轻链包含具有如下氨基酸序列的可变区的那些抗体,所述氨基酸序列包含下表8中针对抗体 102E9H6、102E9H7、102E9H9和102E9H10描述的氨基酸序列(在下表 8中以粗体显示),更有利的是其重链和轻链包含具有如下氨基酸序列的可变区的那些抗体,所述氨基酸序列包含下表8中针对抗体102E9H10描述的氨基酸序列。
表8.源自嵌合抗体102E9的人源化抗体的VH和VL结构域中包含的氨基酸序列。对应于优选抗体(因为其在嵌合抗体的水平上表现出结合,与原始嵌合抗体的水平相似:在ELISA中嵌合抗体结合的至少70%)的序列以粗体显示。
与人恒定区嵌合或人源化的本发明抗体、其功能片段或衍生物,有利地包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:144(其对应于具有额外C末端赖氨酸残基的人重链恒定区序列SEQ ID NO:53)的人重链恒定区。另外或可选地,对于与人恒定区嵌合或人源化的本发明抗体、其功能片段或衍生物,恒定区有利地包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:54 的人轻链恒定区。具有IgG1同种型的优选人重链(SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:144)或轻链(SEQ ID NO:54)恒定区序列在下表9中给出。
表9.优选的人重链(SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:144)或轻链 (SEQ ID NO:54)恒定区序列。人重链恒定区SEQ ID NO:144对应于具有额外C末端赖氨酸残基的人重链恒定区SEQ ID NO:53。
因此,根据本发明的嵌合或人源化抗体、其功能片段或其衍生物的重链和轻链有利地包含下表10中所述的序列(或基本上由或由这些序列组成)。
表10.根据本发明的嵌合或人源化抗体的重链和轻链氨基酸序列。
本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链和/或轻链有利地可以还包含至少一个异源信号肽序列SEQ ID NO:65(MRWSWIFLLLLSITSANA,信号肽MB7)。实际上,已经显示该肽在高等真核细胞系中改善重组蛋白的表达和分泌(参见WO2011/114063)。因此,本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链有利地包含选自SEQ ID NO:66至70的氨基酸序列(其是信号肽MB7的氨基酸序列(SEQ ID NO:65)与本发明抗体的VH区氨基酸序列(SEQ ID NO:43至47)之一的N至C端融合物),或者基本上由或由这些序列组成。另外或替代地,本发明抗体、其功能片段或衍生物的轻链有利地包含选自SEQ ID NO:71至75的氨基酸序列(其是信号肽MB7的氨基酸序列(SEQ ID NO:65)与本发明抗体的VL区氨基酸序列(SEQ ID NO:48至52)之一的N至C端融合物),或基本上由或由这些序列组成。
通过加入优选的重链和轻链恒定区,获得本发明抗体的优选完整氨基酸序列,如下表11所述。对于重链,恒定区可以进一步含有另外的C-末端赖氨酸残基。因此,根据本发明的嵌合或人源化抗体、其功能片段或衍生物的重链和轻链有利地包含下表11所述的序列(或基本上由或由这些序列组成)。
表11.根据本发明的嵌合和人源化抗体的重链和轻链氨基酸序列,带信号肽MB7。
本发明抗体、其功能片段或衍生物可以由本说明书中描述的(特别是在下文涉及本发明的核酸、载体、宿主细胞、转基因非人动物和转基因植物的章节中描述的)任何宿主细胞、任何转基因非人动物或任何转基因植物产生。
“功能片段”是指保留抗原结合结构域并因此与原始抗体具有相同抗原特异性的抗体片段,如片段Fv、ScFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc 或双抗体(diabody)。因此,根据本发明的功能性抗体片段可以有利地选自片段Fv、ScFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc或双抗体。
抗体的“衍生物”是指由载体肽和原始抗体的至少一个CDR组成的融合蛋白,从而允许其保持其识别CD303的能力。
本发明抗体、其功能片段或衍生物有利地具有小于或等于65%的低岩藻糖含量。
“岩藻糖含量”是指,在与每个抗体的每个重链Fc片段的Asn297残基连接的N-聚糖内,岩藻糖基化形式的百分比。“低岩藻糖含量”是指岩藻糖含量小于或等于65%。事实上,目前众所周知,抗体组合物的岩藻糖含量在所述组合物通过FcγRIII诱导强ADCC反应的能力中起关键作用。有利地,岩藻糖含量小于或等于65%、优选小于或等于60%、55%或50%、甚至小于或等于45%、40%、35%、30%、25%或20%。然而,没有必要岩藻糖含量是零,其可以例如大于或等于5%、10%、15%或20%。岩藻糖含量可以例如在5%至65%之间、5%至60%之间、5%至55%之间、5%至50%之间、5%至45%之间、5%至40%之间、5%至35%之间、5%至 30%之间、5%至25%之间、5%至20%之间、10%至65%之间、10%至 60%之间、10%至55%之间、10%至50%之间、10%至45%之间、10%至40%之间、10%至35%之间、10%至30%之间、10%至25%之间、10%至20%之间、15%至65%之间、15%至60%之间、15%至55%之间、15%至50%之间、15%至45%之间、15%至40%之间、15%至35%之间、15%至30%之间、15%至25%之间、15%至20%之间、20%至65%之间、20%至60%之间、20%至55%之间、20%至50%之间、20%至45%之间、20%至40%之间、20%至35%之间、20%至30%之间、20%至25%之间。
本发明抗体、其功能片段或衍生物还可具有不同的糖基化类型(寡甘露糖或二分支(biantennary)复杂型的N-聚糖,具有可变比例的二等分N- 乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基或(在二分支复杂型N-聚糖的情况下)半乳糖残基),只要其具有低的岩藻糖含量即可。因此,寡甘露糖型N-聚糖可以通过如下方式获得:在各种糖基化抑制剂,如α1,2-甘露糖苷酶I抑制剂 (如脱氧甘露糖野尻霉素(deoxymannojirimycin,DMM))或α-葡糖苷酶抑制剂 (如粟精胺(Cs))存在下培养;或在CHO细胞系Lec1中生产抗体。在转基因山羊乳中生产也可以得到其大多数的N-聚糖是寡甘露糖型的抗体,少数形式为具有一个或两个半乳糖的岩藻糖化二分支复杂形式,没有二等分的GlcNAc并且没有唾液酸化(G1F或G2F)(参见WO2007/048077)。可以在大多数哺乳动物细胞中,还可以在糖基化机制被修饰的细菌、酵母或植物中,获得二分支复杂型N-聚糖。为了限制岩藻糖含量,可以使用天然具有低活性酶1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)(该酶负责将岩藻糖添加到与Fc片段结合的GlcNAc上)的细胞系;如YB2/0细胞系、鸭胚胎细胞系大鼠肝癌细胞系H4-II-E(DSM ACC3129)和H4-II-Es(DSMACC3130)或细胞系NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)和NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856)。也可以使用其它基因的突变体细胞系,所述基因的表达或过表达导致低岩藻糖含量,如CHO细胞系Lec13,一种具有降低的 GDP-岩藻糖合成的CHO细胞系突变体。还可以选择感兴趣的细胞系,减少或消除(特别是通过使用干扰RNA或通过突变或缺失表达感兴趣蛋白的基因)参与N-聚糖岩藻糖基化途径的蛋白表达(特别是FUT8,参见 Yamane-Ohnuki等人2004;还有参与GDP-岩藻糖转运的GMD,参见 Kanda等人2007)。另一种备选方案是,选择感兴趣的细胞系并过表达以某种方式干扰N-聚糖的岩藻糖基化的蛋白质,如GnTIII(β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III)蛋白。特别地,具有低岩藻糖化N-聚糖的抗体尤其可以通过以下方式获得:
·在YB2/0(参见EP1176195A1、WO01/77181、Shinkawa等人,2003)、 CHO Lec13(参见Shields等人,2002)、(Olivier等人,2010)、大鼠肝癌细胞系H4-II-E(DSMACC3129)、H4-II-Es(DSM ACC3130)(参见WO2012/041768)和人细胞系NM-H9D8(DSMACC2806)、 NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)和NM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856) (参见WO2008/028686)中生产。
·在针对FUT8(Mori等人,2004,Suzuki等人,2007,Cardarelli等人, 2009,Cardarelli等人,2010,Herbst等人,2010)或GMD(编码高尔基体中的GDP-岩藻糖转运蛋白的基因,参见Imai-Nishiya等人,2007)的小干扰RNA存在下、在野生型CHO细胞系中生产。
·在CHO细胞系中生产,其中编码1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因的两个等位基因都已被缺失(Yamane-Ohnuki等人,2004)、或者其中编码高尔基体中GDP-岩藻糖转运蛋白的GMD基因的两个等位基因已被缺失(Kanda等人2007)。
·在CHO细胞系中生产,其中编码GnTIII(β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III)酶的基因通过转基因而过表达(Umana等人,1999)。除了低岩藻糖基化外,所获得的N-聚糖还具有高二等分GlcNAc含量的特征。
·在转基因植物(本氏烟草(N.benthamiana))中生产,其中通过使用小干扰RNA大大降低了β1,2-木糖和α1,3-岩藻糖残基的含量(Forthal 等人,2010)。
寡甘露糖型N-聚糖与二分支复杂型N-聚糖相比具有降低的体内半衰期。因此,有利的是,本发明抗体在其Fc片段N-糖基化位点上具有如上定义的低岩藻糖含量的二分支复杂型聚糖结构。
特别地,根据本发明的单克隆抗体可以具有大于60%含量的G0+G1 +G0F+G1F形式和如上定义的低岩藻糖含量。其也可以具有大于65%含量的G0+G1+G0F+G1F形式和如上所定义的低岩藻糖含量。其还可以具有大于70%含量的G0+G1+G0F+G1F形式和如上定义的低岩藻糖含量。其也可以具有大于75%含量的G0+G1+G0F+G1F形式和如上定义的低岩藻糖含量。其也可以具有大于80%含量的G0+G1+G0F+G1F形式和如上定义的低岩藻糖含量。其也可以具有大于60%、65%、70%、75%或80%含量的G0+G1+G0F+G1F形式和小于50%含量的G0F+G1F 形式。形式G0、G1、G0F和G1F定义如下:
特别地这样的抗体组合物可以通过在YB2/0细胞、在CHO Lec13细胞、在针对FUT8或GMD的小干扰RNA存在下培养的野生型CHO细胞系中生产而获得,或者在其中编码1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因的两个等位基因或编码高尔基体中GDP-岩藻糖转运蛋白的GMD基因的两个等位基因已被缺失的CHO细胞系中生产获得。
然而,在另一个实施方案中,本发明抗体、其功能片段或衍生物具有高的寡甘露糖型N-聚糖含量。
“寡甘露糖型N-聚糖”是指,在其五糖核心(由两个N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)残基(其中一个与抗体Fc片段的Asn297残基结合)和三个甘露糖残基组成)上补充了一至六个与该五糖核心的末端甘露糖残基结合的另外甘露糖的N-聚糖。寡甘露糖型N-聚糖不是岩藻糖基化的。
“寡甘露糖型N-聚糖含量”是指,在与每个抗体的每个重链Fc片段的 Asn297残基连接的N-聚糖中寡甘露糖形式的百分比。“高寡甘露糖型N- 聚糖含量”是指,寡甘露糖型N-聚糖含量大于或等于30%、有利地大于或等于35%、大于或等于40%、大于或等于45%、大于或等于50%、大于或等于55%、大于或等于60%、大于或等于65%、大于或等于70%、大于或等于75%、大于或等于80%、大于或等于85%、大于或等于90%、或甚至大于或等于95%。
除了低岩藻糖含量外额外地,或作为低岩藻糖含量的替代,本发明抗体、其功能片段或衍生物具有高半乳糖含量。
抗体的“半乳糖含量”或“半乳糖基化水平”是指,根据下式从抗体释放的N-聚糖的分析色谱图计算的百分比:
其中:
-“n”是在色谱图上,例如在正相高效液相色谱(NP-HPLC)的谱图上,分析的N-聚糖峰的数量,
-“Gal的数量”是在对应于该峰的聚糖的分支(antenna)上的半乳糖数量,
-“A的数量”是对应于该峰的聚糖形式的N-乙酰基-葡糖胺分支的数量,
-“%相对面积”是相应峰下面积的百分比。
“高半乳糖含量”是指半乳糖含量大于或等于30%、有利地大于或等于 50%、有利地大于或等于55%、大于或等于60%、大于或等于65%、大于或等于70%、大于或等于75%、大于或等于80%、大于或等于85%、大于或等于90%、大于或等于95%、甚至等于100%。
本发明还涉及针对人CD303抗原(SEQ ID NO:130)胞外域的单克隆抗体或其功能片段或衍生物,其特征在于:
a)与在CHO细胞中产生的针对人CD303抗原胞外域的抗体相比,其具有改善的对FcγRIIIa(CD16a)的亲和力;和
b)轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区。
可以通过几种方法测量抗体的Fc片段对FcγRIIIa(CD16a)的亲和力,包括表面等离子体共振(SPR,特别是使用BIAcore 2000装置, Pharmacia Biosensor,Upsala,Sweden)和Scatchard分析。已经在人中鉴定了编码FcγR的8个基因,但仅有5个编码表达的受体(FcγRIa、 FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)。除了作为免疫细胞活化抑制受体的FcγRIIb之外,所有这些都是效应细胞活化受体。FcγRIa的特征在于对免疫球蛋白的高亲和力(Kd为5·10-7至10-10M),而FcγRIIa、FcγRIIb、 FcγRIIIa、FcγRIIIb为特征性的低亲和力受体(Kd低于10-7M)。与CHO 细胞中产生的针对人CD303抗原胞外域的抗体相比,本发明抗体具有改善的对FcγRIIIa(CD16a)的亲和力。在该比较的上下文中,优选参考野生型CHO细胞系,其在正常条件下产生Fc片段高度岩藻糖基化(至少80%、优选至少90%的连接Fc片段的寡糖是岩藻糖基化)的抗体,如以下细胞系之一:CHO–K–1( CCL–61TM)、CHO Pro–5( CRL–1781TM)、CHO dhfr-( CRL–9096TM)、CHO–DP12( CRL–12444TM或 CRL–12445TM)、CHO DUKX–B11(ATCC CRL–9010)和CHODG–44(Urlaub等人,Cell 33[2],405–412,1983)。与 CHO细胞中产生的针对人CD303抗原胞外域的抗体相比具有改善的 FcγRIIIa(CD16a)亲和力(如上所定义)的本发明抗体,具有这样的优点,即,这种改善的亲和力使其不被多克隆IgG抗体(特别是存在于血清中的IgG)从FcγRIIIa(CD16a)上置换下来、或较少地被置换下来。这样的抗体有利地对FcγRIIIa(CD16a)具有高亲和力,即亲和力至少等于 2×106M-1、至少等于2×107M-1、2×108M-1或2×109M-1,如Scatchard 分析或BIAcore(无标记的表面等离子体共振)技术所确定。
可以按照上文所述的各种方式(即,针对与本发明人开发的具体抗体竞争结合CD303胞外域的能力以及轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区的事实而定义的本发明抗体、其功能片段或衍生物,在上文中描述的方式),获得与CHO细胞中产生的抗体相比显著改善的对FcγRIIIa (CD16a)的高亲和力。特别地,可以通过以下方式获得与CHO细胞中产生的抗体相比显著改善的对FcγRIIIa(CD16a)的高亲和力:
·在Fc片段中存在增加结合FcγRIIIa(CD16a)的突变,如上所述(特别是如WO00/42072、Shields等人,2001、Lazar等人,2006、 WO2004/029207、WO2004/063351、WO2004/074455中所述的增加结合 FcγRIIIa(CD16a)的突变);和/或
·控制抗体的糖基化,特别是:
о在二分支复杂形式中低岩藻糖含量和/或通过高含量的寡甘露糖型N-聚糖,如上所述,和/或
о高半乳糖含量,如上所述。
根据本发明的这样的抗体可以另外具有上述(即,针对与本发明人开发的具体抗体竞争结合CD303胞外域的能力以及轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区的事实而定义的本发明抗体、其功能片段或衍生物,在上文中描述的)任何特征或特征组合。
核酸、载体、宿主细胞、转基因非人动物和转基因植物
本发明还涉及编码如上所述的本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链和/或轻链的核酸(也称为核酸或核苷酸序列)。
由于遗传密码的简并性,编码特定氨基酸序列的所有不同的核酸序列都在本发明的范围内。
特别地,根据本发明的核酸序列可以被优化以促进其在宿主细胞、转基因非人动物或感兴趣的转基因植物中表达。实际上,通常相同的氨基酸 (甲硫氨酸和色氨酸除外)可以由几种三核苷酸组合编码,它们被称为同义密码子。然而,通常细胞或给定生物体优先地使用这些组合中的一些(这被称为遗传密码使用偏倚)。这种偏好尤其依赖于细胞所来源的生产生物体。因此,当在异源生物体或这样的异源生物体的细胞中生产源自一种或多种生物体的蛋白质时,修饰编码蛋白质的核酸序列以主要使用异源生物体的偏好密码子是有用的。关于不同物种的偏好密码子使用,文献中提供了数据,本领域技术人员知道如何在异源生物体或异源生物体的细胞中优化给定蛋白质的表达。
根据本发明的核酸有利地包含如表12所示的SEQ ID NO:86至95 (嵌合抗体)中的至少一个,其编码本发明抗体的VH和VL区的氨基酸序列,并已针对在褐家鼠(Rattusnorvegicus)细胞中的表达进行了优化。
表12.编码本发明抗体、其功能性片段或衍生物的VH和VL区的优选核苷酸序列,其针对在褐家鼠细胞中的表达进行了优化。
根据本发明的核酸还可有利地包含下表13所示的SEQ ID NO:181 至187(源自抗体122A2的人源化抗体)中的至少一个,其编码根据本发明的人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列,并且已针对在褐家鼠细胞中的表达进行了优化。
表13.源自抗体122A2的人源化抗体的优选核苷酸序列,其针对在褐家鼠细胞中的表达进行了优化,编码本发明抗体、其功能性片段或衍生物的VH和VL区。
根据本发明的核酸还可有利地包含下表14所示的SEQ ID NO:188 至193(源自抗体102E9的人源化抗体)中的至少一个,其编码根据本发明的人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列,并且已针对在褐家鼠细胞中的表达进行了优化。
表14.源自抗体102E9的人源化抗体的优选核苷酸序列,编码本发明抗体、其功能性片段或衍生物的VH和VL区,已经针对在褐家鼠细胞中的表达进行了优化。
编码优选的重链或轻链恒定区的核酸序列也已经针对在褐家鼠细胞中的表达进行了优化,优选为在下表15中描述的那些。
表15.编码优选的人重链或轻链恒定区的优选核苷酸序列。
因此,编码本发明抗体的重链和/或轻链的核酸优选包含至少一个下表 16所述的核酸序列(或基本上由其组成或由其组成),其由以下的5'至3' 融合组成:
·编码本发明优选嵌合抗体的VH区的SEQ ID NO:86至90之一和编码优选人重链恒定区的SEQ ID NO:96的融合(参见SEQ ID NO:98 至102);
·编码本发明优选嵌合抗体的VL区的SEQ ID NO:91至95之一和编码优选人轻链恒定区的SEQ ID NO:97的融合(参见SEQ ID NO:103 至107);
·编码源自本发明嵌合抗体122A2的优选人源化抗体的VH区的SEQ ID NO:181至183之一和编码优选人重链恒定区的SEQ ID NO:96的融合(参见SEQ ID NO:194至196);
·编码源自本发明嵌合抗体122A2的优选人源化抗体的VL区的SEQ ID NO:184至187之一和编码优选人轻链恒定区的SEQ ID NO:97的融合(参见SEQ ID NO:197至200);
·编码源自本发明嵌合抗体102E9的优选人源化抗体的VH区的SEQ ID NO:188至189之一和编码优选人重链恒定区的SEQ ID NO:96的融合(参见SEQ ID NO:201至203);
·编码源自本发明嵌合抗体102E9的优选人源化抗体的VL区的SEQ ID NO:191至193之一和编码优选的人轻链恒定区的SEQ ID NO:97的融合(参见SEQ ID NO:204至206)。
表16.本发明抗体的重链和轻链的优选核苷酸序列。
编码本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链和/或轻链的核酸可以有利地包含编码异源信号肽MB7(MRWSWIFLLLLSITSANA,SEQ ID NO: 65)的核酸序列,特别是核酸序列SEQ ID NO:108 (ATGAGGTGGTCCTGGATCTTCCTGCTGCTGCTGAGCATCACCAG CGCCAACGCC)。实际上,已经显示该肽改善重组蛋白在高等真核生物细胞系中的表达和分泌(参见WO2011/114063)。
因此,编码本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链的核酸有利地包含(或基本上由其组成或由其组成)选自SEQ ID NO:109至113(嵌合抗体)、SEQ ID NO:207至209(源自嵌合抗体122A2的人源化抗体)和 SEQ ID NO:214至216(源自嵌合抗体102E9的人源化抗体)的核酸序列,由编码信号肽MB7(SEQ ID NO:108)的核酸序列5'至3'融合到编码本发明抗体的VH区的核酸序列(嵌合抗体的SEQ ID NO:86至90、源自嵌合抗体122A2的人源化抗体的SEQ ID NO:181至183,和源自嵌合抗体102E9的人源化抗体的SEQ ID NO:188至190)之一组成。
另外或替代地,编码本发明抗体、其功能片段或衍生物的轻链的核酸有利地包含(或基本上由其组成或由其组成)选自SEQ ID NO:114至118 (嵌合抗体)、SEQ ID NO:210至213(源自嵌合抗体122A2的人源化抗体)和SEQ ID NO:217至219(源自嵌合抗体102E9的人源化抗体)的核酸序列,由编码信号肽MB7(SEQ ID NO:108)的核酸序列5'至3'融合到本发明抗体的VL区的氨基酸序列(嵌合抗体的SEQ ID NO:91至 95、源自嵌合抗体122A2的人源化抗体的SEQ ID NO:184至187,和源自嵌合抗体102E9的人源化抗体的SEQ ID NO:191至193)之一组成。
通过加入优选的重链和轻链恒定区,获得本发明抗体的优选完整氨基酸序列,如下表17所述。
因此,编码本发明嵌合或人源化抗体、其功能片段或衍生物的重链和 /或轻链的核酸有利地包含下表17中所述的至少一个序列(或基本上由这样的序列组成或由这样的序列组成)。
表17.编码本发明抗体的重链和轻链的核酸序列,具有信号肽MB7。
本发明还涉及包含根据本发明的核酸的载体。这样的载体包含表达所述核酸序列所需的元件,特别是启动子、转录起始密码子、终止序列和合适的转录调控序列。这些元件根据用于表达的宿主而变化,并且是本领域技术人员基于他们的一般知识容易选择的。特别地,对于设计用于在真核细胞中表达的载体,载体有利地包含Kozak共有序列,即在真核信使RNA 的翻译起始位点处发现的保守序列,其在AUG起始密码子周围(通常为 GCCGCC(A/G)CCATGG,翻译起始密码子加下划线)。特别地载体可以是质粒或病毒载体。其用于克隆或表达根据本发明的核酸。
能够在本发明的上下文中使用的优选载体的实例包括:
·WO2013/061010(特别优选)中描述的载体,其包含至少一个包含以下调控元件的转录单元:hCMVie病毒增强子(所述增强子具有核苷酸序列SEQ ID NO:220,或与SEQ IDNO:220具有至少70%序列同一性且基本上具有转录活化特性的核酸)、和细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9) 启动子区(所述启动子区具有核苷酸序列SEQ ID NO:221,或与SEQ IDNO:221具有至少70%序列同一性且基本上具有启动子活性的核酸)。
有利地,载体中包含的转录单元还包含以下两个其它成分中的至少一个:
о位于启动子区下游的5'非翻译区(5'UTR),特别地选自:
·HTLV-1病毒长末端重复(LTR)调控(R)区,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:222、或与SEQ ID NO:222具有至少70%序列同一性的核酸,
·NF-κB阻抑因子(NRF)基因5'UTR,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:223、或与SEQID NO:223具有至少70%序列同一性的核酸,
·真核起始因子4GI(eIF4GI)基因5'UTR,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:224、或与SEQ ID NO:224具有至少70%序列同一性的核酸,
与所述SEQ ID NO:222、223、224具有至少70%序列同一性的所述核酸,基本上具有稳定mRNA和促进翻译的特性。
о位于启动子区下游和翻译起始位点上游的内含子,特别地选自:
·延伸因子1α(EF1α)基因内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:225或与SEQ IDNO:225具有至少70%序列同一性的核酸,
·鼠ROSA内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:226或与 SEQ ID NO:226具有至少70%序列同一性的核酸,
·HTLV-1病毒5'LTR内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO: 227或与SEQ ID NO:227具有至少70%序列同一性的核酸,
·pCI-neo内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:228或与 SEQ ID NO:228具有至少70%序列同一性的核酸,
·泛素基因内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:229或与 SEQ ID NO:229具有至少70%序列同一性的核酸,
·人ROSA内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:230或与 SEQ ID NO:230具有至少70%序列同一性的核酸。
有利地,载体中包含的转录单元包含hCMVie病毒增强子、CDK9启动子区、eIF4GI基因5'UTR和EF1α基因内含子,并具有核苷酸序列SEQ ID NO:231(“HKgenEFss”载体)。
·WO2013/117871中描述的载体,其包含至少一个包含以下调控元件的转录单元:
оhCMVie病毒增强子,所述增强子具有核苷酸序列SEQ ID NO: 232、或与SEQ IDNO:232具有至少70%序列同一性且基本上具有转录活化特性的核酸,
оβ-肌动蛋白启动子区,所述启动子区具有核苷酸序列SEQ ID NO: 233、或与SEQID NO:233具有至少70%序列同一性且基本上具有启动子活性的核酸,以及
о位于所述启动子区下游和翻译起始位点上游的核酸,所述核酸包含选自以下的至少一个5'非翻译区(5'UTR):
·HTLV-1病毒5'长末端重复(LTR)调节(R)区,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:234或与SEQ ID NO:234具有至少 70%序列同一性的核酸,
·NF-κB阻抑因子(NRF)基因5'UTR,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:235或与SEQ IDNO:235具有至少70%序列同一性的核酸,
·真核起始因子4GI(eIF4GI)基因5'UTR,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:236或与SEQ ID NO:236具有至少70%序列同一性的核酸,
与SEQ ID NO:234、235或236所代表的序列之一具有至少 70%序列同一性的所述核酸,基本上具有稳定mRNA和促进翻译的特性。
包含在载体中的转录单元还可以包含内含子,特别是选自以下:
o延伸因子1α(EF1α)基因内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO: 237或与SEQ IDNO:237具有至少70%序列同一性的核酸,
o鼠ROSA内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:238或与SEQ ID NO:238具有至少70%序列同一性的核酸,
o人ROSA内含子,其具有核苷酸序列SEQ ID NO:239或与SEQ ID NO:239具有至少70%序列同一性的核酸,
所述内含子位于:
(i)5'UTR的下游和翻译起始位点的上游,或
(ii)启动子的下游和5'UTR的上游,或
(iii)翻译起始位点之后和编码序列内,或
(iv)编码序列的终止密码子和多聚腺苷酸化信号之间。
有利地,载体中包含的转录单元包含hCMVie病毒增强子、β-肌动蛋白启动子区、HTLV-1病毒5'UTR(U1)和eIF4GI基因5'UTR(U3),并且其具有核苷酸序列SEQ ID NO:240。
本发明还涉及宿主细胞、转基因非人动物或转基因植物,其包含至少一个根据本发明的核酸或根据本发明的载体。
宿主细胞可以是原核或真核来源的,并且可以特别地选自细菌、昆虫、植物、酵母或哺乳动物细胞。然后可以通过在合适的条件下培养宿主细胞来产生本发明抗体、功能片段或衍生物。特别地可以通过用本发明抗体、其功能片段或衍生物的重链和轻链的表达载体转化细胞系、并分离获得的各种细胞克隆,获得根据本发明的宿主细胞。转化的细胞系优选为真核来源,并且可以特别选自昆虫、植物、酵母或哺乳动物细胞。用于抗体生产的合适细胞系特别包括选自以下的细胞系:SP2/0;YB2/0;IR983F;人骨髓瘤Namalwa;PERC6;CHO细胞系,特别是CHO–K–1、CHO–Lec10、 CHO–Lec1、CHO–Lec13、CHO Pro–5、CHO dhfr-、CHO–DP12、CHO DUKX–B11、CHO DG–44、或缺失编码FUT8基因和/或GMD基因的两个等位基因的CHO细胞系;Wil-2;Jurkat;Vero;MoIt–4;COS–7; 293–HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0–Ag 14,P3X63Ag8.653,鸭胚胎细胞系(Valneva);大鼠肝癌细胞系H4–II–E(DSM ACC3129)和 H4–II–Es(DSM ACC3130)(参见WO2012/041768),NM–H9D8(DSM ACC2806),NM–H9D8–E6(DSM ACC 2807)和NM H9D8–E6Q12(DSM ACC 2856)(参见WO2008/028686)。
可以通过将感兴趣的基因(在此,编码抗体重链和轻链的重排基因) 直接注射到受精卵中,获得根据本发明的转基因非人动物(Gordon等人,1980)。也可以通过将感兴趣的基因(在此,编码抗体重链和轻链的重排基因)引入胚胎干细胞并通过嵌合体聚集方法或嵌合体注射方法制备动物来获得转基因非人动物(参见Manipulating the Mouse Embryo,ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); GeneTargeting,A Practical Approach,牛津大学出版社的IRL出版社 (1993))。转基因非人动物也可以通过克隆技术获得,其中已经引入感兴趣基因(在此,编码抗体重链和轻链的重排基因)的核被移植到去核卵中 (Ryan等人,1997;Cibelli等人,1998,WO00/26357)。可以通过上述方法制备产生感兴趣抗体的转基因非人动物。然后抗体可以积累在转基因动物中并收获(特别是从动物的乳或卵中)。为了在转基因非人动物的乳中产生抗体,特别是在WO90/04036、WO95/17085、WO01/26455、 WO2004/050847、WO2005/033281、WO2007/048077中描述了制备方法。从奶中纯化目的蛋白的方法也是已知的(参见WO01/26455, WO2007/106078)。感兴趣的转基因非人动物特别地包括小鼠、兔、大鼠、山羊、牛(特别是奶牛)和家禽(特别是鸡)。
根据本发明的转基因植物可以选自允许抗体生产的任何植物。已经在转基因植物中生产了许多抗体,而且用于获得表达感兴趣抗体的转基因植物和回收抗体所需的技术是本领域技术人员公知的(参见Stoger等人, 2002、Fisher等人,2003、My等人,2003、Schillberg等人,2005)。还可以例如通过小干扰RNA的方法(Forthal等人,2010),影响植物中获得的糖基化,以获得类似于天然人抗体(不含木糖)的糖基化,但另外具有轻微的岩藻糖基化。
抗体的治疗用途
本发明还涉及本发明抗体、其功能片段或衍生物用作医药产品。
在第一实施方案中,本发明抗体、其功能片段或衍生物有利地用于治疗或预防表达CD303抗原的造血***肿瘤。特别是表型为CD4+、CD11c-、 Lin-、CD303+、CD304+、CD56+的母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)的病例。
在第二实施方案中,本发明抗体、其功能片段或衍生物有利地用于治疗或预防炎性疾病,特别是自身免疫性疾病。本发明抗体、其功能片段或衍生物有利地用于治疗或预防涉及pDC的疾病,更特别地用于治疗或预防涉及pDC引起的IFN-α分泌的疾病。特别地,本发明抗体、其功能片段或衍生物有利地用于治疗或预防已经确立了pDC的作用的以下疾病(参见 Wollenberg等人,2002和Cao,2014):特应性皮炎、接触性皮炎、牛皮癣、***性红斑狼疮、皮肌炎、综合征、1b型糖尿病、自身免疫性血小板减少症(或血小板减少症)(特别是特发性血小板减少性紫癜或 ITP)、***性硬皮病(也称为进行性***性硬皮病或***性硬化症)、类风湿关节炎。
本发明还涉及:
·本发明抗体、其功能片段或衍生物在制备用于治疗或预防表达 CD303抗原的造血***肿瘤、特别是表型为CD4+、CD11c-、Lin-、CD303 +、CD304+、CD56+的母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)的医药产品中的用途。
·本发明抗体、其功能片段或衍生物在制备用于治疗或预防炎性疾病、特别是自身免疫疾病以及特别是上述疾病的医药产品中的用途。
本发明还涉及:
·本发明抗体、其功能片段或衍生物在治疗或预防表达CD303抗原的造血***肿瘤、特别是表型为CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+、 CD56+的母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)中的用途。
·本发明抗体、其功能片段或衍生物用于治疗或预防炎性疾病、特别是自身免疫疾病以及特别是上述疾病中的用途。
本发明还涉及:
·治疗或预防患者中表达CD303抗原的造血***肿瘤、特别是表型为 CD4+、CD11c-、Lin-、CD303+、CD304+、CD56+的母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤的方法,所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明抗体、其功能片段或衍生物。
·治疗或预防患者中炎性疾病、特别是自身免疫性疾病和特别是上述疾病之一的方法,所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明抗体、其功能性片段或衍生物。
“治疗”是指,在临床或生化水平观察到的患者疾病的改善。
“预防”是指,防止或延迟与该疾病相关的临床或生化表现的发生或降低其强度的事实。
本领域技术人员根据他们的一般知识知道如何确定哪些临床或生化表现与给定疾病相关以及哪些可能被改善(治疗)或预防、延迟或降低强度(防止)。在表达CD303抗原的造血***肿瘤、特别是母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(BPDCN)的情况下,感兴趣的生物学参数可以是母细胞的数量。在炎性疾病的情况下,感兴趣的生物学参数可以是pDC的数量或有助于炎症的局部或***分子(炎性细胞因子,特别是INFα)的数量。
以下实施例旨在举例说明本发明。
实施例
实施例1:五种嵌合抗体和现有技术的人源化抗体的制备和结构
生成了具有鼠可变区和IgG1型人恒定区的五种嵌合单克隆抗体,并表征了其结构。此外,再现了人源化抗体BIIB059(申请WO2014/09339 中描述了其序列),其用于与根据本发明的嵌合抗体进行比较。
材料和方法
来自鼠杂交瘤的重链和轻链的测序
使用来自Macherey-Nagel的NucleoSpin RNA II试剂盒(柱纯化),提取来自每个杂交瘤的总RNA。
将mRNA转化为cDNA,并使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)扩增抗体的重链和轻链,克隆到M13载体中。然后通过M13载体转化细菌,对M13序列阳性的克隆进行测序。
确定重链VH、DH、JH区段和轻链VL和JL区段
通过使用IMGT的域空位比对工具(参见Ehrenmann等人,2010和 Ehrenmann等人,2011)(其可在以下网址获得:http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/ DomainGapAlign.cgi),确定重链和轻链使用的可变部分、V和J区段以及重链和轻链CDR的序列。
用于嵌合抗体的表达载体的构建
针对褐家鼠(Rattus norvegicus)的偏好密码子使用,优化了五种鼠抗体的可变区VH和VL序列。另外在编码每个抗体的可变区VH或VL 的序列5'末端引入编码异源信号肽MB7的序列。
通过用ApaI/AscI消化(对于H链)(IgG1m1.17)和用DraIII/XbaI 消化(对于κ链),从人抗恒河猴D抗体(T125)的表达载体CHK622-21 中提取人恒定部分的序列。
最后,通过用KAPA T4连接酶连接,将相同链的可变部分和恒定部分同时引入通用载体HKgenEFss,生成载体HKBDCA–2–122A2、 HKBDCA–2–102E9、HKBDCA–2–104C12、HKBDCA–2–114D11和 HKBDCA–2–104E10(参见图1A至1E)。
嵌合抗体的生成
将载体HKBDCA–2–122A2、HKBDCA–2–102E9、 HKBDCA–2–104C12、HKBDCA–2–114D11和HKBDCA–2–104E10(参见图1A至1E)转染到YB2/0细胞中,选择产生每种抗体的克隆以产生嵌合抗体。
生成对应于WO2014/09339中描述的抗体(BIIB059)的抗体
根据所述专利申请中描述的序列,通过添加Kozak序列以及在两个H 和K序列的每一侧添加限制性位点以允许通过消化/连接进行克隆,来合成重(H)链和轻(K)链的序列。
用于产生人源化抗体BIIB059的表达载体是10,835bp的双顺反子载体HKgenEFss,其使得可以在CHO细胞中优化产生抗体(图1F)。以两个相继步骤进行重链和轻链的克隆。第一步是通过消化/连接将H链插在 NheI/AscI克隆位点之间以产生仅含有该链的中间载体。在第二步中,通过相同的技术在SpeI/XbaI克隆位点之间***K链。连接酶是KAPA T4 DNA连接酶(Kapa Biosystems)。然而,由于SpeI/XbaI限制性位点产生平头末端,因此在***K链之前脱磷酸化步骤是必需的,以防止线性化质粒环化。
通过从CHO细胞系瞬时转染产生人源化抗体BIIB059,以满足申请 WO2014/09339的条件。该细胞系在补充有4mM谷氨酰胺的ProCHO4培养基中培养。在实验室中,该细胞系每2天以2·105至3·105细胞/mL维持。用于转染的溶液是缓冲液(OptiPRO)和转染试剂(Freestyle Max Reagent)。
一旦生成,通过亲和色谱法纯化抗体BIIB059。
结果
关于五种抗体的重链VH、DH、JH区段和轻链VL和JL区段的数据在上表2中给出。值得注意的是:
·家族1的两种抗体(122A2和104C12)共享使用相同的VH区段 (IGHV1S137*01),以及使用相同家族的VL (IGKV10-96*01/IGKV10-96*02)和JL(IGKJ1*01/IGKJ1*02)区段,如下表18所示。因此,这两种抗体具有相似的结构。
·家族2的三种抗体(102E9、114D11和104E10)共享使用相同的 VH、JH、VL和JL区段,如下表18所示。因此,这三种抗体具有相似的结构。
表18.各种抗体使用的VH、JH、VL和JL区段。相同家族中的相同区段是粗体。
此外,关于五种抗体的CDR和可变区的氨基酸序列的数据在上述表3 中给出。值得注意的是:
·家族1的两种抗体(122A2和104C12)具有相同的CDR1-H和 CDR2-L序列,另外还具有高度相似的CDR2-H、CDR1-L和CDR3-L序列(仅一个或两个氨基酸的差异)。甚至CDR3-H序列具有高度同源性(共有5/11氨基酸),如下表19所示。这证实这两种抗体具有非常相似的结构。
·家族2的三种抗体(102E9、114D11和104E10)具有相同的CDR2-L 序列,另外具有高度相似的CDR1-H、CDR2-H、CDR1-L和CDR3-L序列(仅一个氨基酸的差异)。甚至CDR3-H序列具有高度同源性(共有12/14 氨基酸),如下表19所示。这证实这三种抗体具有真正高度相似的结构。
表19.相同家族抗体的CDR之间的序列同源性。相同家族内的相同氨基酸是粗体。
关于五种抗体恒定区的氨基酸序列的数据在上述表9中给出。
此外,各抗体可变区(VH和VL)和恒定区的核酸序列在上述表12 和表15中给出。
最后,五种抗体的表达载体的图谱示于图1A至1E。
结论
生成了五种嵌合单克隆抗体,其具有鼠可变区和IgG1型人恒定区并且针对CD303抗原,并且表征了这五种嵌合单克隆抗体结构。结果证明,两种抗体(122A2和104C12)具有相似的结构并形成抗体亚家族(家族1),其它三种抗体(102E9、114D11和104E10)在结构上也非常相似并形成另一个抗体亚家族(家族2)。
还在CHO细胞中生成了具有申请WO2014/09339中所述抗体 (BIIB059)的序列的人源化抗体(如申请WO2014/09339中所述)。
然后根据其生物学特性,表征了这些抗体(参见实施例2)。
实施例2:五种嵌合抗体和对应于申请WO2014/09339中所述抗体 (BIIB059)的抗体的生物学特性
测试了在实施例1中产生的具有鼠可变区和IgG1型人恒定区、并且针对CD303抗原的五种嵌合单克隆抗体的各种生物学特性。在某些情况下,将这些特性与以下抗体的特性进行比较,所述抗体与申请WO2014/09339 中描述的抗体(BIIB059)相对应(相同的序列和相同的生产细胞系)。
材料和方法
测试的抗体
测试的抗体是如实施例1所述制备的抗体。
抗原结合
与CD303+细胞(Fcγ链-CD303Jurkat,CAL-1,和过表达CD303的 CAL-1)的结合
以多种抗原密度使用表达CD303的各种类型的细胞:
1.Fcγ链-CD303Jurkat细胞,其表达约25,000-35,000个CD303分子 /细胞;
2.CAL-1细胞,如Maeda T等人(Int J Hematol.2005Feb;81(2): 148-54)所述,其表达约3,000-6,000个CD303分子/细胞;
3.用CD303表达载体转染的、针对高表达CD303而选择的CAL-1 细胞,约40,000-50,000个CD303分子/细胞。
在稀释剂(PBS+1%FCS)中制备表达CD303的细胞和抗体。
1·105细胞与不同浓度(0-40μg/mL,终浓度)的100μL抗体(抗CD303 或阴性对照)在4℃孵育30分钟。
用稀释剂洗涤后,通过在4℃加入藻红蛋白(PE)-偶联的山羊抗小鼠 IgG F(ab')2片段(100μL,在稀释剂中1:100稀释)持续45分钟,显色抗体。然后洗涤细胞并通过流式细胞仪分析(FC500,Beckman Coulter)。
FcγRIIIa(CD16a)结合
从外周血单个核细胞(PBMC)中分离NK细胞,然后与不同浓度的测试抗体(0至100μg/mL)孵育,同时与10μL/测试的藻红蛋白-偶联的鼠抗体(3G8-PE,Beckman Coulter)孵育。
洗涤后,通过流式细胞仪评估3G8-PE与NK细胞表达的CD16的结合。平均荧光强度(MFI)值表示为百分比,100%是单独使用3G8-PE抗体获得的值,0%是不存在3G8-PE时获得的值。
使用PRISM软件计算IC 50值(诱导3G8结合的50%抑制所必需的抗CD303抗体的浓度)。
ADCC
将Fcγ链-CD303Jurkat细胞(35,000个细胞/孔)在96孔平底板中与 NK细胞和递增浓度的抗CD303抗体在37℃孵育4小时。孵育后,收集上清液。通过显色定量裂解的靶细胞释放到上清液中的细胞内乳酸脱氢酶 (LDH)(细胞毒性检测试剂盒(LDH),RocheDiagnostics),测定由抗 CD303抗体诱导的靶细胞裂解。
裂解百分比按照下列公式计算:
%裂解=[(ER-SR)/(100-SR)]-[(NC-SR)/(100-SR)]
其中ER和SR分别代表实验释放(ER)和自发释放(SR)的LDH, NC代表NK细胞的天然细胞毒性。
结果(%裂解)表示为抗体稀释因子的函数。对于每种抗体,“50%活性”值对应于诱导以该抗体获得的平台值的50%所必需的抗体稀释因子。该值用PRISM软件计算。
抑制IFN-α分泌
细胞的制备
通过Ficoll密度梯度从健康供体的外周血中分离外周血单个核细胞 (PBMC)。通过负耗竭(Miltenyi Biotec-Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit,human)纯化pDC。计数细胞并在稀释剂(RPMI 1640+10%胎牛血清(FCS))中以2·10 5个细胞/mL重悬。
纯化的pDC导致的IFN-α分泌
然后将该悬浮液(205μL/孔)转移到24孔平底培养板中。添加CpG ODN(10μM,50μL)、IL-3(100ng/mL,50μL)、抗体(100μg/mL,50μL) 和稀释剂(100μL)。然后将板在37℃、7%CO2下过夜孵育。
IFN-α测定法
收集每孔的培养物上清液并使用FlowCytomix Human IFN-α试剂盒 (BenderMedSystems BMS216FF+Basic试剂盒BMS8420FF)、通过流式细胞仪进行测定。
评估每个样品相对于阴性对照(在没有抗CD303单克隆抗体时CPG 活化的pDC)的抑制百分比。
导致小于20%抑制的样品被认为是非抑制剂,导致20%至75%抑制的那些样品被认为是弱抑制剂,导致大于75%抑制的那些样品被认为是强抑制剂。
TNF-α分泌的抑制
细胞的制备
通过Ficoll密度梯度从健康供体的外周血中分离外周血单个核细胞 (PBMC)。通过负耗竭(Miltenyi Biotec-Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit,human)纯化pDC。计数细胞并在稀释剂(RPMI 1640+10%胎牛血清(FCS))中以2·10 5个细胞/mL重悬。
纯化的pDC导致的TNF-α分泌
然后将该悬浮液(205μL/孔)转移到24孔平底培养板中。添加CpG ODN(10μM,50μL)、IL-3(100ng/mL,50μL)、抗体(100μg/mL,50μL) 和稀释剂(100μL)。然后将板在37℃、7%CO2下过夜孵育。
TNF-α测定法
收集每孔的培养物上清液,并使用FlowCytomix Human IFN-α试剂盒(BenderMedSystems BMS216FF+Basic试剂盒BMS8420FF)、通过流式细胞仪进行测定。
评估每个样品相对于阴性对照(在没有抗CD303单克隆抗体时CPG 活化的pDC)的抑制百分比。
导致小于20%抑制的样品被认为是非抑制剂,导致20%至75%抑制的那些样品被认为是弱抑制剂,导致大于75%抑制的那些样品被认为是强抑制剂。
补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的测量
在存在幼兔血清(1:10稀释)作为来源的情况下,将Fcγ链-CD303 Jurkat细胞与递增浓度的抗CD303抗体(0至5,000ng/mL)孵育。
在37℃孵育2小时后,用Cytotoxicity Detection Kit(LDH)(RocheDiagnostics,产品编号:11644793001)测量由裂解的靶细胞释放到上清液中的细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的量。
结果
抗原结合
与Fcγ链-CD303 Jurkat细胞结合
本发明抗体与Fcγ链-CD303 Jurkat细胞上的CD303抗原结合的测试结果示于图2A和下表20中。
表20.本发明抗体与Fcγ链-CD303Jurkat细胞上CD303抗原的结合。 Bmax:表示为平均荧光强度(MFI)的最大结合。EC50(μg/mL):获得该抗体最大结合的50%的抗体浓度,以μg/mL计。
在剂量-反应建模后计算的这些相对Kd结果和Bmax值可以将抗体分为两组:包含抗体104C12(Bmax:MFI=27.7;Kd=0.17μg/mL)和122A2 (Bmax:MFI=26.2Kd=0.13μg/mL)的第一组,其与第二组抗体是可比较的并显示更高的相对亲和力,第二组抗体:114D11(Bmax:MFI=24.7; Kd=3.9μg/mL)、104E10(Bmax:23.7;Kd=6μg/mL)和102E9(Bmax: MFI=24.9;Kd=3.8μg/mL)。
这些结果表明,所有生成的嵌合抗体都有效地结合表达在Jurkat细胞表面上的CD303抗原,对于该抗原,其是特异性的。
与CAL-1细胞结合
根据本发明的嵌合抗体与CAL-1细胞上CD303抗原结合的测试结果示于图2B和下表21中。
表21.本发明嵌合抗体与CAL-1细胞上CD303抗原的结合。Bmax:表示为平均荧光强度(MFI)的最大结合。EC50(μg/mL):获得该抗体最大结合的50%的抗体浓度,以μg/mL计。
在剂量-反应建模后计算的这些相对Kd结果和Bmax值可以将抗体分为两组:包含抗体104C12(Bmax:MFI=29.02Kd=0.34μg/mL)和122A2 (Bmax:MFI=25.2Kd=0.20μg/mL)的第一组,其与第二组抗体是可比较的并显示更高的相对亲和力,第二组抗体:114D11(Bmax:MFI=30.1; Kd=1.7μg/mL)、104E10(Bmax:MFI=29.2;Kd=1.93μg/mL)和102E9(Bmax:MFI=30.47;Kd=1.81μg/mL)。
这些结果与Jurkat-CD303细胞的结合结果明显相关。
在另一实验中,测试了嵌合抗体122A2和102E9以及人源化抗体 BIIB059的CAL-1细胞结合。结果示于图2C和下表22中。
表22.本发明嵌合抗体122A2和102E9以及人源化抗体BIIB059与 CAL-1细胞上CD303抗原的结合。Bmax:表示为平均荧光强度(MFI) 的最大结合。EC50(μg/mL):获得该抗体最大结合的50%的抗体浓度,以μg/mL计。
这些数据表明,根据本发明的两种嵌合抗体122A2和102E9(特别是嵌合抗体122A2)比人源化抗体BIIB059更强地结合CAL-1细胞表面上的 CD303抗原。
与过表达CD303抗原的CAL-1细胞的结合
本发明嵌合抗体122A2和102E9及人源化抗体BIIB059,与转染了 CD303表达载体且表达约40,000至50,000个CD303分子/细胞(或比野生型CAL-1细胞多约10倍)的CAL-1细胞上的CD303抗原的结合测试结果,示于图2D和下表23中。
表23.本发明嵌合抗体122A2和102E9以及人源化抗体BIIB059,与用CD303表达载体转染的CAL-1细胞(表达约40,000至50,000个CD303 分子/细胞,或是比野生型CAL-1细胞多约10倍)上的CD303抗原的结合。Bmax:表示为平均荧光强度(MFI)的最大结合。EC50(μg/mL):获得该抗体最大结合的50%的抗体浓度,以μg/mL计。
这些数据再次表明,根据本发明的两种嵌合抗体122A2和102E9(特别是嵌合抗体122A2)比人源化抗体BIIB059更强地结合用CD303表达载体转染的CAL-1细胞(表达约40,000至50,000个CD303分子/细胞)表面上的CD303抗原。
FcγRIIIa(CD16a)结合
根据本发明的五种嵌合抗体结合FcγRIIIa(CD16a)的测试结果示于图3A中,并且表明本发明嵌合抗体全部能够以优化的结合亲和力有效地结合CD16a。其IC50值低于CHO细胞中产生的抗体(Rituxan)的IC 50 值,范围为18.08至45.02μg/mL,甚至低于18μg/mL,如下表24所示。
表24.对照(Rituxan)和本发明嵌合抗体的IC50值(诱导3G8结合的50%抑制所必需的抗CD303抗体的浓度)。
根据本发明的两种嵌合抗体122A2和102E9以及人源化抗体BIIB059 的FcγRIIIa(CD16a)结合测试结果示于图3B和下表25中,表明根据本发明的两种嵌合抗体122A2和102E9比抗体Rituxan和BIIB059强得多地结合FcγRIIIa(CD16a)。
抗体 | IC50μg/mL(50%) |
Rituxan | >83 |
122A2 | 13 |
102E9 | 13 |
BIIB059 | >83 |
表25.对照(Rituxan)和本发明嵌合抗体122A2和102E9以及人源化抗体BIIB059的IC50值(诱导3G8结合的50%抑制所必需的抗CD303 抗体的浓度)。
ADCC
根据本发明的五种嵌合抗体对Fcγ链-CD303Jurkat靶细胞的ADCC 测试结果示于图4A和下表26中。
表26.本发明抗体在Fcγ链-CD303Jurkat靶细胞上诱导的ADCC。 Emax:用该抗体获得的最大裂解,表示为裂解的百分比。EC50(ng/mL):获得该抗体最大裂解的50%的抗体浓度,以ng/mL计。
这些结果表明,五种抗CD303嵌合抗体诱导Jurkat-CD303细胞的裂解(Emax约40%)。104C12(EC50:0.21ng/mL)、122A2(EC50:0.16 ng/mL)、114D11(EC50:3.6ng/mL)、102E9(EC50:3.4ng/mL)和104E10 (EC50:8.3ng/mL)的EC50值表明,具有高亲和力的抗体比具有较低亲和力的抗体在ADCC方面更有效。
无关抗体(抗因子VIII抑制剂抗体,抗Id FVIII)、根据本发明的两种嵌合抗体122A2和102E9、以及人源化抗体BIIB059在CAL-1靶细胞上的ADCC测试结果示于图4B和下表27中。
表27.本发明抗体在Fcγ链-CD303Jurkat靶细胞上诱导的ADCC。 Emax:用该抗体获得的最大裂解,表示为裂解的百分比。EC50(ng/mL):获得该抗体的最大裂解的50%的抗体浓度,以ng/mL计。nd:不可检测。
这些结果表明,与人源化抗体BIIB059不同,根据本发明的两种嵌合抗体122A2和102E9能够诱导非常弱地表达CD303抗原的CAL-1细胞的裂解。此外,本发明嵌合抗体122A2比本发明嵌合抗体102E9更强的ADCC 反应,也表明具有高亲和力的抗体比具有较低亲和力的抗体在ADCC方面更有效。
IFN-α分泌的抑制
对活化pDC引起的IFN-α分泌的抑制测试结果示于图5。
这些结果表明,对于由CpG活化的pDC引起的IFN-α分泌,五种抗 CD303嵌合抗体诱导了对该IFN-α分泌的抑制,并且该抑制在两个测试浓度(10和0.1μg/mL)下均存在。在0.1μg/mL浓度下,IFN-α测定表明抗体104C12和122A2与其它三种抗体(114D11、102E9、104E10)相比的优势。
TNF-α分泌的抑制
对活化pDC引起的TNF-α分泌的抑制测试结果示于图6。
这些结果表明,对于由CpG活化的pDC引起的TNF-α分泌,五种抗 CD303嵌合抗体在10μg/mL诱导了抑制作用。
补体依赖性细胞毒性(CDC)活性
CDC测试结果示于图7,表明五种嵌合抗体确实具有CDC活性。
实施例3.源自嵌合抗体122A2和102E9的人源化抗体的制备和表征
材料和方法
人源化序列的定义
在计算机上进行人源化工作(利用IMGT.org数据库和建模),以定义含有“人氨基酸”替代其鼠同源物的重链和轻链可变部分的各种序列。
对于每个VH或VL结构域,确定编码具有最接近原始嵌合抗体的鼠序列的氨基酸序列的VH或VL结构域的人基因。针对嵌合抗体122A2和 102E9确定的最接近人VH和VL基因在下表28中提及:
VH | VL | |
122A2 | IGHV1–2*02 | IGKV1–33*01 |
102E9 | IGHV7–4–1*02 | IGKV1–9*01 |
表28.最接近原始嵌合抗体的鼠序列的人VH和VL基因(IMGT命名法)。
对于每个VH和VL结构域,根据原始嵌合抗体的鼠氨基酸序列与最接近的人基因氨基酸序列之间的比对确定两个氨基酸序列(鼠/人)之间的不同突变位置,并且生成了并入可变数量的突变(用人氨基酸替代鼠氨基酸)的几种鼠序列。
因此,对于抗体122A2和102E9中的每一个,确定了每个重链可变部分(Hha、Hhb和Hhc)和轻链可变部分(Kha、Khb和Khc)的三个版本。对于抗体122A2,添加了轻链可变部分的第四版本(Khd)。这些不同的序列相对于原始嵌合抗体的VH和VL区包含可变数量的突变,如下表 29所述:
表29.与原始嵌合抗体的VH和VL区相比,源自嵌合抗体122A2和 102E9的人源化抗体的VH和VL区的氨基酸序列的突变。对于每个VH 或VL结构域,相对于原始嵌合抗体的VH和VL区具有最少数量突变的序列由**表示。相对于由**表示的序列的其它序列的额外突变加下划线。 **氨基酸残基的位置对应于IMGT独特编号。
表达载体的制备
将各种序列合成为线性双链DNA,称为“串”,具有用于褐家鼠(Rattusnorvegicus)的密码子优化。
通过同源重组、利用In- HD克隆试剂盒(Laboratories),进行编码人源化抗CD303抗体的表达载体的构建。为每个 Ig重链和轻链选择的表达载体是商业载体pCEP4(Invitrogen)。其与人细胞系FreeStyle HEK-293(该细胞系用于快速生产足够量的抗体以进行某些测试)组合使用时,具有高生产力的优点。pCEP4是单顺反子、大小为10,186bp、并具有表达感兴趣基因所必需的所有元件,即氨苄青霉素抗性基因、复制起点(pUC起点)、CMV启动子和SV40poly A(参见图8A)。在NheI和XhoI限制性位点之间、启动子的下游克隆感兴趣的序列(参见图8B-8N)。首先,进行这些酶的消化以便在所需地方打开载体。然后需要使用NucleoSpin质粒试剂盒(Macherey-Nagel)进行纯化以纯化线性化载体,降低至10,163bp。
与合成可变部分并行地,使用载体CHK622-21作为基质(包含针对褐家鼠优化的H和K链的恒定部分,通过PCR扩增制备重链和轻链的恒定部分。使用高保真DNA聚合酶、Herculase II Fusion(Agilent Technologies)、和引物进行PCR,所述引物限定为向恒定部分添加用于在其3'末端克隆的限制性位点以及与载体互补的15bp以允许重组克隆。一旦进行了PCR,就进行纯化凝胶(1.25%低琼脂糖)电泳,以确认感兴趣的片段确实被扩增,并作为回收所述片段的手段。使样品在低电压下通过纯化凝胶迁移,以提供DNA片段的良好分离。
一旦制备好所有的基因元件,可以通过In-试剂盒进行组装。因此,混合物(即线性化载体(0.5μL)、初始浓度为50ng/μL的“串”(1μL) 和重链或轻链恒定部分(1μL)用无菌水调至10μL)加入到含有冻干产品 (主要由高保真PCR酶CloneAmpTMHiFi组成)的试剂盒的管中。然后将混合物在37℃孵育15分钟,然后在50℃孵育15分钟。并行地,进行不含可变和恒定部分的仅线性化载体的连接,将其用作实验的阴性对照。
然后将载体克隆到高感受态大肠杆菌NEB 5-α细菌中,通过测序确认每个载体的各种克隆的序列。当确认克隆在序列上匹配时,使用 NucleoBond Xtra EF试剂盒(Macherey-Nagel),制备所选克隆的细菌培养物(300mL)以纯化其中所含的感兴趣载体。获得的质粒是无菌的,并且量足以在生产细胞系中进行共转染。
在FreeStyle HEK-293细胞中产生抗体
通过瞬时共转染,从FreeStyle人胚胎肾(HEK)-293细胞系产生抗体。最后是永生化的细胞系,具有在悬浮和不存在血清的情况下增殖的能力。在补充有8mM谷氨酰胺的Freestyle F17表达培养基(Life Technologies) 中培养的这种HEK细胞系也允许更大和更快的重组蛋白质生产。
在共转染期间,用于验证实验的对照是生长对照(对应于未经历转染的HEK细胞培养物)以及已经用编码荧光蛋白质GFP的载体pMAX转染的细胞系(其24小时后用于确定转染率)。用于稀释DNA的缓冲液、转染试剂和细胞是(Life Technologies)。聚乙烯亚胺(PEI) 是转染试剂(TA),其可以将载体引入细胞。观察到DNA与TA的比例为 1:2,包含H链的载体与包含K链的载体的比例为1:3。在DNA/TA复合物与细胞接触后,然后在37℃、8%CO2下振荡培养。
在共转染后7天的生产结束时,将细胞培养物以3,000g离心15分钟。收集含有所产生抗体的澄清的上清液,使用商业试剂盒FastELISA (RD-Biotech)进行测定,以精确地估计每种上清液的抗体量,用于之后进行人源化抗体对于CD303蛋白的亲和力研究。
用表达载体稳定转染的YB2/0克隆产生嵌合抗体122A2的某些人源化衍生物
用包含编码源自嵌合抗体122A2的人源化抗体122A2H5、122A2H7、 122A2H9和122A2H10的核酸的表达载体,稳定转染YB2/0克隆。然后产生抗体,并测定其在上清液中的量。
从用于在HEK细胞系中瞬时转染的单顺反子载体,通过SpeI-XbaI 消化将轻链(122A2H5:pCEP4_Kha_122A2;122A2H9: pCEP4_Khb_122A2;122A2H10:pCEP4_Khb_122A2;122A2H7: pCEP4_Kha_122A2)引入到HKgenEFss载体中以获得中间载体。然后,在这些中间载体上进行NheI-AscI消化以引入重链(122A2H5: pCEP4_Hha_122A2;122A2H9:pCEP4_Hha_122A2;122A2H10: pCEP4_Hhb_122A2;122A2H7:pCEP4_Hhc_122A2)。
通过ELISA表征产生的抗体的抗原结合
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA),研究在FreeStyle HEK-293细胞中产生的各种抗体的结合能力。
这种使用比色方法的技术使得可以检测和可视化抗原-抗体相互作用。ELISA的原理是,首先,用10ng抗原包被MaxiSorp板的每个孔,在这种情况下抗原是CD303胞外域。后者是从供应商Mybiosource购买的。第二,将上清中含有的产生的各种抗体全部稀释至相同浓度,并与抗原接触以使其结合。第三步是加入二抗HRP缀合的抗人抗体,对于扩增检测抗CD303抗体的抗原结合是必需的。最后,使用含有酶底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺或TMB)的溶液进行检测。出现底物着色表明抗原-抗体复合物的形成。这种着色的强度与存在的酶的量成比例,并因此与结合抗原的测试抗体的量成比例。通过加入H2SO4(酸)停止反应。使用分光光度计在 450nm的波长下读取这些颜色。
通过流式细胞仪表征产生的抗体的抗原结合
为了确认通过ELISA获得的结果,通过流式细胞仪评估了FreeStyle HEK-293细胞中产生的各种抗体。流式细胞仪可以证实重组抗体能够在细胞环境中结合其抗原,从而确认通过ELISA获得的结果。
用于进行该技术的细胞系CAL-1是从BPDCN患者获得的浆细胞样树突细胞的白血病细胞系。测试在上清液中所产生的抗体,但也测试用蛋白 A-琼脂糖凝胶(未在本文中详述)亲和色谱法纯化的抗体形式。
对于细胞染色,将细胞和抗体用PBS/1%FCS预稀释。在100μL反应体积中,1·105细胞与待测抗CD303抗体在4℃孵育30分钟,待测抗CD303 抗体为0.1μg/mL或1μg/mL两个浓度。孵育后几次洗涤。然后将由此形成的细胞/抗体复合物在4℃下与1:50稀释的二抗接触30分钟,二抗是与荧光染料藻红蛋白偶联的抗人IgG Fc F(ab')2。最后洗涤细胞并通过流式细胞仪(FC500,Beckman Coulter)、特别是通过测量平均荧光强度(MFI) 来研究细胞。使用各种阴性对照消除可能的非特异性结合,如:单独的细胞或直接与二抗接触,或用无关的嵌合抗体(因子VIII抗独特型)替代测试的抗体。最后,使用其它对照(如使用上清(假模))以表明其不影响抗体对膜抗原的亲和力。
IFN-α分泌的抑制
细胞的制备
通过Ficoll密度梯度从健康供体的外周血中分离外周血单个核细胞 (PBMC)。将107细胞/孔(200μL)转移到24孔平底培养板中,其中存在1μM CpG ODN 2216-1(Invivogen)和10ng/mL IL-3(产品编号:130- 093-909,Miltenyi Biotec)。在RPMI 10%FCS培养基中加入各种浓度(0 至1μg/mL)的抗CD303或无关抗体。然后将板在37℃和7%CO2下过夜孵育。
IFN-α测定法
收集每孔的培养物上清液并使用Human IFN–αModule Set试剂盒(产品编号:BMS216MST,eBioscience)通过ELISA进行测定。
诱导Jurkat-CD16细胞的IL-2分泌
该测试评估抗CD303抗体与CD16Jurkat细胞上表达的CD16(Fcγ受体III)结合并诱导IL-2分泌的能力。
该测试包括在96孔板中使抗CD303抗体、表达CD303的靶细胞、 CD16Jurkat细胞和十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯(PMA)接触。
在37℃下过夜孵育后,离心板并在上清液中测定分泌的IL-2量。
结果
产生的载体在HEK-293F细胞中共转染
从表达人源化重链和轻链序列的载体,通过在HEK-293F细胞中的瞬时共转染,产生各种重(H)链/轻(L或K)链组合,生成两种候选抗体的各种代表性版本。以这种方式生成以下抗体(见下表30):
1.杂合抗体(两个Ig链之一是人源化的,另一个是嵌合的),和
2.人源化抗体。
表30.源自嵌合抗体122A2和102E9的杂合或人源化抗体的名称,随所使用的人源化重链和轻链而变。
在产生该组36个分子而进行的各种瞬时共转染期间,使用载体pMAX 测定在第1天的转染效率。
在第7天生产结束时,收集含有所产生蛋白质的上清液、离心、过滤、最后进行测定,以测量所产生的IgG的滴度(见下表31和32)。由此获得的浓度随所产生抗体的各种版本所具有的H链和K链类型(即嵌合或人源化)而变化。
表31.使用FastELISA试剂盒测定的含有所生成抗体(嵌合抗体 122A2和其杂合或人源化的衍生物)的各种上清液在第7天的浓度,以μg/ mL计。
表32.使用FastELISA试剂盒测定的含有所生成抗体(嵌合抗体 102E9和其杂合或人源化的衍生物)的各种上清液在第7天的浓度,以μg/ mL计。
可以注意到,抗体浓度依赖于所产生的组合,也依赖于H和/或K链的类型(人源化或嵌合)。在本文中,嵌合抗体122A2和102E9以及大多数杂合体(如上所述的,嵌合H或K链和人源化H或K链的组合)的生产率远低于其余的分子。该观察与嵌合H和K链的表达有关,其对于令人满意的细胞表达是不利的。
嵌合抗体与人源化抗体的区别是已经突变的氨基酸;生产率的变化独特地依赖于几个氨基酸。
因此,对于源自102E9的抗体,具有嵌合重链或轻链的杂合抗体和具有Hhc重链(102E9H7、102E9H11和102E9H15)的人源化抗体都具有较低的生产率。
在源自122A2的抗体的情况下,嵌合K和人源化H Hha链导致较低的生产率。发现嵌合抗体122A2与其某些杂合和人源化衍生物相比具有最低的生产率。意外地,人源化使得可以在122A2H10(Hhb,Khb)的情况下将体积滴度提高多达100倍。
最后,应注意人源化抗体122A2比人源化抗体102E9整体更好地生成。这证实了相同同种型抗体的表达高度依赖于其一级序列并主要依赖于其可变部分。
通过ELISA表征所产生抗体的抗原结合
生成后从收集的培养上清液进行ELISA。首先,其均被稀释至相同的浓度,使得所有样品都处于相同的条件下。此外,通过离心、过滤来自在转染期间用作生长对照的细胞培养物的上清液,进行初始稀释。这些培养物不表达抗体,因此被称为“假模”培养物。然后使用含有PBS、4%BSA 和0.05%Tween的缓冲液,将样品在MaxiSorp 96孔板上稀释至一半。
当通过分光光度计读取时,产生的所有抗体(无论是源自122A2还是 102E9)都产生了其强度可量化的颜色信号。这可以解释为各种抗体特异性结合CD303胞外域的能力。然而,对抗原的亲和力存在差异,其表示为 OD450的差异。
因此,对于产生的每种抗体,可以将OD450图形表示为抗体浓度的函数。结果是双相曲线,具有导致平台的指数相。这种图形表示使得可以将所测试的抗体和其所源自的嵌合抗体按照其对CD303抗原的亲和力进行分类。
在源自102E9的抗体的情况下,在每个孔中沉积的抗体范围为 1.25ng/mL至20ng/mL。OD450信号的饱和显示为在约10ng/mL抗体的浓度。图9显示了各种人源化抗体获得的结果。使用5ng/mL的浓度对人源化抗体进行分类(图10)。
人源化抗体都不如嵌合抗体那样好地结合CD303抗原。然而,所有人源化抗体保留了结合CD303抗原的合理能力。人源化抗体102E9H10在所有人源化抗体中具有最好的CD303抗原结合能力。与原始嵌合抗体102E9 相比,它代表的结合损失仅为约20%(图10)。其它三种人源化抗体 102E9H6、102E9H7和102E9H9也具有与参考嵌合抗体相似的结合能力。它们分别具有73%(102E9H6)、76%(102E9H7)和71%(102E9H9) 的CD303胞外域结合能力。
在源自122A2的抗体的情况下,测试的抗体浓度范围为1.75至 10ng/mL。使用的对照与前述相同:单独的上清液(假模)和嵌合抗体,这里为122A2。图11显示了各种人源化抗体获得的结果。使用5ng/mL的浓度分类人源化抗体(图12)。
所有测试的抗体都能够结合CD303胞外域。“上清液”阴性对照样品的 OD450接近零。因此,没有上清液导致的非特异性结合。此外,对所有测试的样品也观察到剂量-反应效应。代表各种人源化抗体的大部分曲线在外观上与嵌合抗体122A2的相似。
最后,122A2的几种人源化抗体(122A2H5、122A2H6、122A2H7、 122A2H9、122A2H10、122A2H11、122A2H14和122A2H15)看上去具有至少与嵌合抗体相等(122A2H11和122A2H15)、并且有时显著高于嵌合抗体(122A2H5、122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10和122A2H14)的CD303胞外域结合能力。
通过流式细胞仪表征所产生抗体的抗原结合
还通过流式细胞仪研究了抗体结合,以确认ELISA获得的结果。
对于抗体102E9,选择人源化抗体102E9H10、102E9H6、102E9H7、102E9H9和嵌合抗体102E9以通过该技术进行表征。
对于抗体122A2,选择上清液中的人源化抗体122A2H5、122A2H6、 122A2H9、122A2H7、122A2H10、122A2H14、122A2H17、122A2H15、杂合抗体122A2H8、122A2H3和嵌合抗体122A2进行表征。122A2H8代表最佳的杂合抗体,其亲和力高于嵌合抗体;而122A2H3具有比亲本抗体低得多的亲和力。所选择的人源化抗体属于与原始嵌合抗体相比具有更好的靶蛋白亲和力的抗体之列。
在抗体102E9的情况下,人源化和嵌合抗体之间几乎没有差异(文中未示出)。
在抗体122A2的情况下,结果示于图13(其代表浓度为0.1μg/mL的每种测试抗体的平均荧光),其表明某些人源化抗体(在上清液中测试) 显示比嵌合抗体122A2更好的亲和力。特别是人源化抗体122A2H5、 122A2H9、102E9H7和122A2H10是这种情况。先前通过ELISA鉴定为具有至少与嵌合抗体相等的结合能力并通过流式细胞仪测试的其它人源化抗体(122A2H14和122A2H15)在细胞仪测试中具有略低于嵌合抗体的结合(MFI),但仍然保留了接近嵌合抗体的结合。因此,通过流式细胞仪获得的结果支持了之前通过ELISA获得的结果。
以纯化形式评估了相同的抗体,其显示相同的结果。
IFN-α分泌的抑制
CpG基序诱导PBMC中包含的pDC分泌IFN-α。在该实验(图14) 中,比较了各种抗CD303抗体(嵌合122A2和四种122A2人源化抗体) 介导的IFN-α分泌抑制。
IC 50值(下表33)为:
·嵌合抗体ch.122A2为0.95ng/mL,
·人源化抗体h122A2H5为0.81ng/mL,
·人源化抗体h122A2H7为0.86ng/mL,
·人源化抗体h122A2H9为0.91ng/mL,
·人源化抗体h122A2H10为0.94ng/mL。
表33.对于PBMC中pDC的IFN-α分泌的50%抑制浓度(IC50)。 n/a:不适用。
这些结果表明,测试的四种122A2人源化单克隆抗体能够抑制IFN-α分泌,其IC50低于或等于嵌合抗体的IC50。
通过稳定转染表达载体的YB2/0克隆生产源自嵌合抗体122A2的人源化抗体
源自嵌合抗体122A2的人源化抗体122A2H5、122A2H7、122A2H9 和122A2H10在生产率和抗原结合方面看起来特别有利。因此选择它们来产生稳定转染这些抗体的表达载体的YB2/0克隆。
表达人源化抗体122A2H5、122A2H7、122A2H9和122A2H10的 HKgenEFss载体的图谱示于图15A至15D中。
由此获得的四个克隆的上清液测定数据示于下表34中,其表明这四种人源化抗体可以以令人满意的生产率生产,其中抗体122A2H9具有最好的生产率。
抗体 | 上清液测定(μg/mL) |
122A2H5 | 17.96 |
122A2H7 | 19.8 |
122A2H9 | 20.47 |
122A2H10 | 19.32 |
表34.在表达源自嵌合抗体122A2的人源化抗体122A2H5、122A2H7、 122A2H9和122A2H10的稳定YB2/0克隆上清液中产生的人源化抗体的测定。
诱导Jurkat-CD16细胞的IL-2分泌
测试源自嵌合抗体122A2并由稳定的YB2/0克隆产生的人源化抗体 122A2H9结合CD16并诱导Jurkat-CD16细胞分泌IL-2的能力,并与嵌合抗体122A2进行比较。
获得的示例性结果示于图16。另外,几个实验的结果示于表35中,表中表示为ng/mL(50%),该值表示达到嵌合抗体平台的50%所需的抗体量。值越低表示活性更好。
表35.达到嵌合抗体平台的50%所需的抗体量,以ng/mL(表格的上部)或两个抗体之间的比例表示,嵌合抗体ch122A2的值被任意地设定为 1以便平衡实验之间的差异。
这些结果表明,尽管Fc片段序列与嵌合抗体相同,人源化抗体 122A2H9诱导的Jurkat-CD16细胞IL-2分泌比嵌合抗体略高。
结论
为了优化抗体的免疫原性耐受性,对本发明人生成的五种嵌合抗体中的两种进行了人源化,目的是保持对CD303抗原相似的或不显著不同的亲和力。为此,对于每种原始抗体,组合测试了几种人源化重链和轻链,并转染至HEK-293F细胞。
在样品测定之后,注意到抗体浓度依赖于原始氨基酸序列(源自122A2 的人源化抗体比源自102E9的人源化抗体更好地生成)、依赖于生成的组合以及还依赖于H和/或K链的类型(人源化或嵌合)。这些数据证实,总体来说,相同同种型的抗体的表达高度依赖于其一级序列并主要依赖于其可变部分。此外,源自两种原始嵌合抗体中的一种或另一种的许多人源化抗体比原始嵌合抗体更好地生成。
通过ELISA表征了所产生的抗体。在所测试的抗体彼此相似的范围中,难以鉴定与原始嵌合抗体具有相同的抗原结合特性的人源化抗体。当以几种浓度测试抗体时,分析集中于观察到各种抗体之间OD450存在实际差异的浓度。因此,通过5ng/mL的浓度,可以表明102E9的最佳人源化抗体 102E9H10具有嵌合抗体80%的CD303胞外域结合能力。以这种方式,鉴定并选择四种人源化抗体(102E9H10、102E9H6、102E9H7和102E9H9),并通过流式细胞仪确认为感兴趣的人源化抗体。
在源自122A2的人源化抗体的情况下,几个抗体首先被ELISA清楚地鉴定为具有至少等于(122A2H11和122A2H15)、实际上高于(122A2H5、 122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10和122A2H14)嵌合抗体的 CD303胞外域结合能力。通过使用流式细胞仪,以正交方法补充了从上清液获得的这些结果。
总体而言,上述结果表明,对于嵌合抗体122A2和102E9的每种,可以产生比原始嵌合抗体以更好的生产率生成的人源化抗体(因此在人中具有降低的免疫原性),其所具有的CD303抗原结合能力为:
·对于嵌合抗体102E9的衍生物,至少接近嵌合抗体(抗体102E9H10 为至少80%,抗体102E9H6、102E9H7和102E9H9为至少70%)。
·对于嵌合抗体122A2的衍生物,至少等于(122A2H11和122A2H15)、实际上高于(122A2H5、122A2H6、122A2H7、122A2H9、122A2H10和 122A2H14)嵌合抗体。
此外,源自122A2的人源化抗体能够与嵌合抗体122A2一样好地抑制 IFN-α分泌。
对于源自122A2的某些人源化抗体,能够获得稳定转染的YB2/0克隆,其以令人满意的生产率产生抗体。这些抗体具有强的CD16结合和诱导 Jurkat-CD16细胞分泌IL-2的能力。
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Claims (30)
1.一种针对人CD303抗原(SEQ ID NO:130)胞外域的单克隆抗体或其功能片段或衍生物,特征在于:
a)其与至少一种选自以下的抗体竞争结合人CD303抗原:
i)重链可变区包含SEQ ID NO:43和轻链可变区包含SEQ ID NO:48的抗体;
ii)重链可变区包含SEQ ID NO:44和轻链可变区包含SEQ ID NO:49的抗体;
iii)重链可变区包含SEQ ID NO:45和轻链可变区包含SEQ ID NO:50的抗体;
iv)重链可变区包含SEQ ID NO:46和轻链可变区包含SEQ ID NO:51的抗体;
v)重链可变区包含SEQ ID NO:47和轻链可变区包含SEQ ID NO:52的抗体;且
b)轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区。
2.一种针对人CD303抗原(SEQ ID NO:130)胞外域的单克隆抗体或其功能片段或衍生物,特征在于:
a)与CHO细胞中产生的针对人CD303抗原胞外域的抗体相比,其具有改善的对Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa,CD16a)的亲和力;和
b)轻链和重链恒定区是来自非鼠物种的恒定区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其重链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-H(根据IMGT命名法的重链CDR),并且其轻链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-L(根据IMGT命名法的轻链CDR):
i)CDR1-H家族1:SEQ ID NO:1,CDR2-H家族1:SEQ ID NO:2,CDR3-H家族1:SEQ ID NO:3,CDR1-L家族1:SEQ ID NO:4,CDR2-L家族1:SEQ ID NO:5,CDR3-L家族1:SEQ ID NO:6;或
ii)CDR1-H家族2:SEQ ID NO:7,CDR2-H家族2:SEQ ID NO:8,CDR3-H家族2:SEQ ID NO:9,CDR1-L家族2:SEQ ID NO:10,CDR2-L家族2:SEQ ID NO:11,CDR3-L家族2:SEQ ID NO:12。
4.根据权利要求3所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于重链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-H(根据IMGT命名法的重链CDR),并且轻链包含具有以下氨基酸序列、或与以下序列具有至少80%同一性的序列的三个CDR-L(根据IMGT命名法的轻链CDR):
i)CDR1–H–122A2:SEQ ID NO:13,CDR2–H–122A2:SEQ ID NO:14,CDR3–H–122A2:SEQ IDNO:15,CDR1–L–122A2:SEQ ID NO:16,CDR2–L–122A2:SEQ ID NO:17,CDR3–L–122A2:SEQ IDNO:18;
ii)CDR1–H–102E9:SEQ ID NO:19,CDR2–H–102E9:SEQ ID NO:20,CDR3–H–102E9:SEQID NO:21,CDR1–L–102E9:SEQ ID NO:22,CDR2–L–102E9:SEQ ID NO:23,CDR3–L–102E9:SEQID NO:24;
iii)CDR1–H–104C12:SEQ ID NO:25,CDR2–H–104C12:SEQ ID NO:26,CDR3–H–104C12:SEQ ID NO:27,CDR1–L–104C12:SEQ ID NO:28,CDR2–L–104C12:SEQ ID NO:29,CDR3–L–104C12:SEQ ID NO:30;
iv)CDR1–H–114D11:SEQ ID NO:31,CDR2–H–114D11:SEQ ID NO:32,CDR3–H–114D11:SEQ ID NO:33,CDR1–L–114D11:SEQ ID NO:34,CDR2–L–114D11:SEQ ID NO:35,CDR3–L–114D11:SEQ ID NO:36;或
v)CDR1–H–104E10:SEQ ID NO:37,CDR2–H–104E10:SEQ ID NO:38,CDR3–H–104E10:SEQID NO:39,CDR1–L–104E10:SEQ ID NO:40,CDR2–L–104E10:SEQ ID NO:41,CDR3–L–104E10:SEQ ID NO:42。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于,其重链包含具有选自SEQ ID NO:43至47、131至133、和138至140的序列、或与SEQ ID NO:43至47、131至133、和138至140之一具有至少80%同一性的序列的可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其轻链包含具有选自SEQ ID NO:48至52、134至137、和141至143的序列、或与SEQ ID NO:48至52、134至137、和141至143之一具有至少80%同一性的序列的可变区。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其是嵌合抗体,有利地是重链和轻链恒定区为人来源的嵌合抗体。
8.根据权利要求7所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其具有重链和轻链,所述重链和轻链包含以下氨基酸序列或与以下序列具有至少80%同一性的序列:
i)抗体122A2:重链:SEQ ID NO:55,轻链:SEQ ID NO:60,
ii)抗体102E9:重链:SEQ ID NO:56,轻链:SEQ ID NO:61,
iii)抗体104C12:重链:SEQ ID NO:57,轻链:SEQ ID NO:62,
iv)抗体114D11:重链:SEQ ID NO:58,轻链:SEQ ID NO:63或
v)抗体104E10:重链:SEQ ID NO:59,轻链:SEQ ID NO:64。
9.根据权利要求1至8中任一项的所述抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其是人源化抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其重链包含具有选自SEQ ID NO:131至133和138至140的序列或与SEQ ID NO:131至133之一具有至少80%同一性的序列的可变区,有利地,其重链包含具有选自SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ IDNO:139的序列或与SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:139之一具有至少80%同一性的序列的可变区。
11.根据权利要求9或10所述的抗体、其功能片段或衍生物,其特征在于其轻链包含具有选自SEQ ID NO:134至137和141至143的序列或与SEQ ID NO:134至137和141至143之一具有至少80%同一性的序列的可变区,有利地,其轻链包含具有选自SEQ ID NO:134、SEQID NO:135和SEQ ID NO:142的序列或与SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:142之一具有至少80%同一性的序列的可变区。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其具有重链和轻链,所述重链和轻链的可变区具有以下氨基酸序列或与以下序列具有至少80%同一性的序列:
i)抗体122A2H5:重链:SEQ ID NO:131,轻链:SEQ ID NO:134,
ii)抗体122A2H6:重链:SEQ ID NO:132,轻链:SEQ ID NO:134,
iii)抗体122A2H7:重链:SEQ ID NO:133,轻链:SEQ ID NO:134,
iv)抗体122A2H9:重链:SEQ ID NO:131,轻链:SEQ ID NO:135,
v)抗体122A2H10:重链:SEQ ID NO:132,轻链:SEQ ID NO:135,
vi)抗体122A2H14:重链:SEQ ID NO:132,轻链:SEQ ID NO:136,
vii)抗体102E9H6:重链:SEQ ID NO:139,轻链:SEQ ID NO:141,
viii)抗体102E9H7:重链:SEQ ID NO:140,轻链:SEQ ID NO:141,
ix)抗体102E9H9:重链:SEQ ID NO:138,轻链:SEQ ID NO:142,
x)抗体102E9H10:重链:SEQ ID NO:139,轻链:SEQ ID NO:142。
13.根据权利要求12所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其具有重链和轻链,所述重链和轻链包含以下氨基酸序列或与以下序列具有至少80%同一性的序列:
i)抗体122A2H5:重链:SEQ ID NO:150,轻链:SEQ ID NO:153,
ii)抗体122A2H6:重链:SEQ ID NO:151,轻链:SEQ ID NO:153,
iii)抗体122A2H7:重链:SEQ ID NO:152,轻链:SEQ ID NO:153,
iv)抗体122A2H9:重链:SEQ ID NO:150,轻链:SEQ ID NO:154,
v)抗体122A2H10:重链:SEQ ID NO:151,轻链:SEQ ID NO:154,
vi)抗体122A2H14:重链:SEQ ID NO:151,轻链:SEQ ID NO:155,
vii)抗体102E9H6:重链:SEQ ID NO:158,轻链:SEQ ID NO:160,
viii)抗体102E9H7:重链:SEQ ID NO:159,轻链:SEQ ID NO:160,
ix)抗体102E9H9:重链:SEQ ID NO:157,轻链:SEQ ID NO:161,
x)抗体102E9H10:重链:SEQ ID NO:158,轻链:SEQ ID NO:161。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其是同种型IgG,特别是IgG1。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其重链和/或其轻链进一步包含SEQ ID NO:65的异源信号肽。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其在选自以下的细胞系中产生:SP2/0;YB2/0;IR983F;人骨髓瘤Namalwa;PERC6;CHO细胞系,特别是CHO–K–1、CHO–Lec10、CHO–Lec1、CHO–Lec13、CHO Pro–5、CHO dhfr-、或缺失编码FUT8基因和/或GMD基因的两个等位基因的CHO细胞系;Wil-2;Jurkat;Vero;MoIt–4;COS–7;293–HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0–Ag 14,P3X63Ag8.653,鸭胚胎细胞系(Valneva);大鼠肝癌细胞系H4–II–E(DSM ACC3129)和H4–II–Es(DSM ACC3130),NM–H9D8(DSM ACC2806),NM–H9D8–E6(DSM ACC 2807)和NM H9D8–E6Q12(DSM ACC 2856)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其具有低于或等于65%的低岩藻糖含量。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其具有大于或等于30%的寡甘露糖型N-聚糖含量。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物,特征在于其具有大于或等于50%的半乳糖含量。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的抗体,特征在于,Fc片段在其Fc片段中具有以下突变或突变的组合:
·N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y,
·P230S/N315D/M428L/N434Y,
·E294del/T307P/N434Y,
·T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y,
·V259I/N315D/N434Y,或
·T256N/A378V/S383N/N434Y,
其中Fc片段中氨基酸的编号是Kabat的EU索引编号。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的抗体,特征在于所述抗体在Fc片段的位置293(Del293)或294(Del294)上具有氨基酸缺失,其中Fc片段中的氨基酸编号是Kabat的EU索引编号。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的功能性抗体片段,特征在于其选自片段Fv、ScFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc或双抗体。
23.一种编码根据权利要求1至22中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物的重链和/或轻链的核酸。
24.根据权利要求23所述的核酸,特征在于其包含SEQ ID NO:86至95和181至193中的至少一个。
25.一种载体,其包含根据权利要求23或24所述的核酸。
26.一种宿主细胞、转基因非人动物或转基因植物,其包含权利要求23或权利要求24所述的至少一种核酸或根据权利要求25所述的载体。
27.根据权利要求26所述的宿主细胞,其选自以下细胞系:SP2/0;YB2/0;IR983F;人骨髓瘤Namalwa;PERC6;CHO细胞系,特别是CHO–K–1、CHO–Lec10、CHO–Lec1、CHO–Lec13、CHOPro–5、CHO dhfr-、或缺失编码FUT8基因和/或GMD基因的两个等位基因的CHO细胞系;Wil-2;Jurkat;Vero;MoIt–4;COS–7;293–HEK;BHK;K6H6;NSO;SP2/0–Ag 14,P3X63Ag8.653,鸭胚胎细胞系(Valneva);大鼠肝癌细胞系H4–II–E(DSM ACC3129)和H4–II–Es(DSMACC3130),NM–H9D8(DSM ACC2806),NM–H9D8–E6(DSM ACC 2807)和NM H9D8–E6Q12(DSM ACC2856)。
28.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物用作医药产品。
29.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物用于治疗或预防表达CD303抗原的造血***肿瘤,特别是母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤。
30.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体、其功能片段或衍生物用于治疗或预防炎性疾病,特别是自身免疫性疾病。
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