CN107630010B - 抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物耐药性研究技术领域，具体提供一种抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶(DNAzyme)，所述脱氧核酶为DNA片段Dz136或Dz341，Dz136的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，Dz341的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还进一步提供了所述脱氧核酶在抑制细菌耐药性以及制备抑制qnrD基因阳性细菌耐药性的试剂中的应用。本发明开创性的利用DNAzyme抑制质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的表达，通过新设计的脱氧核酶Dz136或Dz341，在喹诺酮类抗生素条件下，能够显著抑制细菌菌株的生长速度，Dz341导入后菌株生长速度变缓慢，进入对数生长期的时间延长了4.5小时。

Description

抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶及 其应用

技术领域

本发明属于微生物耐药性研究技术领域，具体涉及一种抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶及其应用。

背景技术

近年来研究发现，质粒介导的细菌对氟喹诺酮药物的耐药性也发挥着重要作用，并且检出率呈上升趋势。由于其重要的临床意义，PMQR迅速成为近几年研究的热点之一。尤其值得关注的是Cavaco L.M等首次从沙门氏菌当中发现了一个新的PMQR基因，命名为qnrD。该基因编码214个氨基酸，与qnrA1，qnrB1和qnrS1的同源性分别为48％、61％和41％。而在其他种属的细菌中还没有该基因的相关报道，也还没有该基因功能研究相关的报道。

脱氧核酶(deoxyribozyme，DNAzyme)是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的单链DNA片段，能特异性识别靶mRNA，并将其切断。当前，DNAzyme的应用主要集中在对肿瘤和病毒复制过程的抑制的研究上，将脱氧核酶应用于抑制细菌耐药性的报道极少。

基于以上技术背景，如何通过对脱氧核酶的结构进行设计改造，使得其能够应用于抑制细菌耐药性，是一个亟待深入研究的课题。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶，基于所述抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶，本发明的另一目的是提供其应用。

本发明所采用的技术方案为：

根据本发明的具体实施方式，本发明的抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶为DNA片段Dz136或Dz341，Dz136的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，Dz341的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的具体实施方式，本发明的抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶中，DNA片段Dz136或Dz341的两端经硫代磷酸化修饰处理。进一步优选的，DNA片段Dz136或Dz341的5′和3′端的各2个磷酸二酯键进行硫代修饰。

基于前述本发明所提供的抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶，根据本发明的具体实施方式，本发明还提供了所述脱氧核酶的应用，所述脱氧核酶可以应用于抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD，相应的可应用于制备抑制qnrD基因阳性细菌耐药性的试剂，所述细菌优选为大肠杆菌。当用于制备抑制qnrD基因阳性细菌耐药性的试剂时，所述脱氧核酶的浓度为0.1μmol/L～1.6μmol/L。进一步的，根据本发明的具体实施方式，本发明还提供了所述脱氧核酶在制备抑制qnrD基因阳性细菌生长的试剂中的应用，具体的，所述抑制细菌生长的试剂中优选包含有喹诺酮类抗生素，所述喹诺酮类抗生素优选为环丙沙星。

基于前述技术方案，本发明的有益效果为：本发明开创性的利用DNAzyme抑制qnrD基因的表达，通过新设计的脱氧核酶Dz136或Dz341，在喹诺酮类抗生素条件下，能够显著抑制细菌菌株的生长速度，Dz341导入后菌株生长速度变缓慢，进入对数生长期的时间延长了4.5小时。本发明为质粒介导细菌对氟喹诺酮类药物耐药性的控制提出了新的思路，具有较好的进一步开发及应用前景。

附图说明

图1是qnrD基因全长二级结构分析预测结果图；

图2是图1中所示qnrD基因全长二级结构中脱氧核酶Dz136作用靶位点图；

图3是qnrD基因全长二级结构中脱氧核酶Dz341作用靶位点图；

图4是无抗性条件下DNAzyme转化菌的生长曲线图；

图5是不同浓度DNAzyme转化菌在环丙沙星抗性条件下生长曲线图；

图6是不同浓度Dz136导入菌及对照组进入对数生长期时间方差分析柱状图；

图7是不同DNAzyme导入菌及对照组生长曲线图；

图8是不同DNAzyme导入菌及对照组进入对数生长期时间方差分析柱状图。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本发明的设计原理及作用效果，下文将结合具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释。应当声明的是，其不应当理解成对本发明的保护范围的限制。

具体实施例：

1、DNAzyme靶位点的选择和设计

在NCBI的GenBank库获得qnrD基因全长mRNA序列，并利用美国伦斯勒理工学院生物信息学RNA二级结构在线分析软件进行qnrD基因mRNA二级结构分析，以获得qnrD基因mRNA二级结构预测图。qnrD基因mRNA二级结构预测图显示qnrD基因全长mRNA中分别有2个区域(70bp-150bp和320bp-360bp)的结构相对简单，可以作为DNAzyme设计的候选位点(图1中方框标示区域)。qnrD基因全长mRNA分析预测结果见图1。选择的两个靶位点区域局部放大图见图2和图3，根据分析预测结果，选取无复杂二级结构的区域进行DNAzyme靶位点的设计。

2、DNAzyme的序列设计以及对照序列设计

在对qnrD基因mRNA二级结构预测的基础上，针对mRNA的136bp和341bp处设计出2条DNAzyme(分别命名为Dz136和Dz341)，并将与mRNA互补臂的碱基进行硫代磷酸化修饰，具体的设计以及修饰方法原理过程如下：

设计过程中遵循以下四点：一是作用位点应结构相对简单，不易形成复杂的高级结构；二是设计的DRz自身分子内不能形成Watson.Crick碱基配对；三是所设计的DRz的剪切位点应符合设计要求，剪切位点应具有以下结构特点5′…R↓Y…3′(R＝A或G，Y＝U或C，↓指示R和Y之间可被剪切的磷酸二酯键)；四是注意底物结合区的长度及GC含量，结合区越长，GC含量越多，剪切产物越不易与DRz解离，剪切的速率将会下降。反之则DRz和底物RNA不易稳定结合，同样会使剪切速率和效率降低。本发明还优选对DRz 5′和3′端的各2个磷酸二酯键进行硫代修饰，以提高DRz的稳定性而又能保持大部分剪切活性。本发明所设计的Dz136及Dz341两种脱氧核酶均完全符合DNAzyme的设计要求。在DRz切割位点临界处的核苷酸改变将会显著降低催化活性，而其催化核心的改变可使其完全丧失催化活性。因此，本实施例还分别设计了两个对照突变对照(Dz136a，Dz136b)，分别在切割位点临界处和催化核心内进行了点突变，本发明结果证实了DNAzyme具有非常严格的序列特异性。

本实施例最终同时设计两条分别在结合臂和DNAzyme内部点突变的序列(分别命名为Dz136a和Dz136b)和1条相同长度的随机序列作为对照。Dz136、Dz341、Dz136a、Dz136b和随机序列分别依次见SEQ ID NO.1～5，为了便于对照，五条序列也可参见下表：

上表中，“□”标示序列为DNAzyme的核心催化区域，“__”标示区域为DNAzyme与靶位点结合臂。序列中小写字母部位为突变对照突变位点。

在以上序列设计的基础上，可以通过行业常规方法合成各DNA片段，具体的合成方法过程本实施例中不再赘述，本实施例的各DNA片段均在上海生工生物公司合成获得。

3、实验材料

3.1菌株

大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)，质控菌大肠埃希菌ATCC25922。TA克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，表达载体pET-30b(+)购自Novagen公司。

3.2试剂

3.2.1分子生物学试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer(Mg2+free)、MgCl2、TIANgel MidiPurification Kit、DNA MarkerⅣ、DNA Marker DL2000,蛋白质MarkerⅡ、2×SDS上样缓冲液、购自天根公司；限制性内切酶HindⅢ、NdeⅠ、DNA Ligation Kit Ver2.0、IPTG购自TaKaRa公司。

3.2.2溶液及培养液

LB培养基、TE(pH＝8.0)、50×TAE、5×TBE、10×DNALoading buffer、SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、1mg/mL RNase、10mol/L醋酸铵、M-H培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；

3.3主要仪器

美国Biometra公司Personal cycler PCR仪、Power300稳压稳流电泳仪、DOC3000凝胶成像***(Bio-Rad公司产品)、高速台式离心机(TGL-16B)、HZS-H水浴式振荡培养箱、HH.S11-2型电热恒温水浴锅、WH-851旋涡混合器、DYY-Ⅱ恒压恒流电泳仪(Bio-Rad)，电子天平等。

4、方法研究过程

4.1 DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响研究

4.1.1无抗条件下DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响

分别将Dz136及突变对照Dz136a，Dz136b和随机序列DNA对照分别电转导入100μlpET-qnrD-BL21感受态细胞。电转步骤如下：取-80℃冻存的感受态细胞(90μl/管)，冰上融化，分别加入10μl脱氧核酶(8μmol/L)Dz136及相同浓度的对照。轻柔混匀后转入0.1mm电转杯中，在电穿孔仪中以25μf，900V,200Ω进行电击。电击后，迅速加入37℃预热的SOC培养基5mL，37℃，140r/min复苏1h。再分别以1：10比例加入新鲜LB培养基，37℃，140r/min，震荡培养18h。分别于0h，1.5h，3h，4.5h，6h，7.5h，9h，10.5h，12h，13.5h，15h，16.5h，18h测定样品OD600值。绘制转化菌株生长曲线，并对各组菌进入对数生长期的时间进行统计学方差分析。

4.1.2环丙沙星抗性下DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响

(1)不同浓度DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响

分别将10μl不同浓度的Dz136(16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L、1μmol/L)及突变对照Dz136a，Dz136b和随机序列DNA对照分别电转导入90μl pET-qnrD-BL21重组菌感受态细胞。电转步骤如下：取-80℃冻存的感受态细胞(100μl/管)，冰上融化，分别加入10μl5种不同浓度的脱氧核酶及对照。轻柔混匀后转入0.1mm电转杯中，在电穿孔仪中以25μf，900V,200Ω进行电击。电击后，迅速加入37℃预热的环丙沙星抗性(0.06μg/ml)SOC培养基5mL，37℃，140r/min复苏1h。再分别以1：10比例加入新鲜环丙沙星抗性(0.06μg/ml)LB培养基，37℃，140r/min，震荡培养18h。分别于0h，1.5h，3h，4.5h，6h，7.5h，9h，10.5h，12h，13.5h，15h，16.5h，18h测定样品OD600值。绘制转化菌株生长曲线，并对各组菌进入对数生长期的时间进行统计学方差分析。

(2)不同DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响

对比相同浓度下(8nmol/L)，不同DNAzyme(Dz136，Dz341)对pET-qnrD-BL21重组菌在环丙沙星抗性条件下生长的影响，操作步骤及数据采集同上。绘制转化菌株生长曲线，并对各组菌进入对数生长期的时间进行统计学方差分析。

5、结果分析

5.1 DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的抑制结果

5.1.1无抗性条件下DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响

无抗性条件下DNAzyme转化菌的生长曲线见图4，结果表明：导入DNAzyme的pET-qnrD-BL21重组菌及对照组细菌在无喹诺酮类抗生素环境中正常生长，在第3小时即进入对生长期，9小时时进入平台期。Dz136，Dz 341及突变对照Dz136a，Dz136b与随机对照和去离子水对照生长曲线无显著差异(P>0.05)。

5.1.2环丙沙星抗性下不同浓度DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌生长曲线的影响

不同浓度DNAzyme导入pET-qnrD-BL21重组菌后在环丙沙星抗性条件下生长曲线见图5。结果表明：在环丙沙星抗性条件下导入不同浓度Dz136的转化菌生长与对照株细菌菌相比生长活性降低，进入对数生长期的时间延长到了7.5-9小时。参见图6，将不同浓度Dz136导入菌与对照组进入对数生长期的时间做方差分析，差异显著(P<0.05)而突变对照组与去离子水对照组及随机DNA对照组相比，差异不显著。说明Dz136能特异性的抑制qnrD基因的表达，降低了菌株的耐药性。在Dz136的结合臂和催化核心区域进行点突变后，Dz136催化活性消失。同时结果表明，Dz136抑制qnrD表达的效率与浓度呈正相关，导入Dz136浓度越高，抑制效果越好。

5.1.3不同DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌在环丙沙星抗性条件生长曲线的影响

不同DNAzyme对pET-qnrD-BL21重组菌在环丙沙星抗性条件下生长曲线见图7，结果表明：在环丙沙星抗性条件下Dz136，Dz341导入后，菌株生长速度变缓慢，进入对数生长期的时间延长了4.5小时。表明所设计的Dz136，Dz341两条脱氧核酶均能特异性的抑制qnrD基因的表达。将不同DNAzyme导入菌与对照组进入对数生长期的时间做方差分析见图8，图8中，A：Dz341，B：Dz136，C：Dz136a，D：Dz136b，E：随机DNA对照，F：去离子水对照。＊＊:与对照组相比，差异显著(P<0.05)；＊与去离子水对照相比，差异不显著(P>0.05)，而两种DNAzyme之间差异不显著(P>0.05)。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川大学

<120> 具有抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

tgttggtcat ttagcaacat cgatcggagt cggtttctg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

caatagtata agagcaacat cgatcggatt ttaatcggg 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tgttggtcat ttagtaacat cgatcggagt cggtttctg 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tgttggtcat taagcaacat cgatcggagt cggtttctg 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

tcagcagtag tatgcgtact atgtctatgg tctaggtct 39

Claims (8)

1.抑制细菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrD的脱氧核酶，其为DNA片段Dz136或Dz341，Dz136的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，Dz341的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的脱氧核酶，DNA片段Dz136或Dz341的两端经硫代磷酸化修饰处理。

3.根据权利要求1所述的脱氧核酶，DNA片段Dz136或Dz341的5′和3′端的各2个磷酸二酯键进行硫代修饰。

4.权利要求1～3任一所述脱氧核酶在制备抑制qnrD基因阳性细菌耐药性的试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述细菌为大肠杆菌。

6.根据权利要求4所述的应用，所述抑制细菌耐药性的试剂中，所述脱氧核酶的浓度为0.1μmol/L～1.6μmol/L。

7.权利要求1～3任一所述脱氧核酶在制备抑制qnrD基因阳性细菌生长的试剂中的应用；所述抑制qnrD基因阳性细菌生长的试剂中还包含有喹诺酮类抗生素。

8.根据权利要求7所述的应用，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。

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