CN107625794A - 灵芝醇提物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的制剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灵芝提取物在制备预防和/或治疗疾病的制剂中的用途,具体涉及一种灵芝醇提物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的制剂中的用途。经实验研究发现,灵芝醇提物能显著增强PC12细胞增殖,对PC12细胞损伤模型具有保护作用,显著改善AD模型大鼠学习记忆能力,显著减少阿尔茨海默症相关蛋白Aβ1‑42和Tau的表达,安全性高,可以用于包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病的预防和/或治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种灵芝提取物在制备预防和/或治疗疾病的制剂中的用途,具体涉及一种灵芝醇提物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的制剂中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经***退行性疾病。在临床上,通常以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征,迄今为止,病因及发病机制尚不明确,可能有多因素参与,如老龄、遗传、代谢、头部外伤史、***缺乏等。
研究发现,神经元损伤是阿尔茨海默症的发病因素之一。现代研究还发现,引起神经细胞死亡的机理主要包括氧化应激机理、线粒体机能障碍机理、兴奋性毒性机理、炎症机理及细胞凋亡(apoptosis)机理等。它们之间相互影响,最终导致神经功能失调和细胞死亡。这些关于神经退行性疾病病变机理研究的新发现,为该类疾病病变机理的阐明提供了有用的资料,同时也为寻找相应的新型药物提供了新的思路和作用靶点。
近年,研究者提出神经细胞保护(Neuroprotection)的概念,试图通过以下3种途径来保护神经细胞,防止其退行性改变:
(1)抑制神经细胞退行性改变的启动因子:导致神经元变性的因素主要包括线粒体功能障碍、异常蛋白沉积、炎症、自由基损伤和氧化应激反应和兴奋性氨基酸毒性等,目前研究的许多药物都是为了通过清除上述致病因素,发挥神经元的保护作用,用于防治神经退行性疾病。
(2)阻断神经细胞退行性改变的信号传导过程:神经退行性病变的共同病理机制之一就是神经细胞的凋亡。现代研究证明,兴奋性氨基酸作用、线粒体功能损伤和氧化应激可能是这些神经退行性疾病发病机制。
(3)激活内源性神经保护机制,例如神经营养因子等:近年发现NGF(Nerve growthfactor,神经生长因子)对成熟神经元有营养作用,NGF能保护神经元对抗有毒物质,机械性损伤或脑缺血等。
因此,寻找可影响神经营养因子生成或作用的小分子,用于神经退行性疾病的治疗是一种新的途径。
灵芝Ganoderma lucidum是一种大型药用真菌,属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌亚门(Agaricomycotina)、伞菌纲(Agaricomycetes)、多孔菌目(polyporales),灵芝科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma,其包括赤芝G.lucidum(Levss.exFr.).和紫芝G.sinense.等,始载于《神农本草经》,分为赤芝(丹芝)、黑芝(玄芝)、青芝(龙芝)、白芝(玉芝)、黄芝(金芝)和紫芝(木芝),具有补中益气、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效。
现代药理临床研究证明,灵芝具有多种生物活性及药理作用,如抗肿瘤、护肝、抗衰老、降血糖、调节免疫、改善造血机能、镇痛、镇静、降血压、强心、调节内分泌、抗疲劳、抑菌等作用。灵芝中含有多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等多种成分,是其药效物质的基础,其中三萜和多糖是灵芝最主要的两大活性成分。
目前,国内外对灵芝的研究主要集中在灵芝多糖、三萜抗肿瘤和提高免疫等方面,但对灵芝提取物在预防和/或治疗阿尔茨海默症中的应用的研究还较少。
发明内容
本发明通过以下方案达到上述目的:
在本发明的第一方面,提供一种灵芝醇提物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的制剂中的用途。
优选的,所述醇包括1-10个碳的一元饱和醇。
进一步优选的,所述灵芝醇提物包括灵芝的甲醇提取物、乙醇提取物、丙醇提取物、丁醇提取物。
进一步优选的,所述灵芝醇提物为5mg/kg-300mg/kg的灵芝醇提物。
在本发明的第二方面,提供一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物,包含前述的灵芝醇提物和药学上可接受的载体。
优选的,所述药物剂型包括片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或口服液。
在本发明的第三方面,提供一种灵芝醇提物的制备方法,包括将灵芝子实体在层析柱中利用石油醚进行浸泡,收集石油醚渗透液,再采用醇进行渗透,收集醇提取物,并可选地进行纯化。
优选的,一种灵芝醇提物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将灵芝子实体60-70℃烘干,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8-12倍量石油醚,浸泡约1-4h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-12倍量质量浓度为90-100%的醇,浸泡约1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集醇渗透液;
(4)50-70℃减压浓缩至相对密度为1-1.2的稠膏,真空干燥,得到灵芝醇提物;
(5)可选地进行纯化。
其中,上述采用石油醚渗透的目的在于回收灵芝中大分子物质。
其中,上述采用醇类溶液进行渗透的目的在于回收灵芝中小分子物质。
优选的,所述纯化包括采用大孔吸附树脂,采用浓度逐渐提高的醇洗脱液进行洗脱,回收得到纯化的醇提取物。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
经实验研究发现,灵芝醇提物能显著增强PC12细胞增殖,对PC12细胞损伤模型具有保护作用,显著改善AD模型大鼠学习记忆能力,显著减少阿尔茨海默症相关蛋白Aβ1-42和Tau的表达,安全性高,可以用于包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病的预防和/或治疗。
附图说明
图1为实施例2的灵芝乙醇提取物的HPLC指纹分析图谱。
图2为试验例1的灵芝醇提物对NaN3致PC12细胞的损伤模型的显微镜图。
图3为试验例2的灵芝醇提物对AD模型大鼠脑组织切片HE染色的显微镜图。
图4为实施例2的灵芝醇提物对AD模型大鼠脑组织中Aβ1-42和Tau蛋白的表达量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
经发明人实验研究发现,灵芝醇提物对PC12细胞损伤模型具有保护作用,包括对损伤模型的细胞存活率、形态等方面的提高、改善作用;还能改善学习记忆能力,特别是对罹患阿尔茨海默症的小鼠的学习记忆能力具有显著增强作用,能抑制海马神经元减少;并且经细胞和动物急性毒性实验证实,其安全剂量范围大,提示在治疗和/或预防阿尔茨海默症的潜力。
基于此,在第一方面,本发明提供一种灵芝醇提物在制备预防和治疗阿尔茨海默症的制剂中的用途。
其中,本发明所述的醇包括脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子被羟基取代而成的化合物,优选包括烷烃中的氢原子被羟基取代而成的化合物,例如1-10个碳的醇,进一步优选为一元饱和醇,例如1-10个碳的一元饱和醇。
本发明中所述的“取代”是指在相同或不同位置上利用相同或不同的基团的1-3个取代基。
在一些优选的实施例中,所述灵芝醇提物包括灵芝的甲醇提取物、乙醇提取物、丙醇提取物、丁醇提取物。
其中,所述灵芝包括赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝和紫芝,优选紫芝。
其中,本发明中所述的制剂可以包括任意可食用的制剂,例如药物、保健品、食品等。
本发明中所述的灵芝醇提取物不仅可用于预防和/或治疗阿尔茨海默症,还可用于具有相同或相似发病机理的疾病,例如其他神经***退行性疾病,可能地包括缺血性中风、帕金森氏病等,治疗或减轻这些疾病的严重程度。
在一些优选的实施例中,提供一种灵芝乙醇提取物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物、保健品、或食品特别是药物中的用途。
优选的,所述用途中灵芝醇提物的用量范围为5mg/kg-300mg/kg。
经证实,本发明中所述的灵芝醇提物在实例中对小鼠例如AD模型大鼠表现出显著的改善学习记忆能力,包括空间学习记忆能力等。
经证实,本发明中所述本发明中所述的灵芝醇提物在实例中能够抑制海马神经元减少,显著减少阿尔茨海默症相关蛋白Aβ1-42和Tau蛋白的表达。
经证实,本发明中所述的灵芝醇提物在实例中能够对PC12细胞损伤模型具有保护作用,例如对NaN3致PC12细胞损伤模型的保护作用,包括对损伤模型的细胞存活率、形态等方面的提高、改善作用。
经证实,本发明中所述的灵芝醇提物没有表现出安全性问题,例如致畸或致毒等可能性,其安全剂量范围很大。
综上所述,本发明中所述的灵芝醇提物安全并且,在治疗和/或预防阿尔茨海默症等方面的效果明显。
在第二方面,本发明提供一种灵芝醇提物的制备方法,包括将灵芝子实体在层析柱中利用石油醚进行浸泡,收集石油醚渗透液,再采用醇进行渗透,收集醇提取物,并可选地进行纯化。
其中,所述灵芝子实体烘干并粉碎后进行提取。
其中,所述灵芝子实体在60-70℃烘干并粉碎至10-50目后进行提取。
其中,所述层析柱的径高比为1:3~1:10之间,例如1:3~1:10径高比的大孔树脂的玻璃层析柱。
其中,层析柱先经过预处理。
其中,一种预处理方法例如包括:在柱内加入高于树脂层约10cm的95%以上的醇浸渍4小时,然后用水如蒸馏水淋洗至流出液用水稀释不浑浊时为止,最后用水反复洗涤至醇含量小于1%或无明显醇气味即可。
预处理还包括最终水位要保持在树脂层面以上,以免干柱。
其中,石油醚的用量为灵芝子实体量的8-12倍量。
其中,所述利用石油醚进行浸泡,收集石油醚渗透液的具体步骤包括:加入8-12倍量石油醚,浸泡,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液。其中,所述采用醇进行渗透的具体步骤包括:加入5-12倍量的醇,优选质量浓度为90-100%的醇,浸泡,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集醇渗透液。
其中,所述收集醇提取物的具体步骤包括:收集的醇渗透液即为粗略的醇提取物或者将收集的石油醚渗透液和醇渗透液合并后,加水,静置分层,得到有机层和水层,水层即为粗略的醇提取物;将上述粗略的醇提取物进行可选地浓缩干燥,得到醇提取物。
其中,所述浓缩干燥可以采用包括减压浓缩、真空干燥在内的常用浓缩、干燥方法。
其中,在一个优选的实施例中,所述浓缩干燥的具体步骤包括:50-70℃减压浓缩至相对密度为1-1.2的稠膏,真空干燥,得到灵芝醇提物。
在一个优选的实施例中,所述制备方法包括:
(1)将灵芝子实体60-70℃烘干,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8-12倍量石油醚,浸泡约1-4h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-12倍量质量浓度为90-100%的醇,浸泡约1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集醇渗透液;
(4)50-70℃减压浓缩至相对密度为1-1.2的稠膏,真空干燥,得到灵芝醇提物;
(5)可选地进行纯化。
在一个优选的实施例中,所述制备方法包括:
(1)将灵芝子实体60-70℃烘干,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎后的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8倍量石油醚,浸泡约2h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-10倍量质量浓度为90-100%的醇,浸泡1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集醇渗透液;
(4)50-70℃减压浓缩至相对密度为1.0-1.2的稠膏,真空干燥,即得灵芝醇提物;
(5)可选地进行纯化。
在一个更优选的实施例中,所述制备方法包括:
(1)将灵芝子实体70℃干燥6h,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎后的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8-12倍量石油醚,浸泡约1-4h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-12倍量质量浓度为90-100%的醇,浸泡约1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集醇渗透液;
(4)合并石油醚渗透液和醇渗透液,加水至20%,摇匀,静置分层,得有机层、水层,回收水层部分,得粗略的醇提取物;
(5)将粗略的醇提取物50-70℃减压浓缩至相对密度为1.0-1.2的稠膏,真空干燥,即得灵芝醇提物;
(6)可选地进行纯化。
如上所述,上述制备得到的灵芝醇提物还可以可选地进一步进行纯化。
优选的,所述纯化包括采用大孔吸附树脂,采用浓度逐渐提高的醇洗脱液进行洗脱,回收得到纯化的醇提取物。
其中,所述大孔吸附树脂可以包括大孔树脂ADS-8或者填料为YMC-GEL ODS-A-HG的大孔树脂。
在一个优选的实施例中,所述大孔吸附树脂为ADS-8,柱内径3cm,柱高60cm,树脂柱死体积约为400mL。
在一个优选的实施例中,所述大孔吸附树脂为填料YMC-GEL ODS-A-HG,柱高50cm,内径5.5cm的大孔吸附树脂。
其中,所述大孔树脂还可以进行预先的处理,优选采用一定浓度的醇溶液进行处理,例如采用pH值为3的25%甲醇溶液处理。
其中,所述采用浓度逐渐提高的醇洗脱液进行洗脱可以理解为采用醇的质量浓度从30%至100%之间,以5%或10%或者20%或者其他相同的梯度或者不同的梯度,递增的质量浓度的醇洗脱液,依次进行洗脱,并按照回收的纯度要求和/或回收率要求,对洗脱得到的液体进行收集,并可选地进行进一步处理,得到纯化后的醇提取物。
在一个优选的实施例中,所述采用浓度逐渐提高的醇洗脱液进行洗脱包括依次采用30%、50%、70%、90%、100%的醇洗脱液进行洗脱。
在另一个优选的实施例中,所述采用浓度逐渐提高的醇洗脱液进行洗脱包括依次采用30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%的醇洗脱液进行洗脱。
其中,上述的进一步处理可以包括在制备方法中所述的减压浓缩干燥步骤或者其他的对液体进行相应处理而不影响其药理性质的方法。
其中,本发明所述的醇包括脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子被羟基取代而成的化合物,优选包括烷烃中的氢原子被羟基取代而成的化合物,例如1~10个碳的醇,进一步优选为一元饱和醇,例如1~10个碳的一元饱和醇。
本发明中所述的“取代”是指在相同或不同位置上利用相同或不同的基团的1-3个取代基。
在一些优选的实施例中,所述醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇。本发明中所述的“醇溶液”或“醇洗脱液”或“一定质量百分浓度的醇”,如无特殊说明,均可以理解为包括100%或近100%的醇(无水醇)和水在内的溶液,或者以100%或近100%的醇(无水醇)和水组成的溶液,例如85%的醇洗脱液为85重量份100%或近100%的醇(无水醇)和15重量份水组成的溶液。
在一个优选的实施例中,所述纯化方法包括以下步骤:
(1)大孔树脂ADS-8,柱内径3cm,柱高60cm,树脂柱死体积约为400mL,用pH值为3的40%乙醇预处理,醇提取物5g,先用50mL无水乙醇溶解,用pH值为3的40%乙醇溶液定容到100mL,制得pH值为3,浓度为50mg/mL的70%乙醇上样母液;
(2)上样流速1mL/min,每上样20mL,更换pH值为3的40%乙醇溶液洗脱40mL,以降低上样时的醇浓度,最终上样高度约为上样完成后,分别用30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液流速8mL/min冲洗800mL,根据纯度或回收率要求进行收集。
在一个优选的实施例中,所述纯化方法包括以下步骤:
(1)采用填料YMC-GEL ODS-A-HG(12nm S-50μm),柱高50cm,内径5.5cm的大孔吸附树脂,预先用pH值为3的25%甲醇处理;
(2)取醇提取物10.6g,溶解于50ml纯甲醇中,调节pH值到3,上样流速1ml/min,每次上样5mL后立即用5%甲醇15mL稀释柱头,最终上样高度约3cm,洗脱流速10ml/min,依次采用30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%的甲醇洗脱液进行洗脱,根据纯度要求进行收集。
其中,上述优选纯化实施例中的收集可以分开收集,将收集的液体进行HPLC分析,根据分析结构进行取舍。
采用上述制备方法得到的灵芝醇提物,经HPLC、LC-MS等检测鉴别,结果显示,醇提物主要含有Cyathane型骨架的Erinacine A、B、C、D、E、F、G以及Hericenone A、B、C、D、E、F、G等萜类化合物;还含有少量的麦角甾醇、不饱和脂肪酸和寡糖等化合物。
在本发明的第三方面,本发明还提供一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的制剂,包括药物、保健品、或食品等,包含上述灵芝醇提物。
本发明中所述的“制剂”还可以理解为包含上述灵芝醇提物的组合物。
在本发明的第四方面,本发明还提供一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物,包含上述灵芝醇提物和药学上可接受的载体。
本发明所述药物的剂型包含可以诸如用于经口投药的片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、口服液、含片或酏剂、栓剂、无菌溶液或悬浮液、还可以包括静脉注射制剂、冻干剂等。
本发明中所述的“药学上可接受的载体”还可以理解为“稀释剂”或“辅料”等,在医药领域内众所周知且描述于例如雷明顿医药科学(Remington′s PharmaceuticalSciences),马克出版公司(Mack Publishing Co.)(A·R·格纳诺(A.R.Gennaro)编,1985)。这些物质在所使用的剂量和浓度下对接受者来说是无毒,包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐等缓冲液;诸如抗坏血酸等抗氧化剂;诸如聚精氨酸等低分子量(小于约10个残基)肽;诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质;诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水聚合物;诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸等氨基酸;单糖、二糖和包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物;诸如EDTA等螯合剂;诸如甘露醇或山梨醇等糖醇;诸如钠等抗衡离子;和/或诸如吐温(Tween)、泊洛尼克(Pluronics)或聚乙二醇等非离子型表面活性剂;还包括包括无菌水、盐水、葡萄糖、油(如玉米油、花生油及类似物)、酸。进一步还可以包括防腐剂、润湿剂、乳化剂、及类似物等。
本发明的灵芝醇提物或药物的给药剂量可以随具体给药方法和被治疗的客体或类型而变化。该剂量足以产生预期的有益效果,并且可以配制用于单一剂量施用或多重剂量施用。
本发明中所述的药物可以通过本领域技术人员已知的任何途径施用,包括口服、肌内、静脉内、真皮内、病灶内等途径。施用可以是局部、表面或者全身的。在任何给定的情况下最合适的途径取决于多种因素,例如疾病的性质、疾病的进程、疾病的严重性等。作为优选,本发明的醇提物或包含醇提物在内的药物通过口服给药。
本发明的所述醇提物还可以与第二活性化合物/第二治疗剂一起施用,同时、相继或并行施用。在分别施用时,本发明的所述醇提物或包含醇提物的药物与第二活性化合物或第二治疗剂可以以不同的用药频率或间隔施用。
在本发明的第五方面,本发明还提供一种上述药物的制备方法,采用本领域的相应药物制备方法进行制备即可。
在本发明的第六方面,本发明还提供一种预防和/或治疗方法,包括预防或治疗或减轻疾病的严重程度,所述方法包括给主体服用本发明所述的灵芝醇提取物,这样的疾病包括阿尔茨海默病在内的神经***退行性疾病例如缺血性中风、帕金森氏病等。
本发明中所述的“神经***退行性疾病”是指以神经***组织和/或神经***组织功能的渐行性丧失为特性的各类中枢神经***紊乱。神经***退行性疾病是一类神经性的紊乱或疾病,所述神经***疾病的特征在于神经***组织的渐行性丧失和/或神经性功能的改变,作为神经***组织渐行性丧失的结构通常造成神经性功能的降低。本发明中所述的用于治疗神经***退行性疾病的实例包括但不限于阿尔茨海默症、缺血性中风、帕金森氏病等。
如本文中所使用,术语“包含”或“包括”指方法包括所列举的要素,但不排除其它要素。
本发明所述的灵芝子实体菌盖肾形、半圆形或近圆形,直径10~18cm,厚1~2cm,皮壳坚硬,黄褐色到红褐色,有光泽,具环状棱纹和辐射状皱纹,边缘薄而平截,常稍内卷,菌肉白色至淡棕色;孢子细小,黄褐色。菌柄:圆柱形,侧生,少偏生,长7~15cm,直径1~3.5cm,红褐色至紫褐色,光亮,气味:气微香,味苦涩。
实施例1:
灵芝醇提物的提取,包括以下步骤:
(1)将灵芝子实体60-70℃烘干,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎后的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8倍量石油醚,浸泡2h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-10倍量质量浓度为90-100%的乙醇,浸泡1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集乙醇渗透液;
(4)50-70℃减压浓缩至相对密度为1.0-1.2的稠膏,转至真空干燥箱中,干燥,即得灵芝醇提物。
实施例2:
灵芝醇提物的纯化,包括以下步骤:
(1)大孔树脂ADS-8(南开和成),柱内径3cm,柱高60cm,树脂柱死体积约为400mL,用pH值为3的40%乙醇预处理,灵芝醇提物5g,先用50mL无水乙醇加热超声溶解,滤纸滤过后,用pH值为3的40%乙醇溶液定容到100mL,制得pH值为3,浓度为50mg/mL的70%乙醇上样母液;
(2)上样流速1mL/min,每上样20mL,更换pH值为3的40%乙醇溶液洗脱40mL,以降低上样时的醇浓度,最终上样高度约为上样完成后,分别用30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液流速8mL/min冲洗800mL,分开收集,HPLC进样分析,洗脱液减压回收溶剂,计算收率,具体洗脱程序见表1。
表1灵芝醇提部位大孔树脂纯化洗脱程序及参数
(3)色谱条件:waters symmetryshield RP18(5μ,4.6×250mm)色谱柱,0min-40%乙腈,30min-100%乙腈,40min-100%乙腈,柱温25℃,检测波长254nm,进样量20μL,流速1mL/min,梯度条件见表2所示。
表2色谱分析洗脱液梯度条件
实施例3:
灵芝醇提物的提取,包括以下步骤:
(1)将灵芝子实体70℃干燥6h,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎后的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8-12倍量石油醚,浸泡约2h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-12倍量质量浓度为90-100%的乙醇,浸泡约1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集乙醇渗透液;
(4)合并石油醚渗透液和乙醇渗透液,加水至20%,摇匀,静置分层,得有机层、水层,回收水层部分,得粗略的醇提取物;
(5)将粗略的醇提取物50-70℃减压浓缩至相对密度为1.0-1.2的稠膏,真空干燥,即得灵芝醇提物,其HPLC指纹图谱如图1所示。
实施例4
灵芝醇提物的纯化:
(1)层析柱处理:填料YMC-GEL ODS-A-HG(12nm S-50μm),柱高50cm,内径5.5cm;预先用pH值为3的25%甲醇处理;
(2)取灵芝醇提物10.6g,溶解于50ml纯甲醇中,调节pH值到3,上样流速1ml/min,每次上样5mL后立即用5%甲醇15mL稀释柱头,最终上样高度约3cm,洗脱流速10ml/min,洗脱程序及参数见表3所示,分别收集洗脱液,得到纯化的灵芝醇提物组分。
表3灵芝醇提物纯化柱洗脱程序及参数
(3)色谱条件:waters symmetryshield RP18(5μm,4.6*250mm)色谱柱,柱温25℃,检测波长254nm,进样量20μL,流速1mL/min,梯度洗脱条件如表4所示。
表4色谱分析洗脱液梯度条件
将本发明所述的灵芝醇提物进行药效试验。
试验例1:灵芝醇提取对NaN3致PC12细胞损伤模型的保护作用
按照细胞培养法,体外培养PC12细胞,采用NaN3共孵育,制备NaN3致PC12细胞损伤模型,给予灵芝醇提物处理24h后,观察细胞生存率、形态等,结果见表5和图2所示。
表5灵芝醇提取对拟AD细胞模型的保护作用
灵芝醇提物浓度(ug/ml) | 细胞存活率/% |
正常组 | 100 |
NaN3 | 46.31±2.34 |
10.0 | 76.84±3.76 |
50.0 | 85.26±3.16 |
100.0 | 93.15±2.84 |
200.0 | 104.73±3.19 |
通过表5可以看出,PC12细胞的正常组细胞存活率能达到100%,经NaN3处理后,细胞存活率显著下降,说明NaN3已经成功制备细胞损伤模型,在经过灵芝醇提物处理后,细胞存活率显著上升,而且,灵芝醇提物的浓度不断上升时,细胞存活率也不断上升,这说明,灵芝醇提物能显著提高细胞的存活率,促进细胞增殖,并且在低浓度的灵芝醇提物下已经表现出对细胞存活率的明显提高效果。
图2为不同批次提取的不同浓度的灵芝醇提物对细胞损伤模型进行处理后的细胞形态图,第一行至第四行分别为不同批次的灵芝醇提物处理,第一列为未经灵芝醇提物处理的模型组,第二列至第四行分别为不同浓度的灵芝醇提物处理(50至200微克/毫升)。通过图2可以看出,与未经灵芝醇提物处理的细胞损伤模型(模型组)相比,给予了灵芝醇提物处理的细胞,形态更加光滑,细胞的数量也增加。该结果表明,灵芝醇提物能显著改善NaN3致PC12细胞的损伤。
试验例2:灵芝醇提物改SPF级SD大鼠学习记忆能力
以SPF级SD大鼠进行试验,采用双侧海马内注射Aβ25~35联合长期腹腔注射D-半乳糖法造模,制备衰老痴呆模型(AD模型)。
造模后,采用正常对照组、假手术组、模型组分别以2mL/d生理盐水灌胃,其余各治疗组(灵芝醇提物50mg/kg、灵芝醇提物100mg/kg、灵芝醇提物200mg/kg)按各自剂量灌胃给予灵芝醇提物治疗,各组持续给药4周。4周后,通过Morris水迷宫(MWM)来评估对大鼠的空间学习记忆能力,结果如表6所示。
观察正常对照组、模型组和治疗组(灵芝醇提物100mg/kg治疗处理组)的AD模型大鼠的海马神经元,结果如图3所示,观察观察正常对照组、模型组和治疗组(灵芝醇提物50mg/kg治疗处理组、灵芝醇提物100mg/kg治疗处理组)的小鼠脑组织中Aβ1-42和Tau蛋白的表达量,如图4所示。
表6空间探索实验结果
#P<0.01vs正常对照组,*P<0.05,**P<0.01vs模型组.
由表6结果显示,各组游泳总路程差异没有显著性(P>0.01),提示各组大鼠在90s内游泳总距离没有差异,说明模型组、正常对照组及治疗组对大鼠游泳速度没有影响。与正常对照组比较,模型组在原平台象限游泳距离与总距离之比与穿越原平台的次数显著减小,差异具有显著性(P<0.01),表明老年痴呆模型造模成功。
进一步地,与模型组比较,各治疗组在原平台象限游泳距离与总距离之比均有所上升而穿越原平台的次数也显著增加,其差异均具有显著性(P<0.01-0.05);在有效剂量范围内,大鼠在原平台象限游泳距离与穿越原平台的次数均随着剂量增大而增加。这结果表明,各治疗组均具有改善AD模型大鼠记忆功能障碍的作用,灵芝醇提物能显著改善大鼠记忆功能障碍的作用。
由图3可以看出,与正常对组相比,模型组的海马神经元明显减少,证明造模成功;与模型组比较,100mg/ml灵芝醇提物给药的治疗组的海马区神经元数目明显增多(P<0.05),与正常对照组相当,提示灵芝醇提物可以显著抑制海马神经元减少。
由图4可以看出,与正常对照组相比,模型组的脑组织中Aβ1-42和Tau蛋白的表达量明显增加,证明造模成功;与模型组比较,灵芝醇提物给药的治疗组的脑组织中Aβ1-42和Tau蛋白的表达量明显减少,提示灵芝醇提物能够显著减少阿尔茨海默症相关蛋白Aβ1-42和Tau的表达,改善大鼠组织细胞的功能与形态。
因此,由上述结果可知,灵芝醇提物能够改善衰老痴呆模型大鼠的学习记忆能力,抑制海马神经元减少,有助于海马神经元发展,减少Aβ1-42和Tau蛋白的表达。
试验例3灵芝醇提物的毒性作用
按照《中药、天然药物安评技术指导原则》进行灵芝醇提物的毒性试验,灵芝醇提物给药量范围为5mg/kg-300mg/kg,灌胃给予昆明小鼠,连续观察14天,未有动物死亡。表明在该范围内灵芝醇提物安全,这说明,灵芝醇提物的安全剂量范围较大,用药不存在安全隐患。
实施例5
含有灵芝醇提物的片剂
药物组分:灵芝醇提物60份、糊精25份、羟基淀粉钠5份、硬脂酸镁5份、二氧化硅5份。
制备工艺:将灵芝醇提物、糊精、羟基淀粉钠、硬脂酸镁、二氧化硅混合均匀、压片,得到灵芝醇提物的片。
以上所述,仅为本发明的较佳的具体实施例,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.灵芝醇提物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默症的制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述醇包括1-10个碳的一元饱和醇。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述灵芝醇提物包括灵芝的甲醇提取物、乙醇提取物、丙醇提取物、丁醇提取物。
4.根据权利要求1至3中任一所述的用途,其特征在于,所述灵芝醇提物为5mg/kg-300mg/kg的灵芝醇提物。
5.一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物,其特征在于,包含权利要求1-4中任一所述的灵芝醇提物和药学上可接受的载体。
6.一种预防和/或治疗阿尔茨海默症的药物,其特征在于,所述药物剂型包括片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或口服液。
7.一种灵芝醇提物的制备方法,其特征在于,包括将灵芝子实体在层析柱中利用石油醚进行浸泡,收集石油醚渗透液,再采用醇进行渗透,收集醇提取物,并可选地进行纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将灵芝子实体60-70℃烘干,粉碎至10-50目;
(2)室温条件下,将粉碎的灵芝子实体加入装有预处理后的大孔树脂的玻璃层析柱中,径高比在1:3~1:10之间;
(3)加入8-12倍量石油醚,浸泡约1-4h,然后以1.5-2BV/h流速连续渗透,收集石油醚渗透液;继续加入5-12倍量质量浓度为90-100%的醇,浸泡约1-2h,然后以1-1.5BV/h流速连续渗透,收集醇渗透液;
(4)50-70℃减压浓缩至相对密度为1-1.2的稠膏,真空干燥,得到灵芝醇提物;
(5)可选地进行纯化。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述纯化包括采用大孔吸附树脂,采用浓度逐渐提高的醇洗脱液进行洗脱,回收得到纯化的醇提取物。
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