CN107619879A

CN107619879A - 一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用

Info

Publication number: CN107619879A
Application number: CN201711111212.7A
Authority: CN
Inventors: 赵群; 孙传伯; 陈乃富; 韩邦兴; 陈存武
Original assignee: West Anhui University
Current assignee: West Anhui University
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对，由引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成，所述SEQ ID No.1单链DNA分子为序列表中序列1中的单链DNA分子，所述SEQ ID No.2单链DNA分子为序列表中序列2中的单链DNA分子。本发明通过特异性引物对，包括引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子，使用快速PCR方法实现了霍山石斛与铁皮石斛之间的快速、准确鉴别，为霍山石斛鉴别提供了新方法。

Description

一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用。

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense)是安徽省大别山地区特有的植物，且为国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)。铁皮石斛(Dendrobium catenatum)为霍山石斛的同属近缘种，两者形态特征比较相近，制成枫斗后两者不易通过外形进行鉴别，导致在市场上铁皮石斛成为霍山石斛的混淆品之一。由于霍山石斛与铁皮石斛通过外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。栗丹，李振坚等，发表的基于ITS序列石斛材料的鉴定及***进化分析，园艺学报，2012,39(8):1539～1550，利用DNA条形码ITS序列对霍山石斛及其近缘物种进行了鉴定，但该方法需要进行测序，耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用。

本发明提出的一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对SH-CP25，所述引物对由引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成，所述SEQ ID No.1单链DNA分子为序列表中序列1中的单链DNA分子，所述SEQ ID No.2单链DNA分子为序列表中序列2中的单链DNA分子；

其中，序列1为SH-CP25s：5’-TTCGTGGGATGGGGAGC-3’；

序列2为SH-CP25a：5’-TGGACATCCGAGCCCTA-3’。

本发明还提供了一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的试剂盒，所述试剂盒包括引物对、dNTP和DNA聚合酶，所述引物对由引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成。

进一步，所述试剂盒中组成引物对的两条单链DNA分子的摩尔数相同。

本发明提供一种鉴定是否含有霍山石斛的方法，包括如下步骤：

①从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成的引物SH-CP25s和SH-CP25a在PCR反应液和PCR仪中PCR扩增；

②PCR产物检测：采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，根据目的条带的大小鉴定待测样品中是否含有霍山石斛。

进一步，所述PCR反应液包括以下试剂：2％模板DNA，4％10pmol上游引物，4％pmol下游引物，10％10×buffer缓冲液，6％浓度为25mM的MgCl₂水溶液，2％浓度为10mM的dNTPs，2％5U/μL Taq DNA聚合酶，余量为无菌双蒸水。

进一步，所述霍山石斛或为铁皮石斛。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明中，通过特异性引物对(引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ IDNo.2单链DNA分子)，使用快速PCR方法实现了霍山石斛与铁皮石斛之间的快速、准确鉴别，为霍山石斛鉴别提供了新方法。

2、与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了快速鉴定霍山石斛与铁皮石斛，解决了从形态学鉴定难的问题。

3、技术通用性强，对仪器设备要求不高，在实际工作中容易推广应用，且操作过程简单、耗时较短、灵敏度高且较稳定。

附图说明

图1为霍山石斛、铁皮石斛及其相似种的***发育树；

图2为通用引物扩增的凝胶电泳图；

图3为特异性PCR引物对SH-CP25扩增的凝胶电泳图；

图4为特异性PCR引物对SH-CP25在不同浓度DNA模板下扩增的凝胶电泳图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步解说。

本发明附图图1中谱系分支节点上方为BI树的后验概率PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值；

图2中M：DNA分子标准(DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100bp)、1-霍山石斛、2-铁皮石斛、3-空白对照；

图3中M：DNA分子标准(DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100bp)、1-用特异性PCR引物对SH-CP25扩增1个霍山石斛样本的结果、2-用特异性PCR引物对SH-CP25扩增1个铁皮石斛的结果、3-空白对照；

图4中M：DNA分子标准(DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100bp)，1-7分别为霍山石斛DNA模板浓度依次为210ng/μl、105ng/μl、52ng/μl、26ng/μl、13ng/μl、7ng/μl和3ng/μl，8-14分别为铁皮石斛DNA模板浓度依次为210ng/μl、105ng/μl、52ng/μl、26ng/μl、13ng/μl、7ng/μl和3ng/μl。

一、用于鉴定霍山石斛的引物对的设计与合成

从GenBank查找或通过本研究进行测序获得霍山石斛及混淆品的ITS序列，详见下表1。其中，本研究测序所得单倍型序列，包括Hap5，Hap6和Hap7。详见序列表中序列4至序列6所示，其中，Hap5对应于序列4，Hap6对应于序列5，Hap7对应于序列6。

表1霍山石斛、铁皮石斛及部分相似种的ITS序列

分别用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)和简约法(maximum parsimony,MP)进行***发育分析，构建BI和MP两种***树。构建***树时，用菱唇石斛Dendrobiumleptocladum的2条ITS序列(GenBank登录号分别为AF521612和EU840697)作为外群。其中BI树用MrBayes version 3.1.2软件构建，MP树用PAUP*version 4.0beta 10软件构建。构建BI树时，用MrModeltest version 2.3软件根据AIC(Akaike Information Criterion)检验标准选择数据的最适模型，所选最适模型是(SYM+G)。马尔科夫链的蒙特卡洛方法(MarkovChains Monte Carlo,MCMC)设置为四条链并运行500000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽取一个样本，共形成10002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样，总共剩余的样本数为9602，用剩余样本重建***树并估计其后验概率值。构建MP树时，设置自举重复次数bootstrap nreps为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法和MP法构建的***发育树表明，2种方法构建的***树主干一致(图1)。图1中各谱系分支的节点处标有BI树的后验概率(posterior probability，PP)值和MP树的自举支持度(Bootstrap,BS)。结果表明，霍山石斛所有序列的单倍型形成单系(PP＝1.00,BS＝96)。

在确定霍山石斛为单系群的前提下，用软件Clustal X 1.81对表1中所有ITS序列进行对位排序和比较，找到差异片段，设计霍山石斛检测特异性PCR引物，如下：

序列1为SH-CP25s：5’-TTCGTGGGATGGGGAGC-3’；

序列2为SH-CP25a：5’-TGGACATCCGAGCCCTA-3’；

理论PCR产物长度为262bp(序列3)。

引物SH-CP25s单链DNA分子和引物SH-CP25a单链DNA分子组成的引物对应用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛技术领域。

二、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的组装

将步骤一设计合成的引物SH-CP25s和SH-CP25a分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶、10×buffer缓冲液等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴定霍山石斛的试剂盒。

三、鉴定待测样品中是否含有霍山石斛的方法

采用试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有霍山石斛：

1、PCR扩增

从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物SH-CP25s和SH-CP25a(序列1和序列2)按照如下进行PCR扩增：PCR反应总体积25μL，包括以下试剂：0.5μL模板DNA，1.0μL上游引物(10pmol)，1.0μL下游引物(10pmol)，2.5μL 10×buffer缓冲液，1.5μL浓度为25mM的MgCl2水溶液，0.5μL浓度为10mM的dNTPs，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，无菌双蒸水补足至25μL。

PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体反应条件如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环；72℃10min。

2、PCR产物检测

采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：

取5μL扩增产物，采用2％的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像***下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有霍山石斛：若获得大小约为262bp的目的条带(序列3)，则所述待测样品中含有霍山石斛；若没有获得大小为262bp的目的条带(序列3)，则所述待测样品中不含有霍山石斛。

四、使用试剂盒鉴定霍山石斛的特异性分析

待测样品：霍山石斛(采自于安徽霍山)和铁皮石斛(采自于安徽霍山)。均符合中国植物志和相关文献的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。

1、从待测样品中提取基因组DNA

分别取约50mg干燥样品(当然也可采用100mg新鲜样品进行基因组DNA提取)，用CTAB法提取总DNA。具体如下：

将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(配方：2％(2g/100ml)CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP 40000、10μL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70％(体积分数)乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。

用通用引物TY1s和TY1a检测以上提取的霍山石斛和铁皮石斛的基因组DNA质量。

TY1s：5’-GATGGATGAACCCTCAAATC-3’；

TY1a：5’-GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。

反应总体系为25μL，包括DNA模板0.5μL(5-50ng)，上游引物1μL(10pmol)，下游引物1μL(10pmol)，10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2(25mM)1.5μL，dNTPs(10mM)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，ddH2O补足至25μL。通用引物PCR反应条件为：95℃5min、35个循环(每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃30s)、72℃10min。

结果发现所有样品均能扩增出DNA条带(附图2)。

2、PCR扩增

从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用引物对(引物SH-CP25s和SH-CP25a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例步骤三中的PCR扩增条件。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。

反应结束后，按照实施例步骤三中的PCR产物检测的方法对待测样品进行鉴定。

结果如附图3所示，从图中可以看出：

利用本发明的引物对(引物SH-CP25s和SH-CP25a)对霍山石斛和铁皮石斛进行检测，霍山石斛能够扩增出片段大小约为262bp的目的条带。而铁皮石斛未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将霍山石斛与铁皮石斛准确的鉴别出来。将大小约为262bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。

五、使用试剂盒鉴定霍山石斛的灵敏度分析

待测样品：霍山石斛(采自于安徽霍山)。通过鉴定，样品实物与名称相符，质量符合标准。

1、从待测样品中提取基因组DNA

分别取约50mg干燥样品(当然也可采用100mg新鲜样品进行基因组DNA提取)，用CTAB法提取总DNA。具体操作参见实施例2步骤一。

2、PCR扩增

将从霍山石斛中提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA浓度分别为210ng/μl、105ng/μl、52ng/μl、26ng/μl、13ng/μl、7ng/μl和3ng/μl的系列稀释液，以系列稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对(引物SH-CP25s和SH-CP25a)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例步骤三中PCR扩增条件。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。

反应结束后，按照实施例步骤三中的PCR产物检测方法对待测样品进行鉴定。

结果如附图4所示，从图中可以看出：

利用本发明的引物对(引物SH-CP25s和SH-CP25a)对霍山石斛进行检测，当模板浓度为52ng/μl时仍能够检测到大小约为262bp的目的条带。将大小约为262bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 皖西学院

<120> 一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用

<141> 2017-11-13

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列 (Synthetic sequence)

<400> 1

ttcgtgggat ggggagc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

tggacatccg agcccta 17

<210> 3

<211> 262

<212> DNA

<213> 霍山石斛(Dendrobium huoshanense)

<400> 3

ttcgtgggat ggggagctgt cgcacgccat attgattgac acgactctcg gcaatggata 60

tctcggctct cgcatcgatg aagagcgcag cgaaatgcga tatgtggtgc gaattgcaga 120

atcccgcgaa ccatcgagtc tttgaacgca agttgcgcct gaggccaacc ggctgagggc 180

acgtccgcct gggcgtcaag cattttatca ctccgtgcct actctcccat ccatggatgt 240

gttgctaggg ctcggatgtc ca 262

<210> 4

<211> 629

<212> DNA

<213> 河南石斛(Dendrobium henanense)

<400> 4

aaacacaacg agcgattttg tgaacctgta aaaataagcg gtggctcttg ctgctgcgat 60

aaaatccacc cgagtcatcg cctcatcccc tctttggggt ggggacgtga tgaaggatgg 120

atgaaccctc aaatcggcgc agcgtagcgc caagggaatc ttgaaacaca agcctataaa 180

tgggttttgt gggatggggt gttgtcgcac gccatattga ttgacacgac tctcggcaat 240

ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagag cgcagcgaaa tgcgatatgt ggtgcgaatt 300

gcagaatccc gcgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcctgaggc caactggctg 360

agggcacgtc cgcctgggcg tcaagcattt tatcactctg tgcctagtct cccatccatg 420

gatgtgttgc caaggctcgg atgtgcacgg tggctcgtcg tgccccttgg tgcggcgggc 480

tgaagggctg gtcatcttct cgttggctgc caacaataag gggtggatta aataaggcct 540

atgctattgt gtcaagcgcg cctgagagat ggtcatactt ttctatgtga tcccaattca 600

tgcgttgatc catggatggc gtatcgaat 629

<210> 5

<211> 629

<212> DNA

<213> 河南石斛(Dendrobium henanense)

<400> 5

aaacacaacg agcgattttg tgaacctgta aaaataagcg gtggctcttg ctgctgcgat 60

aaaatccacc cgagtcatcg cctcatcccc tctttggggt ggggacgtga tgaaggatgg 120

atgaaccctc aaatcggcgc agcgtagcgc caagggaatc ttgaaacaca agcctataaa 180

tgggttttgt gggatggggt gttgtcgcac gccatattga ttgacacgac tctcggcaat 240

ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagag cgcagcgaaa tgcgatatgt ggtgcgaatt 300

gcagaatccc gcgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcctgaggc caactggctg 360

agggcacgtc cgcctgggcg tcaagcattt tatcactctg tgcctagtct cccatccatg 420

gatgtgttgc caaggctcgg atgtgcacgg tggctcgtcg tgccccttgg tgcggcgggc 480

tgaagggcgg gtcatcttct cgttggctgc caacaataag gggtggatta aataaggcct 540

atgctattgt gtcaagcgcg cctgagagat ggtcatactt ttctatgtga tcccaattca 600

tgcgttgatc catggatggc gtatcgaat 629

<210> 6

<211> 628

<212> DNA

<213> 霍山石斛(Dendrobium huoshanense)

<400> 6

aaacacaacg agcgattttg tgaacctgta aaaataagcg gtggctcttg ctgctgcgat 60

aaaatccacc cgagtcatcg cctcatcccc tctttggggt ggggacgtga tgaaggatgg 120

atgaaccctc aaatcggcgc agcgttgcgc caagggaatc ttgaagcaca agcccataaa 180

tgggtttcgt gggatggggt gctgtcgcac gccatattga ttgacacgac tctcggcaat 240

ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagag cgcagcgaaa tgcgatatgt ggtgcgaatt 300

gcagaatccc gcgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcctgaggc caaccggctg 360

agggcacgtc cgcctgggcg tcaagcattt tatcactccg tgcctactct cccatccatg 420

gatgtgttgc taaggctcgg atgtgcacgg tggctcgtcg tgccccttgg tgcggcgggc 480

tgaagggcgg gtcatcttct cgttggctgc caacaataag gggtggatta aataaggcct 540

atgctattgt gtcaagcgcg cccgagagat ggtcatactt tttaggtgat cccaattcat 600

gcgttgatcc atggatggcg tatcgaat 628

Claims

1.一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对，其特征在于，所述引物对由引物SEQID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成，所述SEQ ID No.1单链DNA分子为序列表中序列1中的单链DNA分子，所述SEQ ID No.2单链DNA分子为序列表中序列2中的单链DNA分子；

其中，序列1为SH-CP25s：5’-TTCGTGGGATGGGGAGC-3’；

序列2为SH-CP25a：5’-TGGACATCCGAGCCCTA-3’。

2.一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对、dNTP和DNA聚合酶，所述引物对由引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成。

3.根据权利要求2所述的用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中组成引物对的两条单链DNA分子的摩尔数相同。

4.一种权利要求1所述的用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛引物对的应用，其特征在于，所述引物SEQ ID No.1单链DNA分子和引物SEQ ID No.2单链DNA分子组成的引物对应用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛。

5.一种鉴定是否含有霍山石斛的方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的鉴定是否含有霍山石斛的方法，其特征在于：所述PCR反应液包括以下试剂：2%模板DNA，4% 10 pmol上游引物，4% pmol下游引物，10% 10×buffer缓冲液，6%浓度为25 mM的MgCl₂水溶液，2%浓度为10 mM的dNTPs ，2% 5U/µL Taq DNA聚合酶，余量为无菌双蒸水。

7.根据权利要求5所述的鉴定是否含有霍山石斛的方法，其特征在于：所述霍山石斛或为铁皮石斛。