CN110184393A

CN110184393A - 一种检测非洲猪瘟病毒的引物组、用途、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN110184393A
Application number: CN201910556118.5A
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 吴暄; 杨鑫; 雷昌伟; 宋增旭; 左磊; 翟熙雯
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明属于非洲猪瘟病毒检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物组、用途、试剂盒及其检测方法。引物组包括Bio‑FIP、FITC‑BIP、F3和B3，Bio‑FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FITC‑BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明的优点在于，该引物组特异性好，利用该引物组制备的试剂盒及其检测方法特异性好、灵敏度高，最低可以检测到10^0.6拷贝的模板，比常规OIE‑PCR灵敏10000倍，且本发明提供的检测方法实施过程简单易操作，能够用于ASFV的现场检测，对于ASFV的防控具有重要的意义。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒的引物组、用途、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于猪瘟检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物组，同时涉及该引物组的用途、利用该引物组制备的试剂盒及使用该试剂盒检测非洲猪瘟病毒的检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种只在家猪和野猪之间进行传播的病毒性疾病，其病原体为非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)，为非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种大型、膜包被的双链DNA病毒。1921年，非洲猪瘟首次在肯尼亚的家猪中爆发，随后通过家猪迅速传播至撒哈拉以南的国家，并在20世纪50年代传播至非洲西部，至今仍然在撒哈拉以南的非洲地区流行。2007年，格鲁吉亚出现非洲猪瘟疫情，随后很快疫情传播至周边国家并进一步传播至欧洲东部。至2018年，非洲猪瘟疫情跨过高加索地区，传播至俄罗斯联邦及其邻国，包括乌克兰、波兰、拉脱维亚、立陶宛、爱沙尼亚、摩尔多瓦、捷克共和国以及罗马尼亚，并且在俄罗斯联邦的东部地区以及蒙古的边境发生家猪感染非洲猪瘟的情况。2018年，中国辽宁省出现非洲猪瘟疫情，测序结果表明该毒株的p72基因同格鲁吉亚的Georgia 2007/1株、俄罗斯的Krasnodar 2012毒株和Irkutsk2017毒株以及爱沙尼亚的Estonia 2014isolated毒株完全相同，证明中国爆发的非洲猪瘟疫情很有可能由俄罗斯传播进入。截至2019年3月1日，中国共有28个省份共爆发111起非洲猪瘟疫情，在我国严格的防控措施之下，目前我国的非洲猪瘟疫情形势渐缓，自2019年1月份以来，仅发生20起疫情，相比于2018年8月份至12月份的99起，疫情发生数量大幅度下降。总体上看，我国非洲猪瘟疫情总体可控，防控态势逐步向好，100个疫情爆发区域已经解除封锁，18个省份的疫区已经全部解除封锁。但是，我国面临的非洲猪瘟形势仍是不容乐观，首先，虽然非洲猪瘟不是呼吸***疾病，但由于非洲猪瘟病毒存活能力强，对于低温、干燥有较强的抵抗能力，能够在环境中存活长达数月，所以人员、车辆、饲料、动物等都会成为病毒传播的途径，要完全切断非洲猪瘟病毒的传播，需要一套完整、科学的生物安全方法和高效的流程化、结构化操作。目前我国非洲猪瘟疫情仍零星爆发，参照于非洲猪瘟疫情在俄罗斯、罗马尼亚等国的长期存在，表明对抗非洲猪瘟将会是一场持久战。

非洲猪瘟在家猪之间具有高度传染性，急性毒株致死率可达100％。由于目前没有有效的疫苗对非洲猪瘟进行预防，所以，对于非洲猪瘟的防控措施则以扑杀、封锁为主，而一套高效的检测方法对于防控工作具有很重要的意义。关于非洲猪瘟的检测方法，已有很多人进行研究，并构建出多种病毒基因的监测方法。2003年，King等首次使用Taqman探针构建出检测非洲猪瘟的实时PCR检测方法，并在2012年被引入OIE手册，该方法以VP72作为靶点，检测限为10-100拷贝每微升。2010年，McKillen等使用MGB探针，以9GL基因为靶点构建了新的实时PCR检测方法，检测限为20拷贝每微升。2011年Tignon等使用β-肌动蛋白作为内参构建出新的检测方法，同OIE采用的方法相比，具有更高的灵敏性，检测限可达5.7-57拷贝每微升。2013年，Fernandez-Pinero等人在已经存在的PCR方法的基础上发展出使用通用探针库(UPL)PCR方法，该方法，将检测限降低到18拷贝每微升，进一步提高了检测的灵敏性。虽然传统PCR和qPCR方法具有较好的特异性，且qPCR同时具有较高的灵敏度，但两者都需要在精密的变温装置下进行反应，并且，PCR产物的监测需要通过凝胶电泳来实现，这些缺点无不限制了PCR方法在临场实时ASFV检测中的应用。等温扩增技术，最早发明于2000年。该技术的实施仅需要简单的恒温设备，例如水浴，金属浴设备等。近年来，对于ASFV的等温扩增技术也具有一定的应用。2010年，James等应用LAMP进行ASFV检测，检测限为330拷贝每微升左右。2017年，等使用PCLSR方法，检测限为720拷贝每微升。同年，J.Wang等人构建了使用RPA方法的等温扩增检测方法，该方法检测限为100拷贝每微升。这些等温扩增方法都可以快速的进行现场ASFV检测，但灵敏度较低。因此，急需开发一种可快速的进行现场ASFV检测，且易操作、灵敏度高的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物组，同时涉及该引物组的用途、利用该引物组制备的试剂盒及使用该试剂盒检测非洲猪瘟病毒的检测方法。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的引物组，所述引物组包括Bio-FIP、FITC-BIP、F3和B3，所述Bio-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述FITC-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述F3的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述B3的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

本发明还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括前述的引物组、LAMP扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为人工合成的非洲猪瘟病毒DNA，所述阴性质控品为双蒸水。

优选的，上述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述Bio-FIP和FITC-BIP的终浓度均为1.6μM，所述F3和B3的终浓度均为0.2μM。

优选的，上述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述LAMP扩增试剂包括浓度为10×的Isothermal Amplification Buffer，所述LAMP扩增试剂还包括MgSO₄、Bst 2.0WarmStartDNA聚合酶、dATP、dGTP、dTTP和dCTP。

优选的，上述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，还包括LAMP反应试剂，所述LAMP反应试剂为HybriDetectAssay Buffer。

优选的，上述检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，还包括侧向流动试纸条。

本发明还提供了一种用前述试剂盒检测非洲猪瘟病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)准备待测DNA样品：提取待测样本的DNA；

(2)配制三组LAMP的反应液：包括检测组、阴性对照组和阳性对照组，三组LAMP的反应液中均包括LAMP扩增试剂、前述的引物组、模板和双蒸水，所述检测组、阳性对照组和阴性对照组的模板分别依次为待测DNA样品、阳性质控品和双蒸水；

(3)扩增反应：将步骤(2)中配制好的三组LAMP反应液分别混匀离心，进行扩增，分别得到三组LAMP反应液；

(4)检测：将三组LAMP反应液分别检测，判断结果。

具体的，上述检测非洲猪瘟病毒的检测方法，所述步骤(3)中扩增反应的反应条件为65℃恒温反应40min。

具体的，上述检测非洲猪瘟病毒的检测方法，所述步骤(2)中LAMP反应液的体积为25μL；每组LAMP反应液中各组分的加样量或终浓度如下：10×的IsothermalAmplification Buffer为2.5μL、MgSO₄为2mM、Bio-FIP和FITC-BIP各1.6μM、F3和B3各0.2μM、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶8U、模板1μl、dATP、dGTP、dTTP和dCTP各1.4mM，余量为ddH₂O。

本发明还提供了一种前述引物组在检测非洲猪瘟病毒或制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的引物组特异性好，利用该引物组制备的试剂盒及其检测方法特异性好、灵敏度高，最低可以检测到10^0.6(4)拷贝模板，且本发明提供的检测方法(LAMP-LFD)实施过程简单易操作，能够用于ASFV的现场检测，对于ASFV的防控具有重要的意义。

附图说明

图1是非洲猪瘟病毒B646L基因***进化树。

图2是本发明提供的非洲猪瘟病毒的检测方法的特异性检测结果。

图3是OIE-PCR和本发明提供的非洲猪瘟病毒的检测方法的LAMP-LFD灵敏性比较结果。

具体实施方式

下面结合附图及具体试验例对本发明做进一步阐释。

实施例1：

本试验例的目的在于提供用于检测非洲猪瘟病毒的两对特异性引物。

依据NCBI上公开的ASFV的基因组序列，使用MEGA 6软件对42株ASFV全基因组序列进行比对分析(所用基因组序列的编号见图1和表2)，随后使用Simplot程序3.5.1进行similarity plotting分析以确定ASFV基因组中的保守区域。根据similarity plotting分析的结果，在B646L基因的保守区域由PrimerExplorer V4软件(Fujitsu，Tokyo，Japan)设计LAMP引物。根据引物设计原则和LAMP扩增技术原理共设计两对引物，包括Bio-FIP和FITC-BIP、F3和B3，Bio-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FITC-BIP的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。将设计的两对特异性引物送至生物公司合成，分别得到Bio-FIP、FITC-BIP、F3和B3，对所得到的Bio-FIP、FITC-BIP、F3和B3进行基因测序验证确认。Bio-FIP、FITC-BIP、F3和B3的序列具体如表1所示：

表1引物列表

试验例2

本试验例的目的在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括试验例1的引物组、LAMP扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品为非洲猪瘟病毒的DNA、病毒液或cDNA，阴性质控品为双蒸水。

试验例3

一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括以下组分：

(1)引物组：Bio-FIP、FITC-BIP、F3和B3，各引物序列参见表1，Bio-FIP和FITC-BIP的终浓度均为1.6μM，F3和B3的终浓度均为0.2μM；

(2)LAMP扩增试剂：Isothermal Amplification Buffer(10×)、MgSO₄、Bst2.0WarmStart DNA聚合酶、dATP、dGTP、dTTP和dCTP；

(3)LAMP反应试剂：HybriDetectAssay Buffer(Milenia biotec,Gieβen,Germany)；

(4)阳性质控品为人工合成的非洲猪瘟病毒DNA，非洲猪瘟病毒具体为China/2018/AnhuiXCGQ、Tengani 62、Warmbaths、Mkuzi 1979、NHV、Lil-20/1、Ken05/Tk1和R7(具体信息见表2)所述毒株以及其他已鉴定为非洲猪瘟病毒的毒株；

(5)阴性质控品为双蒸水；

(6)侧向流试纸条(LFD)(Milenia biotec,Gieβen,Germany)。

试验例4

本试验例的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒的检测方法并验证其特异性，即试验例3所述试剂盒检测非洲猪瘟病毒的检测方法。

1材料与方法

1.1本试验例所用的毒株和序列

选择NCBI上公布的42株ASFV毒株的B646L(p72)基因进行***进化分析(具体信息如表2所示)，结果如图1所示。由图1所示的***进化树可知，42个ASFV毒株被分为4个分支。随后，挑选出分布于4个分支的8株毒株(包括China/2018/AnhuiXCGQ、Tengani 62、Warmbaths、Mkuzi 1979、NHV、Lil-20/1、Ken05/Tk1和R7)，在上海生工人工合成它们的B646L基因序列。此外，还人工合成了1个PCV菌株的基因组序列，以用于本发明中检测方法的特异性研究。在所有人工合成序列的5'和3'末端分别加入BamH I和Sal I酶切位点，并将这些人工合成的序列分别克隆到pEASY-T1载体(Transgen，China)中。

表2

本试验例所用的古典猪瘟病毒、猪轮状病毒病、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、蓝耳病毒、Delt-冠状病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒各自保存在-80℃。

此外，为进一步验证本试验例提供的非洲猪瘟病毒的检测方法与其他猪病毒模板之间是否会发生交叉反应，即验证其特异性，本试验例还将古典猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、蓝耳病毒和Delt-冠状病毒的cDNA、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的DNA以及合成的猪圆环病毒基因组序列用作模板(表3)进行LAMP-LFD反应，cDNA和DNA制备方法如本实施例1.2所示。

表3本实施例中使用的其他病毒毒株

物种	毒株	GenBank号	物种	毒株	GenBank号
						CSFV	Thiverval	EU490425.1	Delt-CoV	CH/SCMS/2017	NA
RVA	NX	NA	PCV	MiSD-1	KP282147.1
						PEDV	CV777	NA	PRV	Bartha	JF797217.1
TGEV	HUA	NA	PPV	N	HM989009.1
						PRRSV	SCcd17	MG914067

注：^a CSFV，古典非洲猪瘟病毒；RVA，猪轮状病毒；PEDV，猪流行性腹泻病毒；TGEV，猪传染性胃肠炎病毒；PRRSV，蓝耳病毒；Delt-CoV，Delt-冠状病毒；PCV，猪圆环病毒；PRV，伪狂犬病毒；PPV，猪细小病毒。NA，未提交至GenBank。

1.2 DNA、RNA的提取和cDNA合成

DNA使用Universal Genomic DNA Kit(ComWin Biotech,Beijing,China)进行提取，具体步骤如下：

1.取病毒液200μl，向其中加入20μl Proteinase K；

2.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟；

3.短暂离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心；

4.将步骤3中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin ColumnsDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入；12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

5.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

6.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

7. 2,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；

8.将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入100μl灭菌水，室温放置5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

使用TRIzol(Invitrogen，California，USA)提取RNA，具体步骤如下：

1.将300μL病毒尿囊液和700μl 4℃预冷的RNAlso Plus温和混匀，室温静置5min；

2.加入200μl氯仿，振荡混匀后，室温静置15min，12000r/min，4℃离心10min；

3.弃沉淀，将上清移至新的无菌离心管中，加入700μl 4℃预冷的异丙醇，室温静置10min；

4. 7500r/min，4℃离心10min；

5.弃上清，用1ml 75％的乙醇重悬洗涤沉淀后，12000r/min，4℃离心15min；

6.弃上清后，将离心管敞口在超净台中风干沉淀；

7.用适量的RNase-free水溶解沉淀，-20℃保存备用。

以上一步获得的病毒总RNA为模板，按照TakaRa公司的PrimeScript RTreagentkit反转录试剂盒标准步骤合成cDNA，反应体系如下表所示：

表4反转录体系

组分	体积
		总RNA	8.4μl
5×PrimeScript Buffer	2μl
		Oligo dT Primer	0.5μl
Random 6mers	0.5μl
		PrimeScript RT Enzyme Mix1	0.5μl

反应体系在PCR管中混匀后，置于PCR仪，条件为：37℃，15min；85℃，5s。cDNA产物置于-20℃保存备用。

1.3 LAMP-LFD反应，即试验例3所述试剂盒的检测方法

(1)按本实施例1.2所示方法制备待测样本的DNA或cDNA；

待测样品包括：8种ASFV病毒(China/2018/AnhuiXC GQ、Tengani 62、Warmbaths、Mkuzi 1979、NHV、Lil-20/1、Ken05/Tk1和R7，具体信息如表2所示)、古典猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、蓝耳病毒和Delt-冠状病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒以及猪圆环病毒，具体如本实施例1.1部分所示；

(2)配制LAMP-LFD的反应液体：

LAMP-LFD的反应液体中含有2.5μl 10×Isothermal Amplification Buffer(含有2mM MgSO₄)、MgSO₄ 2mM、dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)各1.4mM、Bio-FIP和FITC-BIP各1.6μM、F3和B3各0.2μM、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶8U和模板1μl，再加ddH₂O将反应体积补齐为25μl。其中，待测样品组的模板为ASFV和其他病毒的DNA或cDNA，阴性对照(NC)的模板为双蒸水。

具体加样体系如下：

表5 LAMP-LFD反应加样体系

试剂	加样量或终浓度
		10×Isothermal Amplification Buffer	2.5μl
MgSO<sub>4</sub>	2mM
		dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)	各1.4mM
Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶	8U
		F3/B3	0.2μM
Bio-FIP或FITC-BIP	1.6μM
		模板	1μl
ddH<sub>2</sub>O	补齐至25μl

(3)扩增反应：将步骤(2)中配制好的LAMP反应液分别于65℃反应40min，得到LAMP反应产物，分别取各反应产物20μl，向其加入80μlHybriDetectAssay Buffer(Mileniabiotec,Gieβen,Germany)，在新的离心管中混合，随后将侧向流试纸条(LFD)(Mileniabiotec,Gieβen,Germany)浸入该混合物中。3-5分钟后，即可观察结果。

2结果

结果如图2所示，图2中从左至右依次为ASFV毒株(ASFV strains)、其他病毒(other Viruses)和阴性对照(NC)。其中，ASFV毒株(ASFV strains)从左至右依次为China/2018/AnhuiXC GQ、Tengani 62、Warmbaths、Mkuzi 1979、NHV、Lil-20/1、Ken05/Tk1和R7；其他病毒(other Viruses)从左至右依次为古典猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RVA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、蓝耳病毒(PPRSV)、Delt-冠状病毒(Delt-CoV)、猪圆环病毒(PCV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)。由此可见，3-5分钟后，即可观察到检测线。当ASFV序列作为模板时，LAMP-LFD结果显示为阳性，本试验例提供的LAMP-LFD引物可以与8株不同基因型的ASFV模板进行反应(ASFV strains)，具有通用性。而当其他病毒核算序列作为模板时，未见假阳性结果。由此可见，LAMP-LFD对ASFV具有高度的特异性，不与ASFV外的其他病毒发生反应。

试验例5

本试验例的目的在于验证试验例3提供的非洲猪瘟病毒的检测方法的灵敏度。

操作步骤如下：

(1)制备待测DNA样品：

将10倍系列稀释的B646L的基因片段作为模板，根据DNA拷贝数确定检测限。将携带B646L片段的载体用BamH I和Sal I消化，反应体系如下：

表6

试剂	体积
		携带B646L的载体	40μl
BamH I/Sal I	1μl
		10×restriction enzymes Buffer	5μl
ddH<sub>2</sub>O	3μl
		总体积	50μl

反应条件：37℃反应2h。然后，通过1％琼脂糖电泳分离B646L片段和线性化载体，并使用TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN BIOTECH，Beijing，China)将B646L片段从琼脂糖凝胶中提取，具体步骤如下：DNA经凝胶电泳分离后，从凝胶中切下目的条带，转移至1.5mL无菌离心管中，称重，加入其质量相对3倍体积的溶液PN，50℃水浴中放置10min，待琼脂完全融化；将溶液转入吸附柱CA2中(CA2放于收集管中)，室温放置2min，12000r/min离心1min，弃废液，向CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，重复漂洗一次；弃废液后，将CA2放回收集管中，12000r/min离心2min，弃除残留的PW，室温放置5min；将CA2转入无菌的1.5mL离心管中，加入20μL去离子水，室温放置2min，12000r/min离心2min，收集的溶液中即含有相应的目的片段；置于-20℃保存备用。

使用NANO DROP 2000(Thermo，Shanghai，China)测量纯化的B646L片段的浓度，并且按照下式计算B646L片段的拷贝数：拷贝数(copies/ul)＝[DNA浓度(DNA ng/ul)/片段大小(bp)]×9.12×10¹¹。测定出回收后的B646L片段浓度为10^8.6拷贝/μl。随后，将纯化的B646L片段从10^8.6至10^0.6拷贝/μl进行梯度稀释，具体如下表所示：

表7

(2)PCR及LAMP-LFD反应

本试验例选择国际兽疫局(OIE)推荐的引物(见表1)在灵敏性试验中作为参考方法，对比OIE-PCR和本发明提供的试剂盒的检测方法(LAMP-LFD)的检测限。

PCR反应：OIE推荐的常规PCR反应混合物包括12.5μl 2×M5Pfu PCRMasterMix(Mei5，Beijing，China)、上下游引物各10pmol(具体见表1)、DNA(模板)1μl，余量为双蒸水(ddH₂O)，最终体积为25μl。PCR参数包括94℃初始变性步骤5分钟，94℃变性50秒，退火50秒，72℃延伸10秒，进行32个循环，72℃延伸10分钟。DNA(模板)为经梯度稀释的B646L片段。阴性对照(NC)的模板为双蒸水。

LAMP-LFD反应：反应液体中含有2.5μl 10×Isothermal Amplification Buffer(含有2mM MgSO₄)、MgSO₄ 2mM、dNTP各1.4mM、Bio-FIP和FITC-BIP各1.6μM、F3和B3各0.2μM、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶8U和模板1μl，再加ddH₂O将反应体积补齐为25μl。其中，模板为经梯度稀释的B646L片段，阴性对照(NC)的模板为双蒸水。将前述配制好的LAMP反应液分别于65℃反应40min，得到LAMP反应产物，分别取各反应产物20μl，向其加入80μlHybriDetectAssay Buffer(Milenia biotec,Gieβen,Germany)，在新的离心管中混合，随后将侧向流试纸条(LFD)(Milenia biotec,Gieβen,Germany)浸入该混合物中。3-5分钟后，即可观察结果。

(3)结果

图3中上图为OIE-PCR的结果图，OIE-PCR扩增的目的片段大小为278bp，Marker为DNA分子量标准品，从左至右所用模板依次为10^8.6拷贝/μl、10^7.6拷贝/μl、10^6.6拷贝/μl、10^5.6拷贝/μl、10^4.6拷贝/μl、10^3.6拷贝/μl、10^2.6拷贝/μl、10^1.6拷贝/μl和10^0.6拷贝/μl的B646L片段，最后一个泳道为阴性对照(NC)。图3中下图为LAMP-LFD结果图，从左至右所用模板依次为10^8.6拷贝/μl、10^7.6拷贝/μl、10^6.6拷贝/μl、10^5.6拷贝/μl、10^4.6拷贝/μl、10^3.6拷贝/μl、10^2.6拷贝/μl、10^1.6拷贝/μl和10^0.6拷贝/μl的B646L片段，最后一个侧向流试纸条为阴性对照(NC)。

结果如图3所示，LAMP-LFD最低可以检测10^0.6拷贝个模板，OIE-PCR最低可以检测10^4.6拷贝的模板。由此可见，本发明提供的LAMP-LFD比OIE-PCR灵敏10000倍。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种检测非洲猪瘟病毒的引物组、用途、试剂盒及其检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagacgtaat gttcattaca gctgtactta atccagagca ag 42

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtccgtgat aggagtaata tcttgttcac agcattttcc cgag 44

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttctcatta aaccaaaagc g 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccataccaa cccgaaat 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggataccg agggaatagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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Claims

1.一种检测非洲猪瘟病毒的引物组，其特征在于：所述引物组包括Bio-FIP、FITC-BIP、F3和B3，所述Bio-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述FITC-BIP的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

2.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组、LAMP扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为人工合成的非洲猪瘟病毒DNA，所述阴性质控品为双蒸水。

3.根据权利要求2所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述Bio-FIP和FITC-BIP的终浓度均为1.6μM，所述F3和B3的终浓度均为0.2μM。

4.根据权利要求2或3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述LAMP扩增试剂包括浓度为10×的Isothermal Amplification Buffer，所述LAMP扩增试剂还包括MgSO₄、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、dATP、dGTP、dTTP和dCTP。

5.根据权利要求4所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：还包括LAMP反应试剂，所述LAMP反应试剂为HybriDetectAssay Buffer。

6.根据权利要求5所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：还包括侧向流动试纸条。

7.一种用权利要求2-6任意一项所述的试剂盒检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)准备待测DNA样品：提取待测样本的DNA；

(2)配制三组LAMP的反应液：包括检测组、阴性对照组和阳性对照组，三组LAMP的反应液中均包括LAMP扩增试剂、权利要求1中所述的引物组、模板和双蒸水，所述检测组、阳性对照组和阴性对照组的模板分别依次为待测DNA样品、阳性质控品和双蒸水；

(4)检测：将三组LAMP反应液分别检测，判断结果。

8.根据权利要求7所述的检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中扩增反应的反应条件为65℃；恒温反应40min。

9.根据权利要求8所述的检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中LAMP反应液的体积为25μL；每组LAMP反应液中各组分的加样量或终浓度如下：10×的Isothermal Amplification Buffer为2.5μL；MgSO₄为2mM、Bio-FIP和FITC-BIP各1.6μM；F3和B3各0.2μM；Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶8U；模板1μl；dATP、dGTP、dTTP和dCTP各1.4mM；余量为ddH₂O。

10.一种权利要求1所述的引物组在检测非洲猪瘟病毒或制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。