CN109536633B - 与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供与玉米抗灰斑病主效QTL‑qRgls2共分离的SNP标记及应用。所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其中，第679位碱基为多态性位点，该处碱基为A或G。本发明还提供用于检测所述SNP标记的KASP引物。利用本发明提供的SNP标记及其KASP引物能够高效且低成本地鉴定出玉米灰斑病抗性材料，可实现对玉米灰斑病抗病基因的高通量检测。

Description

与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用。

背景技术

玉米是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。灰斑病是由玉蜀黍尾孢菌(Cecrospora zeae-maydis Tehon&Daniels)引起的真菌病害，又被称为玉米尾孢菌叶斑病。于20世纪20年代在美国首次发现灰斑病，如今已成为危害玉米生产的主要病害之一，在我国西南地区尤为严重。长期生产实践证明，选育和推广抗病品种是防治玉米灰斑病的最有效的途径之一。

对于玉米抗病育种而言，育种材料的抗病性鉴定是至关重要的，由于玉米灰斑病的发生对气温和空气湿度有较高要求，自然接种鉴定和人工接种鉴定的方式均受到季节、地域及年度病害流行情况等因素限制，只能够在符合玉米生长的特定季节(如春、夏季)及适宜该病害发生的地域内进行田间鉴定，因此抗病性鉴定受到一定的限制。分子标记的应用为抗病行鉴定提供了一种快速有效地方法，利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记可以在苗期筛选出含有抗病QTL的育种材料，相对于自然接种鉴定和人工接种鉴定，利用分子标记对抗病材料进行筛选不受限于玉米的生长时期、种植地域及年份的影响，其效果要优于接种鉴定。

利用分子标记对玉米灰斑病抗病QTL进行筛选，其准确性由所用分子标记与抗病QTL的紧密连锁程度决定，分子标记与抗病QTL连锁程度越高，利用分子标记进行筛选的准确性越高，反之准确性越低。如果分子标记位于抗病QTL的基因内部，那么分子标记将与抗病QTL共分离。

目前利用SSR等分子标记进行抗病QTL筛选，存在通量低、成本高、对环境不友好等缺点，难以在商业化育种中得到大范围应用。SNP标记作为第三代分子标记，具有通量高、单个标记数据成本低等优势，同时基因分型数据准确可靠，遗传稳定性和重复性好，容易实现自动化检测，减少了人力成本，可以满足多次基因分型数据结果的整合。

利用玉米抗灰斑病分子标记高通量检测技术进行抗病辅助育种将会在商业化育种中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用。

本发明的技术路线如下：玉米灰斑病相关基因内部的SNP标记引物组合的获得：1.已知与玉米灰斑病抗性有关的主效QTL位点qRgls2位于玉米第5号染色体，位于QTL位点qRgls2的抗病基因序列来源于抗病材料Y32，序列如SEQ ID NO:1所示，位于QTL位点qRgls2的感病基因序列来源于感病材料B73，序列如SEQ ID NO:2所示。2.采用序列比对软件DNAMAN比对抗病基因序列和感病基因序列。3.根据比对结果选取两序列之间的单核苷酸多态性位点(SNP，single nucleotide polymorphism)，提取SNP位点两侧至少50bp的序列，提交艾吉析(上海)科技有限公司(LGC公司)，设计KASP引物，用于检测所选取SNP位点的基因型。4.对设计的KASP引物进行验证。提取92份玉米材料新鲜叶片的DNA，利用LGC公司生产的SNP高通量检测平台对92份玉米材料的灰斑病抗性相关SNP位点进行检测，验证所设计的KASP引物组合对相应SNP位点的基因型分型效果。有关玉米抗病材料Y32可参见Xu,L.,Zhang,Y.,Shao,S.,Chen,W.,Tan,J.,Zhu,M.,…&Xu,M.(2014).High-resolution mappingand characterization of qRgls2,a major quantitative trait locus involved inmaize resistance to gray leaf spot.BMC plant biology,14(1),230。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其中，第679位碱基为多态性位点，该处碱基为A或G。

第二方面，本发明提供用于检测所述SNP标记的KASP引物，所述引物如表1所示：

表1

第三方面，本发明提供含有所述KASP引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述SNP标记、所述KASP引物或含有所述KASP引物的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2基因分型中的应用；

(2)在鉴定或筛选抗灰斑病玉米材料中的应用；

(3)在玉米分子标记辅助育种中的应用。

第五方面，本发明提供鉴定含有主效QTL-qRgls2的玉米种质资源的方法，包括以下步骤：

1)提取待测玉米基因组DNA作为模板；

2)向步骤1)的模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。

其中，所述KASP Primer mix中含有三种特异性引物：正向引物1、正向引物2和反向引物(表1)，并且，所述正向引物1和正向引物2的5’端分别添加不同的标签序列。优选地，正向引物1的5’端添加的标签序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，正向引物2的5’端添加的标签序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′。

所述KASP Master mix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂。

优选地，步骤(2)中采用的PCR反应体系如下：DNA模板0.8μl，KASP Master mix和KASP Primer mix混合液0.8μl。

其中，所述混合液是由100μM KASP Master mix和2×KASP Primer mix按体积比35:1混合而成。

所述KASP Primer mix中正向引物1、正向引物2和反向引物的浓度分别为12μM、12μM和30μM。

PCR反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。

第六方面，本发明提供一种玉米灰斑病抗病基因的高通量检测方法及其在育种中的应用。所述方法是利用表1所述KASP引物实现对玉米灰斑病抗病基因的高通量检测。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

利用开发的抗灰斑病KASP引物组合，结合高通量的DNA提取方法，LGC高通量SNP分子标记基因型分型平台，实现了玉米抗灰斑病的高通量分子育种。主要流程如下：1.样品准备。对玉米籽粒单粒进行取样，剪取玉米籽粒的部分胚乳，在不伤害胚的情况下，该籽粒可以继续种植。2.DNA快速提取。采用Hotshot法对玉米籽粒单粒进行快速DNA提取。Hotshot提取DNA的方法不仅在试剂耗材成本上低廉，而且整个流程的耗时非常短，在大规模提取DNA时可以节省大量的人力物力和时间。3.高通量分子标记检测。利用LGC生产的高通量实时荧光检测***和水浴PCR仪，对DNA样品进行高通量的分子标记检测。4.优良样品追踪。根据对DNA的分子标记检测的结果，追踪到相应的玉米籽粒，在育种时只对优良的玉米籽粒进行播种，可以节省50％-75％的播种面积。

进一步地，在玉米灰斑病回交育种中的应用：1.利用含有抗病基因的玉米材料Y32作为供体亲本，易感灰斑病但其它农艺性状优良的材料作为轮回亲本，通过回交将抗灰斑病基因导入轮回亲本，改良轮回亲本的抗病性。2.利用开发的KASP引物组合和LGC生产的SNP高通量检测平台对回交群体单株进行抗病基因检测，筛选出含有抗病基因的单株，继续和轮回亲本进行回交。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

利用本发明提供的SNP标记及其KASP引物能够高效且低成本地鉴定出玉米灰斑病抗性材料。本方法只需合成相应的引物并在5'端加上荧光探针序列，与探针法荧光定量PCR相比，极大地降低了检测成本；并且荧光扫描是在反应终点进行，因此可以先进行大批量样品的PCR扩增，反应结束后再集中进行荧光扫描检测，实现了高通量检测，其检测效率是荧光定量PCR的12～24倍；反应结束后无需进行凝胶电泳，扫描荧光信号即可，同时反应体系构建可实现自动化，这样不仅能省时省力，而且能有效降低出错的概率。

附图说明

图1为本发明实施例3中利用KASP引物组合HB2-1对回交世代BC₂F₁的单株进行检测的结果。其中，1-含抗灰斑病基因的玉米材料，2-不含有抗灰斑病基因的玉米材料，其余点代表缺失。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与灰斑病相关SNP标记的获取

已知与玉米灰斑病抗性有关的QTL位点qRgls2位于玉米第5号染色体，抗病材料Y32的抗灰斑病基因序列如SEQ ID NO:1所示，感病材料B73的感灰斑病基因序列如SEQ IDNO:2所示；利用序列比对软件DNAMAN比对SEQ ID NO:1和2的核苷酸序列，选取两序列之间的4个单核苷酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphism)位点：HB2-1，HB2-2，HB2-3，HB2-4，并提取SNP位点HB2-1，HB2-2，HB2-3，HB2-4两侧至少50bp的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6所示。

实施例2KASP引物设计及验证

将获取的SNP位点HB2-1，HB2-2，HB2-3，HB2-4及两侧序列如SEQ ID NO:3(第679位碱基n为SNP位点，n为a(感)或g(抗)，SEQ ID NO:4(第204位碱基n为SNP位点，n为g(感)或t(抗)，SEQ ID NO:5(第193位碱基n为SNP位点，n为a(感)或c(抗)，SEQ ID NO:6(第115位碱基n为SNP位点，n为g(感)或a(抗)。提交艾吉析(上海)科技有限公司进行KASP引物设计，具体引物序列如下：

其中，Primer_FAM、Primer_HEX的5’端分别添加有标签序列，FAM的标签序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX的标签序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′。

利用上述KASP引物对相应的SNP位点进行检测，验证KASP引物的应用效果。选取96份玉米材料，采用改良CTAB法提取玉米新鲜叶片的DNA,对设计的KASP引物进行验证。利用LGC OKTOPURE DNA自动提取工作站将提取的DNA从96孔板转移至384孔板，利用LGCIntelliqube SNP高通量检测平台将PCR反应体系进行分装和混合到array tape中，并封膜进行密封，PCR反应体系为：0.8ul DNA，0.8ul的KASP Master mix和KASP Primer mix的混合液(100μM KASP Master mix和2×KASP Primer mix的体积比为35:1，其中所述KASPPrimer mix中引物Primer_FAM、Primer_HEX和Primer_common的浓度分别为12μM、12μM和30μM)。在LGC Hydrocycler16高通量水浴PCR仪中进行PCR反应，PCR反应程序为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。PCR反应结束后利用LGC Intelliqube SNP高通量检测平台对arraytape进行荧光扫描。经验证，KASP引物HB2-1，对相应SNP位点的基因型分型效果良好。

实施例3在灰斑病回交改良过程中利用SNP标记进行辅助选择

利用含有灰斑病抗病基因的抗病材料Y32作为供体亲本，易感灰斑病的材料LA2061作为轮回亲本，通过回交将抗病基因导入到轮回亲本LA2061中，利用KASP引物组合HB2-1以及LGC生产的SNP高通量检测平台对回交世代BC₂F₁的单株进行检测。具体为：在田间取每个单株的新鲜叶片，共182个样品，采用hotshot法快速提取叶片DNA。利用LGCOKTOPURE DNA自动提取工作站将所提取的DNA从96孔板转移至384孔板，利用LGCIntelliqube SNP高通量检测平台将PCR反应体系进行分装和混合到array tape中，并封膜进行密封，PCR反应体系及反应程序同实施例2。

PCR反应结束后利用LGC Intelliqube SNP高通量检测平台对array tape进行荧光扫描，结果如图1所示，上方紫色的点代表含有抗灰斑病基因的玉米材料，右下方红色的点表示不含抗灰斑病基因的玉米材料，灰色的点代表缺失(即样品的基因型无法区分)。挑选出含有抗病基因的DNA，并追溯到田间的单株，对含有抗病基因的单株继续进行回交。同时利用琼脂糖凝胶电泳对182个单株进行抗灰斑病基因检测，检测结果与KASP引物检测的结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司

<120> 与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用

<130> KHP181117599.2

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6921

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

gtggcttcct ctcttcccct cctcccttgg ccccgtctcg tctcctcccc ctcaccttcc 60

tctccacctt cctccctccc acccctccgc gcctcgcccc accgcgccaa ccaaccaaca 120

cggcgtccca gcctgcctat ataccgctcc ccccgcgccc ccacacgcgc aaatccatat 180

gctcagctcc cgcctcctcc catccccgga ccccggaccc cggccatggg cgcttgcttc 240

tcctccgcct ctgccgcccc cgccggcgcc gccgtcgacg agcgccgccc gtccaaggag 300

ggcgacggca agaagaggcg ccgcgccgcc ggggcatcgc cggatgccgc ggcgcccgtg 360

cgcgtggagt tcggctacga gagggacttc gaggcgcgct acgaggtcgg ccgcctgctc 420

ggccacggcc agttcggcta caccttcgcc gccaccgacc gcggctctgg ggaccgcgtt 480

gccgtcaagc gcatcgacaa ggccaaggtg agctgccgcc tgcccccccg caccccaagc 540

cgccgcgctg tccctgtctc tgtctctcct actagtagta gtagctggtg gtgattccga 600

gcgcgtcttt ggtctggtgc atcgaaccac ttgtgcttgg tgcatttcga ggggattcgg 660

tgtaattccg tgcaaattgg ggatttctct cctgttgctt tccgaggttt aggtgtttcg 720

attgggacgc gattggagcc gttcatttta ggacatttcc ggtgcctttt gggaggcgtt 780

tagctcaacg agtagctcac tcacatttct agctgtttgg ccgcttcatt tctcccaagc 840

tttcgttgtt tgccggtggt tctgagctgc gggatcttga cgttggccag agaggtggtt 900

tcgacattca ggcatctcgg atgacctctt agtttggcac tacagctcta ttatttcggg 960

aacgacgtgt tgctcagtgc gcacctcatt catggaagtg gcaaggtcgc ttgtctgcag 1020

aacggggaag gtgcttttca tctggctatt catggaaaac gacttgttca gttgccctac 1080

taataatttc aataagattg cctgcctcct tgaatggttg gggcttggaa ggttcctgtc 1140

gaagaaaaag tcaggaaaga taacaattgc gcacttgcag tggacaacgc ttccctgtct 1200

tctatgctat aggtggacag catttttcta ggtataatta atttgacctt caaacatatg 1260

tatactaacc aacgcggttt tgattccatc aaatgttttg gactctctct gctgaactgt 1320

caaagttact tcatggggca aaatgtcaaa ttttctggaa ccttccgtag tatattttgg 1380

aaatgagtgt ttattgtgtc attggaaata ccgttcatgt gtctgtgaca gaatgtgtca 1440

ctagaaagct gaattggtgt tgtccttgtc aaaaaggcac taaacacgag tctgaaaatt 1500

aggcctgttc ttggtaaggg aaggaatctg agcatcaatg ctgataggaa tagactctgt 1560

ctgtcaatat tgttaacttg tttatagggc ttcgagtttt caacttttga ggcagataag 1620

taggatacct cttttgatca tgatatataa catattctta tatacctcaa gccttgcact 1680

gttaagttaa tgtggcatcc tttctagaga tcatgacctc aagttgcata tggatgccaa 1740

taatatcgac accaagtgaa catcagtgtc tgtggaatat gccgaaagca gccaacgtgc 1800

cattactgaa ttttcatatg attattatat tctgtttaga tttatttacg tcggaacaca 1860

gtgagatggt aacgtaatga atcaaaatag gctataaaca tgcaattcaa catatcatta 1920

tcatgcccaa gtgttttgtc attctatctt tattcgtcca agaaggacaa gcctggtgca 1980

ttgttgaggg aaccagttct tctgcagtac ttctagggag gtaaaaattc aacaccgttg 2040

gatgcagatc tatcgaaccc agggactttg tgcttccagt gaaaagttat atggacccat 2100

aggccagagg atgtgagagt tttacctctc tggaagttat atgcgctagc attagtgtgg 2160

tcatcaatgg gatcaaagat gagctccacc tttggtgtag agctggagct aggggactct 2220

agcatcctgg cgctccaatc ttccatccag tgaactctgt tttttgggtc tagtaggtca 2280

agggtccagt tattttttct ttctgctgta aagtctctag ttaaggtgtg agttttgtat 2340

ggtgtttttt cgaggtttcc ccaaacctca ccttttttcc ttcttaatat aatgatatgc 2400

agctttcctg cgtattcgag aaaagaaagt tttatctctc tggaagttaa ctgcagagga 2460

acttgttaca ttgttgagag ttgtctcacc gagtcaccag gtcgctggtt caaagcagtc 2520

tctccacatt tatgtggaag gcttgcctcg gtttatccct tcccaagact ctacttgtgg 2580

gagactctgg cattgggtct gtcctatgcc gttgaagcgc taggttcgtt tatcccttcc 2640

ctatacccac ttgtcagagc ctccaacact gagtctgccc taagcttcca agttccaaca 2700

ctgggtctgc cctaggccgt cgaagcgtta tatgattgcc atgtactgtt atgctttgtt 2760

gccttcacat attttccgtt cgaaatcatc tccttgttgc cttcacatat tgccttgttg 2820

ctttcacata ttttctgttc cacgtcatac ttagaagtta gaacacgtga tttatgccaa 2880

ttaagattat tattttatat aacagatgac ccgccctgtt gctgtggagg atgtgaaaag 2940

agaagtgaag attcttaaag cacttaaagg acatcagaat attgttcact tctacaatgc 3000

atttgaggat gattcatacg tgtacattgt gatggagtaa gtaggcccat acacctgttc 3060

ctgctaatag agcatatcga ttttgctatg acttttttcc ctaaagtttt aacatgaaca 3120

atatctatcc tgtttacaga atcctagaca ctaaaatgtc atttctaatt atcaattatt 3180

ctatagctaa accagatgca atcctgattt atttttctta acgtatggat atattggact 3240

tttctttcaa acctgcattt tgaatttgat tacagggaac tataacacta attcagaact 3300

ctatcatgtt taacattttt cttgcattgt tctatgtttg tcaacttgac gcacttctta 3360

gataatataa catcatcttc cacagtcacc attagttagg accttggacc ttcatggttc 3420

cgaaatttag ctaagaatgg tatacatggt catgtgattt caaatagatg ttcctatatg 3480

ccagaaccaa ctcataagtc ataagtttta ccttgtgttt ttgcaggcta tgtgagggcg 3540

gtgaactatt agatcggatt ttggcaaagt aagtagataa gatccccatc tctttgtttc 3600

ccgtacctca ttcttcgcca ttaaatttat agatttttgt gctgtaaaat cagattgctt 3660

tatgttgttt gtctgctttg tttgatttct agttgctcgt tcaagatcct ttacttaatg 3720

gtgtgcgtgt tttgacagaa agaatagccg ctatagtgag aaagatgctg cagtggtagt 3780

ccgccaaatg ctcaaagtag ctgctgaatg ccatctgcgt gggttagttc accgagatat 3840

gaagcctgag gtagaaatca aatacttcaa tctctttgca cacagtaagc atttggtgat 3900

atttcactac ttcctcaggt catgtaagac tgtacctatt ttccttccca gaacttcctt 3960

ttcaaatcga acaaggagga ttcaccacta aaggcgacag attttggttt gtcagatttc 4020

attaagccag gtatctactt ggggccatct gaatctgtcg ggaatctgat aggggcaagt 4080

ctgcagttta gctgaccatt ttgttgtcta atgcatgctt tagggaagaa gttccatgac 4140

attgttggaa gtgcttacta tgtcgcacca gaagtactaa aacgacggtc tggtcctgag 4200

tcagatgttt ggagcatagg agtcataacc tacattttgc tctgtgggag gcgccctttt 4260

tgggataaga ccgaagacgg tatattcaag gaggtaagtg gatggatttt gcataccatg 4320

tgcttacatg taaaatatgc ttggttagag tgctgtacca gggatcagcg ttttcagcgt 4380

gctgatactg ttttgtacaa tgtgtttcta ctttctacgt catatagcag tgtttctttg 4440

ttaactattt cagtgtcaaa ctatttgtcg tgtcacaact cagcagtata attttactat 4500

tttgaacact gtaaacctgc ctggtcaggt tatccttcag taatttctct actagctacc 4560

agaaacccac tttatgcagg tgttcagttt aataacaccc accatctttc agatttctaa 4620

tgttcagtgt tagacagact tcattaagat gcaccttaag atgattgtaa gtagtaaaag 4680

tgctttgcac ttttgttaac ttttgagtct gaagatgact tgtggtacct atgacctcaa 4740

gaaaccaagg cattgccatt ggaatagcta attcgaatga gcttcagata tggctatctg 4800

ttttagtttt ggacatctga ctcaacttta taggataata ctatattagc aatctttgag 4860

gtcattgtct cagccaaaat aagttgcggt ctctttttta ctgtcctaag cagcaatatg 4920

gtttccattt tcattatacc agcaacttcc acctttttct tgctatttaa atatctttat 4980

gcattttatc agcaaggaca tgatacgatc gtatatgtga tattctacat cttttcactt 5040

ctcataatta ggttctaagg aacaagcctg attttcgtaa gaggccttgg tcaagcatca 5100

gcccaggtgc taaagatttt gttaaaaggt tactagtgaa gaatccaagg gccaggctaa 5160

cagctgctca agctctctgt aagttttggt atttttcatt aatttactag cctagtcatg 5220

atgatcagat tcaccttctc tatgtgagaa cagagaacac atatacatct ggcagtatgc 5280

ctttcaatca gttatgacaa tgtaaatatg caaagaccga tgttttttct atcctgcacc 5340

attttagaac attaatgggg aaaaaccaca atatattagg aaaaatgttt aattatgtcc 5400

tggtcacttg aaatgaacat ataccactga ggttttctag ttctcatgcg ttcttataat 5460

gatctaataa gtcagtggag gtttgctgcc caccacccct acatttgtat tgtgaattac 5520

tatcatcttt actgatcctg attgttcttg atatgttaag cacatccgtg ggtaagagaa 5580

ggaggggaag catccgatat ccccgtcgac atatctgtgt tatcaaacat gcgtcagttt 5640

gtcaagtaca gccgtttcaa gcaattcgcg cttcgggtaa ttacagtgat tacaaaaaac 5700

aacactgcat cgtttatttt ttcctcacaa tatttcctcg tggcatggtc aggctctggc 5760

gagcaccctt aacgaggaag agctatcaga tctgaaggat cagtttgatg caattgatat 5820

cgataaaagt ggatcgatta gtatcgagga aatgcgtcat gtaggttctg ttagtgtttg 5880

ctgatgaaaa tgccttagat cctgaactac tctgcggtgc tgattaatct gtgcatgttt 5940

cggtaggccc ttgcaaagga tcttccctgg agattgaagg gtccccgtgt gctggagatt 6000

attcaagcag taagtttgag ccttcttctg gatccagccc tttctttgtt accccccttg 6060

tttccaagaa aatagctggc cttgttctga gggtataacc aaaactgcat cttattttgt 6120

ggtagattga cagcaacact gatgggctcg tggacttcaa ggagtttgtt gcggcaactc 6180

tccatatcca ccagatggcg gagctcgact cagaaaggtg gggcatacgc tgccaagctg 6240

ctttcagtaa gtttgatctt gacggtgatg gatatatcac gccggaggaa ctcagaatgg 6300

taattttcta ctcctgtctt gtttccatgt tgcttcacca acgaatgcac agttcacata 6360

acccttatta tcatcactgc ttcccatgaa taactagctg gctcgaccat catgagattc 6420

agtacttgcg ccctgtgcac ttggttttgg tcccgcttgt tagaatgaag taatttatca 6480

atggaagcgc tgtaatattt taatcagcgt ttagatttga taaagataaa acatgttcat 6540

tgtttgtgcc aagaaatcca cttacacaga tactgagagt tgcaccgtag ataacgctaa 6600

tcggcagtat cctaatcgag attttctttc aaggtgcagc accctgggtt gaagggatct 6660

atcgagccgc tgctggagga ggccgacatc gacaaagacg gcaagataag cctgtccgag 6720

ttccgcaagc tcctacggac agcgagcatg agcaacgtac ccagcccaag ggggccccca 6780

aaccctcagg ctctgtgaat tccggctcgg ccactaggga ggagcaagct taggaagttg 6840

ccatacaata gccatgtgtt ctttgggttc ttcagagtgc catgtgatgt ttctggtttt 6900

tagcatccag gttatgtgtg c 6921

<210> 2

<211> 7116

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

gtggcttcct ctcttcccct cctcccttgg ccccgtctcg tctcctcccc ctcaccttcc 60

tctccacctt cctccctccc acccctccgc gcctcgcccc accgcgccaa ccaaccaaca 120

cggcgtccca gcctgcctat ataccgctcc ccccgcgccc ccacacgcgc aaatccatat 180

gctcagctcc cgcctcctcc catccccgga ccccggaccc cggccatggg cgcttgcttc 240

tcctccgcct ctgccgcccc cgccggcgcc gccgtcgacg agcgccgccc gtccaaggag 300

ggcgacggca agaagaggcg ccgcgccgcc ggggcatcgc cggatgccgc ggcgcccgtg 360

cgcgtggagt tcggctacga gagggacttc gaggcgcgct acgaggtcgg ccgcctgctc 420

ggccacggcc agttcggcta caccttcgcc gccaccgacc gcggctctgg ggaccgcgtt 480

gccgtcaagc gcatcgacaa ggccaaggtg agctgccgcc tgcccccccg caccccaagc 540

cgccgcgctg tccctgtctc tgtctctcct actagtagta gtagctggtg gtgattccga 600

gcgcgtcttt ggtctggtgc atcgaaccac ttgtgcttgg tgcatttcga ggggattcgg 660

tgtaattccg tgcaaattag ggatttctct cctgttgctt tccgaggttt aggtgtttcg 720

attgggacgc gattggagcc gttcatttta ggacatttcc ggtgcctttt gggaggcgtt 780

tagctcaacg agtagctcac tcacatttct agctgtttgg ccgcttcatt tctcccaagc 840

tttcgttgtt tgccggtggt tctgagctgc gggatcttga cgttggccag agaggtggtt 900

tcgacattca ggcatctcgg atgacctctt agtttggcac tacagctcta ttatttcggg 960

aacgacgtgt tgctcagtgc gcacctcatt catggaagtg gcaaggtcgc ttgtctgcag 1020

aacggggaag gtgcttttca tctggctatt catggaaaac gacttgttca gttgccctac 1080

taataatttc aataagattg cctgcctcct tgaatggttg gggcttggaa ggttcctgtc 1140

gaagaaaaag tcaggaaaga taacaattgc gcacttgcag tggacaacgc ttccctgtct 1200

tctatgctat aggtggacag catttttcta ggtataatta atttgacctt caaacatatg 1260

tatactaacc aacgcggttt tgattccatc aaatgttttg gactctctct gctgaactgt 1320

caaagttact tcatggggca aaatgtcaaa ttttctggaa ccttccgtag tatattttgg 1380

aaatgagtgt ttattgtgtc attggaaata ccgttcatgt gtctgtgaca gaatgtgtca 1440

ctagaaagct gaattggtgt tgtccttgtc aaaaaggcac taaacacgag tctgaaaatt 1500

aggcctgttc ttggtaaggg aaggaatctg agcatcaatg ctgataggaa tagactctgt 1560

ctgtcaatat tgttaacttg tttatagggc ttcgagtttt caacttttga ggcagataag 1620

taggatacct cttttgatca tgatatataa catattctta tatacctcaa gccttgcact 1680

gttaagttaa tgtggcatcc tttctagaga tcatgacctc aagttgcata tggatgccaa 1740

taatatcgac accaagtgaa catcagtgtc tgtggaatat gccgaaagca gccaacgtgc 1800

cattactgaa ttttcatatg attattatat tctgtttaga tttatttacg tcggaacaca 1860

gtgagatggt aacgtaatga atcaaaatag gctataaaca tgcaattcaa catatcatta 1920

tcatgcccaa gtgttttgtc attctatctt tattcgtcca agaaggacaa gcctggtgca 1980

ttgttgaggg aaccagttct tctgcagtac ttctagggag gtaaaaattc aacaccgttg 2040

gatgcagatc tatcgaaccc agggactttg tgcttccagt gaaaagttat atggacccat 2100

aggccagagg atgtgagagt tttacctctc tggaagttat atgcgctagc attagtgtgg 2160

tcatcaatgg gatcaaagat gagctccacc tttggtgtag agctggagct aggggactct 2220

agcatcctgg cgctccaatc ttccatccag tgaactctgt tttttgggtc tagtaggtca 2280

agggtccagt tattttttct ttctgctgta aagtctctag ttaaggtgtg agttttgtat 2340

ggtgtttttt cgaggtttcc ccaaacctca ccttttttcc ttcttaatat aatgatatgc 2400

agctttcctg cgtattcgag aaaagaaagt tttatctctc tggaagttaa ctgcagagga 2460

acttgttaca ttgttgagag ttgtctcacc gagtcaccag gtcgctggtt caaagcagtc 2520

tctccacatt tatggggaag gcttgcctcg gtttatccct tcccaagact ctacttgtgg 2580

gagactctgg cattgggtct gtcctatgcc gttgaagcgc taggttcgtt tatcccttcc 2640

ctatacccac ttgtcagagc ctccaacact gagtctgccc taagcttcca agttccaaca 2700

ctgggtctgc cctaggccgt cgaagcgtta tatgattgcc atgtactgtt atgctttgtt 2760

gccttcacat attttccgtt cgaaatcatc tccttgttgc cttcacatat tgccttgttg 2820

ctttcacata ttttctgttc cacgtcatac ttagaagtta gaacacgtga tttatgccaa 2880

ttaagattat tattttatat aacagatgac ccgccctgtt gctgtggagg atgtgaaaag 2940

agaagtgaag attcttaaag cacttaaagg acatcagaat attgttcact tctacaatgc 3000

atttgaggat gattcatacg tgtacattgt gatggagtaa gtaggcccat acacctgttc 3060

ctgctaatag agcatatcga ttttgctatg acttttttcc ctaaagtttt aacatgaaca 3120

atatctatcc tgtttacaga atcctagaca ctaaaatgtc atttctaatt atcaattatt 3180

ctatagctaa accagatgca atcctgattt atttttctta acgtatggat atattggact 3240

tttctttcaa acctgcattt tgaatttgat tacagggaac tataacacta attcagaact 3300

ctatcatgtt taacattttt cttgcattgt tctatgtttg tcaacttgac gcacttctta 3360

gataatataa catcatcttc cacagtcacc attagttagg accttggacc ttcatggttc 3420

cgaaatttag ctaagaatgg tatacatggt catgtgattt caaatagatg ttcctatatg 3480

ccagaaccaa ctcatgagtc ataagtttta ccttgtgttt ttgcaggcta tgtgagggcg 3540

gtgaactatt agatcggatt ttggcaaagt aagtagataa gatccccatc tctttgtttc 3600

ccgtacctca ttcttcgcca ttaaatttat agatttttgt gctgtaaaat cagattgctt 3660

tatgttgttt gtctgctttg tttgatttct agttgctcgt tcaagatcct ttacttaatg 3720

gtgtgcgtgt tttgacagaa agaatagccg ctatagtgag aaagatgctg cagtggtagt 3780

ccgccaaatg ctcaaagtag ctgctgaatg ccatctgcgt gggttagttc accgagatat 3840

gaagcctgag gtagaaatca aatacttcaa tctctttgca cacagtaagc atttggtgat 3900

atttcactac ttcctcaggt catgtaagac tgtacctatt ttccttccca gaacttcctt 3960

ttcaaatcga acaaggagga ttcaccacta aaggcgacag attttggttt gtcagatttc 4020

attaagccag gtatctactt ggggccatct gaatctgtcg ggaatctgat aggggcaagt 4080

ctgcagttta gctgaccatt ttgttgtcta atgcatgctt tagggaagaa gttccatgac 4140

attgttggaa gtgcttacta tgtcgcacca gaagtactaa aacgacggtc tggtcctgag 4200

tcagatgttt ggagcatagg agtcataacc tacattttgc tctgtgggag gcgccctttt 4260

tgggataaga ccgaagacgg tatattcaag gaggtaagtg gatggatttt gcataccatg 4320

tgcttacatg taaaatatgc ttggttagag tgctgtacca gggatcagcg ttttcagcgt 4380

gctgatactg ttttgtacaa tgtgtttcta ctttctacgt catatagcag tgtttctttg 4440

ttaactattt cagtgtcaaa ctatttgtcg tgtcacaact cagcagtata attttactat 4500

tttgaacact gtaaacctgc ctggtcaggt tatccttcag taatttctct actagctacc 4560

agaaacccac tttatgcagg tgttcagttt aataacaccc accatctttc agatttctaa 4620

tgttcagtgt tagacagact tcattaagat gcaccttaag atgattgtaa gtagtaaaag 4680

tgctttgcac ttttgttaac ttttgagtct gaagatgact tgtggtacct atgacctcaa 4740

gaaaccaagg cattgccatt ggaatagcta attcgaatga gcttcagata tggctatctg 4800

ttttagtttt ggacatctga ctcaacttta taggataata ctatattagc aatctttgag 4860

gtcattgtct cagccaaaat aagttgcggt ctctttttta ctgtcctaag cagcaatatg 4920

gtttccattt tcattatacc agcaacttcc acctttttct tgctatttaa atatctttat 4980

gcattttatc agcaaggaca tgatacgatc gtatatgtga tattctacat cttttcactt 5040

ctcataatta ggttctaagg aacaagcctg attttcgtaa gaggccttgg tcaagcatca 5100

gcccaggtgc taaagatttt gttaaaaggt tactagtgaa gaatccaagg gccaggctaa 5160

cagctgctca agctctctgt aagttttggt atttttcatt aatttactag cctagtcatg 5220

atgatcagat tcaccttctc tatgtgagaa cagagaacac atatacatct ggcagtatgc 5280

ctttcaatca gttatgacaa tgtaaatatg caaagaccga tgttttttct atcctgcacc 5340

attttagaac attaatgggg aaaaaccaca atatattagg aaaaatgttt aattatgtcc 5400

tggtcacttg aaatgaacat ataccactga ggttttctag ttctcatgcg ttcttataat 5460

gatctaataa gtcagtggag gtttgctgcc caccacccct acatttgtat tgtgaattac 5520

tatcatcttt actgatcctg attgttcttg atatgttaag cacatccgtg ggtaagagaa 5580

ggaggggaag catccgatat ccccgtcgac atatctgtgt tatcaaacat gcgtcagttt 5640

gtcaagtaca gccgtttcaa gcaattcgcg cttcgggtaa ttacagtgat tacaaaaaac 5700

aacactgcat cgtttatttt ttcctcacaa tatttcctcg tggcatggtc aggctctggc 5760

gagcaccctt aacgaggaag agctatcaga tctgaaggat cagtttgatg caattgatat 5820

cgataaaagt ggatcgatta gtatcgagga aatgcgtcat gtaggttctg ttagtgtttg 5880

ctgatgaaaa tgccttagat cctgaactac tctgcggtgc tgattaatct gtgcatgttt 5940

cggtaggccc ttgcaaagga tcttccctgg agattgaagg gtccccgtgt gctggagatt 6000

attcaagcag taagtttgag ccttcttctg gatccagccc tttctttgtt accccccttg 6060

tttccaagaa aatagctggc cttgttctga gggtataacc aaaactgcat cttattttgt 6120

ggtagattga cagcaacact gatgggctcg tggacttcaa ggagtttgtt gcggcaactc 6180

tccatatcca ccagatggcg gagctcgact cagaaaggtg gggcatacgc tgccaagctg 6240

ctttcagtaa gtttgatctt gacggtgatg gatatatcac gccggaggaa ctcagaatgg 6300

taattttcta ctcctgtctt gtttccatgt tgcttcacca acgaatgcac agttcacata 6360

acccttatta tcatcactgc ttcccatgaa taactagctg gctcgaccat catgagattc 6420

agtacttgcg ccctgtgcac ttggttttgg tcccgcttgt tagaatgaag taatttatca 6480

atggaagcgc tgtaatattt taatcagcgt ttagatttga taaagataaa acatgttcat 6540

tgtttgtgcc aagaaatcca cttacacaga tactgagagt tgcaccgtag ataacgctaa 6600

tcggcagtat cctaatcgag attttctttc aaggtgcagc acactgggtt gaagggatct 6660

atcgagccgc tgctggagga ggccgacatc gacaaagacg gcaagataag cctgtccgag 6720

ttccgcaagc tcctacggac agcgagcatg agcaacgtac ccagcccaag ggggccccca 6780

aaccctcagg ctctgtgaat tccggctcgg ccactaggga ggagcaagct taggaagttg 6840

ccatacaata gccatgtgtt ctttgggttc ttcagagtgc catgtgatgt ttctggtttt 6900

tagcatccag gttatgtgtg cagtgcagcc ccgagtgagt ttcgaagtaa atattcagtg 6960

ctttcttttt ctttccggaa gagtgagagg tggaggtcaa aatggtaggc aagactcgcc 7020

ttcttctttc ctttacactg tacagtgata ctgaaatatg tacgattttt attataactg 7080

ttcgtcgcaa taaagttatt tggagaagtg aggatt 7116

<210> 3

<211> 1069

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

gtggcttcct ctcttcccct cctcccttgg ccccgtctcg tctcctcccc ctcaccttcc 60

tctccacctt cctccctccc acccctccgc gcctcgcccc accgcgccaa ccaaccaaca 120

cggcgtccca gcctgcctat ataccgctcc ccccgcgccc ccacacgcgc aaatccatat 180

gctcagctcc cgcctcctcc catccccgga ccccggaccc cggccatggg cgcttgcttc 240

tcctccgcct ctgccgcccc cgccggcgcc gccgtcgacg agcgccgccc gtccaaggag 300

ggcgacggca agaagaggcg ccgcgccgcc ggggcatcgc cggatgccgc ggcgcccgtg 360

cgcgtggagt tcggctacga gagggacttc gaggcgcgct acgaggtcgg ccgcctgctc 420

ggccacggcc agttcggcta caccttcgcc gccaccgacc gcggctctgg ggaccgcgtt 480

gccgtcaagc gcatcgacaa ggccaaggtg agctgccgcc tgcccccccg caccccaagc 540

cgccgcgctg tccctgtctc tgtctctcct actagtagta gtagctggtg gtgattccga 600

gcgcgtcttt ggtctggtgc atcgaaccac ttgtgcttgg tgcatttcga ggggattcgg 660

tgtaattccg tgcaaattng ggatttctct cctgttgctt tccgaggttt aggtgtttcg 720

attgggacgc gattggagcc gttcatttta ggacatttcc ggtgcctttt gggaggcgtt 780

tagctcaacg agtagctcac tcacatttct agctgtttgg ccgcttcatt tctcccaagc 840

tttcgttgtt tgccggtggt tctgagctgc gggatcttga cgttggccag agaggtggtt 900

tcgacattca ggcatctcgg atgacctctt agtttggcac tacagctcta ttatttcggg 960

aacgacgtgt tgctcagtgc gcacctcatt catggaagtg gcaaggtcgc ttgtctgcag 1020

aacggggaag gtgcttttca tctggctatt catggaaaac gacttgttc 1069

<210> 4

<211> 400

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

gttttgtatg gtgttttttc gaggtttccc caaacctcac cttttttcct tcttaatata 60

atgatatgca gctttcctgc gtattcgaga aaagaaagtt ttatctctct ggaagttaac 120

tgcagaggaa cttgttacat tgttgagagt tgtctcaccg agtcaccagg tcgctggttc 180

aaagcagtct ctccacattt atgnggaagg cttgcctcgg tttatccctt cccaagactc 240

tacttgtggg agactctggc attgggtctg tcctatgccg ttgaagcgct aggttcgttt 300

atcccttccc tatacccact tgtcagagcc tccaacactg agtctgccct aagcttccaa 360

gttccaacac tgggtctgcc ctaggccgtc gaagcgttat 400

<210> 5

<211> 401

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

tcccgcttgt tagaatgaag taatttatca atggaagcgc tgtaatattt taatcagcgt 60

ttagatttga taaagataaa acatgttcat tgtttgtgcc aagaaatcca cttacacaga 120

tactgagagt tgcaccgtag ataacgctaa tcggcagtat cctaatcgag attttctttc 180

aaggtgcagc acnctgggtt gaagggatct atcgagccgc tgctggagga ggccgacatc 240

gacaaagacg gcaagataag cctgtccgag ttccgcaagc tcctacggac agcgagcatg 300

agcaacgtac ccagcccaag ggggccccca aaccctcagg ctctgtgaat tccggctcgg 360

ccactaggga ggagcaagct taggaagttg ccatacaata g 401

<210> 6

<211> 259

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 6

acagtcacca ttagttagga ccttggacct tcatggttcc gaaatttagc taagaatggt 60

atacatggtc atgtgatttc aaatagatgt tcctatatgc cagaaccaac tcatnagtca 120

taagttttac cttgtgtttt tgcaggctat gtgagggcgg tgaactatta gatcggattt 180

tggcaaagta agtagataag atccccatct ctttgtttcc cgtacctcat tcttcgccat 240

taaatttata gatttttgt 259

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc tgattcggtg taattccgtg caaatta 47

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat tcggtgtaat tccgtgcaaa ttg 43

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcggaaag caacaggaga gaaat 25

Claims (9)

1.与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其中，第679位碱基为多态性位点，该处碱基为A或G。

2.用于检测权利要求1所述SNP标记的KASP引物，其特征在于，所述引物如下：

。

3.含有权利要求2所述引物的检测试剂或试剂盒。

4.权利要求1所述SNP标记、权利要求2所述KASP引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2基因分型中的应用。

5.权利要求1所述SNP标记、权利要求2所述KASP引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在鉴定或筛选抗灰斑病玉米材料中的应用。

6.权利要求1所述SNP标记、权利要求2所述KASP引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒在玉米分子标记辅助育种中的应用。

7.鉴定含有主效QTL-qRgls2的玉米种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测玉米基因组DNA作为模板；

2)向步骤1)的模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物；

其中，所述KASP Primer mix中含有三种特异性引物：正向引物1、正向引物2和反向引物，它们的定义同权利要求2中所述；并且，所述正向引物1和正向引物2的5’端分别添加不同的标签序列；

所述KASP Master mix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用的PCR反应体系如下：DNA模板0.8μl，KASP Master mix和KASP Primer mix混合液0.8μl；

其中，所述混合液是由100μM KASP Master mix和2×KASP Primer mix按体积比35:1混合而成；

所述KASP Primer mix中正向引物1、正向引物2和反向引物的浓度分别为12μM、12μM和30μM。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用的PCR反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个TouchDown循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。

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